Liste des abréviations

Université de François Rabelais TOURS
Ecole doctorale : Santé, Sciences et Technologie
Année Universitaire : 2000-2001
Pour l'obtention du Grade de Docteur de l'Université de Tours
discipline du doctorat: Science de la vie et de la santé
Option : Virologie Moléculaire
par
Fabien Dorange
Expression et caractérisation de quatre protéines du virus de la maladie de Marek homologues
aux protéines majeures de tégument VP22, VP16, VP13/14 et VP11/12 du virus HSV-1.
Présentée et soutenue le
19 décembre 2001
M.J.F. Vautherot
Jury :
Examinateur
M. P.Coursaget
Rapporteur
M. A. Epstein
Examinateur
M. A. Jestin
Rapporteur
M. E. Thiry
Président
M.P. Roingeard
Directeur de thèse M. J.F. Vautherot
Liste des abréviations
aa :
acide aminé
ADN
Acide désoxyribonucléique
ARNm
Acide ribonucléique messager
AcMo
Anticorps monoclonal
Bluo-Gal
halogenated indolyl-β-D-galactoside
CAPS
3-cyclohexyl-amino-1-propane-sulfonic acid
CESC
Chicken Embryo Skin Cell
CEF
Chicken Embryo Fibroblast
Da, kDa
Dalton, kiloDalton
DNTP
2’-désoxynucléotide 5’-triphosphate
°C
degré Celsius
EDTA
Acide Ethylène Diamine Tétracétique
E.coli
Escherichia coli
HEPES
Acide N-2-hydroxyéthylpipérazine-N’-2-éthane sulfonique
HSV-1
Herpes Simplex Virus type 1
HVT
Herpes Simplex of Turkey
IF(I)
Immunofluorescence (indirecte)
ORF
“Open Reading Frame” cadre ouvert de lecture
MTT
3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide
MDV
Marek’s Disease Virus
m.o.i
multiplicité d’infection
NBT/BCIP
Nitro Blue Tetrazolium/5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl Phosphate
Kb
kilobase
PBS
Phosphate Buffer Saline
PCR
Polymerase Chain Reaction
SDS
Sodium Dodécyl Sulfate
u.f.p
unité formant page
SAB
Sérum albumine bovine
SP
Sérum de poulet
SVF
sérum fœtal de veau
1
PARTIE BIBLIOGRAPHIQUE
1.1 LES HERPESVIRIDAE
La famille des herpesviridae est composée de virus enveloppés à ADN bicaténaire de 120 à 235
kpb présents dans la majorité des espèces animales (mammifères, reptiles, oiseaux, poissons,
amphibiens et mollusques) (Roizman et Sears, 1996). Bien qu’ayant intégré dans leur génome
des gènes codant pour des protéines impliquées dans le métabolisme des acides nucléiques
(thymidine kinase, dUTPase, etc), dans la synthèse de l’ADN (DNA polymérase, hélicase,
primase) et dans la modification des protéines (protéine kinase), les herpèsvirus sont dépendants
de la machinerie de transcription de l’hôte (ARN polymérase) ainsi que des enzymes impliquées
dans la réparation de l’ADN. La réplication de l’ADN viral s’effectue donc dans le noyau des
cellules infectées. Les herpèsvirus vont également contrôler la traduction, en détournant la
machinerie de traduction de l’hôte au profit de la synthèse des protéines virales, en réprimant
l’expression des gènes cellulaires et en inhibant la synthèse protéique cellulaire.
L’accomplissement de leur cycle de réplication se traduit par la libération de particules virales
infectieuses et par la lyse de la cellule infectée. Les herpèsvirus peuvent également entrer en
latence dans la cellule infectée en n’exprimant qu’un nombre restreint de gènes (Roizman et
Sears, 1996).
1.1.1 Structure des virions.
Les herpèsvirus forment un groupe relativement homogène en terme de structure. Le core
contenant l’ADN viral est inclus dans une capside icosahédrique d’une taille variable 100 à 110
nm de diamètre entourée d’un tégument et d’une enveloppe dans laquelle sont ancrées les
glycoprotéines virales (Fig. 1) (Roizman et Sears, 1996). La taille variable des virions (120 à 300
nm) pourrait être due à l’épaisseur du tégument qui diffère entre chaque virus (Granzow et al.,
2001).
Figure
1:
Structure
de
l’herpèsvirus
Figure 1: Structure de
l’herpèsvirus
simplex 1
simplex 1 (HSV-1)
en microscopie
(HSV-1) en microscopie
électrique
en coloration
électrique en coloration
négative
(De Hans
tégument
négative (De Hans Ackerman;
adresse
:
Ackerman;
adresse internet
internet
:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/
ICTVdb/Images/Ackerman/Anima
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ICTVdb/Ima
lvi/Herpesvi/025-01.htm).
capside
enveloppe
100 nm
ges/Ackerman/Animalvi/Herpesvi/025-01.htm).
fig1
1.1.1.1 Le core
Le core d’un virus contient l’ADN viral double brin sous la forme d’un tore à l’intérieur de la
capside. L’ADN viral, linéaire à l’intérieur de la capside, se circularise immédiatement dès son
entrée dans le noyau après sa sortie de la capside (Garber et al., 1993). La taille des ADN viraux
varie de 120 kb (varicella-zoster virus (VZV) à 235 kb (mouse cytomegalovirus, human
herpesvirus 8 (HHV8) et cytomegalovirus (CMV)). La structure des génomes varie
essentiellement en raison de la distribution de séquences répétées, ce qui permet de distinguer six
groupes de A à F (Fig. 2).
Figure 2 : Organisation génomique des herpèsvirus des groupes A à F (Roizman et Sears, 1996).
Les lignes horizontales représentent les régions uniques. Les domaines répétés sont figurés par
des rectangles et sont ainsi désignés : domaine répété gauche ou droit (LTR et RTR) pour le
groupe A, domaines répétés internes R1 à R4 pour le groupe C et domaines répétés internes et
terminaux (IR et TR) pour le groupe D. Les séquences terminales du groupe B sont composées
de séquences réitérées présentes en nombre variable à chaque extrémité du génome. Le nombre
de ces séquences réitérées peut varier entre les deux extrémités. Le groupe E est composé d’une
séquence unique longue (UL) et d’une séquence unique courte (US) délimitées par des séquences
répétées internes et externes (TRL, TRS, IRL et IRS). Aucune répétition terminale n’a été décrite
pour le sous-groupe F.
fig2
L’action de détergent non ionique (NP-40) seul ou en conjonction avec des solutions de force
ionique élevée a permis de différencier chaque élément structural (enveloppe, tégument et
capside), de les purifier et d’en déterminer la composition protéique (Spear et Roizman, 1972)
(Lemaster et Roizman, 1980) (McLauchlan et Rixon, 1992). Le détergent non-ionique NP-40
seul permet de séparer les glycoprotéines de l’ensemble tégument-capside ; l’augmentation de la
molarité en NaCl permet la séparation des protéines de tégument de la capside (Fig. 3). Des
études plus récentes portant sur la séparation des différents éléments mettent en évidence des
interactions résistantes aux forces ioniques entre certaines protéines de tégument et la capside
(Ojala et al., 2000).
Figure 3: Etude microscopique de particule virale de l’herpèsvirus équin 1 EHV1. a) virions
possédant une membrane virale intacte ou perméable à la coloration négative. B) particules
constituées du tégument et de la capside ou de la capside seulement C) Constituants
tégumentaires partiellement accrochés à la capside (De Steven K. Vernon ; adresse internet :
http://www.virology.net/Big_Virology/Special/EHV1/EHVpage.html).
fig3
A)
B)
C)
1.1.1.2 La capside
La capside possède un diamètre d’environ 100 nm. Elle possède une structure icosahédrique (20
faces), et est constituée de 162 capsomères composés de 150 hexons et de 12 pentons (Fig. 4).
Figure 4 : Capside A d’HSV-1 reconstituée à partir de micrographie électronique de capsides A
enrobées dans de l’eau vitreuse (Du dr.Z.Hong.Zhou; adresse internet :
http://hub.med.uth.tmc.edu/~hong/hsv1a/hsv-1A-capsid.gif)
(Zhou et al., 1999).
fig4
1.1.1.3 Le tégument
Le tégument, structure comprise entre la capside et l’enveloppe, est une des caractéristiques des
herpèsvirus. Les premières études réalisées en microscopie électronique sur des particules virales
purifiées décrivaient une structure asymétrique et amorphe en coloration négative. Cependant,
les contraintes physiques de cette technique sur des virions non fixés semblent induire une
déformation de la structure tégumentaire et un étirement de l’enveloppe virale. Les études
récentes de cryomicrospie électronique montrent au contraire une structure tégumentaire mieux
ordonnée (Fig. 3) (Zhou et al., 1999). Au cours de la maturation virale, le tégument apparaît
comme une structure dont les variations de composition sont en relation avec le passage du virus
dans des différents compartiments de la cellule (Granzow et al., 2001). La structure du tégument
peut également varier considérablement d’un herpèsvirus à l’autre (Granzow et al., 2001).
1.1.1.4 L’enveloppe
L’enveloppe est composée de membranes cytoplasmiques altérées dans lesquelles sont ancrées
les glycoprotéines virales (Fig. 3A).
1.1.2 Classification
La classification des herpèsvirus a été réalisée en fonction de leurs propriétés biologiques et a
permis de distinguer trois grandes sous familles : les alphaherpesvinae, les betaherpesvirinae et
les gammaherpesvirinae.
Les alphaherpèsvirus possèdent un large spectre d’hôtes, ont un cycle de multiplication très
court, diffusent très rapidement en culture, lysent efficacement les cellules infectées et ont la
capacité d’établir des infections latentes dans les neurones des ganglions sensoriels (HSV1,
HSV2, VZV, EHV1, virus de la pseudorage (PrV)).
Les betaherpèsvirus ont une infection restreinte à certains types cellulaires, infection qui
progresse très lentement en culture. Ces virus (cytomégalovirus) peuvent être latent dans un
grand nombre de cellules (glandes sécrétrices, reins, et autres tissus).
Les gammaherpèsvirus se répliquent tous in vitro dans les cellules lymphoblastiques, et certains
d’entre eux sont à l’origine d’une infection lytique dans des cellules de type épithélial et
fibroblastique. Ces virus infectent spécifiquement les lymphocytes B et T et peuvent être soit à
l’état latent soit en phase lytique.
La classification actuelle prend en compte les données de nouvelles séquences nucléotidiques et
les études de phylogénie (McGeoch et al., 2000) ont permis de reclasser certains herpèsvirus en
fonction de leur structure génomique et des homologies de séquence avec les virus prototypes de
chaque famille. Cependant, pour ces virus la définition des sous-familles n’est plus adaptée.
C’est le cas du virus de la maladie de Marek qui possèdent des propriétés biologiques propres
aux gammaherpèsvirus, mais qui a été reclassé dans les alphaherpèsvirus en raison de sa
structure génomique et des homologies de séquence avec les autres alphaherpèsvirus
(Buckmaster et al., 1988). En effet, le MDV qui infecte spécifiquement les lymphocytes, possède
une structure génomique de groupe E et les gènes de structure du MDV (capside, tégument et
glycoprotéine) présentent une plus forte homologie avec ceux des alphaherpèsvirus (HSV-1,
VZV, EHV-1 et EHV-4).
L’alphaherpèsvirus modèle de groupe E, HSV-1, nous a donc servi de base pour mener notre
étude sur la partie tégumentaire du MDV.
Après une description de la structure virale, nous décrirons la réplication du virus HSV-1 avec
un intérêt particulier pour le rôle des protéines de tégument dans la constitution de la particule
virale, dans les modulations qu’elles exercent sur la réplication virale, de l’entrée du virion dans
la cellule hôte jusqu’à la libération de particules nouvellement synthétisées.
Dans un second temps, nous décrirons la maladie de Marek, puis analyserons le génome du
MDV, en décrivant les gènes potentiellement oncogéniques et les gènes homologues au
alphaherpèsvirus codant pour les protéines structurales (protéines de capside, de tégument et
glycoprotéines).
1.2 VIRUS HSV-1 : STRUCTURE, REPLICATION ET RÔLE DES
PROTÉINES DE TÉGUMENT.
1.2.1 Structure virale
La particule virale est composée de quatre structures différentes : la capside renfermant le core,
le tégument qui assure la liaison entre les protéines de capside et les glycoprotéines virales
ancrées dans l’enveloppe extérieure. La particule virale contient au moins 30 protéines (Roizman
et Sears, 1996).
1.2.1.1 La capside
Lors d’une infection virale, trois types de capsides peuvent être visualisés en microscopie
électronique et séparés par ultracentrifugation en gradient de densité en saccharose (Gibson et
Roizman, 1972 , Perdue et al., 1976). La capside de type A qui ne contient pas d’ADN viral, la
capside de type B contenant les protéines d’échafaudage, et la capside de type C contenant
l’ADN. Ces capsides diffèrent dans leur constitution protéique. La capside de type A contient 4
protéines différentes : VP5 (protéine majeure de capside), VP19C et VP23 qui forment les
triplexes (VP19C + 2VP23), et VP26 codées respectivement par UL19, UL38, UL18 et UL35
(Booy et al., 1994 , McNabb et Courtney, 1992b, Newcomb et al., 1993 , Schrag et al., 1989 ).
La capside de type B, précurseur des capsides de type A et C, contient 3 protéines
supplémentaires, les protéines d’échafaudage : VP21, VP22a et VP24 codées respectivement par
les gènes UL26 (extrémité 3’), UL26.5, UL26 (extrémité 5’) (Fig. 5) (Newcomb et al., 1993). La
protéase virale codée par le gène UL26 s’autodigère pour donner naissance à deux protéines : la
protéine VP24 porteuse du site actif et la protéine VP21 (Fig. 5) (Deckman et al., 1992, Preston
et al., 1992). Cette dernière est ensuite clivée dans sa partie C-terminale perdant ainsi 25 aa (Liu
et Roizman, 1993). L’extrémité 3’ des gènes UL26 et UL26.5 étant communes dans le génome
viral, la protéine VP22a est également clivée par la protéase VP24, ce qui donne naissance à la
protéine VP22c dépourvue des 25 aa C-terminaux de VP22a (Fig. 5), présente dans les capsides
virales de type C (Liu et Roizman, 1993).
Figure 5 : clivage (C) et maturation des protéines d’échafaudage
fig5
L’assemblage de la capside qui a lieu dans le noyau sera étudié plus tard au cours de la
réplication virale.
1.2.1.2 Le tégument
Le tégument est composé d’au moins 15 polypeptides qui assurent la liaison entre les protéines
de capside et les glycoprotéines de l’enveloppe (Heine et al., 1974 , Trus et al., 1999 , Wang et
al., 2001, Zhou et al., 1999 ). Cinq protéines majeures de tégument ont été identifiées : VP22,
VP16 ou α-trans-inducing factor (α-TIF), VP13/14, VP11/12 et VP1/2 codées respectivement
par les gènes UL49, UL48, UL47, UL46 et UL36 (Campbell et al., 1984 , Elliott et Meredith,
1992, Honess et Roizman, 1974 , McLean et al., 1990 , McNabb et Courtney, 1992a , Spear et
Roizman, 1972 ). Il paraît important de noter qu’un groupe de gènes colinéaires (UL49 à UL46)
code pour des protéines de même localisation dans le virion. La protéine VP22 s’associe avec la
protéine VP16 pour former le corps tégumentaire (Elliott et al., 1995). La protéine VP16 se lie au
cours du cycle viral à d’autres protéines de tégument moins représentées dans le tégument mais
jouant un rôle majeur dans la réplication virale comme la protéine VHS (virion host-shut off)
(Smibert et al., 1994). La protéine kinase UL13 (UL13), les protéines UL11 (UL11) UL37
(UL37) et US11 (US11) font également partie du tégument (Daikoku et al., 1997 , MacLean et
al., 1989 , MacLean et al., 1987 , Roller et Roizman, 1992, Schmitz et al., 1995 ). D’autres
protéines présentes de façon mineure dans le tégument peuvent être également incorporées au
cours de l’infection virale (ICP4, ICP0) (Yao et Courtney, 1989, Yao et Courtney, 1992).
1.2.1.3 Les glycoprotéines.
Les glycoprotéines ont fait l’objet d’intenses recherches du fait de leur position stratégique à la
surface du virion. Sans vouloir faire une analyse exhaustive, nous avons voulu résumer les
résultats les plus récents en les traitant sous forme synthétique.
Les glycoprotéines sont au nombre de 12 dont 10 sont des glycoprotéines de surface. Ces
glycoprotéines sont impliquées à la fois dans l’attachement du virion sur la cellule hôte, sa
pénétration dans la cellule infectée et dans sa diffusion de cellule à cellule. Au cours de leur
maturation dans les vésicules golgiennes, la partie cytoplasmique de ces glycoprotéines interagit
spécifiquement avec les protéines de tégument permettant le second enveloppement du virion
(Wang et al., 2001) (cf infra). Les glycoprotéines gC (UL44), gE (US8), gG (US4), gI (US7) et
gM (UL10) ne sont pas essentielles à l’entrée et à la sortie du virion HSV-1 (Roizman et Sears,
1996), mais jouent un rôle important dans l’attachement (gC) et dans la diffusion de cellule à
cellule du virion (gE-gI). Les autres glycoprotéines, gB (UL27), gD (US6), gH (UL22) et gL
(UL1), essentielles à la réplication virale, sont impliquées principalement dans la pénétration du
virus et dans la fusion des membranes virales et cellulaires (Spear, 1993) (Roizman et Sears,
1996). La glycoprotéine gK (UL53) serait impliquée dans la sortie du virus (Jayachandra et al.,
1997).
Pour le moment, la glycoprotéine gJ (US5) n’a pas été détectée dans les virions. La
glycoprotéine gN (UL49,5) est une protéine associée aux membranes dans les cellules infectées.
1.2.2 Fixation, pénétration et transport des capsides vers le noyau.
1.2.2.1 Rôle des glycoprotéines.
L’entrée du virion dans la cellule est dépendante de la spécificité des glycoprotéines vis-à-vis des
récepteurs présents à la surface cellulaire. Les virus herpès simplex 1 et 2 peuvent infecter un
grand nombre de cellules, et ceci suggère que ces cellules possèdent des récepteurs communs et
des mécanismes similaires impliqués dans l’entrée virale. L’entrée du virus HSV-1 dans la
cellule hôte requiert la fusion des membranes cellulaires avec l’enveloppe virale (Spear, 1993).
Cinq glycoprotéines participent à l’entrée du virus: les glycoprotéines gB, gC, gD, gH et gL (Fig.
6) (Spear, 1993). La première étape, qui est celle de l’attachement, dépend de la liaison entre la
glycoprotéine gC et les héparanes sulfates présents sur la surface membranaire (WuDunn et
Spear, 1989). Un virus délété du gène gC (gC-) peut encore se lier aux cellules et être infectieux,
mais son niveau d’attachement est inefficace comparé au virus sauvage (1%) (Herold et al.,
1991). Ce faible attachement est dû à la glycoprotéine gB qui possède également une activité de
liaison à l’héparine (Herold et al., 1994). Un traitement enzymatique éliminant les héparanes
sulfates de la surface cellulaire diminue significativement l’efficacité d’infection (WuDunn et
Spear, 1989). La liaison entre la glycoprotéine gD avec un récepteur de la famille TNF (tumor
necrosis factor), HVEM ou HveA (HSV-1 entry mediator A) est également nécessaire et
renforcerait l’attachement du virion sur la membrane cellulaire (Montgomery et al., 1996 ,
Warner et al., 1998). La glycoprotéine gD se lie également à deux autres récepteurs appartenant à
la superfamille des immunoglobulines. Ces récepteurs, présents au niveau des jonctions
adhérentes des cellules épithéliales, ont été nommés HveB et HveC ou nectin2 et nectin1,
respectivement (Takahashi et al., 1999). L’incubation de formes solubles de la gD ou le
traitement du virus par des anticorps neutralisants dirigés contre cette protéine n’affectent pas
l’adsorption du virus à la surface de la cellule mais empêchent sa pénétration (Fuller et Lee,
1992). La glycoprotéine gD est donc impliquée dans l’attachement à la cellule, mais plus
particulièrement dans la fusion des membranes cellulaires et virales.
Figure 6: Rôle des protéines de tégument et des glycoprotéines virales dans le cycle viral. Les
capsides C et A sont représentées sous forme hexagonale noire et blanche, respectivement. Le
tégument apparaît grisé. HS : héparanes sulfates
fig6
Les glycoprotéines gB, gD, et gH sont essentielles à la fusion et à la pénétration du virion dans la
cellule (Cai et al., 1988 , Forrester et al., 1992, Ligas et Johnson, 1988 ). En présence de
polyéthylène glycol, activateur de la fusion membranaire, les virus délétés de ces gènes sont
capables d’initier l’infection (Cai et al., 1988, Forrester et al., 1992, Ligas et Johnson, 1988 ). Un
virus gB- forme difficilement des plages et l’utilisation d’anticorps neutralisants anti-gB
empêche l’entrée des virus (Navarro et al., 1992). Les glycoprotéines gH et gL forment un
hétérodimère nécessaire pour la maturation de chaque protéine (Hutchinson et al., 1992a). La
glycoprotéine gL est également impliquée dans la pénétration virale, et un virus gL- perd sa
capacité à pénétrer les cellules (Roop et al., 1993). Par ailleurs, l’expression transitoire des
quatre glycoprotéines gB, gD, gH et gL induit la fusion cellulaire qui est une étape essentielle
dans la diffusion virale (Browne et al., 2001 , Turner et al., 1998). Le rôle de ses quatre
glycoprotéines dans la diffusion du virus de cellule à cellule sera discuté plus loin. L’ensemble
de ces interactions basées sur la fusion des membranes cellulaires et virales puis à l’entrée de
l’ensemble tégument-capside, est le modèle généralement admis.
Un autre modèle a été proposé qui quant à lui est basé sur l’invagination et la perforation de la
membrane plasmique (Wild et al., 1998). La particule virale au contact de la membrane
plasmique et du cytoplasme resterait enveloppée avant de libérer la capside dans la cellule.
1.2.2.2 Rôle du tégument
Le rôle des protéines du tégument dans le cycle viral commence après la fusion des membranes
cellulaires et virales (Fig. 6) (Morrison et al., 1998). Certaines protéines de tégument restent
associées aux membranes cellulaires, alors que d’autres toujours présentes sur la particule virale
sont au contact des protéines cellulaires cytoplasmiques (Batterson et Roizman, 1983, Lycke et
al., 1988, Sodeik et al., 1997, Zhou et al., 1999). Les modalités de la dissociation restent à
préciser mais il semble que la phosphorylation des quatre protéines majeures de tégument puisse
intervenir dans leur dissociation de la capside et que celà corresponde à leur activation. Ces
protéines sont phosphorylées par des protéines kinases virales et/ou cellulaires (Morrison et al.,
1998). Cette phosphorylation favorise leur dissociation de la capside et correspond à une
activation de leur fonction modulatrice du cycle viral et cellulaire. Ainsi, les quatre protéines
majeures de tégument, VP22, VP16, VP13/14 et VP1/2 ont été étudiées. La protéine VP22 peut
être phosphorylée par la protéine kinase virale UL13, mais aussi par les kinases cellulaires casein
kinase II (CKII) et protéine kinase C (PKC). Deux sites potentiels de phosphorylation de la
protéine VP22 ont été déterminés dans la partie N-terminale (71SSS73) et C-terminale (292SAS294)
(Elliott et al., 1999). Les protéines VP16 et VP13/14 peuvent être phosphorylées par les kinases
cellulaires PKA et CKII, PKC, PKA respectivement (Morrison et al., 1998). Par opposition la
protéine VP1/2, qui serait liée aux pentons de la capside, n’est pas dissociée de la capside bien
qu’elle puisse être phophorylée par la CKII (Morrison et al., 1998).
La capside virale est ensuite transportée à travers le cytoplasme jusqu’au noyau où elle se lie
avec le complexe du pore nucléaire (NPC), et l’ADN viral serait alors injecté dans le
nucléoplasme au niveau des pentons (Sodeik et al., 1997, Whittaker et Helenius, 1998). Le
transport de la capside de la membrane plasmique au pore nucléaire se réalise en 1 heure grâce à
la présence du cytosquelette cellulaire et plus particulièrement le réseau de microtubules (Fig. 6)
(Sodeik et al., 1997). Le transport de la capside est réalisé par une interaction entre la dynéine,
protéine motrice des microtubules, et les pentons (Sodeik et al., 1997). La protéine VP1/2 qui
interagit avec les pentons de la capside, semble donc jouer un rôle important dans le transport de
la capside, mais également dans la libération de l’ADN (Sodeik et al., 1997, Zhou et al., 1999).
En effet, la protéine VP1/2 est supposée interagir avec l’importine β au niveau du NPC (Zhou et
al., 1999). Cette interaction ou la phosphorylation de VP1/2 induirait un changement de
conformation des pentons du virion permettant l’expulsion de l’ADN de la capside (Ojala et al.,
2000). Ainsi, un virus n’exprimant pas VP1/2 est défectueux dans la libération de l’ADN dans le
noyau cellulaire (Batterson et Roizman, 1983).
L’ADN est ensuite rapidement et efficacement éjecté de la capside dans le noyau et se localise
près des domaines nucléaires ND10 en les perturbant (Maul et al., 1996).
1.2.3 La régulation de l’expression des gènes.
Les gènes viraux sont divisés en trois classes distinctes, α, β et γ, en fonction de leur expression
au cours de l’infection virale (Honess et Roizman, 1975). Les gènes α sont les premiers gènes a
être exprimés au cours de l’infection et sont nommés gènes très précoces ou IE (immediate
early), viennent ensuite les gènes β (E=early), et enfin les gènes tardifs γ (L=late). Parmi les six
gènes α (Carter et Roizman, 1996, Roizman et Sears, 1996), quatre codent pour des protéines
nucléaires transactivatrices qui agissent au niveau transcriptionnel ou post-transcriptionnel pour
activer l’expression des gènes β et γ. Les gènes β?qui ne sont exprimés qu’en présence de gènes
α, sont exprimés 5 à 7 heures après l’infection. Ces gènes, au nombre de sept, codent pour des
protéines impliquées dans la réplication de l’ADN (ADN polymérase, thymidine kinase, ...). Les
gènes α et certains gènes β vont ensuite activer la transcription des gènes tardifs codant
essentiellement pour des protéines structurales. Cette régulation en cascade de l’expression des
gènes viraux est hautement régulée. L’inhibition des synthèses des protéines α et β au cours de
l’infection est également observée et serait due à l’autorégulation des gènes α et à l’expression
des gènes γ (Roizman et Sears, 1996).
1.2.3.1 Rôle de la protéine de tégument VP16.
L’initiation de la réplication virale est sous la dépendance des gènes α qui sont transactivés par
la protéine de tégument VP16. La protéine VP16, apportée par le virion, s’associe avec la
protéine HCF qui la relocalise dans le noyau de la cellule nouvellement infectée où VP16 va
participer à l’initiation de la réplication virale (Campbell et al., 1984 , LaBoissiere et O'Hare,
2000, Mackem et Roizman, 1982 ). En effet, une fois l’ADN viral circularisé dans le noyau
(Garber et al., 1993), la protéine de tégument VP16 transactive les six gènes α (Fig. 7)
(Campbell et al., 1984). D’un point de vue fonctionnel, la protéine est divisée en deux parties,
une partie N-terminale impliquée dans l’attachement à l’ADN et une partie C-terminale acide
transactivatrice. La partie N-terminale se lie à des facteurs cellulaires, Oct-1 et HCF, puis ce
complexe protéique se fixe sur une séquence consensus (TAATGARAT où R est une base
purique) située en amont de chaque gène α (Preston et al., 1988). Cette fixation est en partie due
au facteur de transcription Oct-1 qui possède une activité de liaison à l’ADN localisée dans son
domaine POU (Kristie et Sharp, 1993).
La partie C-terminale de VP16 transactive ensuite les gènes situés en aval et à proximité de cette
séquence (Hagmann et al., 1997). Ce domaine d’activation a été particulièrement bien étudié
dans le cas de protéines de fusion ayant des domaines de fixation à l’ADN. En effet, la fusion du
domaine de liaison à l’ADN de l’activateur GAL4 avec le domaine transactivateur de VP16
permet la création d’un activateur transcriptionnel fort (Sadowski et al., 1988). VP16 agirait en
augmentant le taux d’assemblage du complexe de préinitiation de la transcription (Lin et Green,
1991), en interagissant avec des facteurs généraux de la transcription, comme TFIIB (Lin et al.,
1991), TFIIA (Kobayashi et al., 1995), la TBP et TAFII40 (composants de TFIID) (Klemm et
al., 1995). VP16 pourrait également favoriser le recrutement de l’ARN pol II au complexe de
préinitiation (Hengartner et al., 1995). L’activation de VP16 au sein du complexe HCF et Oct-1
nécessite la présence d’une boîte TATA à proximité de la séquence TAATGARAT (Fig. 7). Ce
mécanisme de transactivation permettrait au virus de ne transactiver spécifiquement que les
gènes α (Hagmann et al., 1997).
Figure 7 : La transactivation par VP16. Le domaine C-terminal de VP16, représenté en gris,
changerait de conformation en présence des facteurs de transcription, permettant ainsi la
transactivation des gènes situés en aval du promoteur (Hagmann et al., 1997).
fig7
Ainsi, une lignée de cellules Vero exprimant de manière constitutive la protéine VP16 augmente
de façon significative le nombre de foyers infectieux lorsque l’ADN viral est transfecté dans ces
cellules (Werstuck et al., 1990).
Un virus muté dans le gène UL48 codant pour une protéine VP16 délétée de la partie Cterminale transactivatrice montre une expression réduite des gènes IE et ceci a pour effet
d’induire une augmentation de la multiplicité d’infection pour donner naissance à une u.f.p. (Ace
et al., 1989). Ce virus peut cependant être propagé en culture cellulaire, à une haute multiplicité
d’infection, ce qui suggère que la fonction transactivatrice de VP16 n’est pas essentielle à la
réplication virale. Un autre virus muté délété du cadre de lecture entier montre un défaut dans la
maturation de la particule virale et ne peut être propagé en culture cellulaire (Weinheimer et al.,
1992). Ce virus ne produit pas de virions enveloppés extracellulaires et montre une réduction
dans l’efficacité d’encapsider l’ADN viral de 50 à 75% par rapport au virus sauvage. La synthèse
protéique virale est également diminuée à des stades d’infections intermédiaires et tardifs dans
des cellules infectées par ce virus délété du gène UL48.
L’étude de ces deux virus montre que l’activité transactivatrice de VP16 favorise l’entrée en
cycle lytique d’un virus infectieux dans une cellule permissive mais également que VP16 joue un
rôle essentiel dans la maturation de la particule virale ainsi que dans la synthèse des protéines
virales (cf infra).
Les protéines de tégument VP11/12 et VP13/14 ont été décrites comme modulateur de l’activité
transactivatrice de VP16 (Zhang et McKnight, 1993, Zhang et al., 1991) et la protéine VP22, qui
se fixe sur la partie transactivatrice de VP16, pourrait également moduler son activité (Elliott et
al., 1995). Des résultats récents indiquent que la protéine VP13/14 pourrait également
transactiver l’expression des gènes viraux en absence de VP16 (Donnelly et Elliott, 2001c).
1.2.3.2 Les gènes α
Les premiers ARNm viraux apparaissant dans le cytoplasme de la cellule infectée vont coder
pour les 6 protéines α : ICP0 (infected cell protein 0), ICP4, ICP22 (US1), le produit du gène
US1.5, ICP27 et ICP47. ICP0, qui peut être incorporée dans le tégument, est une protéine non
essentielle à la réplication virale, bien qu’un virus délété de ce gène ne se réplique que très
faiblement. Par contre, la délétion de ICP0 dans le virus mutant ? VP16 décrit précédemment
(VP16 délétée de sa partie transactivatrice) est létal. Ceci suggère que la réduction de la
transactivation liée à la délétion de la partie C-terminale de VP16 est en partie suppléée par la
protéine ICP0 (Mossman et Smiley, 1999). ICP0 augmente le niveau de transcription des gènes
viraux et joue un rôle dans la mise en place d’un environnement favorisant la réplication virale
(Jordan et Schaffer, 1997) (cf infra). La protéine ICP4 est une protéine essentielle à la réplication
virale en tant que transactivateur des gènes β et γ (DeLuca et al., 1985 , Godowski et Knipe,
1986 , Preston, 1979). ICP4 augmente le taux de transcription des gènes viraux au cours d’une
infection virale. Sa liaison avec la TBP, TFIIB et TAF250 favorise la formation des complexes
d’initiation de la transcription (Grondin et DeLuca, 2000 , Smith et al., 1993). ICP4 va
également réprimer la synthèse des gènes α et notamment sa propre synthèse en se fixant sur des
séquences consensus présentes sur les gènes α (Leopardi et al., 1995) ?Fig. 8).
Figure 8 : Représentation schématique de la région 5’ non-transcrite du gène codant pour ICP4.
La transcription est initiée au nucléotide -1. Les régions grisées représentent les sites de fixation
des protéines SP1, des protéines ICP4 et VP16 (α-TIF) et des protéines se liant aux boîtes
TATA. La présence de régions riches en nucléotide G et C favorise la formation de structures
secondaires permettant une expression régulée de ICP4. Le symbole * est présent tous les dix
nucléotides (Mackem et Roizman, 1982).
fig8
ICP27 est également essentielle à la réplication de HSV-1 (Sacks et al., 1985). Elle possède une
fonction de régulation des gènes au niveau post-transcriptionnel, en influençant la maturation des
ARNm et leur export du noyau (Sandri-Goldin, 1998). ICP27 présente une séquence RGG de
liaison à l’ARN (Mears et Rice, 1996) et exerce une inhibition des synthèses cellulaires par
blocage de l’épissage des ARNm (McGregor et al., 1996) (cf infra).
Ces protéines vont activer la synthèse des protéines β impliquées dans la réplication de l’ADN,
puis les protéines α et β ainsi que la synthèse de l’ADN viral vont réguler l’expression des gènes
γ qui codent majoritairement pour les protéines structurales du virion (Holland et al., 1980,
Roizman et Sears, 1996 ).
1.2.4 Contrôle de la traduction et déviation du métabolisme cellulaire en faveur de
la synthèse virale.
Les herpèsvirus exercent un contrôle de la traduction au cours du cycle cellulaire qui joue un rôle
important pour la réplication, la latence et l’expression de la virulence.
Le contrôle de la traduction permet au virus de réprimer l’expression des gènes cellulaires, de
controler l’expression des gènes viraux, de maintenir ou de sortir de la latence, et de contourner
la réponse antivirale de l’hôte (Gale et al., 2000).
1.2.4.1 Lutte contre la réponse anti-virale de l’hôte
En réponse à des stimuli externes (infection virale), la cellule peut moduler la synthèse des
protéines en modifiant entre autre la synthèse des facteurs de transcription. La phosphorylation
de eIF2α (facteur d’initiation de la traduction eucaryote) est un des contrôles les mieux connus.
La présence de double brin d’ARN dans la cellule infectée active la protéine kinase R (PKR) qui
phosphoryle eIF2α bloquant ainsi la synthèse protéique cellulaire. La phosphorylation de eIF2α
qui empêche l’échange de eIF2-GDP en eIF2-GTP nécessaire à la formation du complexe
ternaire (eIF2-GTP-Met-tRNA) peut mener à la mort cellulaire limitant ainsi la propagation de
l’infection virale. Le virus HSV-1, comme beaucoup de virus, a évolué pour empêcher cette
phosphorylation de eIF2α en bloquant la fonction PKR. Le produit du gène γ34,5 du virus HSV-
1 se lie à la phosphatase PP1α (holoenzyme protéine phosphatase 1) et ce complexe en
déphosphorylant la sous-unité α de eIF2, la maintiendrait ainsi active (Chou et al., 1995 , He et
al., 1997, Poon et Roizman, 1997). Un virus délété du gène γ34,5 montre un défaut de croissance
et une augmentation de la phosphorylation de PKR et de eIF2α, ainsi qu’une synthèse protéique
diminuée (Chou et al., 1995).
Un virus délété du gène γ34,5 qui présente une seconde mutation lui permettant de se répliquer a
pu être isolé (Mohr et Gluzman, 1996). Ce virus compense la perte du gène γ34,5 en
surexprimant la protéine US11 codée par le gène US11 (Cassady et al., 1998). US11 est une
protéine de tégument qui se localise dans le nucléole des noyaux infectés. L’expression de US11
empêche l’inhibition de la synthèse protéique cellulaire et inhibe l’activation de la PKR (Poppers
et al., 2000). Un domaine riche en proline, présent sur la séquence primaire de US11, fixe l’ARN
et est également responsable de l’inhibition de l’activation de PKR (Roller et al., 1996).
1.2.4.2 Inhibition de la synthèse protéique.
Une des premières évidences de l’inhibition des synthèses des protéines cellulaires vient de
l’analyse des protéines totales des cellules infectées par HSV-1 ou HSV-2 où la synthèse des
protéines de l’hôte et le niveau des ARNm cellulaires diminue d’environ 90% dans les 3 heures
suivant l’infection. Cette inhibition de la synthèse protéique cellulaire permettrait aux protéines
virales d’être présente en quantité supérieure aux protéines cellulaires dans les stades suivant la
pénétration virale (Fenwick et Walker, 1978).
L’inhibition de la synthèse protéique peut-être séparée en deux étapes : la première inhibition
apparaît très rapidement après l’infection de la cellule par HSV-1, en l’absence de nouvelle
synthèse protéique virale, alors que la seconde se met en place plus tard au cours de l’infection et
nécessite l’expression des gènes viraux (Gale et al., 2000).
1.2.4.2.1 La protéine VHS.
Dès l’entrée du virion dans la cellule, au moins une protéine, la protéine de tégument VHS
(virion host shut-off) libérée de la structure tégumentaire, est nécessaire pour la déstabilisation
des ARNm (Kwong et al., 1988).
VHS, codée par le gène UL41, est une endoRNase similaire aux nucléases de la famille fen-1
(Everly et Read, 1997) et possède une homologie limitée à un petit segment de la protéine de
liaison au polyA (PABP) (Read et al., 1993). Cette protéine inhibe la synthèse de protéines
cellulaires, entraîne la désorganisation des polysomes existants et la dégradation des ARNm
(Fig. 6). Cette dégradation d’ARNm cellulaire permet aux premiers ARNm viraux d’être plus
facilement traduits en augmentant la disponibilité de l’appareil de traduction cellulaire. De plus,
VHS dégrade plus rapidement les ARN polyadénylés favorisant ainsi la traduction des premiers
ARNm viraux qui sont majoritairement non polyadénylés. Un virus délété du gène UL41 montre
une réduction de titre en culture cellulaire d’un facteur 10 par rapport au virus sauvage (Read et
Frenkel, 1983).
Cependant, la protéine VHS néosynthétisée au cours de la réplication virale dégrade aussi bien
les ARNm cellulaires et viraux. Son activité serait régulée par son association avec la protéine
VP16 néosynthétisée aux stades tardifs de la réplication virale (Lam et al., 1996). Les aa 238 à
344 de VHS et la partie N-terminale de VP16 (aa 1 à 369) sont nécessaires à cette liaison
(Smibert et al., 1994). L’interaction VP16-VHS paraît conditionner l’intégration de VHS dans le
tégument (une protéine VHS délétée des aa 149 à 344 n’est plus incorporée dans le tégument
(Smibert et al., 1994).
Deux autres protéines virales sont impliquées dans l’inhibition de la synthèse protéique induite
par HSV-1 : UL13 qui est une protéine de tégument ayant une activité kinase et ICP22 (US1)
pourraient jouer un rôle dans cette inhibition en régulant les protéines VHS et VP16 (Ng et al.,
1997, Overton et al., 1994).
1.2.4.2.2 la protéine ICP27
Au stade de la synthèse des protéines virales, ICP27 joue un rôle dans l’inhibition tardive des
synthèses protéiques de l’hôte (Hardwicke et Sandri-Goldin, 1994). ICP27 possède la propriété
de stimuler et de réprimer spécifiquement différents gènes cibles. ICP27 s’associe avec la
machinerie d’épissage, provoquant une réduction de transcrits épissés cellulaires et une
accumulation de pré-ARNm dans le noyau au cours de l’infection (Hardy et Sandri-Goldin,
1994). ICP27 induit également une redistribution des « small nuclear RNPs » et d’autres facteurs
impliqués dans l’épissage (Sandri-Goldin et al., 1995). Les transcrits cellulaires non épissés
restent dans le noyau puis sont dégradés, ce qui aboutit à une baisse des transcrits cellulaires
exportés dans le cytoplasme et donc une synthèse sélective de protéines spécifiquement virales,
la plupart des transcrits viraux n’étant pas épissés (Gale et al., 2000).
VHS et ICP27 favorisent ainsi une transcription sélective des ARNm d’HSV-1.
1.2.4.3 Le contrôle de la traduction
Le contrôle de la traduction peut également s’effectuer sur des protéines en cours de synthèse.
Deux gènes peuvent ainsi réguler l’efficacité de traduction des ARNm. La protéine de tégument
UL13 phosphoryle EF-1δ, facteur nécessaire à l’élongation de la chaîne peptidique pendant la
traduction (Kawaguchi et al., 1998). EF-1δ, intégré dans le complexe EF-1αβδ, est responsable
de la regénération du GTP sur EF-1α?? ’hydrolyse du?GTP en GDP étant impliquée dans le
transport des aa-tRNA aux ribosomes. Cette phosphorylation différentielle de EF-1δ par UL13
permettrait d’augmenter l’efficacité de traduction des ARNm. La protéine ICP0 interagit
également avec EF-1δ, cependant le rôle de cette interaction sur la fonctionnalité de EF-1δ n’a
pas été élucidé (Kawaguchi et al., 1997). La protéine ICP0, qui présente un domaine en doigt de
zinc, est une protéine multifonctionnelle qui intéragit avec un grand nombre de protéines
cellulaires dont la cycline D3 qui est un régulateur du cycle cellulaire (Kawaguchi et al., 1997),
et la protéine HAUSP, une protéase spécifique de l’ubiquitine (Everett et al., 1997). La protéine
ICP0 interagit également les histones déacétylases. Cette interaction empêcherait ainsi la
répression de la synthèse virale par l’inhibition de ces enzymes (Lomonte et al., 2001). Ces
interactions peuvent moduler plusieurs fonctions clés dans la cellule comme la transcription, la
traduction, la régulation du cycle cellulaire, la dégradation de protéines par le protéasome et
confèrent au virus un avantage pour sa réplication.
1.2.5 Réplication de l’ADN, formation des capsides et encapsidation de l’ADN
viral.
1.2.5.1 Réplication virale.
La synthèse de l’ADN viral a lieu dans le noyau sur une période s’étendant de 3 à 12 h p.i.
(Roizman et Sears, 1996).
HSV1 possède trois origines de réplication situées entre les promoteurs des gènes ICP4 et ICP22
et ICP4 et ICP47 pour l’OriS1 et l’OriS2 et une troisième OriL3 située dans le milieu de la
région UL entre les promoteurs de la protéine de liaison à l’ADN ICP8 (UL29) et l’ADN
polymérase (UL30) (Stow et McMonagle, 1983, Weller et al., 1985). Les oriL et oriS peuvent
être délétés indépendamment sans effets sur le rendement viral et l’accumulation d’ADN dans
les cellules infectées (Igarashi et al., 1993).
Les protéines impliquées dans le métabolisme de l’ADN peuvent être divisées en 2 catégories.
Les protéines intervenant dans la synthèse de l’ADN viral et celles impliquées dans le
métabolisme des acides nucléiques (Roizman et Sears, 1996).
Sept protéines participent à la synthèse de l’ADN viral. Trois d’entre elles, codées par les gènes
UL5, UL8 et UL52, sont présentes dans un complexe équimolaire qui fonctionne comme une
primase/hélicase. La protéine ICP8 (UL29) se fixe spécifiquement avec l’ADN polymérase
(UL30) sur les complexes de réplication et interagit spécifiquement sur la protéine codée par le
gène UL9 qui reconnait trois séquences nucléotidiques près des origines de réplication. La
protéine codée par le gène UL42 qui confère la maturation de l’ADN polymérase se lie
également sur la protéine UL9 et l’ensemble de ces interactions permettraient l’initiation de la
réplication de l’ADN (Marsden et al., 1996, Roizman et Sears, 1996 ).
La seconde catégorie de protéines est impliquée dans le métabolisme des acides nucléiques et
comprend une DNAse alcaline, une thymidine kinase, une ribonucléotide reductase, une uracile
DNA glycosylase et une déoxyuridine triphosphate nucleotidohydrolase (dUTPase) (Roizman et
Sears, 1996).
1.2.5.2 L’assemblage de la capside et l’empaquetage de l’ADN viral.
L’assemblage de la capside s’effectue dans le noyau des cellules infectées. Les protéines VP5,
VP19C, VP23 et les protéines d’échafaudage sont essentielles pour l’assemblage d’une capside
intacte (Thomsen et al., 1994). L’adressage aux noyaux des protéines de capside, n’ayant pas de
signaux de localisation nucléaire, s’effectue par leur association avec d’autres protéines de
capside. Les protéines de capside VP5 et VP23 s’associent respectivement avec la protéine
d’échafaudage VP22a et VP19C possédant des signaux de localisation nucléaire (Nicholson et
al., 1994, Rixon et al., 1996, Spencer et al., 1998). Dans le noyau, ces complexes s’associent à
leur tour avec les protéines VP21, VP22a et VP24 pour donner naissance à une capside de type B
(Spencer et al., 1998). La protéine VP24 clive ensuite les 25 aa C-terminaux de VP22a ce qui
permet la dissociation des protéines VP5 et VP22a aboutissant à la sortie des protéines
d’échafaudage et à l’encapsidation simultanée de l’ADN viral dans la capside (type C) (Thomsen
et al., 1995).
Les produits des gènes UL6, UL15, UL17, UL28, UL32, UL33 jouent un rôle essentiel dans les
processus de clivage et d’empaquetage de l’ADN (Sheaffer et al., 2001). La protéine UL17 est
une protéine de tégument indispensable à la multiplication virale (Salmon et al., 1998). Le virus
délété du gène UL17 peut produire des capsides de type A et B mais pas de type C et l’ADN
viral reste sous forme concatémèrique. Ceci suggère que la protéine UL17 est nécessaire au
clivage et à l’empaquetage de l’ADN (Salmon et al., 1998). Des études plus récentes montrent
que UL17 serait impliquée dans la localisation correcte des capsides de type B vers le
compartiment de réplication de l’ADN viral, où se réalise le clivage et l’empaquetage de l’ADN
(Fig. 6) (Taus et al., 1998).
La protéine UL25 est également essentielle à l’empaquetage de l’ADN en jouant un rôle de
rétention de ce dernier à l’intérieur de la capside (McNab et al., 1998). C’est une protéine qui est
associée aux capsides de type A et B en petite quantité mais qui est présente en grande quantité
sur les capsides de type C. C’est une protéine qui lie l’ADN viral et qui semble jouer un rôle plus
tardif dans l’encapsidation en « accrochant » l’ADN viral dans la capside (Sheaffer et al., 2001).
1.2.6 Sortie de la particule virale nouvellement synthétisée
1.2.6.1 Rôle du tégument.
La capside contenant l’ADN viral se fixe sur la membrane nucléaire interne et subit un premier
enveloppement au niveau de la membrane nucléaire interne se retrouvant ainsi enveloppée dans
l’espace périnucléaire (Fig. 6 (8)) (Baines et Roizman, 1992 , Granzow et al., 1997 , Whittaker et
Helenius, 1998). Il est très rare de voir des capsides vides subir ce phénomène, ce qui suggère
que la capside renfermant l’ADN possède une structure différente des capsides de type A et B.
Le changement structural permettrait à la capside de se lier aux protéines de tégument présentes
sur la face interne de la membrane nucléaire (Baines et al., 1995 , Granzow et al., 2001,
Whittaker et Helenius, 1998 ). A ce niveau, des divergences existent quant aux mécanismes de
sortie du virus (Whittaker et Helenius, 1998). Selon le premier modèle évoqué, le virus
nouvellement enveloppé emprunterait, à l’intérieur des vésicules de transport, la voie classique
de sécrétion du réticulum endoplasmique vers le réseau transgolgien via le complexe de Golgi et
atteindrait finalement la membrane plasmique où les particules virales infectieuses sont libérées
par exocytose (Fig. 6 (9’)) (Campadelli-Fiume et al., 1991 , Di Lazzaro et al., 1995). Un autre
modèle,
décrit
plus
récemment,
fait
état
de
l’enveloppement-déenveloppement
et
réenveloppement de la particule virale (Fig. 6 (9)). Après son premier enveloppement au niveau
de la membrane nucléaire interne, le virion subit un déenveloppement résultant de la fusion avec
la membrane nucléaire externe, et se retrouve sous la forme de capside nue dans le cytoplasme.
Cette capside subit un second enveloppement dans la région transgolgienne, en se fixant sur un
ensemble de protéines tégumentaires qui apparaît, en microscopie électronique, plus dense que
celui impliqué dans le premier enveloppement. Le virus enveloppé présent dans une vésicule est
libéré de la cellule par exocytose.
Les études récentes en microscopie électronique suggèrent fortement le second modèle :
Ces études montrent clairement les 3 étapes décrites (Granzow et al., 2001 , Granzow et al.,
1997). Le tégument qui paraît peu abondant quand la particule virale est périnucléaire, acquiert
sa taille maximale dans les vacuoles cytoplasmiques, ce qui suggère que le changement
morphologique entre le virion intranucléaire et cytoplasmique reflète un changement de
composition protéique du tégument.
Le second modèle est également mis en évidence dans des cellules infectées par des virus codant
pour des glycoprotéines gH et gD modifiées possédant un signal de rétention dans le réticulum
endoplasmique (RE) (Browne et al., 2001, Skepper et al., 2001 ). Les deux glycoprotéines sont
exprimées, mais sont retenues au niveau de la membrane nucléaire et dans le RE. Les virus
extracellulaires produits sont dépourvus des glycoprotéines gH et gD respectivement, ce qui
suggère que les virus perdent leur enveloppe au niveau du passage nucléo-cytoplasmique puis
acquièrent une nouvelle enveloppe dans des compartiments cytoplasmiques post-RE (Browne et
al., 2001, Skepper et al., 2001 ).
Le fractionnement des organelles de cellules infectées par HSV-1, permet de détecter des
particules virales dans les endosomes et le réseau transgolgien (TGN), mais pas dans les citernes
golgiennes (Harley et al., 2001).
A l’heure actuelle, le rôle de quatre protéines de tégument dans la sortie du virus a été décrit:
UL11, UL37, VP1/2, et VP16 (Fig. 6).
La protéine UL11 est impliquée au niveau du premier et du second enveloppement. Une
accumulation de capsides renfermant de l’ADN dans le noyau près des membranes nucléaires est
détectée dans les cellules infectées par un virus délété du gène UL11 (Baines et Roizman, 1992).
Pour ce même virus, une augmentation de virions non-enveloppés dans le cytoplasme et une
baisse de production de virus extracellulaire, suggèrent un rôle de cette protéine dans
l’enveloppement des virions à la fois dans le noyau et le cytoplasme (Baines et Roizman, 1992).
La protéine UL11 est une protéine myristylée et cette modification post-traductionnelle
permettrait l’ancrage de cette protéine sur les membranes cellulaires. La protéine UL11 ancrée
servirait à son tour de point d’ancrage pour les autres protéines de tégument sur les membranes
(Baines et al., 1995, MacLean et al., 1989 ). La capside se fixerait ensuite sur ce coussin
tégumentaire. L’accumulation sur le pourtour du noyau des protéines UL34 et UL31 suggère que
les deux protéines sont impliquées dans le 1er enveloppement (Reynolds et al., 2001, Roller et al.,
2000 ). La localisation d’une de ces deux protéines est dépendante de l’expression de l’autre
ainsi que de la protéine kinase Us3 (Reynolds et al., 2001). Les virus délétés des gènes UL31 et
UL34 du PrV forment de petites plages par comparaison au virus parental. Des études en
microscopie électronique montrent une réduction du nombre de particules cytoplasmiques et
extracellulaires. Ces deux protéines possèderaient les mêmes fonctions durant la phase de
premier enveloppement au niveau de la membrane nucléaire (Fuchs et al., 2001, Klupp et al.,
2000 ). Le virus HSV-1 délété du gène UL37 ne forme pas de particule virale extracellulaire
(Desai et al., 2001). Une augmentation de capside dans le noyau des cellules infectées, suggère
un rôle de la protéine UL37 dans l’enveloppement nucléaire. (Desai et al., 2001) Certaines
capsides non-enveloppées sont cependant détectées dans le cytoplasme de ces cellules, et un rôle
dans le second enveloppement de la protéine UL37 déjà présente sur la capside est soupçonné
(Desai et al., 2001).
Le passage des virus de l’espace périnucléaire vers la partie cytoplasmique nécessiterait la
protéine codée par le gène UL20 du virus HSV-1. En effet, dans les cellules infectées par un
virus délété du gène UL20, une accumulation de virions dans l’espace périnucléaire est observée
(Baines et al., 1991).
Le second enveloppement requiert des protéines supplémentaires par rapport au premier
enveloppement. Une délétion du gène UL36 codant pour la protéine VP1/2 est létale pour la
multiplication virale. Des capsides virales nues s’accumulent dans le cytoplasme des cellules
infectées suggérant que la protéine VP1/2 est requise pour l’enveloppement secondaire (Desai,
2000). De même, dans le cas du PrV, une accumulation de capsides est visualisée dans le
cytoplasme des cellules infectées par un virus délété du gène UL37, ce qui suggère que la
protéine codée par ce gène est nécessaire au second enveloppement et semblerait recruter les
autres protéines de tégument impliquées dans le second enveloppement (Klupp et al., 2001). Les
protéines UL37 des virus PrV et HSV-1 possèdent donc un rôle commun permettant le second
enveloppement des virions (Desai et al., 2001).
Enfin, le virus délété du gène UL48 ne produit pas de virus enveloppés extracellulaires
(Weinheimer et al., 1992), ce qui suggérait un rôle essentiel de VP16 dans la sortie du virion.
Cependant, la diminution de la synthèse protéique virale et du taux d’encapsidation de l’ADN
viral (associé à la dérégulation de VHS) rendait ce résultat difficilement interprétable. Un virus
délété des gènes UL48 et UL41, chez qui la synthèse protéique virale et le taux d’encapsidation
de l’ADN sont en partie rétablis, ne produit toujours pas de virus extracellulaires (Mossman et
al., 2000). En microscopie électronique, une accumulation de capsides non-enveloppées
contenant de l’ADN viral est visualisée dans le cytoplasme des cellules infectées ce qui indique
que la protéine VP16 est essentielle à la maturation virale après le passage nucléaire, sans doute
au stade du second enveloppement (Mossman et al., 2000).
Une seconde expérience met en évidence les deux fonctions de VP16. Un virus infectieux dérivé
du virus délété du gène UL48 a pu être obtenu à la suite d’une longue incubation. Ce virus
montre cependant une différence fondamentale par rapport au virus sauvage : sa réplication
entraîne la formation de syncytiums géants et les cellules ne libèrent aucune particule virale
extracellulaire (Mossman et al., 2000). L’analyse génomique de ce virus met en évidence des
mutations dans le gène UL41 et dans la protéine gK qui est impliquée dans la fusion des
membranes cellulaires (Mossman et al., 2000).
La protéine VP22 semble être également impliquée dans la sortie du virus et plus
particulièrement dans la diffusion de cellule à cellule du virus HSV-1. Un virus exprimant une
protéine VP22 tronquée en position C-terminale, et plus récemment, un virus UL49- délété du
cadre de lecture entier ont été construit (Elliott et Whiteley, 2001 , Pomeranz et Blaho, 2000).
Ces virus, qui produisent des particules virales extracellulaires, forment de petites plages par
comparaison au virus sauvage, ce qui suggère un rôle de VP22 dans la diffusion de cellule à
cellule du virus HSV-1 (Elliott et Whiteley, 2001, Pomeranz et Blaho, 2000). D’ailleurs, la
protéine VP22 d’HSV-1 induit la re-localisation de VP16 pour former le corps tégumentaire, ce
qui suggère un rôle majeur de ces deux protéines dans l’édification du tégument (Elliott et al.,
1995). Ces résultats sont à rapprocher de ceux obtenus avec un virus BHV-1 délété du gène
UL49 (VP22) qui montre également un défaut de croissance en culture cellulaire (Liang et al.,
1995). La protéine VP22 d’HSV-1 se localise dans le cytoplasme des cellules infectées dans les
stades précoces de l’infection virale, puis s’accumule dans le noyau dans les stades tardifs de
l’infection (Elliott et O'Hare, 1999 , Elliott et O'Hare, 2000, Pomeranz et Blaho, 1999 ). Les
modifications post-traductionelles de la protéine VP22, ADP-ribosylation, phosphorylation par la
protéine virale UL13 ou par les protéines kinases cellulaires, peuvent expliquer en partie ces
différentes localisations au cours du cycle viral (Blaho et al., 1994 , Pomeranz et Blaho, 1999).
La protéine VP22 du BHV-1 peut-être également phosphorylée et montre une localisation
majoritairement nucléaire (Harms et al., 2000). Les deux protéines VP22 peuvent s’associer au
cours de l’infection virale à la chromatine cellulaire et virale. La protéine VP22 du BHV-1
interagit avec les histones, et la déacétylation de l’histone H4, associée à la répression de la
transcription des gènes, est observée dans les cellules infectées (Ren et al., 2001a). Le
cytosquelette cellulaire est également modifié par les protéines VP22 d’HSV1 et de BHV1 qui
réorganisent le réseau de microtubules lors d’une infection virale (Elliott et O'Hare, 1998, Harms
et al., 2000 ). De plus, ces deux protéines possèdent la propriété de transport intercellulaire,
utilisant des mécanismes d’exportation et d’importation similaires à la famille des pénétratines
(Tat, l’homéodomaine d’Antennapedia) (Elliott et O'Hare, 1997, Harms et al., 2000, Prochiantz,
2000). D’ailleurs, l’utilisation de la protéine VP22 d’HSV-1, comme vecteur pour l’importation
de molécules biologiques dans les cellules ou à des fins vaccinales, est largement étudiée (Cheng
et al., 2001 , Hung et al., 2001 , Normand et al., 2001 , Wills et al., 2001).
De même que la phosphorylation des protéines de tégument induit leur dissociation du virion dès
l’entrée dans la cellule, on peut imaginer que leur assemblage dans le nouveau virion requiert
l’incorporation de protéines non phosphorylées qui peuvent être soit des protéines
déphosphorylées soit des protéines néosynthétisées non phosphorylées (Spengler et al., 2001).
Ainsi, la protéine VP22 n’est pas phosphorylée dans les virions (Elliott et al., 1999). Par contre,
l’assemblage dans le virion de la protéine VP22 du BHV-1 est conditionné par sa
phosphorylation sur un résidu tyrosine (Ren et al., 2001b).
La quantité totale des protéines de tégument incorporées dans le virion semble constante, mais la
quantité relative de chaque protéine peut-être variable et en relation avec leur quantité relative
dans la cellule infectée. La quantité de la protéine VP22 incorporée dans le virion augmente lors
d’une infection par un virus possédant deux copies du gène UL49. Dans ces mêmes virions, la
protéine VP13/14 est au contraire détectée en quantité moindre (Leslie et al., 1996). Une
augmentation de l’incorporation de la protéine VP13/14 dans les virions est observée dans les
virions issus de cellules infectées par un virus délété du gène UL46 (VP11/12) (Zhang et
McKnight, 1993). De même, la quantité de protéines VP16 est augmentée dans les virions issus
de cellules infectées par un virus délété des gènes UL46 et UL47 (Zhang et McKnight, 1993).
Par opposition, l’incorporation de la protéine de tégument UL37 dans le virion est strictement
contrôlée (McLauchlan, 1997).
Les protéines de tégument jouent donc un rôle important dans la sortie du virion à différentes
étapes de la morphogénèse virale. Cette structure qui est présente avant le premier
enveloppement, devient plus dense au cours du second enveloppement, ce qui suggère que
l’édification du tégument pourrait se réaliser en deux étapes : une étape nucléaire où les protéines
de tégument à localisation nucléaire sont incorporées au cours du premier enveloppement en
interagissant principalement avec les capsides de type C, et une seconde étape cytoplasmique où
les protéines de tégument cytoplasmiques seraient incorporées en assurant l’interaction entre cet
édifice capside « semi-tégumentée » et les glycoprotéines virales. D’autres protéines de tégument
localisées dans les deux compartiments au cours du cycle viral, peuvent également jouer un rôle
à ces deux niveaux.
1.2.6.2 Rôle des glycoprotéines
De même que les glycoprotéines gB, gD, gH et gL jouent un rôle dans l’entrée des virus
extracellulaires, ces glycoprotéines sont impliquées dans la diffusion du virus de cellule à cellule
(Cai et al., 1988 , Forrester et al., 1992 , Huang et Campadelli-Fiume, 1996 , Navarro et al.,
1992 , Roop et al., 1993). Ainsi, la formation des plages de lyse est inhibée en présence d’AcMo
dirigés contre les glycoprotéines gB, gD et gH (Minson et al., 1986, Navarro et al., 1992 ).
Les glycoprotéines gE et gI permettent également une diffusion efficace du virus de cellule à
cellule (Fig. 6). En effet, les virus gE- et gI- forment des plages de petites tailles comparées à
leur virus parental (Balan et al., 1994). Ces deux glycoprotéines ne sont pas impliquées par
contre dans l’entrée du virus extracellulaire (Dingwell et al., 1994, Dingwell et Johnson, 1998),
ce qui suggère que l’entrée du virus et la diffusion du virus de cellule à cellule qui possèdent des
mécanismes (fusion) et des protéines (gB, gD, gH et gL) similaires, diffèrent dans certains
aspects moléculaires.
En ce qui concerne la sortie des virions par exocytose, les virus gB-, gH-, gL-, gD-, gE- ou gIforment des virus extracellulaires, indiquant que la voie de sortie des virus extracellulaires n’est
pas affectée par la délétion de ces 6 gènes (Balan et al., 1994, Cai et al., 1988 , Forrester et al.,
1992 , Ligas et Johnson, 1988 , Roop et al., 1993 ).
La glycoprotéine gK (UL53) qui n’est pas présente dans l’enveloppe virale est impliquée dans la
sortie du virion au niveau du premier et du second enveloppement. La formation de particules
extracellulaires est limitée dans les cellules infectées par un virus gK- (Foster et Kousoulas,
1999, Hutchinson et al., 1992b, Hutchinson et Johnson, 1995 ).
1.3 LE VIRUS DE LA MALADIE DE MAREK (MDV)
La Maladie de Marek est une affection lymphoproliférative du poulet dont l’agent causal est un
virus de la famille des herpesviridae (Churchill et Biggs, 1967). Cette affection reste à l’origine
de véritable perte économique dans l’aviculture. Le virus a été isolé dans des cultures cellulaires
co-cultivées en présence de cellules tumorales (Churchill et Biggs, 1967) ou de lymphocytes
purifiés à partir de sang d’animaux malades (Nazerian, 1979).
Le MDV, qui appartient au genre Gallidherpesviridae, est classé dans les alphaherpesvirinae en
raison de sa structure génomique et des homologies de séquences avec les autres
alphaherpesvinae (Buckmaster et al., 1988). Après une courte présentation de la maladie
(pathogénie et transmission), du virus (souches, cycle viral et structure) et de la vaccination, nous
décrirons plus en détail l’analyse génomique du MDV.
1.3.1 Pathogénie virale et transmission du virus.
La maladie se caractérise par une infiltration de cellules lymphocytaires T transformées au
niveau des nerfs périphériques et/ou de différents organes ou tissus (gonades, foie, rate, poumon,
coeur, rein, muscle). La présence d’infiltrations diffuses au niveau des nerfs périphériques
entraîne la paralysie de l’animal: c’est la forme clinique classique. L’apparition de tumeurs
viscérales constitue également une forme clinique fréquemment observée. Les virus
hypervirulents, d’émergence récente, peuvent manifester leur pouvoir pathogène sur des
animaux vaccinés entrainant une mortalité importante chez des animaux nouveaux-nés. Cette
mortalité est liée à l’induction d’une immunodépression profonde résultant de la destruction des
lymphocytes B et T infectés par les virus. Le virus peut également causer une athérosclérose
chez des poulets normocholestérolémiques (Fabricant et al., 1978).
Trois types de réplication virale peuvent être identifiés in vivo: la multiplication productive,
l’infection latente, et la transformation.
Les poumons sembleraient être le site de l’infection primaire dans laquelle les cellules
phagocytaires (macrophages ou cellules dendritiques ?) sont présumées phagocyter le virus et
l’emmener dans les organes lymphoïdes (bourse de Fabricius, thymus, rate) (Schat et Xing,
2000).
La primo-infection affecte d’abord les lymphocytes B et se caractérise par une forte
multiplication virale. La destruction des lymphocytes B conduit à un début d’atrophie de la
bourse de Fabricius et de la rate. Les lymphocytes T sont ensuite infectés ce qui entraîne une
immunodépression profonde. L’activation des lymphocytes T paraît nécessaire à leur infection
par le MDV. L’infection latente a lieu dans les lymphocytes T dans lesquels aucun antigène n’est
détecté. Ces lymphocytes peuvent subir une transformation néoplasique aboutissant à
l’apparition de lymphomes T.
La transmission du virus est horizontale et le virus infectieux est libéré à partir des cellules
épithéliales des follicules plumeux où la réplication virale est complète (production de virus
extracellulaire) (Calnek et al., 1970). Les débris de phanères ou les poussières présents
continuellement dans les élevages servent de support au virus et constituent les sources
principales de contamination. La résistance ou l’infectiosité du virus est estimée à plusieurs mois
à 20-25 °C (Carrozza et al., 1973).
1.3.2 Cycle lytique, réplication semi-productive, latence et réactivation.
Dans le cas du MDV, trois types de réplication peuvent être distinguées : un cycle lytique
complet au niveau des follicules plumeux où la production de particules virales extracellulaires
est observée (cf supra), une réplication semi-permissive en culture primaire où le virus reste très
associé aux cellules (pas de production de particule extracellulaire), et un état de latence dans des
fibroblastes déjà transformés et dans les lymphomes T issus de poulet infectés.
Au niveau des follicules plumeux, la réplication du MDV semble complète et aboutit à la
formation de particules virales extracellulaires infectieuses.
In vitro, le virus peut se répliquer dans un nombre limité de cellules qui sont essentiellement des
cultures primaires (cellules de rein de poulet (CKC), fibroblastes embryonnaires de poulets
(CEF) et de canard (DEF) et des cellules embryonnaires de peau de poulets (CESC) (Jaikumar et
al., 2001), et moins efficacement dans certaines lignées cellulaires (CHCCOU2, QM7, Vero)
(Abujoub et Coussens, 1995 , Jaikumar et al., 2001, Schumacher et al., 2000 ). Le virus se
multiplie en formant des plages de lyse, mais reste très associé aux cellules et ne forme pas de
particules extracellulaires. Les souches du sérotype 1 perdent leur pouvoir oncogène après
passage en culture (Churchill et al., 1969) et les virus atténués résultants se répliquent en général
à des titres plus élevés et forment des plus grandes plages que les virus parentaux.
Le MDV qui infecte de façon chronique la lignée CHCCOU2 (fibroblastes transformés
chimiquement), est en état de latence lorsque ces cellules sont sous-confluentes, mais induit une
infection lytique lorsque ces cellules sont confluentes (Abujoub et Coussens, 1995, Abujoub et
Coussens, 1997). Les cellules QT35, lignée cellulaire de fibroblastes de caille, obtenues par
cancérogénèse chimique (Moscovici et al., 1977) possèdent à l’état latent des séquences
spécifiques du MDV1. Le virus peut être réactivé soit in vivo soit dans ces cellules par la
surinfection avec HVT ou un autre MDV (Yamaguchi et al., 2000).
Des lignées lymphoblastoïdes provenant de cellules tumorales d’animaux infectés ont été
également obtenues (Powell et al., 1974). Le MDV qui est à l’état de latence dans ces cellules
peut également entrer en réactivation.
1.3.3 Structure du MDV.
En microscopie électronique, le MDV se présente avec une capside typique des herpèsvirus de
100 nm de diamètre. Des virus enveloppés de 150 à 160 nm de diamètre sont détectés dans les
cellules en culture, alors qu’au niveau des follicules plumeux, la taille des particules détectées est
de 273 à 400 nm (Fig. 9) (Calnek et al., 1970).
fig9a
a
Figure 9 : Etude microscopique
de particules virales produites au niveau des follicules plumeux
(a) ou en culture cellulaire (b). [Payne, 1985 #284]
b
fig9b
1.3.4 Souches virales.
Figure
9 :du Etude
microscopique
de sérotypes
particules
virales
produites
Les
souches
MDV sont
réparties en trois
différents
(tableau
1):
au
follicules plumeux (a) ou en culture cellulaire (b). [Payne, 1985 #284].
niveau
des
Le sérotype 1 comprend les souches virulentes classiques et les souches hypervirulentes, très
oncogènes et très pathogènes contre lesquelles la vaccination est peu efficace.
Le sérotype 2 comporte les virus qui sont naturellement apathogènes et qui peuvent être utilisés
comme souches vaccinales (SB-1 strain) (Schat et Calnek, 1978).
Le sérotype 3 (Kawamura et al., 1969) comprend le virus herpès du dindon (HVT: herpesvirus of
turkeys) qui n’est ni pathogène ni oncogène et qui est la souche vaccinale la plus utilisée.
Ces trois sérotypes différent par le profil de leur ADN après digestion par des enzymes de
restriction (Hirai et al., 1979, Silva et Barnett, 1991) ainsi que par des tests immunologiques
utilisant des AcMo (Ikuta et al., 1982, Lee et al., 1983). La séquence de chaque sérotype a mis en
évidence des différences nucléotidiques entre gènes et la présence de gènes uniques dans certains
sérotypes (cf infra).
Tableau 1: classification par oncogénicité des différents herpèsvirus du poulet et de la dinde
(Payne,1985).
Type de virus
sérotype
oncogénicité*
souches virales représentatives
MDV
1
+++
Md/5,Ala-8,RB1B,Md/11
++
GA,HPRS-16,JM
+
HPRS-17,Conn-A
+/-
Cu-2,CVI988
2
-
HPRS-24,SB-1,HN-1
3
-
FC 126, WTHV-1, HPRS-26
HVT
*+++ : très forte ; ++ : forte ; + : modérée ; +/- : faible ; : nononcogène.
1.3.5 La vaccination.
Le virus HVT qui est apathogène pour le poulet a été le vaccin le plus utilisé (von Bulow et al.,
1975). Des souches virales MDV1 atténuées, dont la souche vaccinale Rispens (Rispens et al.,
1972a, Rispens et al., 1972b) ont également induit une bonne résistance à l’infection et sont
utilisées depuis 1990 aux USA. Ces vaccins induisent une réponse immune efficace contre
l’apparition de tumeurs induites par le MDV-1, mais ne font que diminuer la multiplication
virale des souches sauvages chez les poulets vaccinés, ce qui entraîne une persistance de virus
virulents dans les élevages. Depuis quelques années, des virus de plus en plus virulents émergent
et sont capables d’induire des tumeurs ou des syndromes d’immunodépression suraiguë chez les
poulets vaccinés.
Des vaccins polyvalents, comprenant plusieurs sérotypes, sont de plus en plus répandus car les
résultats obtenus notamment avec les sérotypes 2 et 3 sont supérieurs à ceux obtenus avec les
vaccins monovalents (Witter et al., 1984). Cette vaccination à l’aide de 2 souches virales,
permettrait d’augmenter le spectre de la réponse immune.
L’utilisation des virus de la variole aviaire recombinants exprimant des protéines virales (gB, gC,
gD, VP16, VP13/14) a également été testé à des fins vaccinales (Nazerian et al., 1992, Nazerian
et al., 1996). Seule la glycoprotéine gB semble induire une production d’anticorps (Ac)
neutralisants et une protection contre le MDV. Cette protection est totale chez les poulets
infectés par une souche MDV1 virulente, mais n’induit qu’une protection de 18% chez des
poulets possédant des Ac maternels contre 69% avec une souche vaccinale atténuée.
Les souches vaccinales induisent la production d’anticorps neutralisants (Ikuta et al., 1984) et
l’apparition d’une activité de cytoxicité antivirale (Omar et al., 1998). Ceci permet de diminuer
l’infection cytolytique initiale dans les organes lymphoïdes et de réduire l’immunosuppression.
L’immunité à médiation cellulaire joue un rôle essentiel. En effet, les poulets vaccinés montrent
une augmentation des cellules NK particulièrement importante lors de la vaccination HVT + SB1 (Schat et Xing, 2000). De plus, des poulets génétiquement résistants déplétés des cellules T
CD8+ et vaccinés avec la souche SB-1, deviennent très sensibles à l’infection lorsqu’ils sont
éprouvés par une souche oncogénique, ce qui indique qu’une réponse cytotoxique T est
nécessaire (Morimura et al., 1998).
1.3.6 Analyse génomique.
Le MDV a été initialement classé dans les gammaherpesvirinae en raison de son
lymphotropisme puis a été reclassé dans les alphaherpesvinae sur les bases de sa structure
génomique et des homologies de séquence qu’il présente avec les autres alphaherpesvirinae
(Buckmaster et al., 1988).
Le génome de 2 sérotypes (MDV-1 et HVT) a récemment été publié en totalité et a permis une
étude comparative des deux souches d’oncogénécité différentes (Fig. 10) (Kingham et al., 2001).
La séquence des régions RL et RS du sérotype 2 n’étant pour le moment non publiée, la
comparaison génétique de ces régions avec celles des autres sérotypes n’a pu être effectuée.
Figure 10 : Comparaison de la structure génomique du MDV1, MDV2 et d'HVT. Les gènes
colorés en bleu ont des homologues chez les alphaherpèsvirus. Les gènes en jaune sont
spécifiques aux trois sérotypes et les gènes en rouge sont spécifiques du sérotype. Abréviations :
hom., homologue ; pol., polymérase ; prot., protéine ; rep., repeat ; RR, ribonucleotide reductase
; sub., subunit ; TK, thimidine kinase.
fig10
Deux génomes de sérotype 1 (GA (Lee) et Md5 (Tulman)), les régions UL et US du sérotype 2
(HPRS-24) et le génome de sérotype 3 (HVT) (Afonso) ont été récemment entièrement
séquencés. Les gènes de leur région UL sont colinéaires avec les alphaherpèsvirus modèles et
sont très similaires en terme de séquences en aa, notamment avec les alphaherpèsvirus équin 1 et
4 (EHV-1, EHV-4). Entre les différents sérotypes des divergences existent notamment dans la
longueur des différentes régions (RL, UL, RS, US) (Tableau 2), et plus particulièrement dans la
région RL (IRL et TRL) (Kingham et al., 2001).
Tableau 2 : comparaison des tailles des éléments génomiques présents dans HVT, MDV-1 et
MDV-2 (Kingham et al., 2001).
Virus
UL
RL
(IRL
+ US
TRL)
RS
(IRS
+ Total (UL + 2RL
TRS)
+US + 2RS)
HVT
110694
7072
8615
13610
160673
MDV1
113508
12584
11160
12120
174076
MDV2
109932
11951
12109
9164
164270
L’analyse du génome a permis de mettre en évidence trois classes de gènes : les gènes non
homologues aux herpèsvirus mais commun aux trois sérotypes, les gènes uniques de chaque
sérotypes, et les gènes homologues aux alphaherpèsvirus.
Des différences existant dans la désignation de certains gènes, leur dénomination sera semblable
à celle utilisée par Kingham (2001) correspondant au schéma utilisé à la figure 10.
1.3.6.1 Gènes non homologues aux herpesviridae et présent dans chaque sérotypes.
Sept gènes sont trouvés uniquement chez ces 3 gallidherpesviridae et n’existent pas chez les
autres herpèsvirus :
MDV-1 LORF2/MDV-2 LORF1/HVT LORF1: ces gènes codent pour une phospholipase
similaire aux protéines impliquées dans le métabolisme et le transport des lipides, comme la
lipase triacylglycérol, la phospholipase A1, la lipoprotéine lipase.
MDV-1 LORF3/MDV-2 LORF2/HVT LORF2: ces gènes codent pour une protéine contenant
des domaines riches en sérine/arginine dans la partie C-terminale, similaire à ceux trouvés dans
beaucoup de protéines se liant à l’ARN. Elle présente également des similarités avec des
protéines co-activatrices qui modulent la capacité des récepteurs aux stéroïdes à réguler la
transcription. Un des rôles également évoqué serait de réguler la transcription ou l’épissage des
ARNm.
MDV1 LORF9/MDV2 LORF4/HVT LORF3, MDV1 LORF10/absent dans le sérotype 2/HVT
LORF4, MDV1 LORF9/MDV2 LORF4/HVT LORF5 et MDV1 LORF11/MDV2 LORF5/HVT
LORF6 codent pour des protéines de fonctions inconnues.
MDV1 RLORF14a-pp38/MDV2 RLORFpp38/ HVT RLORF1 codant pour la phophoprotéine
pp38. Cette protéine qui diverge cependant entre les différents sérotypes, pourrait également être
impliquée dans la virulence. Compte tenu de ces divergences, son rôle potentiel sera traité plus
en détail dans les gènes spécifiques d’un sérotype (voir infra).
1.3.6.2 Gènes uniques spécifiques d’un sérotype.
Cette catégorie de gènes se situant majoritairement dans les régions RL, l’analyse génomique ne
tiendra pas compte du MDV-2. Le génome de la souche Md5 du MDV1 est plus long que celui
d’HVT de 7 kb dans les régions IRL et TRL. Les gènes localisés dans ces régions semblent être
spécifiques du sérotype 1 (Fig. 10). MDV-1 possède en plus d’HVT les gènes R-LORF7 (Meq),
R-LORF3 (v-IL8), RLORF14 (pp24), MDV087 = MDV097 (SORF2) et MDV093 (SORF4)
ainsi que des cadres ouverts de lecture MDV1 RLORF1, 4, 5, 8, 9, 10, 11 pouvant coder pour
des protéines fonctionnelles (Fig. 10 et 11). Le gène RLORF14a-pp38, cité précédemment, code
pour une phosphoprotéine pp38 qui est différente de celle d’HVT, tronquée en position Nterminale. Ce virus Md5 possède également des séquences répétées de 132 pb résultant de
passages en série sur culture et dont la présence est en corrélation avec l’atténuation et la perte
d’oncogénicité des souches virulentes (Maotani et al., 1986).
Ces différences, dans les régions RS (TRS + IRS) et RL (TRL + ITL) entre les souches
nonpathogènes et très pathogènes, pourraient être importantes pour la spécificité d’hôte, la
virulence et l’oncogénicité, et nous nous sommes attachés à décrire les gènes les mieux connus.
Figure 11 : a) Structure du génome du MDV1 et régions IRL et IRS du MDV1. Les régions qui
n'ont pas d'homologie avec HSV-1 sont soulignées en rouge b) Régions IRL et IRS du MDV1 où
sont localisés les gènes exprimés dans les lignées transformées et potentiellement oncogéniques,
les séquences répétées de 132 pb (orange) amplifiées dans les génome des virus atténués et les
transcripts antisens à ICP4 impliqués dans la latence (vert). (Ross, 1999)
fig11
MDV
-
La protéine Meq, codée par le gène meq (MDV EcoRI-Q) (MDV1 RLORF7), est une
phosphoprotéine de 339 aa (Fig. 12) qui est exprimée très tôt et très faiblement dans
une infection lytique, alors qu’elle est fortement exprimée dans la majorité des
cellules des lignées transformées (Jones et al., 1992). Des oligonucléotides et des
ARN complémentaires au gène et aux transcrits meq empêchent la croissance des
lignées lymphoblastoïdes transformées par MDV (Xie et al., 1996). De même la
surexpression de Meq dans des fibroblastes rat-2 conduit à la transformation cellulaire
et à une inhibition de l’apoptose (Liu et al., 1998). C’est une protéine (Fig. 12) qui
possède une région N-terminale basique impliquée dans la localisation nucléaire et
nucléolaire (Liu et al., 1997) et dans la liaison à l’ADN (Qian et al., 1996). Un
domaine particulier de la protéine de type agrafe à leucines ou transactivateur bZIP
(Leucine-Zipper) présente une forte homologie avec les domaines bZIP des
oncogènes cellulaires c-jun et c-fos (Qian et al., 1995). Ce domaine agrafe à leucines
permet à Meq de se dimériser avec différentes affinités avec ces 2 oncogènes
cellulaires, mais aussi avec la protéine CREB (cAMP-response-element binding
protein) et les protéines ATF1 et ATF2 (cAMP-inducible transcription factor) (Qian
et al., 1996). Les homodimères Meq-Meq et les hétérodimères Meq-jun sont capables
de se lier sur deux groupes distincts de séquences nucléotidiques différentes appelées
MERE1 et MERE2 (Meq-responsive elements) (Qian et al., 1996). Une séquence
MERE2 présente près de l’origine de réplication virale a été décrite suggérant un rôle
possible de Meq dans la réplication virale (Qian et al., 1996). Les 33 aa C-terminaux
sont essentiels pour la transactivation, alors que la région riche en proline inhibe la
transcription (Qian et al., 1995).
Figure 12 : Structure de la protéine Meq du MDV1. Les régions impliquées dans la liaison à
l'ADN, la localisation nucléaire et nucléolaire sont indiquées et localisées dans les régions riches
en aa basiques (BR1 et BR2). Les régions impliquées dans la transformation des fibroblastes rat2, dans la dimérisation et les interactions avec c-Jun, c-Fos, CREB et ATFs sont également
indiquées (Ross, 1999).
fig12
Le rôle de la protéine p53 a également été analysé au cours de la transformation par MDV
(Takagi et al., 1998). La partie bZIP de la protéine Meq qui est capable de se lier à la partie Cterminale de la protéine p53, pourrait ainsi empêcher la fixation de cette dernière sur l’ADN. De
même, plusieurs lignées cellulaires sont délétées de l’exon 8 du gène codant pour la p53 (Takagi
et al., 1998).
Meq se localise dans les cellules infectées au niveau du nucléole (Liu et al., 1997). Dans les
cellules Rat-2, Meq se localise avec les CDK2 (cyclin-dependant kinase 2), au niveau de la
périphérie nucléolaire (Liu et al., 1999b). L’interaction de Meq et de CDK2 est particulièrement
évidente pendant les phases G1/S et S du cycle cellulaire. De plus CDK2 peut phosphoryler Meq
qui perd ainsi son activité de liaison à l’ADN.
La transcription du gène meq est complexe. En plus du transcrit meq, un transcrit épissé codant
pour une protéine de 28 kDa (Meq-sp) (Peng et Shirazi, 1996) et 4 transcrits antisens du gène
meq ont été détectés (Peng et al., 1995). Ces deux protéines (Meq et Meq-sp) sont détectées dans
les noyaux des CEF infectées par MDV-1. Les 100 aa N-terminaux de Meq-sp sont communs
avec ceux de Meq, mais cette protéine ne possède pas le domaine transactivateur. Meq-sp
continue cependant de se lier à l’ADN et d’interagir avec Meq ou jun, et pourrait ainsi réguler
l’activité de Meq en entrant en compétition pour la formation d’hétérodimères avec c-jun. Meqsp est exprimée dans les lignées transformées et dans les fibroblastes infectés avec une souche
virale atténuée. Elle possède également en C-terminal un motif CXC identifié dans de
nombreuses chemokines. Cependant, il est peu probable qu’elle joue un rôle de chemokine en
raison de sa localisation nucléaire. En fait, ce motif est présent sur une autre protéine, qui,
produit d’un épissage différent, possède un peptide signal de sécrétion en N-terminale (v-IL8)
(Liu et al., 1999a).
- v-IL8 (MDV1 RLORF3) (Fig. 10 et 11) est une protéine exprimée à des stades tardifs de
l’infection et serait impliquée dans la réplication virale (Parcells et al., 2001). C’est une
chemokine de type CXC, très similaire à l’IL8 cellulaire. L’IL8 recrute les neutrophiles in vivo
en favorisant l’adhésion cellulaire et la migration transendothéliale. La cellule cible devient
activée et capable de dégranulation, de choc oxydatif et d’influx de calcium, induisant la mort
cellulaire. Les infections virales sont souvent accompagnées de surexpression de l’IL8 cellulaire,
comme réponse cellulaire. La protéine v-IL8 du MDV est une protéine sécrétée quand elle est
exprimée en système baculovirus/cellule d’insecte, et fonctionne comme un chimioattractant
pour les cellules de poulet mononucléées mais pas pour les hétérophiles (Parcells et al., 2001).
L’étude d’un virus délété du gène v-IL8, montre que ce virus demeure oncogène à un niveau très
réduit et induit in vivo une infection lytique très réduite (Parcells et al., 2001). La protéine v-IL8
peut ainsi être impliquée dans le recrutement et l’activation des cellules phagocytaires au niveau
du site d’entrée du virus, les poumons. Ceci permettrait la transmission du MDV à un plus grand
nombre de cellules lymphoïdes. Cette protéine pourrait également recruter les cellules B et T
permettant ainsi l’établissement de l’infection. Un rôle de leurre a été évoqué, la synthèse de vIL8 entraînant un blocage de l’action de l’IL8 cellulaire par recrutement de son récepteur (Liu et
al., 1999a).
- La famille d’ARN de 1,8 kb et les répétitions de 132 pb (Fig. 10).
Les transcrits de 1,8 kb qui sont situés en amont des répétitions de 132 pb, sont initiés à partir
d’un promoteur bidirectionnel qui permet également la transcription du gène pp38 (Shigekane et
al., 1999).
Cette famille d’ARNm semble être altérée au cours du processus d’atténuation par passages
successifs en culture cellulaire des souches oncogènes (Bradley et al., 1989b). Deux transcrits de
1,69 kb non épissés possédant 2 ORFs (ORFA et ORFC) et 2 ARNm épissés de 1,5 kb possédant
également 2 ORFs (ORFB et ORFF) sont détectés dans les CEF infectées par un virus
oncogénique et semblent prolonger la prolifération des CEF (Bradley et al., 1989a). Les
transcrits des ORFA et ORFC ne sont détectés que dans des cellules infectées par un virus
oncogénique, alors que dans les mêmes conditions, un transcrit de 0,4 kb est détecté dans les
souches dérivées atténuées (Bradley et al., 1989b). Cet ARN de 0,4 kb correspond à un messager
tronqué de la famille des ARN de 1,8 kb et ne comprend pas les séquences répétées de 132 pb
(Bradley et al., 1989b). L’amplification de ces séquences répétées de 132 pb est observée lors de
l’atténuation des souches oncogéniques après plusieurs passages en culture, ce qui suggère un
lien entre l’amplification de ces séquences et l’oncogénèse (Maotani et al., 1986).
Les oligonucléotides complémentaires des sites donneurs d’épissage de cette famille bloquent la
maturation de ces ARN et entrainent une baisse rapide de la prolifération des cellules de la lignée
MSB-1 (Kawamura et al., 1991). De plus la transfection de ces ADNc entraine une diminution
de la dépendance des cellules vis-à-vis du sérum et une augmentation de la prolifération des
cultures primaires (Peng et al., 1993). L’analyse de ces transcrits a permis de trouver des cadres
de lecture potentiellement oncogéniques, notamment des protéines homologues à des
oncoprotéines cellulaires, comme l’oncoprotéine associée aux lymphomes T de souris et les
oncoprotéines des protéines kinases de la famille Fes/Fps (Peng et al., 1992). L’ORFA coderait
pour une protéine de 7 kDa, nommée Bha, détectée dans les cellules lymphoblastoïdes et dans les
CEF infectées uniquement par des souches oncogéniques (Peng et al., 1992). L’ORFB coderait
pour la phosphoprotéine pp14 détectée dans les cellules infectées par une souche oncogénique ou
atténuée ainsi que dans les lignées transformées par le MDV (Hong et Coussens, 1994). Cette
protéine n’a pas d’homologue dans les sérotypes 2 et 3.
- Le complexe pp38, pp41, pp24 est constitué des trois phosphoprotéines. Ces trois
phosphoprotéines sont exprimées dans le cytoplasme des cellules lors d’infection lytique et ont
été retrouvées dans les lignées lymphoïdes et les lésions tumorales provoquées par MDV (Chen
et al., 1992). La pp38 qui est une protéine produite d’un gène α ou β, est le constituant majeur du
complexe. Les gènes pp38 et pp24 sont transcrits respectivement dans la région IRL et TRL et
sont également présents dans les sérotypes non-oncogéniques 1 et 2. La pp24 possède les 65 aa
N-terminaux de la pp38 (Zhu et al., 1994). La pp41 serait en fait une forme hyperphosphorylée
de la pp38. La pp38 de MDV-1 diffère de la pp38 d’HVT et de MDV-2 dans sa partie Nterminale, ce qui fait que la pp24 de MDV-1 n’a pas d’homologue chez HVT et MDV-2. Des
ARN anti-sens réduisent considérablement la formation de colonies de cellules MSB-1 cultivées
en agar, donc la prolifération de ces cellules issues de tumeurs de MDV-1 (Xie et al., 1996). Un
rôle indirect de pp38 dans le maintien de l’état transformé ou dans la progression vers la
transformation est suspectée (Chen et al., 1992).
- L1ORF (Fig 11 et non représenté dans la figure 10) a la capacité de coder pour une protéine de
107 aa traduite soit à partir d’un ARNm bicistronique comprenant en amont le gène meq soit à
partir d’un messager monocistronique de 0,6 kb. Ce cadre ouvert de lecture est abondament
transcrit dans les lignées non-productrice CU41 et très peu détectée lors d’une infection lytique
(Ohashi et al., 1994). La délétion de L1ORF sur une souche atténuée a montré que le cadre
ouvert de lecture L1ORF n’est pas essentiel pour la réplication virale, l’établissement de la
latence ou la réactivation (Schat et al., 1998). Son rôle dans l’oncogénèse reste à étudier.
HVT
HVT possède un gène unique dans le monde des herpèsvirus. Ce gène unique HVT RSORF1 est
transcrit en un ARNm épissé donnant naissance à une protéine présentant de forte similarité avec
Bcl2 ainsi qu’avec le gène NR-13 anti-apoptotique de la caille. HVT RSORF1 contient
également un domaine d’association aux membranes, localisé dans sa partie N-terminale,
permettant son attachement aux membranes, à l’instar des protéines Bcl-like (Kingham et al.,
2001). La présence de ce gène peut expliquer la capacité de HVT à inhiber l’apoptose dans les
lignées cellulaires DT40 B, capacité que ne possède pas MDV-1 (Ewert et Duhadaway, 1999,
Kingham et al., 2001).
HVT possède également un gène dupliqué dans son génome (US8) qui code pour une seconde
glycoprotéine gE (SORF1) (Kingham et al., 2001).
1.3.6.3 Gènes homologues aux alphaherpèsvirus.
1.3.6.3.1 La région US
Les 3 sérotypes du MDV possèdent des protéines homologues aux gènes US1, US10, US2, US3,
US6, US7 et US8 du virus HSV-1. Ces gènes ne sont pas essentiels à la réplication d’HSV-1.
Dans le cas du MDV, les gènes US1, US10, US2, US3 et US6 sont également non essentiels à la
réplication du virus en culture (Parcells et al., 1994). Un virus délété du gène US1 (ICP22)
montre un défaut de croissance, ce qui suggère que ce gène est impliqué dans la réplication du
MDV. Par contre, les gènes homologues aux gènes US4, US5, US9, US11 et US12 des virus
HSV et EHV ne sont pas présents dans les différents sérotypes du MDV.
La glycoprotéine gD (US6) n’est pas détectée dans les cultures cellulaires (Tan et al., 2001) et
aucun transcrit correspondant au gène US6 n’est détecté dans les cellules infectées. Un rôle de la
glycoprotéine gD dans la production de virus infectieux au niveau des follicules plumeux a été
évoqué (Niikura et al., 1999).
Les glycoprotéines gI (US7) et gE (US8) sont exprimées dans les cellules infectées par le MDV
et intéragissent pour former un complexe gEgI. La délétion de ces gènes, importants pour
l’infection de cellule à cellule dans le cas d’HSV-1, est létale pour le MDV-1 (Schumacher,
2001).
1.3.6.3.2 La région UL
Les génomes des trois sérotypes et celui d’HSV-1 sont très homologues dans la région UL des
gènes UL1 à UL55. Le pourcentage d’identité, entre les protéines homologues du MDV-1 avec
les autres alphaherpèsvirus non aviaire, peut varier de 24% d’identité (produit du gène UL43), à
62% (produit du gène UL31). De plus la colinéarité de ces gènes est extrêmement bien
conservée. Ainsi, les gènes UL1 à UL54 sont exactement dans le même ordre et la même
orientation que ceux d’HSV-1. Même les gènes UL16 et UL17 transcrits dans l’intron du gène
UL15 ainsi que les régions d’épissage du gène UL15 sont conservés dans le MDV (Fig. 10). La
seule différence est l’insertion entre les gènes UL54 et UL55 d’un nouveau cadre ouvert de
lecture (MDV1 LORF9), dont la fonction est inconnue.
Les gènes UL1 à UL55 d’HSV-1 codent pour des protéines de fonctions variées, impliquées
notamment dans la réplication de l’ADN, ou des protéines de structure (capside, tégument et
glycoprotéines). Les gènes homologues du MDV sont supposés posséder les mêmes fonctions.
Dans le laboratoire, les protéines homologues aux protéines de capside d’HSV-1 ont été
identifiées, clonées et exprimées en système baculovirus/cellules d’insecte (VP5, VP23, VP19C,
VP26, préVP22a, VP21 et VP24). Ces protéines de la souche RB1B du MDV-1 possèdent entre
39% et 58% d’identité avec les alphaherpèsvirus les plus proches. La co-expression des 7
protéines ou simplement des 4 protéines reportées essentielles à la formation des capsides
conduit à l’autoassemblage sous forme de pseudocapsides ou de capsides like particle (CLPs)
semblables aux capsides de type B et A d’HSV-1 (Kut, 2001).
En ce qui concerne les protéines homologues aux protéines de tégument du virus HSV-1, le
pourcentage d’identité est variable (Tableau 3).
Tableau 3 : pourcentage d’identité entre les protéines du MDV-1 par rapport aux sérotypes 2 et 3
et HSV-1 (Kingham et al., 2001) (Tulman et al., 2000).
MDV-1
MDV-2
HVT
HSV-1
UL13
60
55
38
VP1/2 (UL36)
51
50
27
VHS (UL41)
65
64
38
VP11/12 (UL46)
42
37
28
VP13/14 (UL47)
50
46
22
VP16 (UL48)
60
55
39
VP22 (UL49)
52
42
31
Le gène UL13 code pour une protéine de 513 aa qui partage 38% d’identité avec EHV1 et avec
HSV-1 (Reddy et al., 1999). Cette protéine, exprimée dans les cellules infectées par les trois
sérotypes, possède une activité kinase (Reddy et al., 1999), et donc potentiellement une fonction
similaire à celle de ses homologues chez les autres alphaherpèsvirus.
D’un point de vue structural, la protéine VP16 du MDV-1 (427 aa) est plus courte de 80 aa que
son homologue d’HSV-1, et ne possède pas de partie C-terminale acide (Yanagida et al., 1993).
En revanche, une grande homologie est observée sur tout le reste de sa séquence. L’activation en
trans des gènes α pourrait être conservée. En effet la protéine VP16 de VZV ne possède
également pas cette partie C-terminale acide de VP16, mais conserve cependant la capacité à
activer ces gènes α et ceux d’HSV-1. D’autres alphaherpèsvirus ont également une VP16
tronquée (Purewal et al., 1994).
La protéine VP22 de MDV est une protéine de 249 aa également plus courte que son homologue
chez HSV-1 avec qui elle présente une homologie modérée (31% d’identité) (Yanagida et al.,
1993).
La protéine VP13/14 (808 aa) est la protéine présentant la plus faible homologie (22% d’identité)
avec son homologue d’HSV-1. Elles possèdent cependant une région hydrophile conservée dans
leur partie N-terminale (Yanagida et al., 1993).
La protéine VP11/12 (568 aa) est plus courte que son homologue chez HSV-1 qui possède une
région C-terminale plus longue. Cependant ces deux protéines montrent une forte homologie
dans leur région N-terminale et centrale (Yanagida et al., 1993).
Une séquence de 8,4 kb codant pour 7 gènes homologues à des gènes de HSV-1, dont les gènes
UL46 à UL49, avait été déterminée pour une souche du virus MDV, la souche GA appartenant
au sérotype 1 (Fig. 13) (Yanagida et al., 1993).
L’étude des transcrits a permis de mettre en évidence que le gène UL48 codant pour la protéine
VP16 ne possédait pas de transcrit propre, par opposition aux autres alphaherpèsvirus. Un
transcrit bicistronique UL49-48 ou tricistronique UL49,5-48 de 2,5 kb a cependant été détecté et
des études de transcription/traduction ont montré la traduction de ces 2 protéines (VP22 et VP16)
à partir du messager bicistronique dans un système d’expression in vitro (Koptidesova, 95). Un
transcrit de 7,8 kb recouvrant toute la région UL46 à UL49 a également été détecté. La protéine
VP13/14 est exprimée à partir du transcrit de 4,6 kb. La protéine VP11/12 possède son propre
transcrit de 2.0 kb mais pourrait être également traduite à partir du messager bicistronique de 4,6
kb. La traduction de VP11/12 et VP13/14 à partir de ce transcrit bicistronique de 4,6 kb
permettrait une expression régulée de ces deux protéines, similaire à celle de leur homologue
chez HSV-1 (Hall et al., 1982). En effet, l’expression des protéines VP11/12 et VP13/14 d’HSV1, transcrites à partir d’un messager bicistronique, est régulée temporellement, le gène UL46
étant un gène βγ alors que le gène UL47 est un gène γ (Hall et al., 1982 , Zhang et McKnight,
1993).
Figure 13 : Analyse transcriptionnelle de la séquence UL46 à UL49 (Yanagida et al., 1993).
fig13
Les glycoprotéines possèdent un taux d’homologie important (de 26% à 54%) avec leurs
homologues les plus proches.
La glycoprotéine gB (UL27) du MDV est synthétisée à partir d’un précurseur glycosylé de 100
kDa qui est ensuite clivé en peptide de 60 et 49 kDa (Chen et Velicer, 1992) au site consensus
RXRR (Yoshida et al., 1994). Cette protéine est essentielle à la réplication virale en culture
cellulaire (Schumacher et al., 2000).
La glycoprotéine gC (UL42) est majoritairement sécrétée et est détectée dans les surnageants de
culture, dans le sérum des animaux infectés et à un niveau moindre dans les cellules infectées
(Isfort et al., 1986). C’est une protéine qui ne semble pas être essentielle à la réplication du MDV
en culture cellulaire, car l’atténuation du MDV1 par passages en culture, aboutit à la perte ou à la
diminution de son expression (Churchill et al., 1969). D’ailleurs, le virus délété du gène UL42
n’est plus isolé dans la rate et dans les cellules périphériques du sang de poulet inoculé, ce qui
suggère un rôle éventuel de cette protéine dans l’infectivité, l’oncogénicité ou la transmission
horizontale du virus (Morgan et al., 1996).
La glycoprotéine gH (UL22), détectée majoritairement dans le cytoplasme des cellules infectées
(Scott et al., 1993) (Wu et al., 1999), est essentielle à la rétention de la glycoprotéine gL (UL1)
au niveau de la membrane cytoplasmique (Wu et al., 2001, Wu et al., 1999).
La glycoprotéine gp82 (UL32) se localise au niveau de la membrane cellulaire dans les cellules
infectées (Wu et al., 1997), et des anticorps dirigés contre cette protéine réduisent la taille des
plages en culture cellulaire (Lee et al., 1996), indiquant que cette protéine est impliquée dans le
processus de fusion de cellule à cellule.
1.3.6.4 Origines de réplication
Les deux souches du MDV1 ont deux origines potentielles de réplication localisées dans les TRL
et IRL. Ces deux origines de réplication sont similaires à l’OriS d’HSV-1 et contiennent des sites
de fixation potentiels pour le produit du gène UL9. De même une origine de réplication
fonctionnelle a été identifiée dans les régions TRL et IRL pour MDV2, et des séquences
homologues sont également présentes dans les régions répétées du sérotype 3.
1.3.7 Latence chez le MDV.
Md5, comme HVT, code pour une protéine homologue à ICP4 (IRS et TRS) mais qui contient
900 aa en plus par rapport aux autres herpèsvirus. Cette protéine transactivante régulerait les
événements impliqués dans la réplication virale. Son rôle dans la transformation cellulaire est
inconnu, mais il est probable qu’elle bloque l’apoptose et qu’elle initie la transcription des gènes
Meq et pp38 (Pratt et al., 1994). Cinq ARNm de 10 ; 9,3 ; 7,8 ; 7,2 et 6,2 kb ont été reportés dont
deux sont épissés (7,8 et 6,2 kb). Par ailleurs, les transcrits antisens des gènes ICP4 semblent être
associés à la latence. Plusieurs LATs (latency-associated transcripts) ont été décrits (Fig 11)
selon la souche virale étudiée et sont au nombre de 9, dont 1 de 10 kb polyadénylé (Cantello et
al., 1994, Cantello et al., 1997 , Li et al., 1994) qui recouvre exactement l’ARNm sens de 10 kb
d’ICP4, 2 ARN épissés nonpolyadénylés nommés MSRs (MDV small RNAs) (Cantello et al.,
1994, Cantello et al., 1997), 6 ARN épissés polyadénylés de 0,5 ; 1,5 ; 1,8 ; 2,2 kb (McKie et al.,
1995) et de 1,6 et 2,7 kb (Li et al., 1998, Li et al., 1994). Les LATs ont été détectés dans 3
lignées lymphoblastoïdes (MSB1, MKT1 et RPL1) et dans les lymphomes. Les LATs sont
détectés en quantité très importante dans les cellules lymphoblastoïdes mais sont également
présent en petite quantité dans les CEF infectées de façon lytique. Le traitement de cellules
lymphoblastoïdes MSB1 avec de l’iododeoxyuridine, permettant la réactivation du MDV1,
induit une baisse dans les transcrits LATs mais pas du messager ICP4. L’expression des LATs
semble être inversée par rapport à une infection productive et semble ainsi être impliquée dans la
latence. De même, le niveau d’expression des ARN antisens dans les lignées CHCCOU2 semiconfluentes (possédant le MDV à l’état latent) est similaire à celui de la lignée MSB-1 (Abujoub
et Coussens, 1997). Lorsque les cellules atteignent la confluence, le virus entre en phase lytique,
le niveau des ARN antisens diminue et le taux d’ARNm du gène ICP4 augmente. La délétion de
la partie 5’ des MSR (région TRL et IRL) sur un virus oncogénique a permis d’étudier le rôle de
ces transcrits dans l’infection virale. Certains LATs sont cependant toujours synthétisés. Les
résultats in vivo indiquent que ce virus muté n’induit plus de tumeurs chez les poulets inoculés et
contacts. Cependant, cette diminution d’oncogénicité pourrait être due, non pas à la délétion de
certains LATs, mais à une atténuation du virus délété au cours des passages en culture de cellule
nécessaires à son obtention.
Il faut également noter que dans le cas d’HSV-1, les LATs sont également associés aux régions
TRS et IRS et sont antisens au gène codant pour la protéine transactivatrice ICP0. Les LATs de
1,5 et 2,0 kb d’HSV1 et les deux ARNs épissés non polyadénylés du MDV détectés par Cantello
(1997) sont également retenus dans le noyau des cellules infectées.
1.3.8 La mutagénèse dans MDV.
Les constructions de virus délétés ont été réalisées, en cellules primaires, par recombinaison
homologue entre le génome viral et un plasmide portant un gène marqueur (β galactosidase)
situé entre les séquences 5’ et 3’ homologues au gène à déléter. Le MDV étant très associé aux
cellules et ne produisant aucune particule extracellulaire, la sélection du virus recombinant et
l’élimination du virus parental est réalisée après de multiples passages des plages exprimant le
gène marqueur et lorsque 100 % des plages expriment le gène marqueur. Le manque de lignées
très permissives à la réplication virale ne permettait pas dans le cas du MDV d’obtenir des
mutants létaux et la plupart des études de mutagénèse a porté sur la région US, non essentielle à
la réplication d’HSV1. Ainsi les gènes US1, US10, US2, US3, US6, SORF1, SORF2, SORF3
(région US) et RLORF3 (vIL8) et L1ORF (région IRL et TRL) sont non essentiels à la
réplication du MDV1 in vitro.
L’insertion de séquences d’ADN de rétrovirus dans l’ADN génomique du MDV a été observée
dans des souches atténuées du MDV1 possédant un haut passage en culture. Une copie du LTR
du réticuloendothéliosis virus (REV) a été retrouvée dans les séquences bordant le TRL et le
TRS (Isfort et al., 1992). L’insertion de ces séquences peut avoir lieu soit in vivo lors de coinfection soit lors de passages en culture. L’insertion de ces séquences a lieu le plus souvent dans
les régions TRL/UL, IRL/UL, US/TRS, US/IRS et le gène US6 (gD) (Jones et al., 1993) (Isfort
et al., 1994). Une insertion du LTR a également été mise en évidence dans le gène codant la
lipase, ce qui suggère que ce gène est nonessentiel pour la réplication du virus en culture
cellulaire (Isfort et al., 1992).
Les glycoprotéines gB (UL27), gI (US7) et gE (US8) ont été les premières protéines à être
montrées essentielles à la réplication du MDV (Schumacher et al., 2000) (Schumacher, 2001).
Les virus délétés de ces gènes ont été obtenus à l’aide d’un BAC (Chromosome artificiel
bactérien) qui sera utilisé dans ce travail et qui sera décrit plus loin.
2
OBJECTIFS DU TRAVAIL
L’objectif du travail s’inscrit dans une étude plus générale visant à mieux appréhender les
mécanismes de réplication du MDV. Notre travail concerne plus particulièrement l’étude des
protéines impliquées dans l’initiation du cycle viral et dans la morphogénèse virale. Les
protéines de tégument sont impliquées dans la morphogénèse et l’initiation de la réplication
virale. Dans le cas du MDV, deux types de particules virales peuvent être détectés en
microscopie électronique. Au niveau des follicules plumeux où la réplication virale est complète
(production de particules extracellulaires), la taille des particules est de 400 nm. Par opposition,
en culture cellulaire, où la réplication n’est que semi-permissive (virus associé aux cellules), la
taille des particules est de 150 nm. La différence majeure entre ces deux particules pourrait
résider dans la taille et la composition du tégument à l’instar de ce qui a été rapporté pour
d’autres virus. Un défaut d’assemblage de ce dernier en culture cellulaire, dû à une restriction de
l’expression de certaines protéines de tégument, peut également être évoqué. Aucune donnée
n’est à l’heure actuelle disponible sur la constitution et l’organisation du tégument du MDV.
Cependant, les transcrits codant pour 4 protéines homologues aux protéines majeures de
tégument du virus HSV-1 ont été détectés dans les CEF, mais l’expression de ces protéines
restait à mettre en évidence et notamment l’expression de la protéine VP16, nécessaire dans la
production de virus extracellulaire (HSV-1), qui semblait traduite à partir d’un messager
polycistronique dans le cas du MDV.
L’étude de l’expression et de la fonction des protéines homologues aux protéines majeures de
tégument du virus HSV-1 (VP16, VP22, VP13/14 et VP11/12) a été initiée dans ce travail, qui
s’articule en deux parties :
-Obtention d’outils moléculaires et étude de l’expression des protéines virales.
-Obtention et étude des virus délétés.
3 Matériel et méthodes
3.1 CELLULES, VIRUS, PLASMIDES
3.1.1 Cellules
3.1.1.1 Souches bactériennes
TG1 : F’traD36 lacIq ∆lac(Z)M15 proA+B+/supE ∆(hsdM-mcrB)5 (rk-mk McrB-) thi ∆(lacproAB)
DH10B : F- mcrA D(mrr-hsdRMS-mcrBC) φ80dlacZDM15 ∆lacX74 deoR recA1 endA1
araD139 ∆(ara, leu)7697 galU galKλ-rpsL nupG
DH10Bac : F- mcrA D(mrr-hsdRMS-mcrBC) φ80dlacZDM15 ∆lacX74 deoR recA1 endA1
araD139 ∆(ara, leu)7697 galU galKλ-rpsL nupG /bMON14272 /pMON7124
TOP10 : F- mcrA D(mrr-hsdRMS-mcrBC) φ80dlacZDM15 ∆lacX74 deoR recA1 endA1
araD139 ∆(ara-leu)7697 galU galK rpsL (StrR) nupG.
Ces quatres souches bactériennes sont cultivées en milieu de Luria Bertani (milieu LB)
(Sambrook et al., 1989).
3.1.1.2 Obtention de cellules primaires et culture de lignées cellulaires.
3.1.1.2.1 Cellules aviaires
3.1.1.2.1.1 Cellules primaires
Les cellules embryonnaires de peau de poulet (CESC) permettent la multiplication du MDV. Ces
cellules primaires sont obtenues à partir d’embryons de poulet de 12 jours selon un protocole
décrit initialement par Silim légèrement modifié au laboratoire (Silim et al., 1982). Les
embryons sont lavés 3 fois en PBS-EDTA et 3 fois en milieu EMEM puis incubés 15 min à 41°C
en présence de collagénase diluée à 0,25% dans du milieu William’s E (WE). Le surnageant
contenant les cellules est filtré sur gaze et centrifugé à 1000 tours.min-1 (IEC, rotor 3229). Le
culot cellulaire est repris en WE complémenté avec 2% sérum de veau foetal (SVF) et 3% de
sérum de poulet dans un volume correspondant à 10 ml/embryon. Les cellules sont ensemencées
en boîte de culture, préalablement traitée à la gélatine (0,2% gélatine en PBS), à raison d’environ
1 ml pour 10 cm2. Les cellules maintenues à 41°C sont rincées 1 fois en milieu EMEM
(élimination des globules rouges) puis réincubées en présence du milieu de culture décrit
précédemment.
3.1.1.2.1.2 Lignées cellulaires établies
3.1.1.2.1.2.1 QM7
La lignée issue de cellules de muscle de caille QM7 (ATCC cell line CRL-1962) qui permet de
multiplier certaines souches virales de MDV-1 pendant quelques passages est cultivée en milieu
Dulbecco’s modified essential medium (DMEM) supplémenté en acides aminés non essentiels
(BIOMEDIA) et additionné de SVF (10%) et de pyruvate de sodium (1 mM).
Les lignées cellulaires QM7 exprimant constitutivement les protéines VP22, VP22N1 et
VP22N2 ont été obtenues en transfectant les plasmides pUL49, pUL49N1, pUL49N2 (cf infra) à
l’aide de lipofectin (GibcoBRL) puis en les sélectionnant en présence de 0,8 mg/ml de généticine
(G418). Une lignée QM7 témoin a été obtenue de la même manière en transfectant le plasmide
pcDNA3. La lignée QM7 exprimant constitutivement la protéine VP22MS a été obtenue en
transfectant les plasmides pTKhyg (contenant le gène de résistance à l’hygromycine) et pUL4948M2 dans un rapport de 0,25 µg de pTKhyg pour 10 µg de pUL49-48M2 puis en sélectionnant
les cellules en présence de 0,2 mg/ml d’hygromycine. L’expression des différentes protéines
VP22 a été vérifiée en IFI à l’aide d’AcMo (cf infra). Les lignées sont cultivées en présence de
0,4 mg/ml de généticine.
3.1.1.2.1.2.2 LMH
Les cellules LMH (Kawaguchi et al., 1987) sont cultivées en WE supplémenté de 10% SVF.
3.1.1.2.1.2.3 MSB1
La lignée lymphoblastoïde MSB1 (Akiyama et Kato, 1974), issue d’une tumeur prélevée sur un
poulet infecté par la souche GA du MDV, est cultivée en milieu RPMI 1640 supplémenté avec
10% SVF. Les cellules sont traitées avec 3 µM de 5-azacytidine pendant 72 h. pour réactiver le
virus (Fynan et al., 1993).
3.1.1.2.2 Cellules de mammifères
Les cellules RK13 (rein de lapin) sont cultivées en WE supplémenté de 10% SVF.
Les cellules COS-7 (rein de singe) sont cultivées en DMEM supplémenté de 10% SVF.
Les cellules de myélome murin Sp2/O-Ag14 (Shulman et al., 1978), utilisées pour l’obtention
d’hybridomes sécrétant des anticorps monoclonaux (AcMo) sont cultivés en milieu RPMI 1640
additionné de 1 mM en pyruvate de sodium et de 10% SVF.
3.1.1.2.3 Cellules d’insecte
Les cellules Sf9 et Sf21, cellules ovariennes de lépidoptère Spodoptera frugiperda (O’Reilly et
al., 1992), et les cellules High Five, cellules d’oeufs de Trichoplusia ni, sont cultivées en culture
stationnaire à 27°C dans du milieu de Grace (Grace’s insect medium, Gibco BRL) complémenté
avec 10% de SVF. L’amplification des virus recombinants et l’expression des protéines
recombinantes ont été réalisées, respectivement, en cellule Sf9 ou Sf21 et High Five.
3.1.2 Souches virales.
3.1.2.1 Souches de virus de la maladie de Marek (MDV)
La souche virale MDV1 RB1B a été mise en culture en CESC à partir de lymphocytes circulants
prélevés sur des animaux infectés 4 semaines après l’inoculation.
Le BAC20 issu de la souche 584A80p (la souche hypervirulente 584A a été atténuée par
passages successifs en culture et a subi 80 passages) a permis l’obtention des virus délétés.
L’infection virale s’effectue par incubation des cellules infectées sur des CESC de 24 h. A la
suite de la première infection, les passages s’effectuent par co-ensemencement de cellules
infectées et non infectées. Les cellules infectées sont trypsinées, ensemencées sur un tapis de
CESC fraîchement préparées (cellules de 24 h.) pendant 1 h. L’inoculum est éliminé et les
cellules nouvellement infectées sont cultivées à 41°C en présence de WE complété avec 1,5% de
SVF et 1% de sérum de poulet, pendant sept jours.
3.1.2.2 Baculovirus
Le baculovirus Acrp6-SC a servi de témoin dans notre étude. Les cellules d’insecte sont
infectées à une multiplicité d’infection (m.o.i.) d’environ 1 unité formant plage (u.f.p.) par
cellule pendant 1 h. à 27°C. Le milieu est ensuite remplacé par du milieu de Grace contenant
10% de SVF.
3.1.2.3 Virus de la vaccine T7
Le virus de la vaccine T7 utilisé dans cette étude a été décrit antérieurement (Fuerst et al., 1986).
Ce virus a été modifié par insertion dans son génome du gène de la ARN polymérase ADN
dépendante du phage T7 sous le contrôle du promoteur du gène P7,5 de la vaccine. L’infection
d’une cellule par ce virus permet la transcription des gènes sous promoteur T7, apportés sous
forme de plasmides transfectés.
3.1.3 Plasmides.
Quatre vecteurs ont été utilisés pour le clonage des gènes d’intérêt :
3.1.3.1 Vecteur de stockage :
Le vecteur pGEM-T (Promega), qui sert de vecteur de « stockage » de gène, possède un gène de
résistance à l’ampicilline et un mode de sélection basé sur la rupture du cadre de lecture du gène
lacZ lorsque l’insert est présent. Le vecteur pGEM-T, fourni linéarisé, comporte à ses deux
extrémités 3’ une thymidine, ce qui permet la ligation directe des fragments de PCR qui
possèdent une adénine à chaque extrémité 3’ ajoutée par certaines ADN polymérases
thermostables dont l’AmpliTaq de Promega.
3.1.3.2 Vecteurs d’expression
Le vecteur pFastBac 1 (GibcoBRL) permet de cloner les gènes d’intérêt dans l’élément
transposable Tn7, ce qui permet la transposition spécifique de cet élément Tn7 et l’obtention de
baculovirus recombinants. Il possède les gènes de résistance à l’ampicilline et à la gentamicine.
Le vecteur pET 22B+ (Novagen) permet de cloner les gènes d’intérêt sous le promoteur du gène
10 du phage T7. Il possède un gène de résistance à l’ampicilline.
Le vecteur pcDNA3 (Invitrogen) qui sera nommé « p » permet de cloner les gènes d’intérêt sous
promoteur du cytomegalovirus (CMV) et du promoteur T7 et possède un signal de terminaison
de la transcription SV40 polyA.
Le vecteur pETluc a servi à l’amplification du gène de la luciférase modifiée. Le gène modifié de
la luciférase, possédant un site de restriction EcoRI à la position nucléotidique 4 et 9 en phase
avec le cadre ouvert de lecture, a été décrit précédemment (Joubert et al., 2000).
Le vecteur pcDNA3-luc (pluc), construit au laboratoire par L. Fragnet, contient le gène de la
luciférase modifiée sous le promoteur CMV.
3.2 CLONAGE DES GÈNES D’INTÉRÊT.
3.2.1 Obtention des inserts
∗Les séquences codant pour les différents gènes (UL49, UL48, UL47, UL46, UL49-48, UL49,5,
UL49,5-UL48) sont amplifiées par PCR. La matrice correspond à l’ADN viral extrait de
lymphocytes périphériques et de cellules de tumeurs lymphoïdes spléniques prélevés sur des
poulets infectés par la souche MDV1 RB1B puis purifié sur résine (nucleobond application
(Macherey-Nagel)). Le choix des oligonucléotides a été effectué à partir des séquences publiées
de la souche MDV GA (Yanagida et al., 1993) (Tableau 4).
Tableau 4 : Séquence des oligonucléotides utilisés pour le clonage des gènes d’intérêt.
tabl4
La PCR est réalisée avec soit la Taq polymérase (Promega) soit la RTth (Invitrogen) selon les
indications du fournisseur et la température de fusion des oligonucléotides.
∗Mutagénèse dirigée en vue de l’obtention des séquences UL49N1, UL49N2, 49,5-luc, 49-luc et
UL48GAr.
Les séquences UL49N1, UL49N2 codant pour les protéines VP22 tronquée (VP22N1, VP22N2)
ont été obtenues par PCR à partir du pGEMTUL49 en utilisant les amorces 49N1, 49N2 et 49R
(Tableau 4).
Le remplacement du gène UL48 par le gène de la luciférase, dans les séquences 49-48 et 49,548, a été réalisé en 2 étapes (Fig. 14).
Figure 14 : Protocole d'obtention de la séquence UL49,5-Luc. La même méthode a été utilisée
pour l'obtention de la séquence UL49-Luc.
fig14
Les séquences UL49,5-49IR (comprenant les gènes UL49,5, UL49 et la région intergénique
située entre les gènes UL49 et UL48 (49-48)) et UL49IR (comprenant le gène UL49 et la région
intergénique 49-48) sont obtenues par PCR à partir des pGEM-T UL49,5-48 et pGEM-T UL4948 et en utilisant respectivement le couple d’amorces UL49,5F-IRR et UL49F-IRR.
Ces séquences sont ensuite clonées dans le pGEM-T. La linéarisation de ces deux vecteurs par
l’enzyme EcoRI permet de cloner la luciférase portant de chaque côté le site EcoRI pour donner
les plasmides pGEM-T UL49,5-luc et pGEM-T UL49-luc.
L’ajout de la séquence répétée GAr à la protéine VP16 a été réalisé en deux étapes.
La séquence UL48 dépourvue de codon stop a été obtenue par PCR en utilisant comme matrice
le pGEM-T UL48 et les amorces UL48F et UL48R2, puis a été clonée dans le pGEM-T (pGEMTUL48R2).
La séquence GAr (Glycine-Alanine repeat) qui comprend les nucléotides 232 à 1140 du gène
EBNA1, a été amplifiée à partir d’ADN extrait des cellules B95/8 chroniquement infectées par le
virus EBV, puis a été clonée dans le pGEM-T (pGEM-TGAr) (Tableau 4).
La séquence GAr, extraite du pGEM-TGAr par PstI, est clonée en phase avec le gène UL48 dans
le pGEM-T UL48R2 digéré également par PstI.
La séquence de chaque insert présent dans le pGEM-T a été vérifiée par séquençage en utilisant
les amorces universelles -21M13 et RevM13 s’hybridant de part et d’autre de l’insert sur le gène
de la β galactosidase.
3.2.2 Clonage des gènes d’intérêt dans les plasmides d’expression.
Les gènes d’intérêt ont été excisés des vecteurs pGEM-T décrits précedemment (Tableau 5).
Tableau 5 : Le clonage des différents gènes d’intérêt dans les 3 vecteurs d’expression a été
réalisé selon les digestions enzymatiques indiquées.
tabl5
3.2.3 Préparation des inserts, des vecteurs et ligation.
3.2.3.1 Préparation des inserts.
Les inserts (fragments PCR ou fragments issus de digestion) sont purifiés sur gel d’agarose 1%
en tampon TAE (Tris-acide acétique-EDTA) puis extraits de l’agarose et purifiés par adsorption
sur résine, en utilisant soit le kit nucleospin extract 2 in 1 (Macherey Nagel) soit la colonne
ULTRAFREE DA puis le kit Microcon 30 (Millipore).
3.2.3.2 Préparation des vecteurs.
3.2.3.2.1 Clonage pGEM-T.
Les clonages des produits d’amplification dans le vecteur pGEM-T sont effectués selon les
conditions préconisées par le fournisseur (Promega).
3.2.3.2.2 Clonage pFastBac, pET22B+ et pcDNA3.
Les vecteurs (10 µg) pFastBac, pET22B+ et pcDNA3 sont tout d’abord digérés par les enzymes
de restriction appropriées (Tableau 5) pendant 2 heures à 37°C, puis purifiés soit sur résine
[nucleospin Extract 2 in 1 de Macherey-Nagel, soit en utilisant le kit Microcon 30-micropure
(Millipore). L’ADN est repris dans 50 µl de Tris-HCl 5 mM, pH 8,5. La déphosphorylation est
réalisée dans un volume final de 100 µl contenant l’ADN purifié, 10 µl de tampon de
déphosphorylation 10X (500 mM Tris-HCl, pH 9.3, 10 mM MgCl2, 1 mM ZnCl2, 10 mM
spermidine) et 5 µl de phosphatase alcaline (1 U/µl). Le mélange est incubé à 37°C pendant 20
min puis 20 min à 56°C (température d’inactivation de l’enzyme) et enfin 5 min à 4°C. Ces
étapes sont répétées une nouvelle fois en ajoutant une même quantité de phosphatase alcaline. Le
vecteur est alors purifié soit sur résine [Wizard DNA clean up system (Promega)] soit en utilisant
le kit Microcon 30-Micropure (Millipore), puis repris dans l’eau à une concentration d’environ
200 ng/µl.
3.2.3.2.3 Ligation.
La ligation est faite dans un volume de 10 µl contenant insert et vecteur dans un rapport molaire
d’au moins 1:1 (200 ng de vecteur par ligation), 1 µl d’ADN ligase T4 (3 U/µl) et 1 µl de tampon
de ligation 10X (300 mM Tris-HCl, pH 7.8, 100 mM MgCl2, 100 mM DTT, 10 mM ATP). Le
mélange réactionnel est incubé une nuit à 12°C, transféré à 56°C pendant 5 min (inactivation de
l’enzyme) puis transfecté par électroporation dans les cellules E.coli TG1 ou TOP10. Un
microlitre du mélange de ligation est ajouté à 50 µl de cellules compétentes puis électroporé
selon les conditions décrites par Dower et al., (1988) (Dower et al., 1988) (appareil Easyject
(Eurogentec) V=2500 V, 156 Ω, 25 µF). Les cellules TG1 sont reprises dans 150 µl de milieu
LB et étalées sur des boîtes LB-agar en milieu de sélection adéquat. Les cellules TOP10 sont
reprises dans 1 ml de milieu S.O.C (Gibco), agitées pendant 1 h. à 37°C puis étalées à raison de
1, 10 et 100 µl par boîtes.
3.2.3.3 Minipréparation d’ADN plasmidique.
Les clones bactériens sont d’une part repiqués sur boîte de Pétri contenant du milieu LB-agar et
de l’ampicilline (banque de conservation), et d’autre part, ensemencés dans 1,5 ml de milieu LB
liquide contenant 200 µg/ml d’ampicilline. Cette culture en milieu liquide est incubée à 37°C
sous agitation forte pendant 5 heures. Les suspensions bactériennes sont ensuite centrifugées 5
min à 15000 g. Une partie du surnageant est retirée et le reste (environ 50 µl) est utilisé pour
remettre en suspension le culot bactérien. La paroi bactérienne est lysée par l’ajout de 300 µl de
TNS (Tris-HCl 20 mM, pH 7,4, EDTA 1 mM, NaOH 0,1 N, SDS 0,5%). Le mélange est agité
par retournement et laissé à température ambiante pendant 5 min. Les protéines et l’ADN
chromosomique bactérien sont ensuite précipités en ajoutant 150 µl d’acétate de sodium 3M sous
agitation douce. Après une incubation de 5 min dans la glace, le tube est centrifugé 5 min à
15000 g. L’ADN plasmidique dans le surnageant est précipité par addition de 1 ml d’éthanol. Le
mélange est centrifugé 5 min à 15000 g. Le culot obtenu est lavé avec 1 ml d’éthanol 80%, séché
et repris dans 50 µl de tampon (tampon de digestion et 10 ng/ml de Rnase A) permettant les
digestions enzymatiques ultérieures.
3.2.3.4 Maxipréparation d’ADN plasmidique.
Le clone bactérien sélectionné est amplifié par culture dans 250 ml de milieu L-ampicilline sous
forte agitation pendant 1 nuit à 37°C. L’ADN plasmidique est purifié sur résine selon le même
principe de lyse alcaline que les minipréparations d’ADN plasmidique [nucleobond PC 500
(Macherey Nagel)]. La concentration en ADN est ajustée à 500 ng/µl.
3.3 SYSTÈMES D’EXPRESSION.
3.3.1 Système baculovirus/cellule d’insecte.
Nous avons choisi d’utiliser le système décrit par GibcoBRL (Bac-to-Bac Baculovirus
Expression System). Cette technique est basée sur la transposition spécifique d’un transposon
contenant le gène d’intérêt dans un bacmide qui peut se répliquer dans E.Coli et qui contient
l’intégralité du génome d’un baculovirus. Cette technique nécessite 2 outils : le vecteur pFastBac
1 et les bactéries DH10Bac.
- Le vecteur pFastBac 1 permet le clonage du gène d’intérêt. Ce vecteur contient les
éléments transposables du transposon Tn7 (Tn7R et Tn7L) entre lesquels se trouvent le gène de
résistance à la gentamicine, le promoteur de la polyhédrine contrôlant l’expression du gène
étranger, un site multiple de clonage et le signal de terminaison de la transcription SV40 poly(A).
Le gène, une fois cloné, est alors sous le contrôle du promoteur fort de la polyhédrine entre les
éléments transposables Tn7.
- Les bactéries DH10Bac qui contiennent le bacmide et un plasmide « Helper » sont
utilisées pour réaliser la transposition. Le plasmide helper fournit en trans les éléments
nécessaires à la transposition tout en conférant à la bactérie la résistance à la tétracycline. Le
bacmide contient le génome d’un baculovirus modifié dans lequel sont insérés à la place du gène
de la polyhédrine une origine de réplication mini-F, un marqueur de résistance à la kanamycine,
et les sites receveurs du transposon Tn7 inséré dans la sous unité α de la ß-galactosidase.
Lorsque la transposition de l’élément mini-Tn7 a lieu dans le bacmide, la phase de lecture de la
sous unité α n’est plus conservée. La sélection des bactéries blanches permet d’obtenir le
bacmide recombinant possédant le gène d’intérêt. Les baculovirus recombinants sont ensuite
produits en transfectant les cellules d’insecte par le bacmide recombinant.
3.3.1.1 Transposition de l’élément mini-Tn7
La transposition est effectuée en transformant 100 µl de bactéries DH10Bac par 1 ng de plasmide
pFastBac. Après transformation par choc thermique (30 min à 4°C et 45 secondes à 42°C puis 2
min à 4°C), la suspension bactérienne est mise en culture pendant 4 heures à 30°C après ajout de
900 µl de milieu S.O.C. (GibcoBRL). Cette culture est diluée aux 1/10 et 1/100. Cent microlitres
de ces différentes dilutions sont étalés sur boîte de Pétri contenant du milieu L additionné de
kanamycine (50 µg/ml), de gentamicine (7 µg/ml), de tétracycline (10 µg/ml), de substrat Bluogal (100 µg/ml) et de l’inducteur IPTG (40 µg/ml). Les boîtes sont incubées à 37°C pendant au
moins 24 heures. Dans les colonies blanches, la transposition de l’élément mini-Tn7 s’est
effectuée dans les sites receveurs du bacmide.
3.3.1.2 Extraction du bacmide.
Les colonies blanches sont amplifiées et l’ADN de bacmide est extrait dans les conditions
décrites pour la minipréparation d’ADN plasmidique. L’ADN est repris dans 40 µl d’eau ultra
pure.
3.3.1.3 Vérification de la présence du bacmide recombinant.
La présence du bacmide est détectée en gel TAE 0,5% agarose et la présence du mini transposon
Tn7 contenant le gène d’intérêt est détectée par PCR en utilisant les amorces universelles (21M13 et RevM13) sur le bacmide de part et d’autre du site de transposition.
3.3.1.4 Transfection des cellules d’insecte Sf9 ou Sf21.
Pour la transfection, 5 µl des minipréparations d’ADN de bacmide sont mélangés à 6 µl d’une
suspension de liposomes (CellFECTIN, GibcoBRL) et à 200 µl de milieu de Grace puis incubés
pendant 45 min à température ambiante. Le mélange est dilué au 1/10 en milieu de Grace et
déposé dans un puits de P6 (9,6 cm2) contenant 2.106 cellules Sf9. Après 5 heures d’incubation à
27°C, le mélange de transfection est remplacé par 3 ml de milieu complet et l’incubation est
poursuivie jusqu’à 72 heures. Le surnageant ne contient qu’une faible quantité de virus, qui est
amplifiée par un deuxième puis un troisième passage. Cette amplification est réalisée par
infection de cellules Sf9 ou Sf21 en flacon de 25 cm2 (F25) puis de 75 cm2 (F75). Le tapis
cellulaire est infecté par une dilution au 1/10 du surnagant de l’étape précédente en milieu de
Grace. Après 1 h d’adsorption à 27°C, l’inoculum est retiré et remplacé par du milieu complet.
Le surnageant est récolté 72 h après l’infection, clarifié à 500 tours.min-1 (IEC, rotor 3229)
pendant 10 min pour éliminer les cellules d’insecte en suspension et les débris cellulaires, et titré.
Le dernier inoculum (deuxième amplification) est utilisé dans les expériences d’expression. Les
inoculums viraux issus de la transfection et de la première amplification sont stockés à –80°C et
sont utilisés uniquement pour la production de nouveaux inoculums.
3.3.1.5 Titrage du virus recombinant
Des dilutions progressives de l’inoculum (10-3 à 10-8) sont ajoutées à des cellules Sf9 à
confluence en puits de culture P6. Les cellules sont incubées 1 h à 27°C puis elles sont
recouvertes d’une couche d’agar ultra pure (GibcoBRL) contenant du sérum et du milieu de
Grace. Une semaine après l’infection, les cellules vivantes sont colorées par adjonction de 200 µl
d’une solution de MTT (Sigma) à 1 mg/ml en PBS (Shanafelt, 1991). Le nombre de plages à une
dilution donnée permet l’expression du titre de l’inoculum en unités formant plages par ml
(u.f.p./ml).
3.3.1.6 Vérification de la présence du gène d’intérêt.
Le surnageant d’un puits de P6 infecté par le baculovirus recombinant est centrifugé à 500
tours.min-1 (IEC, rotor 3229) pendant 10 min pour éliminer les cellules puis à 40000 tours.min-1
en SW65 (Beckman) pendant 1h à 4°C (sédimentation du baculovirus recombinant). Le culot
viral est repris dans 100 µl de tampon de lyse (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, 1% SDS,
protéinase K à 1 mg/ml). L’ADN est purifié par extraction en phénol/chloroforme/alcool
isoamylique (50/49/1), précipité en présence d’acétate de sodium (0,3 M) et d’éthanol (80%). Le
culot est repris dans 40 µl d’eau ultra pure. La présence de l’insert est vérifiée en PCR avec les
amorces spécifiques du gène.
3.3.2 Expression sous promoteur T7.
3.3.2.1 Système TnT7-lysat de réticulocyte de lapin.
Le système TnT7-lysat de réticulocytes de lapin permet la transcription des gènes d’intérêt et la
traduction des ARNm dans la même réaction. Les gènes d’intérêt sont placés sous le promoteur
du gène 10 du phage T7 dans le vecteur pET 22B+. La traduction a lieu dans un volume
réactionnel de 50 µl, qui comprend 25 µl de TnT lysat de réticulocytes de lapin, 2 µl de tampon
TnT, 1 µl (10 à 20 U) de TnT RNA polymérase T7, 1 µl d’acides aminés sans méthionine (1
mM), 2 µl (106 Bq) de méthionine S35, 1 µl (20U) de RNAsin (inhibiteur la dégradation des
ARNm) et 2 µg de plasmide. La réaction est incubée 2 h à 30°C. La présence de produits
radiomarqués résultant de la traduction des gènes sous promoteur T7 est détectée par migration
de 3 à 5 µl du mélange réactionnel en gel de polyacrylamide. Les gels sont fixés en fixateurdécolorant pendant 15 min puis séchés sous vide avant d’être autoradiographiés.
L’immunoprécipitation sera réalisée, si nécessaire, de la même manière que précédemment avec
25 µl de lysat de réticulocytes contenant les protéines marquées par la méthionine S35.
3.3.2.2 Système Vaccine T7/cellule primaire (CESC).
Vingt-quatre heures après leur préparation, les CESC sont infectées par le virus de la vaccine T7
« avianisée » à une m.o.i de 5 p.f.u./cellule puis transfectées par les plasmides recombinants
(pET22+ ou pcDNA3) à l’aide de lipofectin ou lipofectamine (GibcoBRL). Les cellules sont
ensuite fixées à l’alcool-acétone 24 h. après transfection.
3.4 ANTICORPS.
3.4.1 Obtention des anticorps monoclonaux.
3.4.1.1 Immunisation des souris.
Les extraits totaux ou les extraits nucléaires de cellules High Five infectées par les différents
baculovirus recombinants sont inoculés en intrapodale à des souris Balb/c (Vautherot et al.,
1992).
3.4.1.2 Hybride somatique souris/souris.
Le protocole utilisé pour la formation des hybridomes a été décrit précédement (Vautherot,
1994 , Vautherot et al., 1992). Les hybrides sécrétant des anticorps monoclonaux sont ensuite
clonés, amplifiés in vitro et in vivo selon des protocoles classiques (Vautherot, 1994). La
production de liquide d’ascites a été réalisée pour chaque anticorps monoclonal selon des
protocoles décrits précédement (Vautherot, 1994).
3.4.2 Isotypage des AcMo.
L’isotypage des AcMo est réalisé dans un test immunoenzymatique (ELISA) en utilisant le kit
d’isotypage des AcMo de souris (ISO-2 ; Sigma).
Les Ac anti-isotypes de souris, dilués en PBS, sont déposés dans les puits et incubés 1 nuit à
37°C. Après trois lavages en tampon PBS à 0,05% de tween 20 (PBST), les sites réactifs
résiduels sont saturés en PBS gélatine 1%. Après trois lavages en tampon PBST, les AcMo à
tester dilués en PBST gélatine 1% sont ajoutés et incubés 1 h. à 37°C. Après trois lavages en
PBST, des immunoglobulines anti-souris couplées à la péroxidase diluées au 1/1000 en PBST
gélatine 1% sont incubées 1 h à 37°C. Après de nouveau trois lavages en PBST, l’activité de la
peroxidase
est
révélé
par
incubation
avec
le
mélange
H2O2/TMB
(3,3’-5,5’
tétraméthylbenzidine).
3.4.3 Marquage des AcMo par des fluorophores.
Les AcMo sont purifiés sur des colonnes de protéine A (Immunopure Plus Immobilized Protein
A IgG Purification Kit, Pierce), puis conjugués au Vert Oregon 488 ou au Rouge Texas X en
utilisant des kits de marquage (FluoReporter Oregon Green 488 or Texas Red-X protein labelling
kits - Molecular probes).
3.4.4 Autres anticorps utilisés.
Les AcMo anti-VP5 F19, H18 et L3 reconnaissant la protéine majeure de capside (Kut, 2001) et
l’AcMo K11 détectant la glycoprotéine gB, isolé au laboratoire par S. Laurent et J.F. Vautherot
(Schumacher et al., 2000) ont été également marqués aux fluorochromes et utilisés dans cette
étude.
Les anticorps anti-luciférase (Sigma) ont été utilisés dans les études de traduction de la protéine
VP16.
L’AcMo anti-alphatubuline a été utilisé dans les études d’importation de VP22 selon les
indications du fournisseur (Zymed).
3.5 ANALYSE DE L’EXPRESSION DES PROTÉINES VIRALES
3.5.1 Immunodétection et localisation.
3.5.1.1 Immunofluorescence.
Deux protocoles de fixation ont été utilisés :
3.5.1.1.1 Fixation à l’alcool-acétone.
Les cellules fixées par un mélange alcool-acétone (3/4-1/4) sont incubées à -20°C pendant 30
min, puis sont séchées à l’air libre. L’anticorps monoclonal est dilué dans une solution contenant
du PBS-Tween 20 (0,05%) puis incubé à 37°C pendant 1 h. Après 3 lavages en PBS-Tween 20,
les cellules sont incubées pendant 1 h en présence de l’anticorps anti-souris couplé à la
fluorescéine (Sigma) dilué au 1/200 en PBS-Tween 20. Les cellules sont de nouveau lavées dans
les mêmes conditions précédemment décrites et observées en IFI après montage en vectashield
(vector).
3.5.1.1.2 Fixation à la paraformaldéhyde.
Les cellules sont fixées à la paraformaldéhyde à 4% en PBS dutant 15 min. à T°C ambiante,
rincées 3 fois en PBS, puis perméabilisées en PBS 1% Triton X-100 durant 15 min. Les cellules
sont ensuite rincées 3 fois en PBS puis incubées une nuit à 4°C en PBS contenant 1% BSA et
0,5% Triton X-100. L’anticorps monoclonal est incubé à 37°C dans une solution PBS contenant
1% BSA et 0,5% Triton X-100. Après 3 rinçages en PBS 0,5% Triton X-100, les cellules sont
incubées en présence de l’anticorps anti-souris couplé à la fluorescéine dilué au 1/200 en PBS
contenant 1% BSA et 0,5% Triton X-100. Les cellules sont à nouveau lavées 3 fois en PBS 0,5%
Triton X-100, puis observées en IFI après montage en vectashield (vector).
3.5.1.2 Coupes de plumes infectées.
Les prélèvements de plumes congelés sont enrobés dans un liquide cryoprotecteur (cryomatrix,
Shandon, Pittsburgh, PA) permettant de fixer les blocs sur le porte objet du cryostat. Les coupes
de 9 à 10 µm d’épaisseur sont déposées sur des lames dégraissées (SuperFrost Plus, MenzelGlaser, Allemagne) et fixées à l’alcool-acétone à –20°C pendant 20 min. Les lames sont ensuite
séchées à l’air libre avant d’être utilisées dans des expériences d’IFI (cf supra).
3.5.2 Protocoles d’extraction des protéines.
3.5.2.1 Extraits nucléaires.
Les cellules High Five et les CESC sont remises en suspension et lavées 2 fois en PBS. Le culot
cellulaire est incubé 10 min. à 4°C en PBS avec 1% de NP40 puis centrifugés pendant 10 min. à
1400 g. Le culot obtenu est resuspendu dans un tampon hypertonique (400 mM NaCl, 0,1 mM
EDTA, 10 mM HEPES pH 7.9) (Elliott et O'Hare, 1997) contenant 1% de triton X100 et
centrifugé à 15000 g pendant 1 min. Le culot final (l’extrait nucléaire) est resuspendu dans le
tampon de charge et traité par sonication.
3.5.2.2 Extraits hypertoniques.
Les cellules High Five sont resuspendues dans le tampon hypertonique, subissent un cycle de
congélation-décongélation puis sont centrifugées à 2500 g pendant 10 min (Elliott et O'Hare,
1997). Le surnageant (l’extrait hypertonique) est conservé à –80°C jusqu’à utilisation.
3.5.3 Techniques électrophorétiques et immunoempreinte.
3.5.3.1 Electrophorèse sur gel de polyacrylamide.
Les protéines sont analysées par électrophorèse dénaturante en gel de polyacrylamide-SDS
(Laemmli, 1970) puis sont révélées par coloration au Bleu de Coomassie en incubant le gel dans
une solution à 4 g/l de Bleu de Coomassie R250 (Sigma) dans un mélange éthanol 20%-acide
acétique 10%.
3.5.3.2 Immunoempreinte.
Après migration sur gel de polyacrylamide (cf V.C.1), les protéines sont transférées sur des
membranes de nitrocellulose renforcées (Macherey Nagel) par électrophorèse en tampon CAPS
10 mM pH 11 (Sigma) pendant 1 h. à 50 volts. Les membranes sont incubées à 4°C pendant 1
nuit en présence d’une solution Tris-HCl 20 mM pH 7,4, NaCl 150 mM, Tween 20 0,05% et 3%
lait écrémé (solution I). Les membranes sont ensuite incubées pendant 1 h à 35°C en présence de
l’anticorps monoclonal, lavées et incubées avec un anticorps anti-souris couplé soit à la
phosphatase alcaline soit à la peroxidase (Sigma). Entre chaque étape, les membranes de
nitrocellulose sont lavées par une solution Tris-HCl 20 mM pH 7,4, NaCl 150 mM, Tween 20
0,05% et 1% lait écrémé en 3 étapes (15 min puis 2 fois 5 min). La présence des anticorps est
révélée par la réaction de la phosphatase alcaline avec son substrat (BCIP) en présence de NBT
(ZYMED) ou par la réaction de la péroxydase à l’aide du kit ECL (Amersham).
3.5.3.3 Immunoprécipitation (Ipcp).
Vingt-quatre heures après infection par les Baculovirus recombinants, les Sf9 sont incubées en
présence de méthionine S35 (3,7 106 Bq par puits de P6) ou de phosphore P33 (22,2 105 Bq par
puits de P6). Après 24 heures d’incubation, les cellules sont lysées en tampon hypertonique,
centrifugées à 1800 t/min (IEC, rotor 3229) pendant 5 min. puis resuspendues. Les lysats sont
centrifugés à 15000g et conservés à -20°C. L’immunoprécipitation est réalisée en tampon RIPA
(50 mM Tris-HCl pH 8, 200 mM NaCl, 1% Triton X100). A 200 µl de tampon RIPA sont
ajoutés 200 µl de lysat et 1 µl d’anticorps monoclonal (ascite). Le mélange est incubé 1 à 2
heures à température ambiante, additionné d’anticorps anti-immunoglobulines de souris au 1/500
(Sigma) et incubé pendant une dizaine de minutes. Les complexes Ag/Ac sont précipités par la
protéine A Sepharose {PAS} (Protéine A-Sepharose CL4B - Pharmacia); 35 µl d’une suspension
de PAS en tampon RIPA sont ajoutés au mélange réactionnel et l’ensemble est incubé pendant
30 min sous agitation. Après 4 lavages en tampon RIPA, les complexes Ag/Ac sont décrochés
des billes et dénaturés par ébullition durant 1 min en tampon de dissociation (25 µl/réaction). La
PAS est éliminée par centrifugation et le surnageant est déposé sur un gel de polyacrylamide (cf
V.C.1). Après électrophorèse, les gels sont incubés 15 min en fixateur-décolorant, puis 10 min en
Amplify (Amersham). Les gels sont séchés et mis au contact d’un film d’autoradiographie.
3.6 DÉTERMINATION DE L’ACTIVITÉ DE LIAISON À L’ADN.
(cf Dorange et al., 2000).
3.7 ESSAI D’IMPORTATION DE LA PROTÉINE VP22.
Les extraits hypertoniques contenant les protéines VP22 et VP22 tronquées sont dilués au 1/5
dans le milieu de culture adéquat puis ajoutés sur le tapis composé de cellules semi-confluentes
d’un jour maximum. Dans le cas des études d’importation dans les cellules COS-7 dont le réseau
de microtubule a été désorganisé, les cellules sont préalablement incubées pendant 90 min. en
présence de 10 µg/ml de nocodazole (Sigma) dilué en DMEM.
3.8 ACTIVITÉ LUCIFÉRASE.
Les CESC sont incubées en P24 puis transfectées par une quantité commune de plasmides
d’intérêt à l’aide de lipofectin 24 h après. Deux jours après post-transfection les cellules sont soit
fixées à l’alcool-acétone soit reprises dans 100 ul de tampon luciférase (Tris-HCl pH7,4 25 mM,
MgCl2 8 mM, DTT 1 mM, EDTA 1 mM, Triton X100 1%, BSA 1 % et glycérol 15%) (Nguyen
et al., 1988). L’activité luciférase est mesurée par un luminomètre (Automat LB 953 Berthold)
qui injecte automatiquement 100 µl de tampon luciférine (50 ml de tampon luciférase, 50 µl de
luciférine à 6,25 mg/ml et 20 µl d’ATP à 100 mM). La lecture est effectuée 5 ms après injection
et sur une période de 10 s.
3.9 OBTENTION DE VIRUS DE LA MALADIE DE MAREK
DÉLÉTÉS : L’UTILISATION D’UN BAC (CHROMOSOME
ARTIFICIEL BACTÉRIEN).
3.9.1 Mutagénèse.
Le BAC20 qui contient l’intégralité du génome de la souche 584A80p du MDV1, a été obtenu
antérieurement (Fig 15) (Schumacher et al., 2000). La mutagénèse est réalisée dans les bactéries
DH10B qui possèdent le BAC20 et le plasmide pGETrec nécessaire à la recombinaison
homologue. L’obtention des virus délétés est réalisé par la transformation de ces bactéries par un
fragment PCR contenant le gène de résistance à la kanamycine (kanR) et à ses extrémités les
séquences bordantes le gène à déléter (Fig. 15) (Schumacher et al., 2000). Les amorces utilisées
pour l’obtention de ce fragment kanR sont décrites dans le tableau 6.
Figure 15: Obtention du BAC20 et des virus délétés.
fig15
Tableau 6 : Séquences des oligonucléotides utilisés pour l’amplification de la séquence kanR et
l’obtention des virus délétés
tabl6
3.9.2 Analyse de l’ADN.
L’insertion du gène de résistance à la kanamycine apporte un site de restriction HindIII
supplémentaire au BAC20, ce qui permet de sélectionner les clones sur profil électrophorétique.
Des minipréparations puis des maxipréparations d’ADN plasmidique sont réalisées pour vérifier
le profil électrophorétique en digestion HindIII des BAC20 délétés.
La présence du gène de résistance à la kanamycine et l’absence du gène ciblé sont vérifiées par
southern blot (Dorange et al., 2001).
Les sites d’insertion du fragment kanR ont été vérifiés par séquençage en utilisant les amorces
kan1 et kan2.
3.9.3 Transfection des BAC.
La transfection des différents BAC est réalisée par la technique de transfection au chlorure de
calcium (Morgan et al., 1990). Le mélange contenant 1 µg d’ADN, 50 µl de Tris HCl pH 7,5 20
mM, 388 µl d’eau et 62 µl de CaCl2 2M (ajoutés sous agitation), est incubé la nuit à 4°C, puis
500 µl d’HBSS 2X pH 7 (50 mM HEPES ; 1,5 mM Na2HPO4 ; 280 mM NaCl) sont ajoutés sous
agitation. Cinq cent µl de mélange de transfection sont ajoutés sur les cellules en culture dans
500 µl de milieu de culture. Après 30 min d’incubation, les cellules sont rincées 1 fois en PBS,
puis incubées 2 min en présence d’HBSS glycerol 15%. Les cellules sont de nouveau rincées en
PBS puis cultivées en milieu complété à 2,5% SVF (QM7) ou 1,5% SVF et 1% SP (CESC).
3.9.4 Titrage des virus délétés.
Après amplification du titre viral par passages successifs sur CESC, les inoculums viraux sont
congelés dans 95% SVF et 5% DMSO dans plusieurs tubes de contenance identique. Un tube est
décongelé puis titré sur CESC. A l’aide d’un second tube, les CESC sont infectées à 100 u.f.p./2
X 106 cellules (puits de P6) puis trypsinées à 0, 4, 8, 24, 28, 48, 72, 96, 120, 144, 168 h. et
l’inoculum est titré sur CESC fraichement préparées. Chaque courbe de croissance est effectuée
2 fois pour chaque virus.
Le nombre d’unité infectieuse produite par plage est calculé en divisant le nombre de plages
obtenues après trypsination des cellules à un temps donné par le nombre de virus formant plages
au temps 0 qui est approximativement de 100.
4
RESULTATS
4.1 CLONAGE
ET
SÉQUENÇAGE
DES
PRODUITS
PCR
OBTENUS.
Nous avons choisi d’obtenir les gènes UL49,5, UL49, UL48, UL47 et UL46 et les séquences
UL49-48 et UL49,5-48 par amplification à partir d’ADN provenant de tumeurs lymphoïdes.
Notre premier travail a été de vérifier la séquence nucléotidique et de repérer des différences de
séquences nucléotidiques par rapport aux souches GA et Md5, dues à la souche utilisée (RB1B)
ou/et à des erreurs d’amplification de l’ADN provoquées par la Taq polymérase.
Les divers fragments PCR, clonés dans le pGEM-T, ont été séquencés, et les modifications de
séquences nucléotidiques par rapport aux souches GA et Md5 sont décrites ci-dessous (Tableau
7).
Tableau 7: Description des modifications de séquences nucléotidiques trouvées pour la souche
RB1B par rapport aux séquences des souches GA et Md5. La position et la nature des
modifications sont indiquées ainsi que le changement éventuel de l’aa correspondant. Trois
séquences UL49-48 ont été obtenues à partir de trois amplifications différentes et nommées de
UL49-48 (1) à (3). Dans ces séquences, le gène touché par la modification est indiqué.
Abréviations : id : identique (100% d’homologie) ; RI : région intergénique (107 nt).
Gènes et séquences
GA
Md5
UL49,5
id
id
UL49 (750 nt)
244 (G-A) ala-thr
244(G-A)ala-thr
360 (C-T)
UL48 (1284 nt)
id
265(T-C)tyr-his
671(A-G)asp-gly
861(T-C)
1269 (C-T)
UL47 (2427 nt)
497(C-G)ala-gly
497(C-G)asp-gly
1175(G-A)arg-lys
981(C-T)
1390 (C-T) leu-phe
1175(G-A)ala-lys
1390(C-T)leu-phe
1987 (A-G) thr-Ala
UL46 (1707 nt)
209 (T-C) leu-pro
UL49-48 (1) (2141 nt)
244(G-A)ala-thrUL49
209 (T-C) leu-pro
846(C-T)RI
1449 (C-T) arg-lys
UL49-48 (2) (2141 nt)
UL48
244(G-A)ala-thrUL49
1055(T-C)UL48
1382(G-A)met-ileUL48
1956 (A-G) lys-gluUL48
UL49-48 (3) (2141 nt)
775(A-C)RI
855(A-T)RI
1667 (G-A)UL48
Les mutations observées sont soit silencieuses soit génératrices de changement d’un aa (Tableau
7) ; toutefois nous avons obtenu au cours d’une amplification du gène UL49 de la souche RB1B, un clone bactérien présentant une délétion d’un nucléotide à la position 465. Cette délétion
entraîne une rupture du cadre de lecture et aboutit à une interruption prématurée de ce dernier.
Ce gène, UL49M1, code pour une protéine tronquée, VP22S, d’une taille de 168 aa dont les 154
premiers aa N-terminaux correspondent à la séquence primaire de VP22 (Fig. 16) (Dorange et
al., 2000).
De façon similaire, lors d’une amplification de la séquence UL49-48, nous avons mis en
évidence une mutation affectant le gène UL49 à la position 562 (C-T). Cette mutation aboutit à
l’introduction d’un codon stop, raccourcissant le cadre ouvert de lecture de la protéine VP22
(Fig. 16). Ce gène, UL49-48M2 codent pour une protéine de 187 aa appelée VP22MS.
Au cours de l’étude des propriétés de la protéine VP22, nous avons voulu déléter une partie de sa
région N-terminale, qui pourrait posséder un signal de localisation nucléaire consensus constitué
d’acides aminés basiques (RRKSERRR) et un signal moins consensuel mais similaire au signal
de localisation nucléaire de la protéine phosphorylée P du virus de la maladie de Borna (Izumiya
et al., 1998, Schwemmle et al., 1999 ). Les gènes UL49N1, UL49N2 (Fig. 16) codant pour les
protéines VP22N1 et VP22N2 tronquées dans leur partie N-terminale, respectivement des aa 1 à
15 et 1 à 37, ont été obtenus par mutagénèse dirigée en utilisant le gène UL49 de la souche RB1B comme matrice (Dorange et al., 2000).
Figure 16 : Séquence de la protéine VP22 de la souche RB-1B et des protéines tronquées
VP22N1, VP22N2, VP22MS et VP22S.
fig16
L’ensemble des gènes clonés et séquencés dans le pGEM-T, a été sous-cloné dans les vecteurs
pET22B+, pFastBac et pcDNA3 (p) (Dorange et al., 2000).
4.2 EXPRESSION
DES
PROTÉINES
EN
SYSTÈME
BACULOVIRUS/CELLULES D’INSECTE
4.2.1 Obtention des baculovirus recombinants.
Nous avons choisi le système BAC-to-BAC (GibcoBRL) qui décrivait une obtention de
baculovirus recombinants en 7 jours, avec une efficacité de transposition de 100% dans les
colonies blanches. Ce système s’est révélé efficace, avec au moins l’obtention d’un baculovirus
recombinant pour trois clones bactériens testés pour chaque gène. La stratégie de criblage des
bacmides recombinants et l’obtention des baculovirus recombinants ont été décrites (Dorange et
al., 2000). La présence des gènes d’intérêt a été vérifiée pour chaque baculovirus recombinant
par amplification en utilisant l’ADN extrait des particules virales présentes dans le surnageant de
culture (Fig. 17).
BAC-
BAC-
UL48
UL49
Figure 17: Analyse en gel d’agarose 1% de l’ADN du baculovirus extrait d’un surnageant de
cellules infectées, et mise en évidence de la présence des gènes d’intérêt dans ces baculovirus par
amplification. Amplification des gènes UL48 et UL49, respectivement à partir de l’ADN du Bac
UL48 et du Bac UL49. T : puit contrôle sans ADN
fig17
UL48
UL49
T
Les baculovirus recombinants sont présentés dans le tableau 8. Le titre viral des différents
7
8
baculovirus recombinants varie de 5 x 10Fig
à 117:
x 10
u.f.p/ml.
Analyse en
1300
750
gel d’agarose 1% de l’ADN du
baculovirus extrait d’un surnageant de cellules
infectées, et mise en évidence de la présence
des gènes d’intérêt dans ces baculovirus par
amplification.
Amplification
des
gènes
UL48
et
UL49,
respectivement, à partir de l’ADN du Bac UL48 et
du Bac UL49. T : puit contrôle sans ADN.
Tableau 8 : Liste des différents baculovirus recombinants obtenus codant pour les protéines
étudiées.
tabl8
4.2.2 Détection des protéines.
Nous avons voulu présenter ici une synthèse rassemblant des résultats publiés concernant les
protéines VP22 et VP16 (Dorange et al., 2000) et des résultats non encore publiés concernant les
protéines VP13/14 et VP11/12.
Dans les extraits totaux de cellules High Five infectées par les différents baculovirus
recombinants, les protéines recombinantes sont difficilement détectables par coloration directe
des gels de polyacrylamide au bleu de Coomassie, à l’exception de la protéine VP22 et de ses
formes tronquées (Dorange et al., 2000). Afin de détecter ces protéines, nous nous sommes
placés dans des conditions optimales d’expression et nous avons réalisé des extractions
différentielles permettant de « concentrer » ces protéines en nous donnant des éléments sur leur
localisation. L’expression de ces protéines VP22 recombinantes est maximale dans des cellules
High Five infectées à une m.o.i. de 1 u.f.p/cellule pendant 72 h. et nous avons donc choisi de
nous placer à 72 h. p.i pour analyser l’expression de toutes les protéines recombinantes. De plus,
l’analyse de la séquence primaire des quatre protéines montre que les protéines VP22, VP13/14
et VP11/12 possèdent respectivement un point isoélectrique de 10,2 ; 9,7 et 8,7 souvent associé à
la localisation nucléaire des protéines, ce qui nous a conduit à réaliser des extraits nucléaires de
cellules d’insecte.
L’analyse électrophorétique des protéines non solubilisées par le NP40 1% et le Triton X100 1%
(protéines nucléaires et protéines insolubles) nous a permis de mettre en évidence la production
de toutes les protéines recombinantes exprimées en cellules d’insecte (Fig. 18).
La protéine VP22 est détectée dans les extraits nucléaires des cellules infectées par Bac UL49, et
apparaît sous 2 formes électrophorétiques majeures d’environ 29 et 27 kDa (Fig. 18A et 18B), la
dernière correspondant à la masse moléculaire prévue de VP22. La bande de 29 kDa pourrait être
une forme modifiée de la protéine VP22. Les protéines VP22 tronquées en N- et C- terminales,
VP22S, VP22MS, VP22N1 et VP22N2 présentent également une masse moléculaire apparente
supérieure à celle prédite (24, 25, 28 et 26 kDa au lieu de 19, 21, 26 et 23,5 (Fig. 18B) (Dorange
et al., 2000).
La protéine VP16 est détectée dans les extraits nucléaires des cellules infectées par Bac UL48
sous forme d’une bande distincte de 49 kDa qui correspond à la masse moléculaire prévue de
VP16 (Fig. 18A et 18B). La protéine VP16 n’est pas détectée dans ces mêmes conditions dans
les extraits nucléaires des cellules infectées par Bac UL49-48, alors que la protéine VP22 est
détectée dans ces extraits (Fig. 18A et 18B). Une absence de synthèse de la protéine VP16 à
partir du messager bicistronique a donc été envisagée lors d’une infection virale et l’étude de son
expression à partir des séquences UL49-48 et UL49,5-48 a été réalisée dans des systèmes
d’expression aviaires et mammaliens (cf infra) (Dorange et al., 2000).
Les protéines VP13/14 et VP11/12 présentent une masse moléculaire légèrement supérieure à
celle prévue (100 et 80 kDa au lieu de 92 et 64 kDa, respectivement) (Fig. 18A). Ces différences
entre les masses moléculaires prévues et celles visualisées sont couramment observées pour les
protéines des herpèsvirus et peuvent être dûes à un défaut de migration des protéines riches en
proline et/ou à des modifications post-traductionnelles de ces protéines recombinantes (cf infra).
Figure 18: Détection des protéines recombinantes exprimées dans le sytème baculovirus/cellule
d'insecte. Séparation en gel de polyacrylaminde et coloration au bleu de Coomassie des extraits
nucléaires de cellules High five infectées avec les baculovrirus recombinants codant pour les
protéines VO16, VP22, VP13/14 et VP11/12 (A) et pour les protéines VP22 et VP22 tronquées
(B). Dans ces extraits, la protéine VP22 est détectée sous la forme de deux formes
électrophorétiques notées *
fig18
4.3 OBTENTION ET CARACTÉRISATION DES ANTICORPS
MONOCLONAUX (ACMO).
L’injection à des souris Balb/C d’extrait total de cellules High Five infectées par le Bac UL49 a
permis d’obtenir l’AcMo D18 (tableau 9). Cet AcMo détecte, en immunofluorescence indirecte,
les protéines VP22, VP22N1, VP22N2 et VP22MS recombinantes exprimées en cellule d’insecte
mais ne détecte pas la protéine VP22S. Une seconde fusion a été réalisée après injection d’un
extrait nucléaire de cellules High Five infectées par le Bac UL49 et les AcMo B12, B17, D1, G4,
G22 et L13a ont été obtenus (Tableau 9). Parmi ces 7 AcMo anti-VP22, un seul, l’AcMo G22,
détecte la protéine VP22S recombinante. La protéine VP22MS qui est plus longue de 33 aa que
la protéine VP22S est reconnue par tous les AcMo excepté l’AcMo G4, ce qui suggère que cette
séquence de 33 aa est d’une grande importance pour la conservation de l’immunoréactivité de la
protéine. L’AcMo L13a reconnaît en immunoempreinte la protéine VP22 dénaturée à une masse
moléculaire de 30 kDa (Fig. 19).
Les AcMo I13 (anti-VP16), L13B (anti-VP13/14) et J3 (anti-VP11/12) ont été obtenus par
l’injection à des souris d’extraits nucléaires de cellules High Five infectées respectivement par
les Bac UL48, Bac UL47 et Bac UL46 (Tableau 9). Les AcMo I13 et J3 détectent les protéines
VP16 et VP11/12 dénaturées en immunoempreinte à des masses moléculaires de 49 et 80 kDa
respectivement (Fig. 19), alors que l’AcMo L13B ne réagit pas en immunoempreinte.
La protéine recombinante VP22 produite dans le système baculovirus/cellule d’insecte et
marquée au S35 est immunoprécipitée par tous les AcMo anti-VP22 excepté l’AcMo G4 (Fig.
20). La protéine VP16 est immunoprécipitée par l’AcMo I13 dans les mêmes conditions (cf
infra). L’immunoprécipitation des protéines VP13/14 et VP11/12 a été réalisée après traduction
dans le système TnT7-lysat de réticulocyte de lapin. Seule la protéine VP13/14 est
immunoprécipitée par son AcMo respectif L13B (résultats non montrés).
Tableau 9 : Caractérisation des AcMo dirigés contre les protéines VP22, VP16, VP13/14 et
VP11/12.
AcMo
Protéines
détectées Isotype des Détection de l’activité des AcMo
VP22, N1, N2, MS, S AcMo
Western blot
Ipcp
B12
+
+ +
+ -
IgG2b
-
+
B17
+
+ +
+ -
IgG2b
-
+
D1
+
+ +
+ -
IgG1
-
+
D18
+
+ +
+ -
IgG1
-
+
G4
+
+ +
- -
IgG1
-
-
G22
+
+
+
IgG1
-
+
L13a
+
+ +
IgG2a
+
+
+
+
+ -
I13
VP16
IgG1
+
+
L13b
VP13/14
IgG1
-
+
J3
VP11/12
IgG2b
+
-
Figure 19: Analyse en immunoempreinte des protéines VP22, VP16 et VP11/12 contenues dans
les extraits nucléaires des cellules High Five infectées par les baculovirus recombinants en
utilisant respectivement les AcMo L13a, I13 and J3.
fig19
Figure 20: Immunoprécipitation de la protéine VP22 exprimée en cellule d'insecte. La protéine
VP22 recombinante marqué au s35 est extraite des cellules High Five infectées par le Bac UL49,
puis est immunoprécipitée par les diff érents AcMo anti-VP22 ou l’AcMo anti-VP16 I13. De
même la glycoprotéine gB est détectée dans les mêmes conditions par l’anti-gB K11.
fig20
4.4 MODIFICATIONS
POST-TRADUCTIONNELLES
:
PHOPHORYLATION
Les protéines VP22, VP13/14 et VP11/12 présentant des masses moléculaires supérieures à
celles prévues, l’étude de leurs modifications post-traductionnelles a donc été initiées. Leur
homologue chez HSV-1 et BHV-1 étant phosphorylées durant le cycle viral, l’étude de leur
phosphorylation a été menée dans le système baculovirus/cellule d’insecte. En marquage S35, les
protéines VP22, VP22MS et VP16 sont détectées et présentent des masses moléculaires
respectives de 33 et 29 kDa (VP22), 23 et 22 kDa (VP22MS) et 49 kDa (VP16) (Fig. 21A). En
marquage P33, les protéines VP22 et VP22MS sont détectées également sous la forme de deux
bandes de masses moléculaires identiques à celles observées aux marquage S35 (Fig. 21B). Par
opposition, la protéine VP16 ne semble pas être phosphorylée dans ce système (Fig. 21B)
(Dorange et al., 2000).
L’étude des résidus pouvant subir une phosphorylation a été réalisée dans ce système
d’expression à l’aide d’Ac spécifiques des sites de phosphorylation (Zymed). Les protéines
phosphorylées présentes dans les extraits nucléaires de cellules d’insecte sont détectées en
immunoempreinte à l’aide de ces Ac (Fig. 22).
Les protéines VP22 et VP13/14 semblent posséder des sites de phosphorylation sur les trois
résidus sérine, thréonine et tyrosine (Fig. 22). La protéine VP11/12 semble être phosphorylée sur
les résidus thréonine et tyrosine. Par contre la protéine VP16 n’est détectée par aucun Ac, ce qui
confirme les expériences antérieures.
Figure 21 : Immunoprécipitation des protéines VP22 et VP16 radiomarquées au S35 ou au P33.
fig21
Figure 22 : Etude de la phosphorylation des protéines VP22, VP16, VP13/14 et VP11/12.
fig22
4.5 DÉTECTION ET CARACTÉRISATION DES PROTÉINES
VIRALES
L’obtention des AcMo nous a permis de suivre la synthèse de ces quatre protéines lors d’une
infection virale. Dans les cellules embryonnaires de peau de poulet (CESC) où la réplication du
MDV est semi-permissive (pas de virus extracellulaires formés), la souche RB-1B du virus
MDV1 induit un effet cytopathogène qui se traduit par la formation de plages de cellules
infectées arrondies caractéristiques du virus MDV. L’expression de ces protéines sera également
étudiée dans les cellules épithéliales des follicules plumeux où la réplication virale est complète
et lors de la réactivation du virus dans les lignées lymphoblastoïdes MSB-1.
Nous nous sommes plus particulièrement attaché à décrire les propriétés de la protéine VP22, en
raison de sa forte expression dans les cellules infectées par le virus MDV. Par ailleurs, la faible
expression de la protéine VP16 dans ces cellules, nous a incitée à étudier sa traduction à partir
des messagers bi- et tri-cistroniques reportés coder pour la protéine VP16 dans les cellules
infectées.
4.5.1 Protéine VP22
4.5.1.1 Détection de la protéine VP22
4.5.1.1.1 CESC infectées par MDV1
La protéine VP22, détectée en IFI par les sept AcMo, est très fortement exprimée dans les CESC
infectées par le MDV (Dorange et al., 2000). La protéine VP22, présente dès 4 h après
l’infection, semble augmenter en quantité pendant toute la durée de l’infection. Ce résultat reste
cependant à nuancer car les cellules ne peuvent pas être infectées de façon synchronisée et les
cellules infectées issues de l’inoculum et fixées sur le tapis expriment la protéine VP22.
Cependant, ces cellules présentent des aspects différents qui permettent de les distinguer. En
effet, les cellules de l’inoculum, souvent endommagées, présentent une forte fluorescence et sont
situées au dessus du tapis cellulaire, alors que les cellules nouvellement infectées, peu
endommagées et situées dans le tapis cellulaire, présentent une fluorescence moins intense dans
les premiers stades de l’infection virale.
En immunoempreinte, la protéine VP22 est détectée par l’AcMo L13a dans les extraits totaux et
dans les extraits nucléaires des CESC infectées par MDV. Sa masse moléculaire est estimée à 30
kDa, et est similaire à celle observée pour la protéine VP22 recombinante (Fig. 23). La protéine
VP22 est également détectée par coloration au bleu de coomassie dans cet extrait nucléaire, ce
qui suggère que cette protéine est une protéine virale majeure (Fig. 23).
Figure 23 : Analyse de l'expression de la protéine VP22 dans les CESC en immunoempreinte.
(A) Profils protéiques des extraits cellulaires et nucléaires colorés au bleu de Coomassie et (B)
analyse par immunoempreinte de l’expression de VP22 en utilisant l’AcMo L13a. Lignes 1 et 2 :
extraits totals de CESC infectées (1) et non infectées (2) ; ligne 3 et 4 : extraits cytoplasmique (3)
et nucléaire (4) des CESC infectées.
fig23
Dans ces conditions d’extraction, VP22 semble être une protéine majoritairement associée à ce
que nous définissons comme un compartiment nucléaire.
Nous avons également étudié la localisation de la protéine VP22 en immunofluorescence
indirecte qui nous semblait être la méthode la plus adaptée pour cette étude. Cette étude a été
initiée en fixant les cellules à l’alcool-acétone qui était le mode de fixation couramment utilisé au
laboratoire (Dorange et al., 2000). Cependant, certains auteurs notaient des artéfacts de détection
lors de la fixation de la protéine VP22 d’HSV-1 par des solvants organiques, et nous avons voulu
également étudier la localisation de VP22 après fixation par la paraformaldéhyde. Nous avons
ainsi pu montrer que la détection de VP22 différait à la fois en fonction de l’AcMo et des
procédés de fixation utilisés.
Pour faire face à ces difficultés d’interprétation du signal de fluorescence, l’étude de la
localisation de la protéine VP22 a été étudiée en double marquage en utilisant soit des AcMo
dirigés contre la protéine majeure de capside VP5 (F19 et H18), protéine majoritairement
nucléaire, soit un anticorps dirigé contre la glycoprotéine gB, protéine majoritairement
cytoplasmique. La détection de ces deux protéines (VP5 et gB) par leur AcMo respectif s’est
avérée identique quelque soit le mode de fixation.
Les AcMo L13a, D18, D1 et G4 détectent la protéine VP22 majoritairement dans le noyau des
cellules infectées fixées à l’alcool-acétone (Fig. 24A). En co-localisation, les protéines VP22 et
VP5 sont détectées dans le compartiment nucléaire des cellules infectées (Fig. 24A). Cette colocalisation n’est cependant pas parfaite, VP22 apparaît plutôt diffuse dans le noyau avec une
localisation préférentielle au niveau de la membrane nucléaire ; VP5 détectée en fluorescence,
apparaît moins diffuse que VP22, se présentant majoritairement sous forme de granules
intranucléaires et très brillants. Ces différentes localisations au sein de la cellule pourraient
déterminer les sites de réplication ou d’assemblage de la capside (VP5) et les sites du premier
enveloppement (pourtour nucléaire VP22). Ces mêmes AcMo (D18, L13a et D1) détectent la
protéine VP22 dans la totalité (noyau et cytoplasme) des cellules infectées et fixées en
paraformaldéhyde (Fig. 24Ba et 24Bb), excepté l’AcMo G4 qui détecte la protéine VP22
majoritairement dans le cytoplasme de ces cellules.
L’AcMo B17 détecte la protéine VP22 majoritairement soit dans le noyau soit dans le
cytoplasme des cellules infectées fixées à l’alcool-acétone. Ces différences dans la détection de
VP22 pourraient être dues à différents stades de réplication virale. Cependant, lorsque les
cellules sont fixées en paraformaldéhyde, la protéine VP22 reconnue par l’AcMo B17 est
détectée majoritairement dans le cytoplasme des cellules infectées (Fig. 24Bc).
Figure 24 : Etude de la localisation de la protéine VP22 dans les CESC infectées par le MDV-1.
Les CESC sont fixées soit à l’alcool-acétone (A) soit à la paraformaldéhyde (B) puis incubées
avec les AcMo indiqués marqués soit au vert Oregon (OG) soit au rouge Texas (TR). Les
cellules ont été examinées en microscopie confocale (A) où avec un objectif 40X en utilisant un
microscope à fluorescence équipé d’une caméra digitale TV Lens Nikon (B).
fig24
L’AcMo B12 détecte la protéine VP22 dans le cytoplasme des cellules infectées fixées par les
deux procédés.
La fluorescence visualisée en utilisant l’AcMo G22 est encore différente des autres, en localisant
la protéine VP22 sous forme de points plus ou moins gros dans la totalité des cellules infectées
fixées en alcool-acétone (Dorange et al., 2000). Lorsque les CESC sont fixées en
paraformaldéhyde l’AcMo G22 détecte principalement la protéine dans le cytoplasme des
cellules infectées. Ces résultats sont résumés dans le Tableau 10.
Conscient du fait que la localisation de la protéine puisse être aussi affectée par son interaction
avec d’autres protéines virales, nous avons étudié sa localisation dans des cellules exprimant de
façon permanente la protéine.
4.5.1.1.2 Etude des lignées QM7 exprimant les protéines VP22 et VP22 tronquées.
Nous avons été amenés à sélectionner au cours de ce travail des lignées QM7 exprimant de façon
permanente les protéines VP22 et VP22 tronquées, et pour des raisons d’organisation de nos
résultats, nous avons choisi d’étudier dans cette partie l’expression et la localisation de ces
protéines dans leurs lignées respectives. Il est important de noter les protéines VP22 sont
exprimées dans ces cellules de façon identique et synchrone au cycle cellulaire et que leur
localisation est indépendante de l’expression de protéines virales.
L’étude de la localisation de la protéine VP22 au cours de l’infection virale avait permis de
distinguer des différences entre AcMo quant à leur réactivité vis-à-vis des formes de VP22. Cette
étude confirme ces différences et permet de distinguer 2 catégories d’AcMo (Tableau 10) (Fig.
25). Premièrement, les AcMo qui présentent une image homogène pour tous les procédés de
fixation, et qui peuvent être également divisé en 2 sous-catégories : ceux qui détectent la protéine
VP22 majoritairement dans le noyau des cellules (L13a, D1 et D18) et ceux qui la détectent
majoritairement dans le cytoplasme de ces mêmes cellules (B12). La seconde catégorie
comprend les AcMo qui montrent une image variable en fonction du mode de fixation. Ainsi, les
AcMo G4 et B17 qui détectent majoritairement la protéine VP22 dans le noyau des cellules
QM7UL49 fixées à l’alcool-acétone, montrent une fluorescence majoritairement cytoplasmique
lorsque ces cellules sont fixées par la paraformaldéhyde. De même, l’AcMo G22 détecte la
protéine VP22 dans le cytoplasme des cellules QM7UL49 fixées à l’alcool-acétone, alors que la
Anticorps Monoclonaux
L13a, D1, B12
Cellules Fixation
Alcool-acétone
G4
B17
G22
localisation D18
N
CESC
+
-
+
+
Ponctuation
-
+
-
+
intracellulaire
+
-
-
-
-
+
+
+
+
+
+
-
+
+
+
-
+
-
-
-
+
-
-
-
-
+
+
+
+
-
C
Paraformaldéhyde N
C
Alcool-acétone
N
QM7
C
Paraformaldéhyde N
C
fixation de ces cellules par la paraformaldéhyde semble inhiber la détection de VP22.
Figure 25 : Etude en immunofluorescence indirecte de l'expression et de la localisation des
protéines VP22 et VP22 tronquées dans leur lignée respective. A) La lignée QM7UL49 est fixée,
1 jour après division, à l’AA ou à la PAF puis est incubée en présence des 7 AcMo anti-VP22.
B) Les lignées QM7UL49N1, QM7UL49N2 et QM7UL49-48M2 sont fixées à l’AA puis
incubées avec les AcMo D1 ou D18. Les cellules sont examinées avec un objectif 20X en
utilisant un microscope à fluorescence équipé d’une caméra digitale Nikon.
fig25
Tableau 10 : Réactivité des AcMo en fonction des procédés de fixation. Chaque AcMo montre
une image plutôt cohérente dans la localisation de VP22 dans les CESC infectées et dans la
lignée QM7UL49, sauf pour les AcMo B17 et G22.
Abréviations : N: nucléaire ; C: cytoplasmique. Les signes + et – signifient une forte et faible
détection.
Les protéines VP22 tronquées VP22N1, VP22N2 et VP22MS sont exprimées de façon
permanente respectivement dans les lignées QM7UL49N1, QM7UL49N2 et QM7UL49-48M2
(Fig. 25 o, p et q). Ces protéines sont détectées par les différents AcMo dans les mêmes
compartiments que la protéine VP22, sauf exception précisée ci-dessous.
Les AcMo G22 et B12 ne détectent pas ou très peu, respectivement, les protéines VP22N1,
VP22N2 et les protéines VP22N1, VP22N2 et VP22MS dans leurs lignées respectives.
Ces études nous ont également permis de mettre en évidence que les protéines VP22, VP22N1,
VP22N2 et VP22MS se lient aux chromosomes en phase mitotique dans les cellules en division
(Fig. 25 d, f, i, o, p et q). Cette liaison à l’ADN est visualisée lorsque les deux types de fixation
sont utilisés et ces résultats diffèrent de ceux de Elliott et O’Hare (2000) qui suggéraient que les
techniques de fixation des cellules utilisées pour l’IF induisaient une forte perte de cellules en
phase mitotique peu attachées au support.
4.5.1.1.3 Follicules plumeux des poulets infectés.
La protéine VP22 est détectée dans des sections de plumes de poulets infectés et semble se
localiser dans l’épithelium du follicule plumeux à côté de la couche cornée (Fig. 26).
Figure 26 : Immunofluorescence indirecte sur des sections de plumes de poulet infecté (RB1-B)
ou non-infecté en utilisant les AcMo D18 ou L13b. Les cellules ont été examinées avec un
objectif 20X en utilisant un microscope à fluorescence Olympus BH2.
fig26
4.5.1.1.4 MSB1
La protéine VP22 est détectée dans les lignées lymphoblastoïdes MSB1 en cours de réactivation.
La localisation de la protéine VP22 détectée par l’AcMo D18 est cytoplasmique et nucléaire en
fixation paraformaldéhyde (Fig. 27b), alors qu’elle apparaît majoritairement nucléaire en fixation
alcool-acétone (Fig. 27c).
Figure 27 : Analyse de l’expression de VP22 dans la lignée lymphoblastoïde MSB-1 en cours de
réactivation. Les cellules MSB-1 sont fixées soit en paraformaldéhyde (a, b et ab) soit en alcoolacétone (c, d et cd) puis incubées avec les AcMo indiqués marqués soit au vert Oregon (OG) soit
au rouge Texas (TR). La superposition des images est montrée dans la colonne de droite. Les
cellules ont été en microscopie confocale.
fig27
4.5.1.2 Etude des propriétés de VP22
4.5.1.2.1 Transport intercellulaire
La protéine VP22 possède des propriétés de diffusion dans les myotubes présents dans les tapis
de CESC infectées par le MDV (dorange et al, 2000). Une des remarquables propriétés de la
protéine VP22 du virus HSV-1 étant de diffuser de cellule à cellule, c’est-à-dire d’entrer dans la
cellule et de se relocaliser au noyau, les propriétés potentielles d’importation de la protéine VP22
du MDV-1 ont été étudiées. Plusieurs lignées cellulaires ont été testées pour leur capacité à
importer les protéines recombinantes VP22 et VP22 tronquées exprimées dans le système
baculovirus/cellules d’insecte. L’importation de la protéine VP22 recombinante dans les cellules
RK13 a été étudiée en fonction du temps. Les cellules sont fixées à l’alcool-acétone et la protéine
VP22 est détectée par l’AcMo D18. Après 5 min. d’incubation, la protéine VP22 est localisée
majoritairement dans le cytoplasme des cellules, à 10 min., VP22 se localise à la fois dans le
cytoplasme et le noyau et après 30 min. d’incubation, VP22 se localise majoritairement dans le
noyau des cellules, en formant un anneau périnucléaire (Fig. 28B). Par opposition, l’AcMo G22
détecte la protéine VP22 majoritairement dans le cytoplasme des cellules importatrices (Fig.
28C).
La protéine VP22 est capable de pénétrer dans des cellules de différentes lignées d’origine
aviaire ou mammalienne, LMH, COS-7, Sp2/O et MSB-1.
Les protéines VP22N1, VP22N2 et VP22MS peuvent être importées dans les cellules LMH, ce
qui suggère que la partie centrale de VP22 qui comprend les aa 38 à 188 est impliquée dans le
transport intercellulaire de VP22 (Fig. 28B).
Figure 28 : Importation de VP22. A) Profils protéiques (coloration au bleu de Coomassie) et
immunoempreinte des extraits hypertoniques de cellules d’insecte infectées par le bac UL49 (1)
et le bac UL48 (2). L’AcMo L13a a été utilisé en immunoemprreinte. B) Importation de VP22 en
fonction du temps. Les cellules RK13 sont fixées après 5, 10 ou 30 min. d’incubation. De même,
les cellules LMH sont incubées avec les protéines VP22, VP22N1 et VP22N2 pendant 45 min.
puis fixées à l’alcool-acétone. Les protéines recombinantes sont détectées en IFI avec l’AcMo
D18. C) La détection par l’AcMo G22 de la protéine VP22 importée dans les RK13 est
également représentée. Les cellules ont été examinées avec un objectif 40X en utilisant un
microscope Olympus BH2, excepté pour les cellules de l’image C) observées en microscopie
confocale.
fig28
La protéine VP22 d’HSV-1 étant associée aux microtubules au cours de l’infection virale, un
rôle éventuel des microtubules dans le trafic intracellulaire et dans la localisation nucléaire de la
protéine VP22 recombinante a été étudié dans des cellules importatrices. L’utilisation du
nocodazole, désorganisateur du réseau des microtubules n’empêche cependant pas l’importation
de la VP22 dans ces cellules (Fig. 29).
Figure 29 : Etude de l'importation de VP22 en présence d'un réseau de microtubules désorganisé.
Les cellules COS-7 ont été incubées en présence de nocodazole (a et c) ou n’ont pas été traitées
(b et d) puis les cellules sont incubées en présence de VP22 (c et d). Les cellules sont fixées puis
incubées avec AcMo anti-alphatubuline (a et b) ou anti-VP22 D18 (c et d). Les cellules ont été
examinées avec un objectif 40X en utilisant un microscope à fluorescence Olympus BH2.
fig29
4.5.1.2.2 Liaison à l’ADN
Nous avons étudié une interaction éventuelle entre la protéine VP22 et l’ADN, en raison du
caractère basique de la protéine (pHi = 10,8) et d’études démontrant que la protéine VP22
d’HSV-1, qui est une protéine fortement basique, est liée à la chromatine cellulaire au cours de
l’infection virale. Nous avons également précédemment observé que la protéine VP22 exprimée
de façon constitutive dans les cellules QM7UL49 se localise avec les chromosomes en phase
mitotique.
Ces expériences sont basées sur la capacité des protéines recombinantes, séparées en gel de
polyacrylamide puis transférées sur membrane de nitrocellulose et renaturée, à fixer des
fragments d’ADN marqués à la digoxigénine. Deux bandes majeures sont détectées dans les
extraits nucléaires, possédant des masses moléculaires de 33 et 30 kDa (Fig. 30), et
correspondant aux deux formes électrophorétiques de VP22 visualisées par coloration au bleu de
Coomassie.
Les protéines tronquées VP22N1, VP22MS et VP22S fixent également l’ADN, contrairement à
la protéine VP22N2 (Fig. 30). Ceci nous a conduit à estimer que les aa 16 à 37 jouent un rôle
majeur dans la liaison à l’ADN de la protéine VP22 (Dorange et al., 2000).
Figure 30 : Activité de liaison à l'ADN de VP22 et des protéines VP22 tronquées. Les mêmes
quantités d’extraits nucléaires de cellules High Five utilisés à la figure 1 ont été transférés des
gels de polyacrylamide sur les membranes de nitrocellulose. Ces membranes sont ensuite mise
en présence d’ADN marqué à la digoxigénine qui est détecté en utilisant un Ac anti-digoxigénine
conjugué à la phosphatase alkaline. Les protéines recombinantes présentes dans les extraits
nucléaires sont indiquées. La protéine majeure de capside L1 du papillomavirus-16 est une
protéine qui lie l’ADN.
fig30
4.5.2 La protéine VP16
4.5.2.1 Détection de la protéine VP16
La protéine VP16 est difficilement détectable dans les CESC infectées par le MDV et fixées à
alcool-acétone (Fig. 31a). Les photos présentant la détection en IFI des protéines VP16 dans les
CESC fixées à l’alcool-acétone sont très rares. La protéine VP16 est par contre détectée de façon
reproductible lorsque les CESC sont fixées à la paraformaldéhyde (Fig. 31b). Elle est détectée
majoritairement dans les cellules arrondies situées au centre des plages virales et au dessus du
tapis cellulaire (Fig. 31c). La protéine VP16 semble être majoritairement détectée dans la partie
cytoplasmique de ces cellules infectées. VP16 ne co-localise ni avec la protéine VP22, détectée
par l’AcMo D18, nucléaire en fixation alcool-acétone, ni avec la protéine VP5 lorsque les
cellules sont fixées à la paraformaldéhyde (Fig. 31a et 31c).
Figure 31 : Analyse en immunofluorescence de l'expression de la protéine VP16 dans les CESC
infectées par le MDV. Les CESC sont fixées soit à l’alcool-acétone soit à la paraformaldéhyde
puis incubées avec l’AcMo I13 qui est détecté en IFI et un autre AcMo marqués au rouge Texas
(TR). Les images présentées sont le résultat de la superposition des deux couleurs. Les cellules
ont été examinées avec un objectif 40X en utilisant un microscope à fluorescence équipé d’une
caméra digitale TV Lens Nikon.
fig31
La protéine VP16 n’a pas été détectée dans plusieurs coupes de plume, ni dans les lignées MSB1 en cours de réactivation.
4.5.2.2 Etude de la traduction de VP16.
La protéine VP16 d’HSV-1 étant une protéine essentielle à la réplication virale, présente en
quantité importante dans les cellules infectées, la faible détection de son homologue chez MDV
était surprenante. Une des explications entre ces différences d’expression, pourrait résider dans
les mécanismes de transcription de ces 2 gènes homologues. En effet, la protéine VP16 du MDV
est traduite à partir d’un messager bi et/ou tricistronique, alors que son homologue chez HSV-1
possède un transcrit qui lui est propre. Nous avons donc étudié la traduction de la protéine VP16
à partir du messager bicistronique UL49-48 et tricistronique UL49,5-48 dans différents systèmes
d’expression afin de comprendre si sa faible détection dans les cellules infectées pouvait être liée
à l’absence d’ARN messagers monocistronique correspondant à UL48.
Des expériences préliminaires effectuées dans le système baculovirus/cellule d’insecte, système
très efficace en terme de traduction de protéines, semblaient mettre en évidence un défaut de
traduction de VP16 à partir de la séquence UL49-48 par analyse des protéines en gel de
polyacrylamide. L’IFI confirme l’absence de la protéine VP16 dans ces cellules d’insecte
infectées par les Bac UL49-48 et Bac UL49,5-48, alors que la protéine VP22 est détectée lors de
ces deux infections.
Il est possible, cependant, que les mécanismes de traduction des cellules d’insecte diffèrent de
ceux des cellules aviaires ou mammaliennes, et que ces cellules soient incapables de traduire
efficacement des messagers polycistroniques. Nous avons donc voulu étudier la synthèse de
VP16 dans des systèmes d’expression in vitro (TNT7-lysat de réticulocytes de lapin) et dans des
systèmes d’expression in vivo aviaire et mammalien.
4.5.2.2.1 In vitro
L’étude de la transcription/traduction des séquences UL49-48 (1) à (3) a permis de mettre en
évidence la synthèse des deux protéines VP22 et VP16 présentant des masses moléculaires de 33
et 49 kDa, respectivement (Fig. 32A). L’immunoprécipitation des protéines de 33 et 49 kDa par
les AcMo D18 et I13 respectivement, (Fig. 32 A1-A2), confirme leur correspondance avec les
protéines VP22 et VP16. Les protéines VP16 et VP22MS sont également synthétisées à partir de
la séquence UL49-48M2 (Fig. 32 A1-A2).
Figure 32 : Etude de la traduction de VP16 à partir des messagers bi- et tri-cistroniques.
A) Transcription/traduction de la séquence UL49-48. Les protéines sont radiomarquées à la
méthionine S35 et séparées en gel de polyacrylamide. Les produits obtenus sont
immunoprécipités avec l'AcMo D18 (A1) ou I13 (A2).
Transcription/traduction des gènes UL48 (ligne 1), UL49 (ligne 2), UL49 plus UL48 (ligne 3)
UL49-48M2 (ligne 4), UL49-48 (1) (ligne 5), UL49-48 (3) (ligne 6) et UL49-48 (2) (ligne 7). M
: marqueur de poids moléculaire.
B) Transcription/traduction de la séquence UL49, 5-48.
Transcription/traduction des séquences UL49, 5-48 (ligne 1), UL49-48 (2) (ligne 2), UL49 (ligne
3) et IL48 (ligne 4)
fig32
La traduction de VP16 à partir du messager UL49,5-48, messager tricistronique détecté dans les
cellules infectées par le MDV, a également été étudiée.
La transcription/traduction de la séquence UL49,5-48 permet la synthèse des protéines VP16 et
VP22 (Fig. 32B). La protéine VP22 est produite en quantité faible si l’on compare à la
production de VP22 résultant de sa traduction à partir de la séquence UL49-48, alors que la
protéine VP16 semble être traduite de équivalente à partir des séquences UL49,5-48 et UL49-48.
La présence de la protéine gN (10 kDa) codée par UL49,5 n’a pu être mise en évidence. Les
protéines VP22 et VP16 synthétisées à partir de la séquence UL49,5-48 sont immunoprécipitées
par leur AcMo respectif (non montré).
Deux bandes de masses moléculaires plus basses sont détectées lors de la synthèse de la protéine
VP16 à partir des différentes séquences étudiées. Ces deux bandes de 43 et 48 kDa, qui sont
immunoprécipitées par l’AcMo I13, peuvent être attribuées à des initiations internes en phase
avec le premier codon méthionine du messager UL48 (Dorange et al., 2000).
Ce système nous a permis de confirmer que la protéine VP16 pouvait être synthétisée à partir du
messager bicistronique (Dorange et al., 2000, Koptidesova et al., 1995 ) mais également à partir
du messager tricistronique. Cependant, les ribosomes de réticulocytes peuvent initier la synthèse
protéique à tous les codons AUG (Joubert et al., 2000 , Kozak, 1989), nous avons donc entrepris
de suivre la synthèse de la protéine VP16 a été étudiée dans des systèmes d’expression in vivo
plus proches d’un environnement viral (virus de la vaccine T7 (vvT7)).
4.5.2.2.2 In vivo.
Nous avons voulu voir si un faible niveau de traduction de VP16 à partir des messagers UL49-48
ou UL49,5-48 pouvait rendre compte de sa faible détection dans les cellules infectées par le
MDV. Pour cela, nous avons choisi d’étudier la fonctionnalité des messagers polycistroniques
d’une part en détectant la protéine VP16 en IFI mais également en mesurant l’activité
enzymatique d’un gène rapporteur (luciférase) en remplacement du gène UL48 dans les
séquences UL49-48 et UL49,5-48 (Fig. 14).
La protéine VP22 qui est fortement exprimée à partir des séquences UL49-48 et UL49,5-48,
nous a servi de témoin d’expression et de transfection dans ces expériences.
Les expériences d’IFI ont été menées en parallèle en utilisant les constructions pET48, pET4948, p48 et p49-48.
Les gènes sous promoteur T7 sont transcrits à l’aide du virus de la vaccine T7 fournissant en
trans l’ARN polymérase T7. La protéine VP16 est détectée dans les CESC transfectées par p48
et à un niveau plus faible dans ces mêmes cellules transfectées avec p49-48 et pET48 après
l’infection de la Vaccine T7. Lorsque les gènes sont clonés sous le contrôle du promoteur CMV,
la protéine VP16 n’est pas détectée dans les CESC ni dans les RK13 transfectées par les
différents vecteurs, alors qu’elle peut être détectée à un très faible niveau en cellules COS-7
transfectées avec p48 et p49-48.
Ces expériences menées en IFI ne permettent pas cependant d’affirmer l’absence de synthèse de
la protéine VP16 qui peut être exprimée à un niveau très faible non détectable en IFI. Le
remplacement d’UL48 par un gène rapporteur (Luc) dans les transcrits bi et tricistroniques nous
permettait de suivre l’expression de ce gène rapporteur par la mesure d’une activité enzymatique
et par IFI. Ces résultats d’IFI pouvaient ainsi être comparés avec ceux obtenus lors de
l’immunodétection de VP16.
Ces expériences ont été réalisées en cellules COS-7. Ces cellules sont transfectées avec un
nombre approximativement identique de plasmides. L’activité enzymatique de la luciférase est
détectée dans les cellules transfectées par les trois constructions (pluc, p49,5-luc et p49-luc) et
correspond à 100% pour pluc (valeur de base), 10% pour p49-luc, 5,5% pour p49,5-luc et 1%
pour p49 (valeur témoin). La luciférase a été détectée en IFI uniquement dans les cellules
transfectées par pluc, mais n’a pu être détectée lors de la transfection des deux autres
constructions. Ces expériences suggèrent que la luciférase peut-être exprimée à partir des
messagers UL49-luc et UL49,5-luc, mais à un niveau de réinitiation faible d’environ 10% et
5,5% qui ne permet pas de la détecter en IFI.
Ces deux types d’expériences mettent en évidence que la protéine VP16 peut être traduite à partir
des messagers bi et tricistroniques, mais que son expression est très faible et difficilement
détectable.
En complément de ces expériences, nous devons prendre en considération le fait que la protéine
VP16 soit très faiblement détectée lorsqu’elle est exprimée à partir de la séquence UL48. Ceci
supposait que la protéine VP16 était soit toxique pour les cellules soit instable dans ces cellules.
Nous avons voulu augmenter la stabilité de VP16 dans ces cellules en créant une protéine de
fusion possèdant en N-terminal l’intégralité de VP16 et en C-terminal la région de répétition en
GA (GAr) réputée empêcher la dégradation de la protéine EBNA1 du virus EBV par le
protéasome (Dantuma, 2000). Cependant, l’ajout de cette séquence n’augmente pas la détection
de VP16 dans les cellules, ce qui suggère que la protéine VP16 peut être toxique pour ces
cellules.
4.5.3 Les protéines VP13/14 et VP11/12
Les protéines VP13/14 et VP11/12 à l’instar de la protéine VP16 ne sont pas ou très peu
détectées en IFI dans des CESC infectées par le MDV et fixées à l’alcool-acétone. Ces protéines
sont par contre détectées lorsque les CESC sont fixées à la paraformaldéhyde. Ces 2 protéines
sont également détectées majoritairement dans des cellules qui semblent au stade avancé de
l’infection, situées au centre des plages de lyse et au dessus du tapis cellulaire (Fig. 33Aa et
33B). La localisation de ces 2 protéines est difficile dans ces cellules abîmées, exprimant une
forte quantité d’antigènes viraux. La protéine VP13/14 semble être cependant majoritairement
localisée dans les noyaux de ces cellules (Fig. 33). Dans les noyaux, la protéine VP13/14 se
présente sous deux aspects : elle apparaît diffuse dans certains noyaux (Fig. 33d) et parfois
concentrée sous forme de ponctuations dans d’autres noyaux (Fig. 33f). Elle semble également
être liée au chromosome dans des cellules infectées en se co-localisant avec la protéine VP22
(Fig. 33de- flèche).
Leur localisation a également pu être étudiée dans d’autres systèmes d’expression. Dans le
système baculovirus/ cellule d’insecte, le protéine VP13/14 semble être majoritairement
détectées dans noyau des cellules infectées respectivement par le Bac UL47, alors que la protéine
VP11/12 présente une localisation cytoplasmique et nucléaire dans les cellules infectées par le
Bac UL46. Lorsque ces deux gènes sont clonés sous le contrôle du promoteur CMV, la protéine
VP11/12 semble se localiser dans le cytoplasme et le noyau des cellules COS-7, alors que la
protéine VP13/14 est faiblement détectée dans ces mêmes cellules.
Figure 33 : Analyse en immunofluorescence de l'expression des protéines VP13/14 et VP11/12
dans les CESC infectées par le MDV. Les CESC sont fixées à la paraformaldéhyde, excepté les
figures Af, Ag et Afg où les cellules ont été fixées à l’alcool-acétone. Les cellules sont ensuite
incubées avec les AcMo indiqués marqués au vert oregon (OG) ou au rouge texas (TR). La
superposition des images est montrée dans la colonne de droite. Les cellules ont été examinées
en microscopie confocale. L’image Aa a été visualisée en contraste de phase.
fig33
Dans les follicules plumeux, les deux protéines VP13/14 et VP11/12 (plus faiblement) sont
détectées en IFI dans les cellules épithéliales (Fig. 26).
Ces expériences sur la détection des protéines VP11/12, VP13/14, VP16 et VP22 nous ont
permis de confirmer leur expression dans les cellules infectées par le MDV. Nous avons
également mis en évidence des différences importantes dans l’expression de ces protéines au
cours du cycle viral et nous avons souhaité aborder une étude sur le rôle de chaque protéine dans
la multiplication virale en utilisant une stratégie de délétion des gènes.
4.6 ETUDE DES VIRUS DÉLÉTÉS
4.6.1 Obtention des virus délétés.
Les virus délétés des gènes UL49, UL48, UL47 et UL46 ont été construits à l’aide du
chromosome artificiel bactérien possédant le génome du MDV-1, le BAC20 (Dorange et al.,
2001).
Dans le génome du BAC20, les gènes UL46 à UL49 sont présents sur un fragment HindIII de 24
kpb (Fig. 34). L’insertion du gène de la résistance à la kanamycine (950 nt) par recombinaison
homologue dans le BAC20 introduit un site HindIII supplémentaire, séparant le fragment de 24
kpb en deux fragments plus petits (Fig. 34). L’analyse en gel d’agarose des fragments HindIII du
BAC20 et des virus délétés nous a permis de visualiser dans un premier temps l’absence du
fragment de 24 kpb (présent dans le BAC20) et la présence de 2 fragments plus petits dans le
profil génomique des virus délétés (Fig. 34) (Dorange et al., 2001). Cette étude a été complétée
par l’analyse de la présence ou de l’absence des séquences d’intérêt par hybridation de sondes
spécifiques (gène de résistance à la kanamycine et gènes UL46 à UL49) (Fig. 35) (Dorange et
al., 2001).
La détermination de la séquence des sites de recombinaison a été également réalisée pour chaque
virus délété, confirmant l’insertion correcte du fragment portant le gène de la résistance à la
kanamycine dans le site désiré (résultats non montrés).
Figure 34 : Illustration schématique de la mutagénèse du BAC20 et de l'obtention des BAC
délétés. A) Organisation schématique et la carte de restriction HindIII de la souche Md-5 du
MDV-1. B) Illustration de l'insertion de la séquence BAC dans le locus US2 de la souche 584A
du MDV1 (BAC20). C) Illustration schématique de la mutagénèse du BAC20 et de l'obtention
des BAC D2L2T2S. La digestion du BAC avec HindIII conduit à un fragment de 24 kb
contenant les séquences UL46 à UL49. L'insertion du gène de la kanR par recombinaison
homologue génère un nouveau site de restriction HindIII dans tous les BAC délétés, divisant le
fragment de 24 kb en deux plus petit. La taille des fragments est en paires de base (pb) et a été
calculée sur la base du génome de la souche Md-5 du MDV-1.
fig34
Figure 35 : Digestion par HindIII et analyse en southern blot des BAC20 délétés. A) L'ADN des
BAC a été digéré par HindIII, et les fragments ont été séparés en gel d'agarose à 0,8% puis
détectés en présence de BET. La flèche et les astérisques indiquent, respectivement, le doublet de
bandes dans le BAC20 et les nouveaux fragments générés par l'insertion du gène de la kanR dans
les BAC20 délétés. B) Les fragments d'ADN ont été transférés sur une membrane de nylon puis
les hybridations ont été réalisées en utilisant des sondes spécifiques des gènes kanR, UL49,
UL48, UL47, et UL46. La taille des marqueurs de poids moléculaire (M) est indiquée.
fig35
4.6.2 Les protéines VP11/12, VP13/14 et VP16 ne sont pas essentielles à la
réplication du MDV1.
Les ADN des BAC délétés 20? 46, 20? 47 et 20? 48 qui sont incapable d’exprimer,
respectivement, les protéines VP11/12, VP13/14 et VP16, sont transfectés dans les CESC et les
cellules QM7 pour analyser les propriétés de croissance de chaque virus. La formation des plages
est observée dans les CESC quatre jours après la transfection de l’ADN des BAC délétés 20? 46,
20? 47 et 20? 48. La présence de la protéine majeure de capside VP5 dans les cellules des plages
virales, est détectée en IFI en utilisant l’AcMo F19 (Fig. 36 a, c, e, g et i). Dans les cellules QM7
transfectées par ces différents BAC délétés, la détection en IFI de plages fluorescentes est
également observée (Fig. 36 b, d, f, h et j). Cependant, en CESC comme en QM7, les virus
délétés semblent former des plages beaucoup plus petites que le virus parental, le BAC20. De
plus, la taille des plages des virus 20? 46 et 20? 47 régresse à partir du cinquième jour après
transfection dans les CESC ou après passage en série sur ces cellules. Cette régression semble
plus importante pour le 20? 46 dont les plages de lyse ne sont plus détectables par observation
directe sans immunodétection.
Figure 36 : Analyse en IF des virus BAC20 et des virus délétés 20∆46, 20∆47, 20∆48 et 20∆4648. L'ADN des différents BAC est transfecté dans les CESC et les cellules QM7. Les cellules
sont fixées, respectivement, 5 et 4 jours post-transfection, puis incubées avec l'AcMo anti-VP5
marqué au vert-oregon. Les cellules sont éxaminées avec un objectif 10X (a-i) ou 20X (b-j) en
utilisant un microscope à fluorescence équipé d'une caméra digitale Nikon.
fig36
Ces observations nous ont incité à évaluer de façon quantitative les éventuels défauts de
croissance des virus délétés par rapport au virus parental (Fig. 37). La courbe de croissance du
BAC20 atteint un maximum à 72 h. et décroit doucement jusqu’au septième jour. Tous les virus
délétés présentent un défaut de multiplication par rapport au virus parental, qui se traduit pour
tous par une réduction du titre maximal à 72 h. p.i. (Fig. 37) et pour les virus 20? 46, 20? 47 et
20? 46-48 une décroissance accentuée du troisième au septième jour. Le virus présentant le plus
important défaut de multiplication est le 20? 46, alors que le virus 20? 46-48 délété des trois
gènes semble se répliquer de façon plus efficace que le 20? 46. Ces expériences montrent que les
protéines VP11/12, VP13/14 et VP16 seules ou ensemble ne sont pas essentielles pour la
multiplication virale (Dorange et al., 2001).
Figure 37 : Courbe de croissance des virus délétés.
Après l'infection des CESC avec approximativement 100 p.f.u. de chaque virus délétés, les titres
viraux ont été déterminés au temps indiqué p.i. en incubant des dilutions sur des CESC
fraîchement préparées. La valeur moyenne et les déviations standards de deux expériences
indépendantes sont représentées.
fig37
4.6.3 La protéine VP22 est essentielle pour la réplication du MDV-1.
Les virus délétés du gène UL49, 20? 49 et 20? 48-49, ne sont plus capables de se propager dans
les CESC et dans les cellules QM7. En effet, seules des cellules isolées exprimant la protéine
majeure de capside VP5 sont détectées dans les CESC et QM7 transfectées par l’ADN des virus
20? 49 et 20? 48-49 (Fig. 38A et 38Ba). Un certain niveau de multiplication est restauré en
cellules QM7 lorsque les ADN des BAC 20? 49 et 20? 48-49 sont cotransfectés avec le plasmide
pUL49 (Fig. 38Bc et 38Bd) (Dorange et al., 2001). Ces résultats démontrent que la croissance
des virus délétés 20? 49 et 20? 48-49 peut être partiellement complémentée en trans par
l’expression transitoire de VP22 dans les cellules QM7, et que la protéine VP22 est essentielle
pour la multiplication du MDV-1 en culture cellulaire.
Afin de déterminer la région de VP22 nécessaire à la multiplication du MDV1, des cotransfections de l’ADN du BAC 20? 49 avec les différentes constructions pcDNA3, pUL49N1,
pUL49N2 et pUL49-48M2 codant respectivement pour les protéines VP22N1, VP22N2 et
VP22MS ont été réalisées en cellules QM7. Toutes les protéines VP22 tronquées en N- ou Cterminale sont capables de trans-complémenter le virus 20? 49, car la formation de plages
fluorescentes est observée dans chaque co-transfections, alors que la transfection du 20? 49 dans
les cellules QM7 ne montre que la présence des cellules isolées fluorescentes (Fig. 38Be à 38Bj)
(Dorange et al., 2001).
Figure 38 : A) analyse en IF de la réplication des virus 20∆49 et 20∆48-49 dans les CESC et B)
trans-complémentation du 20∆49 dans les cellules QM7. A) Les CESC ont été transfectées avec
l'ADN des BAC 20∆49 et 20∆48-49, fixées 5 j post-transfection et incubées avec l'AcMo antiVP5 F19 marqué au vert oregon. B) Les cellules QM7 ont été transfectées avec l'ADN du 20∆49
(a-b), 20∆49 + pUL49 (c-d), 20∆49 + pUL49N1 (e-f), 20∆49 + pUL49N2 (g-h), ou 20∆49 +
pUL49-48M2 (i-j) puis fixées 4 j post-transfection. Les cellules ont été incubées en présence de
l'AcMo anti-VP5 F19 marqué au vert oregon et de l'AcMo anti-VP22 D18 marqué au texas red.
La superposition des images est montrée dans la colonne de droite. Les cellules ont été
examinées avec un objectif 40X en utilisant un microscope à fluorescence équipé d'une caméra
digitale Nikon.
fig38
L’ADN de ces virus délété du gène UL49 a ensuite été transfecté dans les lignées QM7UL49,
QM7UL49N1, QM7UL49N2 et QM7UL49-48M2, exprimant de façon constitutive les protéines
VP22,
VP22N1,
VP22N2
et
VP22MS.
Cependant,
aucune
des
lignées
exprimant
constitutivement les protéines VP22 tronquées n’a été capable de trans-complémenter les virus
20? 49 et 20? 49-48. Dans la lignée exprimant constitutivement la protéine VP22, des plages
fluorescentes sont détectées après transfection du 20? 49 ou du 20? 49-48, suggérant que la
protéine VP22 est capable de trans-complémenter le défaut de croissance des virus délétés du
gène UL49. Cependant cette trans-complémentation est partielle et n’a lieu que dans un nombre
limité de cellules transfectées, ce qui se traduit par la formation d’une plage fluorescente pour 15
cellules transfectées (Dorange et al., 2001). Par opposition la transfection du BAC20 dans ces
lignées permet la formation de plages de lyse, ce qui montre que l’inefficacité de croissance
détectée pour les virus délétés du gène UL49 n’est pas due à un phénomène d’interférence, mais
plus à une incapacité des protéines VP22 et VP22 tronquées constitutivement exprimées à transcomplémenter efficacement les virus 20? 49 et 20? 48-49.
Nous ne pouvions cependant pas exclure que des mutations présentes ailleurs dans le génome
des virus 20? 49 et 20? 48-49 affectent leur réplication ne permettant qu’une complémentation
partielle de ces virus délétés. Il convient toutefois de noter que l’ADN de ces deux BAC, délétés
d’un gène commun (UL49), ont été obtenus de façon indépendante et il est peu probable que des
mutations léthales n’affectent uniquement ces deux BAC alors que d’autres virus délétés viables
ont été obtenus de la même manière. Nous avons cependant reconstitué, par recombinaison
homologue, un virus 20? 49R en cotransfectant l’ADN du BAC 20? 49 avec le plasmide pGEMT UL49,5-48. Ce virus 20? 49R reconstitué se réplique de façon similaire au BAC20 et exprime
la protéine VP22, ce qui confirme que le défaut de croissance observé du 20? 49 est dû à
l’absence d’expression de VP22 (Dorange et al., 2001).
4.7 LA LIGNÉE QM7UL49-48M2 FAVORISE LA CROISSANCE
VIRALE.
Lors des essais de transfection du BAC20 sur les différentes lignées, nous avons observé que la
taille des plages de lyse semblait plus importante dans la lignée QM7UL49-48M2 que dans les
cellules QM7 ou les autres lignées exprimant les protéines VP22 ou VP22 tronquée (Fig. 39Aa et
39Ac). De même, le virus 20? 46-48 semble se répliquer de façon plus importante dans ces
cellules par rapport aux cellules QM7 (Fig. 39Ab et 39Ad).
La multiplication du BAC20 par passage successif a été étudiée dans ces cellules. Après le
premier passage, le BAC20 est détecté dans la majeure partie du tapis cellulaire des QM7UL49-
48M2, alors qu’il forme peu de petites plages dans les cellules QM7, dans lesquelles le titre viral
diminue fortement après le premier passage (Fig. 39B).
Figure 39 : Augmentation de la croissance virale sur la lignée UL49-48M2. A) les cellules QM7
et QM7UL49-48M2 sont transfectées par l'ADN des virus BAC20 et 20∆46-48 puis sont fixées 4
jours post-transfection. B) Le second passage du BAC20 dans les cellules QM7 et QM7UL4948M2. Les cellules ont été incubées en présence de l'AcMo anti-VP5 F19 marqué au vert oregon.
Les cellules ont été examinées avec un objectif 10X (a et c) ou 20X ( b et d) en utilisant un
microscope à fluorescence Nikon équipé d'une caméra digitale Nikon (a, b, c et d) ou d'un
microscope à fluorescence Olympus BH2 équipé d'un illuminateur à fluorescence (e et f).
fig39
L’efficacité de formation des plages de lyse a également été étudiée à la fois dans les CESC, les
QM7 et les QM7UL49-48M2. Les QM7UL49-48M2 permettent la formation de plage de lyse
deux fois plus facilement que les QM7, mais sont nettement moins efficaces (10 fois) que les
CESC.
Un rôle du gène UL48 dans ces lignées est peu probable car la protéine VP16 n’y est pas
détectée. De plus, la réplication du BAC20 dans la lignée QM7UL48 est identique à celle
observée dans les cellules QM7 (résultats non montrés), suggérant un rôle facilitateur de
VP22MS dans la multiplication virale.
Cependant la multiplication de différents virus (GA et RB1B) n’a pu être observé dans ces
lignées qui semblent perdre le virus après seulement un passage.
4.8 VP22 POURRAIT ÊTRE NÉCESSAIRE À LA SORTIE DU
VIRION CYTOPLASMIQUE.
La protéine VP22 du virus HSV-1, qui est détectée majoritairement dans le cytoplasme des
cellules infectées, est suspectée de jouer un rôle dans la sortie du virion après son
déenveloppement nucléaire. Un rôle similaire de la protéine VP22 du MDV-1 a également été
envisagé. En effet, la protéine majeure de capside VP5 qui est un antigène tardif (gène γ) est
synthétisée dans les cellules infectées par le virus 20? 49, ce qui suggère que la protéine VP22
n’est pas nécessaire au premières étapes de la réplication virale. De plus, de manière similaire
aux glycoprotéines gE et gI dont l’expression permanente en cellules QM7, facilite également la
multiplication virale, la protéine VP22 pourrait être impliquée à l’instar de ces protéines dans la
diffusion du virus de cellule à cellule.
Une étude sur le rôle de VP22 dans la sortie du MDV1 a donc été initiée.
Le virus 20? 49 ne pouvant être multiplié sur une lignée complémentante, l'étude en microscopie
électronique des cellules infectées par 20? 49 en CESC est difficilement réalisable. Une autre
méthode d’approche, pour le moment préliminaire, basée sur la création de polycarions à l’aide
de polyéthylène glycol, a donc été réalisée. L’hypothèse est la suivante : si VP22 est nécessaire à
la sortie du virus au niveau cytoplasmique, les capsides cytoplasmiques présentes dans la cellule
infectée et ici dans le polycarion seraient ainsi capables d’infecter les autres noyaux. Si VP22 est
nécessaire à la sortie du virus au niveau nucléaire, un seul noyau au sein d’un polycarion devrait
être fluorescent. Les cellules QM7 sont ainsi transfectées par le virus 20? 49 puis 24 h après sont
mises en présence de polyéthylène glycol pendant 2 min. Les cellules sont ensuite incubées 72 h
à 37°C puis fixées. La présence de l’antigène VP5 est détectée dans une moyenne de 4 à 5
noyaux fluorescents, suggérant ainsi que des capsides cytoplasmiques synthétisées par un des
noyaux ont pu établir une autre infection dans les noyaux voisins (Fig. 40). Cependant, nous ne
pouvons exclure la possibilité d’une relocalisation nucléaire de la protéine VP5 dans ces noyaux
non infectés. La confirmation de cette expérience nécessite l’utilisation de sondes fluorescentes
spécifiques des séquences nucléotidiques du MDV-1, afin de confirmer la présence d’ADN viral
dans ses noyaux.
Figure 40 : Rôle de VP22 dans la sortie du virion. Les cellules QM7 sont transfectés par l'ADN
du BAC 20∆49 puis fusionnées à l'aide de polyéthylène glycol pendant 1 mn. Quatre jours après
transfection, les cellules sont fixées puis incubées en présence de l'AcMo anti-VP5 F19 marqué
au vert oregon. Les cellules ont été examinées avec un objectif 20X en utilisant un microscope à
fluorescence Nikon équipé d'une caméra digitale Nikon.
fig40
5
DISCUSSION
Notre travail a porté sur l’étude de l’expression et du caractère indispensable de quatre protéines
du MDV-1 homologues aux protéines de tégument VP22, VP16, VP13/14 et VP11/12 du virus
HSV-1. Ceci nous a permis de distinguer deux groupes de protéines : les protéines VP16,
VP13/14 et VP11/12 synthétisées tardivement qui semblent peu abondantes et non essentielles à
la multiplication virale et la protéine VP22 très abondamment synthétisée tout au long de
l’infection et essentielle à la multiplication virale dans les CESC.
La protéine VP16 est détectée dans les CESC fortement infectées par le MDV et situées au
dessus du tapis cellulaire, ce qui suggère que la protéine VP16 est exprimée tardivement au cours
de l’infection virale. Cependant, comme la protéine VP16 est traduite à partir de messager
codant également pour la protéine VP22, détectée dès quatre heures p.i., cette protéine peu
abondante pourrait être exprimée dans les premières étapes de la réplication virale de façon non
détectable. Cette protéine n’est détectée de façon reproductible que lorsque les CESC sont fixées
à la paraformaldéhyde. Les solvants organiques peuvent avoir un effet plus « dissociant » que la
paraformaldéhyde aboutissant au décollement de ces cellules fortement endommagées par
l’infection virale. La fixation à l’alcool-acétone pourrait également provoquer la fuite de ces
protéines hors des cellules infectées (Brewis et al., 2000). Une absence de détection de l’AcMo
I13 vis-à-vis d’une protéine VP16 modifiée post-traductionnellement peut-être suspectée. La
protéine VP16 exprimée dans les cellules d’insecte n’est pas phosphorylée dans ce système. Une
phosphorylation de VP16 au cours de la réplication virale par une protéine kinase virale pourrait
empêcher sa reconnaissance par l’AcMo I13 et pourrait ainsi expliquer l’absence de détection de
la protéine VP16 dans les stades précoces de l’infection virale. Dans cette hypothèse, il nous faut
envisager une phosphorylation plus spécifique d’une des kinases virales (US3 et UL13) sur un
site spécifique de la protéine VP16. Dans les stades tardifs de l’infection virale où la protéine
VP16 du MDV-1 est détectée par l’AcMo I13, l’absence de phosphorylation des protéines de
tégument avant leur incorporation dans le virion pourrait expliquer cette meilleure détection
(Morrison et al., 1998).
Cependant, nous avons pu montrer que le faible niveau de détection de la protéine VP16 dans les
CESC était probablement dû à sa traduction à partir des messagers bi et tricistroniques ayant la
capacité de coder pour la protéine VP16 mais également à une toxicité de la protéine pour les
cellules (Kopacek et al., 1997, Koptidesova et al., 1995 ). En effet, la synthèse de la protéine
VP16 à partir du messager bicitronique a été confirmée (Koptidesova et al., 1995) et nous avons
également démontré sa synthèse à partir du messager tricistronique dans le sytème d’expression
in vitro. L’étude de la traduction de la protéine VP16 dans les systèmes d’expression in vivo,
nous a permis de confirmer ce résultat, mais également de mettre en évidence à l’aide d’un gène
marqueur un faible taux de réinitiation au sein des messagers polycistroniques. La détection de la
luciférase exprimée à partir de ces messagers n’est possible qu’en mesurant son activité
enzymatique mais ne peut être observée en immunofluorescence indirecte. Un défaut similaire
dans l’immunodétection de VP16 au cours de l’infection virale peut-être envisagé. Ce faible taux
de réinitiation ne permettrait pas une détection de VP16 dans des cellules en début d’infection,
mais pourrait être augmenté aux stades tardifs de l’infection virale dans des cellules ne
contrôlant plus ou ayant un contrôle modifié du fait de la régulation de la traduction des
protéines virales. D’autres ARNm bicistroniques eucaryote, possédant une structure similaire au
messager UL49-48, c’est-à-dire deux cadres ouverts de lecture non-chevauchants séparés par une
séquence intergénique, permettent l’expression de deux protéines fonctionnelles (Bouhidel et al.,
1994 , Wang et al., 1987). La présence du premier cadre ouvert de lecture régule souvent la
traduction du second, ne permettant en général qu’une faible traduction de ce dernier (Kozak,
1989). Ce phénomène peut être expliqué par la traduction qui est initiée en 5’ de l’ARNm à
partir du CAP et qui mène à la traduction du premier cadre ouvert de lecture. Cependant, après sa
traduction, les ribosomes peuvent perdre les facteurs d’initiation de la traduction liés au
ribosome 40S, et devenir incapable d’initier la traduction du second cadre ouvert de lecture.
Dans le modèle de réinitiation de la traduction, la traduction du premier cadre ouvert de lecture,
généralement court, permet aux ribosomes de garder des facteurs d’initiation, qui permettrait à
certains ribosomes 40S de scanner la région intergénique et d’initier la traduction du second
cadre ouvert de lecture (Kozak, 1989). Par exemple, l’efficacité de la réinitiation de la traduction
de l’ARNm de l’HIV-1 est déterminée par la longueur du premier cadre ouvert de lecture et de la
distance intergénique (Luukkonen et al., 1995).
Nous ne pouvons écarter l’hypothèse de la présence d’un messager monocistronique, en faible
abondance et non détectable dans les stades tardifs de l’infection virale, qui permettrait une
meilleure expression de la protéine VP16. Nous avons donc étudié la synthèse de la protéine
VP16 à partir du gène UL48 dans différents systèmes d’expression.
Ces expériences d’expression transitoire nous ont permis de proposer une autre explication quant
à la faible détection de la protéine VP16. En effet, nous avons également constaté que la
détection de la protéine VP16 exprimée à partir du gène UL48 était faible dans les systèmes
d’expression in vivo, et ceci nous a amené à émettre l’hypothèse d’une toxicité de la protéine
VP16 pour les cellules. L’analyse de la transcription du gène UL48 en transfection transitoire
sera réalisée car une instabilité du transcrit monocistronique pourrait également expliquer la
faible production de VP16. Une meilleure stabilité des transcrits et/ou une meilleure expression
de la protéine VP16 pourrait rendre compte des résultats obtenus en utilisant le virus
recombinant de la vaccine T7 (vvT7), ce qui suggère que le « contexte viral » pourrait être
nécessaire à la bonne expression de VP16.
La protéine VP16 codée par le gène UL48 n’est pas essentielle pour la réplication du virus en
culture cellulaire. Un virus portant une délétion du gène UL48 est capable de former des plages
dans les CESC et les cellules QM7. Cependant, le virus 20? 48 présente un défaut de croissance
dans les CESC par comparaison au BAC20. L’expression de VP16 et son accumulation dans les
stades tardifs de l’infection dans les CESC, expliquerait de toute évidence le défaut de croissance
observé pour le virus 20? 48.
Il faut également noter qu’un petit cadre ouvert de lecture (ORF91), codant pour un peptide de
91 aa et présent dans l’ORF48, pourrait jouer un rôle dans la réplication virale. Ce peptide ne
possède pas d’homologie avec des peptides connus, et son caractère fonctionnel reste à démonter
dans le cas d’une infection par le MDV.
Le défaut de croissance observé pourrait avoir pour origine une modification de l’organisation
transcriptionnelle de la région due au remplacement du gène UL48 par le gène de résistance à la
kanamycine. En effet, en aval du gène UL48, se situe le signal de polyadénylation partagé par les
gènes UL49,5 et UL49 ainsi que la région promotrice du gène UL47. Cependant, ni le signal de
polyadénylation ni le promoteur de la séquence UL47-46 ne sont affectés par la mutagénèse, car
la protéine VP22 semble être exprimée à un niveau similaire que dans les CESC infectées par le
BAC20 et la synthèse de la protéine VP13/14 est détectée lors d’une infection par le 20? 48, ce
qui indique que l’organisation transcriptionnelle de la région UL49,5-46 est peu affectée par
l’insertion du gène de la résistance à la kanamycine. Par ailleurs, les protéines VP13/14 et
VP11/12 semblent être mieux exprimées dans les cellules infectées par le virus 20? 48. Il reste à
montrer que cette élévation du niveau d’expression de ces deux protéines est significative et
vient pallier l’absence de la protéine VP16 au cours de la réplication virale.
Les plages formées par le virus 20? 48 semblent possèder en leur centre un plus grand nombre de
cellules infectées que les plages formées par les virus BAC20, 20? 47 et 20? 46. Il est possible
que l’expression de la protéine VP16 induise le décollement des cellules du tapis cellulaire. En
effet, les cellules infectées par le virus 20? 48, dans lesquelles la protéine VP16 n’est pas
détectée, semblent plus adhérentes que les cellules infectées par les virus BAC20, 20? 47 et
20? 46. Cette hypothèse pourrait également expliquer (en partie) la meilleure détection des
protéines VP13/14 et VP11/12 dans ces cellules dans les stades tardifs de l’infection du virus
20? 48.
La comparaison de la protéine VP16 du MDV-1 avec les autres alphaherpesvirinae montre que
l’expression de VP16 est régulée différemment dans le MDV-1, et son rôle exact durant
l’infection reste encore à établir. La protéine VP16 du VZV (ORF10) est abondamment
exprimée dans les cellules infectées, mais n’est pas essentielle à la réplication virale. Par
opposition, la protéine VP16 est absolument nécessaire à la réplication d’HSV-1. La protéine
VP16 d’HSV-1 possède plusieurs rôles dans la réplication virale, transactivant l’expression des
gènes α, interagissant avec la protéine VHS (virion host shut-off), et permettant la sortie du
virion et la formation de particules extracellulaires.
Des expériences ultérieures sont nécessaires pour déterminer si la protéine VP16 du MDV-1 est
impliquée dans la réplication à des stades précoces de l’infection virale ou dans la maturation
virale et l’infection de cellule à cellule dans les stades tardifs de l’infection, mais la délétion de
ce gène n’a qu’un impact mineur sur la croissance du MDV-1 en culture cellulaire. La faible
expression de la protéine VP16 dans les CESC pourrait expliquer le caractère très associé aux
cellules du MDV, mais une action non régulée de la protéine VHS (UL41) au cours de
l’infection du MDV-1 pourrait également être à l’origine du faible taux réplication du MDV en
culture cellulaire. Il reste à montrer qu’une délétion du gène UL41 MDV facilite la
multiplication virale.
Les protéines VP13/14 et VP11/12 sont détectées dans les CESC infectées par le MDV et sont
exprimées majoritairement dans les cellules situées au dessus du tapis cellulaire et sensibles au
décollement lors de la fixation par des solvants organiques. Il convient de signaler que ces deux
protéines présentent les mêmes caractéristiques que la protéine VP16 lorsqu’elles sont exprimées
sous contrôle du promoteur du CMV. Une toxicité de ces protéines pour les cellules peut être
également supposée, mais l’absence d’autres protéines virales pourrait également rendre compte
de cette faible production. La stabilité et le niveau de traduction des transcrits γ2 sont en effet
dépendants de la présence de facteurs viraux impliqués dans le contrôle de la traduction et ceci
pourrait expliquer nos résultats dans les expériences d’expression transitoire ou constitutive. La
protéine VP13/14 est détectée majoritairement dans les extraits nucléaires des cellules d’insecte
et sa localisation dans les CESC est également majoritairement nucléaire. Dans les noyaux, la
protéine VP13/14 se présente sous deux aspects similaires à son homologue chez HSV-1 :
diffuse dans certains noyaux, elle apparaît parfois dans d’autres noyaux sous forme de
ponctuations. Elle semble également être liée au chromosome dans des cellules infectées en se
co-localisant avec la protéine VP22. Cette localisation nucléaire pourrait être liée à un rôle de la
protéine VP13/14 dans la réplication virale et/où à un rôle dans la maturation du virion. Un virus
délété du gène UL47 montre d’ailleurs un défaut de croissance par rapport à son virus parental,
le BAC20. Ce virus présente également une diminution importante de la taille des plages et de la
production de virus infectieux entre les jours 5 et 7 post-infection. Du fait de sa localisation
nucléaire, la protéine VP13/14 pourrait jouer un rôle dans le premier enveloppement du MDV au
niveau nucléaire. La protéine VP13/14 du virus HSV-1 qui présente une localisation nucléaire
est capable d’importation et d’exportation nucléaire et serait également incorporée dans la
structure tégumentaire au niveau nucléaire (Donnelly et Elliott, 2001a, Donnelly et Elliott,
2001b). Cette protéine qui a récemment été suspectée d’être une protéine transactivante pourrait
également réguler la réplication de l’ADN viral (Donnelly et Elliott, 2001c).
La protéine VP11/12 est par contre très faiblement détectée dans les CESC en
immunofluorescence indirecte, ce qui suggère que cette protéine n’est pas une protéine virale
majeure. La protéine VP11/12 semble être phosphorylée dans les cellules d’insecte au niveau des
thréonine et tyrosine et l’utilisation d’un seul AcMo peut introduire un biais pour la détection de
protéines phosphorylées. En effet, il est possible que l’AcMo J3 réagisse avec des épitopes
sensibles à la phosphorylation et présente une faible fluorescence, restreinte à certaines formes
de la protéine. Dans les CESC, la protéine VP11/12 peut être sous-phosphorylée par rapport au
système baculovirus/cellule d’insecte ou phosphorylée sur des résidus différents par des
protéines kinases virales spécifiques des herpèsvirus.
Un virus délété du gène UL46 forme des plages de lyse dans les CESC. Cependant, ce virus
montre un défaut de croissance important par comparaison au BAC20. A l’instar du virus 20? 47,
ce virus présente une diminution importante dans la taille des plages et dans la production de
virus entre les jours 5 et 7 post-infection. Les plages formées par le virus 20? 46 disparaissent
même au septième jour. Une baisse dans la taille des plages a été reportée pour un virus MDV-1
délété du gène US1 codant pour la protéine homologue à la protéine ICP22 d’HSV-1. La courbe
de croissance du virus ? US1 est très similaire à celle de son virus parental jusqu’au quatrième
jour, mais ensuite la taille de ses plages et la production de virus diminuent entre les jours 5 et 7.
Ces auteurs ont démontré que cette diminution corrélait avec la survie des cellules dans le tapis
cellulaire (Parcells et al., 1994).
Dans le cas du virus HSV-1, les protéines VP11/12 et VP13/14 modulent l’activité de
transactivation de VP16. Cependant, ces deux gènes ne sont pas nécessaires pour la croissance
virale, et leur délétion soit séparément soit en combinaison a très peu d’impact sur la réplication
virale. Il est important de noter cependant, que dans le cas d’HSV-1, les cellules peuvent être
infectées avec les virus délétés des gènes UL46, UL47 et UL46-47 à de hautes multiplicités
d’infection (5 u.f.p/ cellule), ce qui n’est pas possible dans le cas du MDV. Le virus délété des
gènes UL46, UL47 et UL48, 20? 46-48, est capable de se multiplier en CESC et QM7, mais se
caractérise par une multiplication virale très diminuée. Nous pouvons conclure, que ces trois
gènes, délétés séparément ou en combinaison, ne sont pas essentiels à la réplication du MDV-1
dans des cultures cellulaires. Dans le cas du virus HSV-1, ces trois protéines, qui font partie de la
particule virale extracellulaire, sont fortement exprimées dans les cellules infectées. Ces
protéines, incorporées à différentes étapes de la morphogénèse virale (les protéines VP13/14 et
VP16 sont incorporées au premier et second enveloppement respectivement), jouent un rôle dans
la sortie virale (Mossman et al., 2000 ; Donnelly et Elliott, 2001a). Dans le cas du MDV où
aucune particule virale extracellulaire n’est produite, la faible détection ou l’absence de ces
protéines à des étapes clés de la maturation virale pourrait expliquer le caractère très associé aux
cellules du MDV-1.
La protéine VP22 est détectée dans les CESC infectées par le MDV, au niveau des follicules
plumeux des poulets infectés par le MDV-1, et dans les lignées lymphoblastoïdes MSB-1 en
cours de réactivation. C’est une protéine fortement exprimée dans les CESC au cours de
l’infection virale et qui est retrouvée majoritairement sous forme insoluble dans les extraits
nucléaires. Lors de l’étude de sa localisation cellulaire, nous avons été confrontés à deux
problèmes majeurs : le profil de réactivité des différents AcMo et pour un même AcMo, une
détection différente en fonction du mode de fixation utilisé. D’une manière générale, la
localisation de la protéine VP22 semble être uniforme (nucléaire et cytoplasmique) dans les
cellules infectées et fixées en paraformaldéhyde, alors qu’après fixation à l’alcool-acétone la
protéine VP22 est détectée majoritairement dans et en périphérie des noyaux. Ces observations
sont en accord avec celles faites pour la protéine VP22 d’HSV-1. En effet, dans les cellules
infectées par le virus HSV-1 et fixées par des solvants organiques, la protéine VP22 pourrait être
« solubilisée » et relocalisée dans le noyau où elle se lierait préférentiellement à des composants
nucléaires (histones et ADN) (Elliott et O'Hare, 1999). La fixation des cellules par la
paraformaldéhyde qui préserve les structures cellulaires et semble éviter cette fuite de VP22,
pourrait cependant inhiber la fluorescence intranucléaire de la protéine VP22 (Brewis et al.,
2000). Le pontage par la paraformaldéhyde de complexes composés de la protéine VP22 liée à
des composants nucléaires comme l’ADN, les histones ou d’autres protéines cellulaires et virales
pourrait expliquer en partie ces différences dans la détection de VP22.
Dans le cas de l’immunodétection par nos AcMo, la protéine VP22 est détectée dans des
compartiments cellulaires différents, certains la détectant majoritairement dans le noyau, d’autres
dans le cytoplasme, et d’autres dans les deux compartiments ce qui suggère que la protéine VP22
est localisée dans la totalité de la cellule infectée. Des études sont nécessaires pour déterminer si
ces différences de fluorescence sont dues à différentes affinités, à des masquages épitopiques
résultants de l’association de VP22 avec des constituants cellulaires ou nucléaires ou des
modifications post-traductionnelles dans VP22. Ainsi, Morrison et col. (1998b) ont reporté qu’un
AcMo dirigé contre la protéine VP22 d’HSV-1, P43, reconnaît une forme non phosphorylée de
VP22, montrant une faible intensité de fluorescence dans les cellules infectées équivalente à
celle observée en utilisant l’AcMo G22 lors de l’infection par MDV. L’étude de la
phosphorylation qui est la modification post-traductionnelle la plus étudiée dans le cas des
herpèsvirus, nous a montré que la protéine recombinante VP22 du MDV est phosphorylée au
niveau des 3 résidus sérine, thréonine et tyrosine. La protéine VP22 d’HSV-1 ne semble être
phosphorylée que sur les résidus sérine (Elliott et al., 1999). Ces sites de phosphorylation sont
supposés être situés en position N-terminale (71SSS73) et C-terminale (292SAS294) pourrait être
des substrats de la caséine kinase II et d’une kinase inconnue, respectivement (Elliott et al.,
1999). La protéine BHV-1 est phosphorylée sur une tyrosine mais les expériences n’ont pas
portées sur d’autres résidus (Ren et al., 2001b).
Dans le cas du virus HSV-1, le profil de phosphorylation de la protéine VP22 semble déterminer
sa localisation cellulaire. En effet, Pomeranz & Blaho (1999) ont démontré que la forme nonphosphorylée de VP22 était cytoplasmique au début de l’infection virale (entre 0 et 7 h p.i.), puis
qu’une partie des protéines VP22 était phosphorylée à des stades plus tardifs (> 7 h p.i.), se
localisant majoritairement dans le noyau des cellules infectées. Dans le cas du virus BHV-1, la
phosphorylation sur les résidus tyrosines de la protéine VP22 semble faciliter son incorporation
dans les virions, par opposition à ce qui a été décrit pour HSV-1 (Ren et al., 2001b)(Morrison et
al., 1998). L’ensemble de ces résultats montre le rôle important de cette modification posttraductionnelle dans les fonctions et la localisation de VP22 au cours de l’infection virale.
La protéine VP22 du virus HSV-1 qui possède de remarquable propriété de transport
intercellulaire, est capable d’être importée dans des cellules en culture, mais également de
diffuser d’une cellule qui l’exprime aux cellules voisines (Elliott et O'Hare, 1997). Nos résultats
sur l’importation de la protéine VP22 recombinante en fonction du temps, montrent que VP22
est identifiée d’abord dans le cytoplasme des cellules importatrices puis atteint progressivement
le noyau dans lequel elle se concentre. Cette protéine est capable d’être importée à partir d’un
milieu de culture dans plusieurs types cellulaires incluant des cellules de la lignée blanche
comme les lignées cellulaire lymphoïdes d’origine aviaire et murine, à l’instar de la protéine
VP22 d’HSV-1 (Elliott et O'Hare, 1997). Une fuite de la protéine VP22 dans le noyau de ces
cellules importatrices fixées à l’alcool-acétone semble peu probable, dans la mesure où nos
études montrent qu’à 5 min la protéine VP22 est majoritairement détectée dans le cytoplasme
même en fixation alcool-acétone. Les protéines recombinantes VP22 tronquées en position N- et
C-terminales sont importées, ce qui suggère que la région centrale de la protéine (aa 38-188) est
importante pour l’importation de VP22. L’alignement des protéines VP22 de MDV et d’HSV-1
en utilisant DIALIGN 2.1 (Morgenstern, 1999), révèle une région de grande similarité entre les
deux protéines des aa 93 à 173 pour la protéine VP22 du MDV. Cette région qui présente
également une grande similarité avec les protéines VP22 homologues du VZV, BHV-1, pourrait
être impliquée dans le trafic intercellulaire des protéines homologues à la VP22 (Fig. 41)
(Dorange et al., 2000) (Normand et al., 2001).
Figure 41 : Alignement de la séquence primaire des protéines VP22 des virus MDV-1, HSV-1,
VZV et BHV-1. Les résidus présentant cinq astérisques correspondent aux régions de similarité
maximale (Dialign 2).
fig41
L’importation au noyau implique plusieurs intéractions et mécanismes, dont l’attachement de la
protéine sur la membrane cytoplasmique, l’entrée dans les cellules, le ciblage et l’accumulation
nucléaire. La détection de la protéine VP22 du MDV dans les myotubes présents dans les tapis
des cellules infectées, laisse suggérer l’interaction de VP22 avec le réseau du cytosquelette
cellulaire (les microfilaments d’actine ou les microtubules), à l’instar de la VP22 d’HSV-1
(Elliott et O'Hare, 1998). Cependant, comme précedemment démontré pour la protéine VP22
d’HSV-1, la désorganisation du réseau de microtubule par le nocodazole n’empêche pas
l’importation de la VP22 dans ces cellules, suggérant un autre mode d’importation pour la
protéine VP22.
Izumiya et coll (1998) ont reporté un signal de localisation nucléaire (NLS) potentiel situé dans
la partie N-terminale de VP22 (RRKS-(S/E)RRRS). Cependant, les protéines tronquées en
position N-terminale, VP22N1 et VP22N2 continue d’être importée dans le noyau des cellules,
suggérant que le NLS est situé ailleurs dans la séquence protéique ou que cette protéine de 30
kDa peut diffuser dans le noyau puis y être retenue par liaison à des composants nucléaires. La
protéine VP22 du MDV semble être détectée sur les chromosomes des CESC infectées. A
l’instar de la VP22 d’HSV-1, la protéine VP22 recombinante présente une importante activité de
liaison à l’ADN qui a été localisée dans sa partie N-terminale entre les aa 16 et 37. La protéine
VP22N2, délétée des aa 1 à 37, peut être importée dans les noyau des cellules réceptrices, mais
semble disparaître après plusieurs lavages, suggérant que la région de fixation à l’ADN est
impliquée dans la rétention de VP22 dans les noyaux. Les résultats d’IFI effectués sur la lignée
QM7UL49N2 montrant la protéine VP22N2 se lier à l’ADN cellulaire sont en contradiction avec
ces premières expériences de liaison à l’ADN. Une affinité moindre de la protéine VP22N2 pour
l’ADN, en condition dénaturante, est suspectée, mais la possibilité, que la protéine VP22 possède
une séquence de fixation à l’ADN et une autre impliquée dans la liaison avec des protéines liées
à l’ADN (histones), ne peut être exclue.
Les virus délétés du gène UL49 et des gènes UL48-49 sont incapables de se multiplier en culture
cellulaire. Des essais de trans-complémentation ont été réalisés en utilisant les différentes
constructions codant pour les protéines VP22 et VP22 tronquées. Les deux virus 20? 49 et
20? 48-49 sont complémentés en co-transfection avec le plasmide d’expression pUL49, ce qui
suggère que la protéine VP22 peut complémenter les virus délétés du gène UL49 en trans. Par
contre, l’importation de la protéine VP22, exprimée dans le système baculovirus/cellule
d’insecte, dans les CESC et QM7 n’est pas capable de complémenter les deux virus 20? 49 et
20? 48-49. Comme prévu, la protéine VP16 qui est absente dans le virus 20? 48-49 n’est pas
nécessaire pour la réplication virale, car ce virus peut-être complémenté partiellement par
l’expression de VP22 seulement. La délétion du gène UL49 pourrait perturber l’expression de la
protéine gN (UL49,5) au sein du messager tricistronique. Cependant, la cotransfection du 20? 49
et du plasmide pUL49,5 ne permet pas la production de plages fluorescentes, suggérant que le
gène UL49,5 n’est pas impliqué dans l’incapacité du 20? 49 à former des plages de lyse. De plus,
l’obtention d’un virus ? 49R reconstitué confirme que l’incapacité du 20? 49 à se multiplier est
due à la délétion du gène UL49.
Cependant, la complémentation des BAC 20? 49 et 20? 48-49 n’est que partielle lorsque la
protéine VP22 est fournie en trans soit transitoirement soit de façon permanente.
Dans le cas des lignées exprimant de façon permanente les protéines VP22 et VP22 tronquées, la
transfection du BAC20 conduit à la formation de plages fluorescentes, ce qui suggère qu’aucun
facteur cellulaire impliqué dans la multiplication virale n’a été endommagé dans ces cellules. La
différence fondamentale entre la capacité de ces cellules exprimant de façon permanente les
protéines VP22 tronquées, versus les QM7 exprimant transitoirement les mêmes protéines, dans
lesquelles un certain degré de trans-complémentation est observé, doit être clarifiée. Dans le cas
du virus HSV-1, les sites et les effets de la phosphorylation de VP16 pendant l’infection virale
diffèrent de ceux identifiés lors de son expression en transfection (Triezenberg et al., 2001). De
même, les modifications post-traductionnelles de la protéine VP22 d’HSV-1 jouent un rôle dans
la localisation de VP22 et peuvent contribuer à différentes fonctions de la protéine au cours de
l’infection virale (Pomeranz et Blaho, 1999). Les protéines recombinantes VP22 et VP22MS du
MDV-1 présentent chacune deux formes phosphorylées en cellule d’insecte et la protéine VP22
possède au moins trois sites de phosphorylation situés aux résidus sérine, thréonine et tyrosine.
Une phosphorylation incorrecte des protéines VP22 et VP22 tronquées exprimées de façon
permanente dans les lignées cellulaires, pourrait empêcher une trans-complémentation efficace
du virus 20? 49. De même, une expression régulée de VP22 au cours de l’infection virale
permettant son interaction avec d’autres protéines virales pourrait être nécessaire pour la
formation d’une protéine VP22 fonctionnelle. Le profil de phosphorylation de ces protéines et
l’identification précise des sites de phosphorylation pourra permettre d’élucider leur importance
dans la trans-complémentation du 20? 49, par création de protéines VP22 délétés de ses sites de
phosphorylation.
Des expériences ultérieures sont nécessaires pour déterminer si la protéine VP22 du MDV-1 est
impliquée dans la transactivation des gènes viraux ou dans la sortie du virus. Nous avons
cependant quelques éléments de réponses. L’absence de synthèse de VP22 dans les cellules
infectées par les virus 20? 49 et 20? 48-49 ne semble pas affecter la synthèse des protéines
tardives, car la protéine VP5 est détectée dans les cellules infectées par ces deux virus, écartant le
rôle de VP22 dans la transactivation. Les protéines VP22 et VP22 tronquées partagent la région
impliquée dans le transport intercellulaire, ce qui suggère un rôle important de cette propriété de
la protéine VP22 dans la multiplication et dans la diffusion de cellule à cellule du virus. De plus,
la lignée QM7UL49-48M2 exprimant la protéine VP22MS favorise la multiplication virale du
BAC20 significativement par rapport à la lignée QM7 et nous savons que l’expression
permanente en cellule QM7 des glycoprotéines gE et gI, impliquées dans la diffusion du virus de
cellule à cellule, favorise également la multiplication virale, ce qui suggère un rôle de VP22MS
dans la diffusion du virus de cellule à cellule. Des manipulations préliminaires utilisant la
capacité du polyéthylène glycol à former des polycarions, semble indiquer que des capsides
virales cytoplasmiques sont présentes dans les cellules infectées par le 20? 49. Ces capsides
virales sont ensuite capable d’infecter les noyaux au sein d’un même polycarion. Cette étude, qui
demande cependant à être vérifiée, suggère qu’en absence de VP22, des capsides s’accumulent
dans le cytoplasme, indiquant également que la protéine VP22 est essentielle à la diffusion du
virion après le déenveloppement nucléaire. Ce résultat est à mettre en corrélation avec
l’expression largement cytoplasmique de la protéine VP22 d’HSV-1 dont le rôle dans la sortie
virale au niveau cytoplasmique est fortement suggéré.
Ce résultat montrant que la protéine VP22 du MDV-1 est essentielle pour la multiplication virale
est en contradiction avec l’étude des protéines VP22 d’HSV-1 et de BHV-1 qui ont été montrées
non-essentielles pour la croissance du virus en culture cellulaire (Elliott et Whiteley, 2001 ,
Liang et al., 1995). Cependant, ces virus génèrent des plages de taille réduite par comparaison à
leur virus parental, ce qui suggère que la protéine VP22 des virus HSV-1 et BHV-1 est
importante pour une diffusion efficace du virus de cellule à cellule en culture cellulaire (Elliott et
Whiteley, 2001 , Liang et al., 1995). VP22 influencerait ainsi le devenir d’une particule virale
dans la diffusion de cellule à cellule. Il est possible que la délétion de VP22 empêche totalement
la diffusion de cellule à cellule et que la formation de plages dans le cas des virus HSV-1 et
BHV-1 délétés du gène UL49 soit due aux particules virales extracellulaires qui infectent
majoritairement les cellules voisines. La diffusion de cellule à cellule étant l’unique moyen de
propagation du MDV, la délétion du gène UL49 lui serait ainsi létale.
D’ailleurs, l’utilisation de cette particularité du MDV qui est très associé aux cellules, peut être
un outil important pour déterminer le rôle des protéines des herpèsvirus au cours de la
morphogénèse virale, en déterminant les gènes essentiels à la diffusion de cellule à cellule et les
gènes non-essentiels qui pourraient être impliqués dans la formation de particules
extracellulaires.
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ANNEXE
ARTICLE 1
DORANGE, F., EL MEHADAOUI, S., PICHON, C., COURSAGET, P., VAUTHEROT, J.F.
Marek’s disease virus (MDV) homologues of herpes simplex virus type 1 UL49 (VP22) and
UL48 (VP16) genes: high-level expression and characterization of MDV-1 VP22 and VP16.
Journal
of
General
Virology,
2000,
81,
2219-2230.
http://vir.sgmjournals.org/cgi/content/abstract/81/9/2219?maxtoshow=&HITS=10&hits=10&RE
SULTFORMAT=&fulltext=2219&searchid=1047054850258_623&stored_search=&FIRSTIND
EX=0&volume=81&issue=9&search_url=http%3A%2F%2Fvir.sgmjournals.org%2Fcgi%2Fsear
ch
ARTICLE 2
DORANGE F., TISCHER, B.K., VAUTHEROT, J.F., OSTERRIEDER, N. Characterization of
Marek's Disease Virus Serotype 1 (MDV-1) Deletion Mutants That Lack UL46 to UL49 Genes:
MDV-1 UL49, Encoding VP22, Is Indispensable for Virus Growth. Journal of Virology, 2002,
76, No. 4, 1959-1970. http://jvi.asm.org/cgi/content/full/76/4/1959?view=full&pmid=11799190