GHIGNA Maria
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LA CYTOLOGIE EN CANCEROLOGIE BRONCHO-PULMONAIRE Dr MR Ghigna Service d’anatomie pathologique Centre Chirurgical Marie Lannelongue GENERALITES L’examen cytologique consiste dans l’analyse de la morphologie des cellules desquamées ou prélevées dans un tissu par abrasion ou bien par aspiration à l’aiguille. Les cellules sont étalées sur lame, colorées et analysées au microscope. Le cytologiste/pathologiste est donc confronté à des « cellules isolées » ou regroupées en « amas » de taille variée. Les éléments cellulaires sont donc extraits de leur contexte architectural à l’opposé des prélèvements histologiques. CYTOLOGIE AVANTAGES Modalité de prélèvement peu traumatisante, dont les complications hémorragiques ou infectieuses sont exceptionnelles. Prélèvements pouvant être effectués hors hospitalisation (ambulatoire/hôpital de jour) sous anesthésie locale. Techniques cytologiques peu couteuses et pouvant être réalisée rapidement par rapport à un examen histologique standard. Possibilité d’effectuer des analyses complémentaires sur les micro-fragments à but diagnostic (immunocytochimie) ou pour la prise en charge oncologique (test de bio-marqueurs pronostiques / biologie moléculaire). LIMITES La limite principale est parfois la faible quantité des cellules tumorales recueillies, ne permettant pas la mise en route de toutes techniques complémentaires (immunocytochimie / biomol). Difficulté à préciser la différentiation des éléments cellulaires sur la base du seul aspect morphologique. MODALITES DE PRELEVEMENTS - EXPECTORATION : analyse des cellules ayant spontanément desquamé de la surface bronchique - CYTOLOGIE LIQUIDE PLEURAL : analyse des cellules ayant spontanément desquamé de la surface pleurale. - BROSSAGE BRONCHIQUE : analyse cytologique des cellules recueillies par brossage de la surface bronchique - LAVAGE BRONCHO-ALVEOLAIRE : analyse cytologique des cellules recueillies par injection dans les voies aériennes plus périphériques de sérum physiologique - PRODUIT D’ASPIRATION BRONCHIQUE : examen cytologique des cellules recueillies par aspiration des éléments de la surface bronchique - CYTOPONCTIONS TRANSBRONCHIQUES : examen cytologique des cellules recueillies par aspiration à l’aide d’aiguilles fines (21 ou 22G). Telle aspiration est conduite sur des lésions bien identifiées par un echoendoscope. CYTOLOGIE EXFOLIATIVE PRELEVEMENTS SOUS FIBROSCOPIE BRONCHIQUE STANDARD PRELEVEMENTS SOUS FIBROSCOPIE ASSOCIEE A UN ECHOENDOSCOPE PRODUIT D’EXPECTORATION La recherche de cellules tumorales dans le produit d’expectoration est une méthode actuellement peu pratiquée. Cependant constitue la méthode la moins invasive et potentiellement applicable aux patients les plus « fragiles ». Méthodologie: - Rinçage abondant de la bouche pour minimiser la contamination - Recueil des expectoration après un « effort » de toux (meilleur résultat après séance de kinésithérapie) - Recueil du produit d’expectoration ainsi obtenu dans un conteneur stérile pour envoie au laboratoire. Avantages/limites: - Examen de conduite simple, non invasif, peu couteux et rapide. - Meilleure rentabilité de l’examen dans le cas de tumeur « centrales » - Cytologie emportant différents éléments de paroi bronchique/faible spécificité. CYTOLOGIE PLEURALE (1) Tout épanchement pleural chez un patient avec suspicion de cancer bronchopulmonaire doit être prélève pour examen cytologique. L’examen cytologique du liquide pleural montre une sensibilité très élevée pour l’identification des éléments tumoraux. Méthodologie: - Prélèvement pratiqué au lit du patient (souvent à « l’aveugle », rarement sous contrôle échographique) - Ponction affectée par une aiguille adaptée (avec ou sans aspiration an fonction du contexte) - Recueil du liquide (volume allant de 20 à 50 ml) dans un conteneur stérile avec anticoagulant (EDTA, citrate de sodium…) ou étalement par le médecin préleveur sur lame séchée à l’air. - Rapide acheminement du prélèvement non fixé recueilli en conteneur stérile au laboratoire en évitant de le conserver au réfrigérateur (possibilité d’anomalies morphologiques induite par une mauvaise conservation de l’échantillon). - Cytocentrifugation du liquide et coloration (Giemsa, HE, Papanicolau…) - Les étalements séchés sont directement colorés au laboratoire. CYTOLOGIE PLEURALE (2) Cellules tumorales Lymphocytes Cellules tumorales C. mésothéliales Avantages/limites: - Méthode particulièrement sensible pour l’identification des cellules tumorales - Problème de diagnostic dans le cas de liquides pauvre en cellules - Différentiation cellulaire parfois difficile à préciser (nécessité de techniques complémentaires… immunocytochimie et bonne connaissance du contexte clinique) - Possibilité d’inclure le prélèvement en paraffine après fixation et d’y pratiquer l’immunohistochimie/biomol si quantité suffisante de cellules. CYTOLOGIE PLEURALE (3) Cellules tumorales après fixation et inclusion en paraffine Cellules tumorales liquide Cellules tumorales après fixation et inclusion en paraffine TTF-1 BROSSAGE BRONCHIQUE Le brossage bronchique est réalisé au cour d ’ un examen bronchoscopique standard et consiste à prélever des échantillons de cellules par abrasion à l’aide de « brosses » spécifiques. Le prélèvement peut être dirigé sur une lésion visible à l’endoscopie ou bien intéresser des lésions pulmonaires périphériques en poussant la brosse le plus loin possible dans l’arbre bronchique. Méthodologie: - Prélèvement plus efficace si « brossage énergique » de la lésion - Matériel recueilli sur lame et étalé ou déposé dans un milieu fixateur Cellules tumorales (carcinome épidermoide) LAVAGE BRONCHO-ALVEOLAIRE (1) Le lavage broncho-alvéolaire (LBA) est un moyen d’investigation permettant le recueil des cellules au niveau des voies aériennes distales (bronchioles, alvéoles). Cette méthode est souvent pratiquée dans l ’ exploration des pathologies interstitielles, infectieuses et a trouve une utilité plutôt restreinte en pathologie tumorale. Dans ce dernier cas il peut être utilisé pour le diagnostic de tumeurs périphériques ou associées à une lymphangite carcinomateuse. Méthodologie: - Injection de 50ml de sérum physiologique dans le territoire atteint (dans le cas d’une maladie diffuse le sérum physiologique est injecté au niveau de la lingula; si pathologie systématisée territoire d’injection en fonction de la topographie de la lésion). - l’injection du sérum physiologique peut être répété trois fois. - liquide recueilli sur tubes en polypropylène et acheminé au laboratoire. - cytocentrifugation du liquide et colorations (MGG, HE…) LAVAGE BRONCHO-ALVEOLAIRE (2) Macrophages alvéolaires Cellules lymphomateuses Polynucléaires éosinophiles Macrophages alvéolaires Cellules inflammatoires Cellules Cellules tumorales tumorales Cellules tumorales ASPIRATION BRONCHIQUE L’étude cytologique des cellules prélevées par aspiration au cours d’un endoscopie bronchique est assez souvent réalisé en association à un prélèvement biopsique. La prise en charge par le laboratoire de ce type de prélèvement se rapproche de celle de l’expectoration. Cellules bronchiques Cellules tumorales Cellules bronchiques métaplasiques Cellules tumorales Cellules inflammatoires CYTOPONCTION TRANSTHORACIQUE (et aussi « electromagnetic navigation guided bronchoscopy ») Les cytoponctions transthoraciques sont réalisées sous contrôle tomodensitométrique, à but diagnostique dans le cas de tumeurs pulmonaires périphériques. De même que les cytoponctions transbronchiques elles sont réalisées à l’aiguille fine (22-23G) et un examen extemporané peut être pratiqué sur place. Méthodologie: - Repérage par tomodensitométrie la lésion à ponctionner - Prélèvement du matériel cytologique par une aiguille fine (22-23G) en aspiration - Après avoir traversé la plèvre une aspiration à la seringue est effectuée, associé à des mouvements de rotation et de va-et-vient de l’aiguille. - Un examen extemporané par étalement est systématiquement pratiqué à fin d’évaluer la quantité de matériel cellulaire - Le reste du matériel prélevé est ensuite fixé au formol non tamponné et inclus en paraffine pour obtenir un « cytobloc » (cell block). CYTOPONCTION TRANSBRONCHIQUE (1) L ’ EBUS (EndoBronchial Ultra Sound ) est une méthode micro-invasive permettant l’exploration pré-chirurgicale des lésions thoraciques; le plus souvent il s’agit d’adénopathies identifiées dans le bilan des néoplasies broncho-pulmonaires et les maladies inflammatoires atteignant des ganglions lymphatiques du médiastin. Les adénopathies pathologiques sont d’abord repérées à l’aide du CT et du PET scan. L’EBUS-TBNA (EBUS-TransBronchial Needle Aspiration ) est une méthode sûre, sans contreindications autres que celles liées à toute bronchoscopie. La sensibilité de cette procédure diagnostique varie entre 92 et 96% et sa spécificité est proche de 100%. Méthodologie: - Repérage par echodoppler associé au fibroscope de la masse/ganglion à ponctionner - Prélèvement du matériel cytologique par une aiguille fine (22-23G) en aspiration - Après avoir traversé la paroi bronchique une aspiration à la seringue est effectuée, associé à des mouvements de va-et-vient de l’aiguille. - Un examen extemporané par étalement est systématiquement pratiqué à fin d’évaluer la quantité de matériel cellulaire - Le reste du matériel prélevé est ensuite fixé au formol non tamponné et inclus en paraffine pour obtenir un « cytobloc » (cell block). CYTOPONCTION TRANSBRONCHIQUE (2) aiguille CYTOPONCTION TRANSBRONCHIQUE (3) Etages ganglionnaires médiastinales 2r 12l 4 13r 7 14r 10r 11l EBUS: procédure mini-invasive permettant l ’ accès aux étages ganglionnaries 2l,2r, 3p, 4r, 4l, 7, 10r, 10l, 11r, 11l. Les micro-biopsies ganglionnaires sont fixées au formol et incluses en paraffine pour analyse histologique standard. EUS: cytoponction trans-esophagienne , permettant l’accès aux ganglions 2l,4l, 3p, 7, 8 et 9. Médiastinoscopie: 2, 4R +/-7 Thoracoscopie: permet d’accéder aux étages gg 4l/r, 5, 6, 7, 8 et 9. CYTOPONCTION TRANSBRONCHIQUE (4) Le cancer pulmonaire (diagnostic + staging pre-opératoire) Table2. Overview of common invasive mediastinal staging techniques†. Investigation Sensitivity (%) Specificity (%) EBUS EUS TTNA Cervical mediastinoscopy Anterior mediastinoscopy VATS 93 84 89 78 87 75 100 99.5 100 100 100 100 FP (%) FN (%) Median prévalence % 0 0.7 0 0 0 0 9 19 81 11 8 7 63 61 39 38 44 Expert Rev. Respir. Med. 5(6), (2011) CYTOPONCTION TRANSBRONCHIQUE (5) Classification histologique proposée pour les prélèvements de petite taille (Int. Ass. for the study of the lung/ Am. Thor. Society/ Europ Resp. Society 2011): Adénocarcinome Carcinome epidermoïde Carcinome non à petites cellules NOS Carcinome à petites cellules Aspect morphologique typique d’adénocarcinome (structure glandulariforme, sécrétion mucus…) Variantes: solide, papillaire, acineuse, mixte, mucineux, à cellules en ‘bague à chaton », cellules claires) Si adénocarcinome lépidique mentionner que « au niveau du matériel l’éventuelle infiltration ne peut pas être précisée » Aspect morphologique de carcinome epidermoïde (maturation cornée, ponts intercellulaires…) Variantes: basaloide, à petites cellules, à cellules claires, papillaire) Carcinome non à petites cellules NOS (absence de différentiation glandulaire, de mucus et d’expression de TTF-1) Carcinome non à petites cellules neuroendocrine (expression des marqueurs de différentiation neuroendocrine) Carcinome à petites cellules (expression des marqueurs de différentiation neuroendocrine) CELL BLOCK (1) (cellules lymphoïdes et éléments de paroi bronchique) Cellules lymphoides Cellules bronchiques Macrophage anthracosique Cellules lymphoides (cytobloc) Cellules bronchiques (cytobloc) CELL BLOCK (2) (pathologie tumorale adénocarcinome) Etalement (extemporané) Cytobloc (après fixation 20X) Cytobloc (après fixation 40X) TTF-1 CELL BLOCK (3) (pathologie tumorale carcinome epidermoide) Etalement Cytobloc après fixation Cytobloc après fixation Cytobloc après fixation (p63/p40) CELL BLOCK (4) (pathologie tumorale carcinome carcinomes neuroendocrines) Carcinome neuroendocrine à petites cellules Carcinome neuroendocrine à grandes cellules CD56 Cytokératine 7 TTF-1 CELL BLOCK (5) (pathologie tumorale carcinome à grandes cellules) Cytobloc après fixation Etalement Cytokératine AE1/AE3 TTF-1 p63 CELL BLOCK (6) (pathologie tumorale mésothéliome) CK5/6 calretinine HES 40x Ghigna MR Cytopathol 2016 TUMORIGENESIS DRIVER GENES Anomalies génétiques ADK 42% inconnues 25% mut KRAS 10% mut EGFR ALK fusion 4% ROS1 fusion 1,9% RET fusion 0,9% NTRK1 fusion 1% HER2 mut 3% BRAF mut 3% PI3KCA mut 2% HRAS mut 1% AKT mut 1,1% MET ex 1 4,3% MAP3KI mut 1% 11% NSCLC 34% 55% Anomalies génétiques SCK FGFR ampl 22% unknown DDR mut 4% PI3KCA amp 33% MET amp 5% MET mut 1% BRAF mut 2% Autres/inconnues 33% Shames DS J Pathol. 2014 Interaction :pneumologueoncologue-chirurgienradiologue-pathologiste « Managment » du tissu Micro-biopsie (cell-block) prélèvement : ≥4 passages pathologiste Fractionnement de l’échantillons (min 2 cell blocks) Primo diagnostic ou récidive? Réalisation de plusieurs niveaux de coupes et lames blanches pour IHC bio marqueurs ALK ALK ROS1 PDL1 Bonne conservation épitopes: - 3-6h fixation - LB récentes (<6 mois) - Prélèvement <3ans Al. M et al. JCO 2016 ALK (anaplastic lymphoma kinase): - 2p23 (initialement découvert dans les lymphomes anaplasiques CD30+, codant pour le récepteur CD246, faisant partie de la supérfamille des récepteurs à insuline) - Mutations et amplifications dans : neuroblastomes (sporadiques et familiaux); réarrangements par translocation (multiples gènes partenaires) ou inversion: lymphomes et tumeurs conjonctives - Dans le CBNPC: réarrangements avec EML4 (Echinoderm microtubules associated protein 4) ; autres gènes parténaires (KIF5B, TGF, KLC..) Soda M et al Nature 2007 Immunohistochimie: - Deux anticorps validés : clone 5A4 (Novocastra, leica, Cliniscience CE-IVD) et clone D5F3 (Cell Signalling Technology, Ventana CE-IVD) Interprétation IHC: Tissu pulmonaire ALK - Négatif (absence de marquage) - Score + (cytoplasme faible dans ≥10% des cellules) - Score ++ (cytoplasme faible-modéré dans ≥10% des cellules) - Score +++ (cytoplasme forte intensité dans ≥10% des cellules) Togashi Y et al. PLoS1 2012, Mino-Kenudson M et al. Clin Canc Res 2010 ALK FISH: Sondes disponibles: - Sondes de séparation (break-apart ou split, es: Vysis ALK break-apart FISH probe kit) FISH patterns positif négatif Signaux séparés Noyau (bleu) Fusion signaux orange et vert ? Noyau Signaux séparés et délétion Signaux adjacents ? Signal vert et délétion du signal orange Extrémité 3’ ALK (300KB): orange Extrémité 5’ ALK (442 KB): vert Interprétation: - Echantillon négatif : <5/50 cellules (<10%) - Echantillon positif: >25/50 cellules (>50%) - Douteux : 5-25 cellules (augmenter le n 100 cellules, 2ème lecteur) ROS1 (6q22) - Récepteur avec domaine tyrosine kinase, faisant partie de la famille des récepteurs de l’insuline - Les réarrangements ont été décrit dans : glioblastomes, cholangiocarcinome, cancer ovaire et CBNPC - CBNPC: fusion du domaine de la tyrosine kinase au domaine amino-terminal de différent gènes partenaires (SCL34A2, CD74, FIG1, TPM3, SDC4..), ayant comme conséquence l’activation des voies de signalisation PI3K/Akt/mTOR, ERK, Stat3 Davies KD Clin Cancer Res 2013 FISH ROS1 - exprimé normalement tau niveau du rein, tissu nerveux, tube digestif…absent dans le tissu pulmonaire - FISH: sondes de séparation break-apart Vysis LSI a) Fusion des signaux: négatif b) Séparation et fusion: positif c) Fusion et un signal vert isolé (délétion sonde orange) : positif d) polysomie: négatif e) séparation: positif f) délétion: positif Bubendorf L et al. Virchows arch 2016 IHC ROS1 IHC interprétation (D4D6 rabbit monoclonal Ab) : - Score 0 (absence of expression) - Score 1+ (marquage cytoplasmique faible) - Score 2++ (marquage <50%) - Score 3+++ (marquage for dans >50%) Sholl LM et al. Am J Surg Pathol 2013 PD-1/PD-L1(B7-H1 ou CD274) pathway : - PD-1 (CD279) est exprimé à la surface des lymphocytes T activés. - Les ligands PD-L1 (CD274, B7-H1) et PD-L2 (B7-DC et CD273) sont souvent exprimés à la surface des cellules dendritiques et des macrophages. - Interaction PD-1/PD-L1 comporte le déclanchement d’un signal inhibiteur ayant comme consequence la diminution de la production de cytokine pro-inflammatoire et la suppression de la prolifération des lymphocytes T - Surexpression de PD-L1 par les cellules tumorales pour se soustraire à la réponse immunitaire - Actuellement 5 anticorps monoclonaux ciblant PD-1 et PD-L1 ont été mis au point: Nivolumab - anti PD-1 Bristol-Meyers Squibb, IHC ab28.8 rabbit (Weber JS et al. I Clin Oncol 2013) Pembrolizumab (anti PD-1, Merck, 22C3 mouse) (Tumeh PC et al. Nature 2014) Durvalumab (anti PD-L1 Astrazeneca, SP263 rabbit) Positif : marquage membranaire complet ou partiel des cellules tumorales (marquage cytoplasmique non significatif) (Planchard D et al. Clin Lung Cancer 2016) Avelumab (anti PD-L1 Merck, 28-8 Dako) (Kaufman HL et al. Lancet oncol 2016) Atezolizumab (anti PD-L1 Genetech-Roche, SP142 rabbit) Marquage des cellules immunitaire, considéré aussi comme positif RÔLE DU PATHOLOGISTE Micro-biopsie (cell-block) Pathologiste: Analyse morphologique/cytologique Quantité minimale ADN requise = 5ng ADN Eberhard DA et al. JCO 2008 Etude immunohistochimique (TTF-1, p40, mucines) ADK: Evaluation du pourcentage cellulaire avant séquençage (EGFR, KRAS, BRAF, HER2) CR incorporant les résultats des analyse génétiques Diagnostique Bio marqueurs pronostiques - ADK: IHC ALK, ROS1 - NSCLC: PD-L1 CYTOPONCTION TRANSBRONCHIQUE (14) Technique Sensibilité Séquençage Sanger 10-25%, risque de faux négatifs Pyroséquençage 10% qPCR 0,1- 0,01% PCR digitale/ beaming <0.001% NGS (Safe-Seq/TAM-Seq) <0.1% CONCLUSION La cytologie est une méthode de diagnostique reconnue et largement répandue en cancérologie broncho-pulmonaire. L’étude cytologique des liquides d’épanchement pleural est une méthode peu ou non invasive, performante dans l’hypothèse d’une pathologie tumorale bronchopulmonaire (la sensibilité pouvant atteindre 80%). Les prélèvements cytologiques et les micro-biopsies font (sous réserve de la quantité du matériel recueilli) l’objet d’études complémentaires tels que l’immunohistochimie, la cytogénétique, la biologie moléculaire ou la CMF (cytométrie en flux) pour fournir au cancérologue un typage précis de la pathologie tumorale diagnostiquée.
