Analyse des résistances des bactéries aux antibiotiques et
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FICHE D’APPLICATION Spectrométrie Spec o é e de masse Emmanuel WEY1, Thierry LEGOUPIL2 Analyse des résistances des bactéries aux antibiotiques et médicaments avec l’ID Plus Performance RÉSUMÉ Aujourd’hui l’identification rapide et efficace des bactéries multi-résistantes est un enjeu de santé publique majeur. En effet, les services de santé doivent de plus en plus souvent faire face à des résistances aux antibiotiques utilisés en première intention contre les infections bactériennes, ce qui peut entraîner une inefficacité du traitement, voire une aggravation de l’état du patient. Ces souches bactériennes nécessitent une détection fiable et rapide afin d’adopter la bonne thérapie au bon moment pour chaque patient. Notre objectif est de montrer comment l’ID Plus de Shimadzu permet une analyse rapide et peu coûteuse des pathogènes. Cet exemple illustre l’identification des bactéries résistantes aux antibiotiques et médicaments grâce à la détection d’enzymes induisant cette résistance, ou d’un plasmide portant un gène de résistance. MOTS-CLÉS Résistance aux antibiotiques - Identification bactérienne - Spectromètre de masse - Recherche clinique. Analysis of bacterial resistance to drugs and antibiotics with ID Plus Performance SUMMARY Nowadays, the rapid and efficient identification of multidrug-resistant bacteria is a major public health issue. Indeed, we often face resistance to antibiotics used as first-line therapy against bacterial infections, which may result in an ineffective treatment, or even the worsening of the patient’s condition. These bacteria require reliable and fast detection to choose the right therapy at the right moment for each patient. Our goal is to show how the Shimadzu ID Plus allows rapid and inexpensive analysis of pathogens. This example shows identification of resistant bacteria to drugs and antibiotics by detecting an enzyme inducing this resistance, or a plasmid carrying a resistance gene. KEYWORDS Resistance to Antibiotics - Bacterial identification - Mass spectrometer - Clinical research. Figure 1 I - Introduction L’identification bactérienne par une technologie MALDI est aujourd’hui entrée dans le monde de la routine de beaucoup de laboratoires de bactériologie dans les hôpitaux, cliniques ou dans les laboratoires de biologie médicale. Cette technique permet une analyse rapide et à moindre coût des pathogènes actuellement considérés. Dans l’optique d’une approche clinique, ce type d’instrument permet de compléter cette identification par une étude des résistances des bactéries aux antibiotiques et médicaments. Cette approche est aujourd’hui réalisable par des solutions plus ouvertes comme l’ID Plus Performance qui permet d’utiliser une méthodologie de fragmentation (MS/MS) plus spécifique et destinée à la recherche clinique (figure 1). Actuellement, l’émergence d’entérobactéries multirésistantes qui produisent des bêta-lactamases à spectre étendu (BLSE) et des carbapénémases est 1 Royal Free Hospital - NHS Foundation Trust - Royaume-Uni Shimadzu France SAS, Le Luzard II - Noisiel Boulevard Salvador Allende - 77448 Marne la Vallée Cedex 2 - Tél. : +33 (0)1 60 95 10 10 [email protected] www.shimadzu.fr 2 SPECTRA ANALYSE n° 304 • Juillet - Août 2015 59 FICHE D’APPLICATION une problématique de santé publique mondiale. En effet, les BLSE confèrent une résistance à large spectre aux antibiotiques utilisés de manière empirique aux premières phases de traitement, dans le cas d’infections bactériennes gram négatif. Les métallo-β-lactamases de type VIM et NDM sont également très limitantes pour les options de traitements par antibiotiques. Elles sont devenues endémiques dans certains pays. Ces souches nécessitent d’être détectées rapidement et efficacement afin de comprendre leurs mécanismes de résistance et ainsi d’adopter les approches thérapeutiques appropriées vis-à-vis des patients qui les hébergent. II - Marqueurs de résistance dans des isolats A RTICLES Quatre isolats, souches bactériennes isolées à un genre, ont été préparés en utilisant une souche de type DH5alpha E. coli transformée à l’aide d’un plasmide de type pBAD (Tableau I). Les isolats 1 et 3 montrent une résistance à la bêta-lactamase, alors que l’isolat 4 est entièrement sensible aux antibiotiques. Après une croissance dans des conditions aérobies, l’ensemble des cellules bactériennes ont été extraites de manière spécifique et les protéines ont été alkylées, réduites puis digérées à la trypsine. Les peptides ont été séparés grâce au système AccuspotTM, robot autonome couplé à un système nanoLC qui collecte les composés issus de la séparation chromatographique pour une analyse en spectrométrie de masse sur l’ID Plus Performance. Les analyses ont été faites ensuite en MALDI de manière automatisée avec une fragmentation CID (Collision-Induced Dissociation) MS/MS haute énergie (20KeV). Les caractérisations ont été faites sur le moteur de recherche MASCOT TM en comparaison Figure 2 60 SPECTRA ANALYSE n° 304 • Juillet - Août 2015 avec la base de données du National Center for Biotechnology Information. Ainsi, les peptides biomarqueurs des enzymes induisant la résistance à la bêta-lactamase ont été détectés dans les isolats 1, 2 et 3 de la souche de type DH5alpha E. coli. Comme nous l’avions anticipé, aucune de ces enzymes n’a été détectée dans l’isolat 4. Un exemple de spectres MS et MS/ MS obtenus dans l’expérience d’identification LCMALDI de l’isolat 2 est présenté sur la figure 2. Les données du spectre MS/MS ont été confrontées au moteur de recherche MASCOTTM et ont permis d’identifier l’enzyme liée au type CTX-M de la bêta-lactamase. Spectres MS et MS/MS de l’isolat 2 Le nombre de biomarqueurs détectés et le mécanisme de résistance de chaque isolat (basé sur l’identification des enzymes) de la souche de type DH5alpha E. coli sont détaillés dans le tableau II. Aucun biomarqueur n’a été détecté sur l’isolat 4 ce qui démontre l’efficacité de cette démarche analytique. Ces résultats démontrent l’utilité de la solution ID Plus Performance pour discriminer des espèces issues d’une souche identique, avec pour différence la résistance aux antibiotiques portant le plasmide modifié. III - Le futur de l’identification des marqueurs de résistance en clinique D’autres expériences ont été réalisées sur des isolats cliniques non modifiés. Ainsi, il a été possible de caractériser la séquence peptidique des enzymes résistantes pour les souches présentant des mécanismes de résistance multiples. Certaines enzymes identifiées incluaient la classe C Amp-C β-lactamases et la classe B Analyse des résistances des bactéries aux antibiotiques et médicaments avec l’ID Plus Performance FICHE D’APPLICATION Tableau I Résistance à la bêta-lactamase des isolats analysés Isolat TEM1 CTX-M15 KanR 1 Résistant Sensible Sensible 2 Résistant Résistant Résistant 3 Résistant Sensible Résistant 4 Sensible Sensible Sensible Tableau II Mécanisme de résistance et nombre de biomarqueurs détectés pour chaque isolat Isolats TEM1 5 1,2 et 3 CTX-M 15 14 2 KanR 6 2 et 3 des Métallo-β-lactamases de la classification d’Ambler. Tous les résultats ont été confirmés par LC-MALDI par comparaison aux méthodes conventionnelles de diagnostic. Ces méthodes sont les méthodes moléculaires utilisées dans les laboratoires de microbiologie. De plus, certains isolats de bactéries sensibles aux antibiotiques ont été utilisés et analysés pour servir de référence et montrer l’absence de l’enzyme induisant la résistance. RTICLES Nombre de biomarqueurs A Résistance IV - Conclusion En résumé, la solution ID Plus Performance peut apporter : - une détection des marqueurs de résistance dans des souches de bactéries identiques ou non identiques, - une différenciation des souches résistantes aux antibiotiques basée sur le génotype et le phénotype, - l’évaluation des mécanismes de résistance en LC-MALDI pour la recherche et dans un avenir proche pour le diagnostic. RÉFÉRENCES (1) WEY E., HART P., VANSTONE G., OPENSHAW M., HOPKINS K., WOODFORD N. et al., Detection of β-lactamase, aminoglycoside modifying enzyme and carbapenemase resistance biomarkers directly using MALDI-TOF Tandem MS, ECCMID 2014 SPECTRA ANALYSE n° 304 • Juillet - Août 2015 61
