AUTEURS : Liliane GRANDMOUGIN Claude TREILLES Niveau concerné : Lycée Type Terminale S Mise en forme : Jean-François CORNUET Date : Janvier 2000 Merci à : CLaude VILAIN et Jeanne FRÉDRIC Suggestion d'utilisation de la cassette vidéo "Immunité à médiation cellulaire" Fiche Professeur Programme Mécanismes de l'immunité TP3 : CULTURE MIXTE DE LYMPHOCYTES - TEST DE CYTOTOXICITÉ Source : partie III de la cassette vidéo «Immunité à médiation cellulaire - base expérimentale» But : Les étapes de la réponse immunitaire sont les mêmes que celles vues en partie I, mais cette fois, on veut visualiser la derniètre étape : la lyse cellulaire. La technique employée sera donc différente. Il s’agit d’une variante de l’expérience de Zinkernagel. Objectif : L’élève doit s’interroger sur la structure du récepteur T. Résumé du contenu : schémas page 33 et 35 du livret Étapes expérimentales du test de cytotoxicité Résultats du test de cytotoxicité ± virus 51 Cr * A B 50 % de Chrome libéré 40 30 20 LTc Cellules cibles 1 2 3 4 A B C 5 6 7 8 9 10 11 12 C 10 0 Cellules cibles D E F B44 + virus B44 A2 + virus G H Mélange / Incubation / Mesures © Grandmougin & Cornuet © Grandmougin & Cornuet © L. Grandmougin Créteil Fiche professeur TP 3 page 1/2 • Un individu atteint d’une maladie virale fournit les lymphocytes T cytotoxiques. Les cellules cibles proviennent d’une culture de cellules manipulées génétiquement : pour simplifier l’étude, elles n’expriment qu’un type de molécules HLA à leur surface (et non 12 au maximum). Cetype de molécule est commun ou étranger à ceux du donneur de LT. La molécule représentera le SOI ou pas. • Ces cellules sont ensuite infectées ou non par le même virus. Pour visualiser leur lyse, on les incube avec du 51 Chrome qui entre dans les cellule et n’est libéré que si celle-ci est lysée. C’sst le taux de 51 Cr qui permet de mesurer précisément l’intensité de la réponse. Exploitation : voir le document élève «TP3 élèves» . Questions : Question 1 : Résumez les étapes de la manipulation et précisez l’intérêt de chacune. Réponse attendue : étape A : prélèvement des lymphocytes cytotoxiques chez un individu infecté de phénotype [A1A3, B18B44]. Ce sont les «cellules réactives» qui vont lyser les cellules cibles. NB : ce sont des lymphocytes pris dans le sang, donc «re-circulants», ayant été sélectionnés dans les organes lymphoïdes secondaires. Toutes les étapes de la réponse immunitaire ont déjà lieu in-vivo, dont la phase d’amplifica tion, ce qui explique leur nombre plus important que celui des autres LT. étape B : préparation des cellules cibles : 1. manipulation génétique pour ne leur faire exprimer qu’un seul type de molécule HLA 2. infection ou non par le même virus que celui «vu» par les LTc : on veut savoir ce qu’ils reconnaissent précisément. 3. Incubation avec le 51 Chrome puis lavage du milieu : toute trace de radioactivité ne doit pro venir que de cellules lysées. étape C : mélange des populations de cellules, incubation, puis mesure du relargage de 51 Cr, témoin indirect de la cytotoxicité. Question 2 : Faites un tableau des mélanges effectués. Qels résultats prévoyez-vous? Réponse attendue : On mélange des LTc [A1A3, B18B44] avec des cellules [B44] ± le virus, ou des cellules [A2] + virus. On peut aussi envisager des expériences complémentaires. Question 3 : Interprétez les résultats et comparez-les avec vos prévisions ci-dessus. Réponse attendue : Le taux de 51 Cr n’est important que dans le premier milieu : il n’y a lyse que des cellules portant à la fois le HLA du donneur et le virus. Toute autre combinaison ne donne lieu à aucune lyse, donc n’est pas reconnue par les LTc : ceux-ci sont spécifiques. [B44] + virus constitue du SOI MODIFIÉ. [A2] aussi, mais n’a pas été «vu» par ces lymphocytes : ils n’ont donc qu’un seul type de récepteur. Question 4 : Schématisez votre réponse à l’échelle moléculaire. Réponse attendue : LT LT signal RT peptide du SOI membrane Reconnaissance = signal interne = lyse lyse peptide viral HLA du SOI B44 LT HLA du SOI B44 peptide viral HLA A 2 SOI SOI + Ag molécule du CMH B44 présentant un peptide du SOI molécule du CMH B44 présentant un peptide du NON-SOI Les LT réalisent une double reconnaissance. Pas de reconnaissance = pas de signal interne = pas de lyse. molécule du CMH A2 présentant le peptide viral Les LT ne possèdent qu'un seul type de récepteur (il faut une autre réaction et un autre LT pour reconnaître l'association ci-dessus). © Grandmougin & Cornuet BILAN : on peut récapituler avec les élèves les étapes de la réponse immunitaire à médiation cellulaire vue au TP2, mais avec les précisions moléculaires qui manquaient. © L. Grandmougin Créteil Fiche professeur TP 3 page 2/2