Analyse des résistances des bactéries aux antibiotiques et

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SPECTRA ANALYSE n° 304 • Juillet - Août 2015
FICHE D’APPLICATION
Spectrométrie de masse
Spec o é e
Spec o é e
Analyse des résistances des bactéries
aux antibiotiques et médicaments
avec l’ID Plus Performance
I - Introduction
L’identifi cation bactérienne par une technologie
MALDI est aujourd’hui entrée dans le monde
de la routine de beaucoup de laboratoires de
bactériologie dans les hôpitaux, cliniques ou
dans les laboratoires de biologie médicale. Cette
technique permet une analyse rapide et à moindre
coût des pathogènes actuellement considérés.
Dans l’optique d’une approche clinique, ce
type d’instrument permet de compléter cette
identifi cation par une étude des résistances des
bactéries aux antibiotiques et médicaments.
Cette approche est aujourd’hui réalisable
par des solutions plus ouvertes comme l’ID
Plus Performance qui permet d’utiliser une
méthodologie de fragmentation (MS/MS) plus
spécifique et destinée à la recherche clinique
(fi gure 1).
Actuellement, l’émergence d’entérobactéries multi-
résistantes qui produisent des bêta-lactamases à
spectre étendu (BLSE) et des carbapénémases est
RÉSUMÉ
Aujourd’hui l’identifi cation rapide et effi cace des bactéries multi-résistantes est un enjeu de santé publique
majeur. En effet, les services de santé doivent de plus en plus souvent faire face à des résistances aux
antibiotiques utilisés en première intention contre les infections bactériennes, ce qui peut entraîner une
ineffi cacité du traitement, voire une aggravation de l’état du patient. Ces souches bactériennes nécessitent
une détection fi able et rapide afi n d’adopter la bonne thérapie au bon moment pour chaque patient.
Notre objectif est de montrer comment l’ID Plus de Shimadzu permet une analyse rapide et peu coûteuse
des pathogènes. Cet exemple illustre l’identifi cation des bactéries résistantes aux antibiotiques et
médicaments grâce à la détection d’enzymes induisant cette résistance, ou d’un plasmide portant un gène
de résistance.
MOTS-CLÉS
Résistance aux antibiotiques - Identifi cation bactérienne - Spectromètre de masse - Recherche clinique.
Analysis of bacterial resistance to drugs and antibiotics with ID Plus Performance
SUMMARY
Nowadays, the rapid and efficient identification of multidrug-resistant bacteria is a major public health issue. Indeed,
we often face resistance to antibiotics used as first-line therapy against bacterial infections, which may result in
an ineffective treatment, or even the worsening of the patient’s condition. These bacteria require reliable and fast
detection to choose the right therapy at the right moment for each patient.
Our goal is to show how the Shimadzu ID Plus allows rapid and inexpensive analysis of pathogens. This example
shows identification of resistant bacteria to drugs and antibiotics by detecting an enzyme inducing this resistance, or
a plasmid carrying a resistance gene.
KEYWORDS
Resistance to Antibiotics - Bacterial identification - Mass spectrometer - Clinical research.
Figure 1
1 Royal Free Hospital - NHS Foundation Trust - Royaume-Uni
2 Shimadzu France SAS, Le Luzard II - Noisiel Boulevard Salvador Allende - 77448 Marne la Vallée Cedex 2 - Tél. : [phone]
[email protected] www.shimadzu.fr
Emmanuel WEY1, Thierry LEGOUPIL2

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RTICLESA
une problématique de santé publique mondiale.
En eff et, les BLSE confèrent une résistance à large
spectre aux antibiotiques utilisés de manière
empirique aux premières phases de traitement,
dans le cas d’infections bactériennes gram négatif.
Les métallo-β-lactamases de type VIM et NDM
sont également très limitantes pour les options de
traitements par antibiotiques. Elles sont devenues
endémiques dans certains pays.
Ces souches nécessitent d’être détectées rapi-
dement et effi cacement afi n de comprendre leurs
mécanismes de résistance et ainsi d’adopter les
approches thérapeutiques appropriées vis-à-vis
des patients qui les hébergent.
II - Marqueurs de résistance
dans des isolats
Quatre isolats, souches bactériennes isolées à un
genre, ont été préparés en utilisant une souche de
type DH5alpha E. coli transformée à l’aide d’un
plasmide de type pBAD (Tableau I). Les isolats 1
et 3 montrent une résistance à la bêta-lactamase,
alors que l’isolat 4 est entièrement sensible aux
antibiotiques.
Après une croissance dans des conditions
aérobies, l’ensemble des cellules bactériennes
ont été extraites de manière spécifique et les
protéines ont été alkylées, réduites puis digérées
à la trypsine. Les peptides ont été séparés grâce
au système AccuspotTM, robot autonome couplé
à un système nanoLC qui collecte les composés
issus de la séparation chromatographique pour
une analyse en spectrométrie de masse sur l’ID
Plus Performance. Les analyses ont été faites
ensuite en MALDI de manière automatisée
avec une fragmentation CID (Collision-Induced
Dissociation) MS/MS haute énergie (20KeV).
Les caractérisations ont été faites sur le moteur
de recherche MASCOTTM en comparaison
avec la base de données du National Center for
Biotechnology Information.
Ainsi, les peptides biomarqueurs des enzymes
induisant la résistance à la bêta-lactamase ont
été détectés dans les isolats 1, 2 et 3 de la souche
de type DH5alpha E. coli. Comme nous l’avions
anticipé, aucune de ces enzymes n’a été détectée
dans l’isolat 4. Un exemple de spectres MS et MS/
MS obtenus dans l’expérience d’identifi cation LC-
MALDI de l’isolat 2 est présenté sur la fi gure 2. Les
données du spectre MS/MS ont été confrontées
au moteur de recherche MASCOTTM et ont
permis d’identifi er l’enzyme liée au type CTX-M
de la bêta-lactamase.
Spectres MS et MS/MS de l’isolat 2
Le nombre de biomarqueurs détectés et le
mécanisme de résistance de chaque isolat (basé
sur l’identifi cation des enzymes) de la souche de
type DH5alpha E. coli sont détaillés dans le tableau
II. Aucun biomarqueur n’a été détecté sur l’isolat
4 ce qui démontre l’effi cacité de cette démarche
analytique.
Ces résultats démontrent l’utilité de la solution ID
Plus Performance pour discriminer des espèces
issues d’une souche identique, avec pour diff érence
la résistance aux antibiotiques portant le plasmide
modifi é.
III - Le futur de l’identi cation des
marqueurs de résistance en clinique
D’autres expériences ont été réalisées sur des
isolats cliniques non modifiés. Ainsi, il a été
possible de caractériser la séquence peptidique
des enzymes résistantes pour les souches
présentant des mécanismes de résistance multi-
ples. Certaines enzymes identifiées incluaient
la classe C Amp-C β-lactamases et la classe B
Figure 2

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SPECTRA ANALYSE n° 304 • Juillet - Août 2015
Analyse des résistances des bactéries aux antibiotiques et médicaments avec l’ID Plus Performance
RTICLESA
des Métallo-β-lactamases de la classification
d’Ambler. Tous les résultats ont été confirmés
par LC-MALDI par comparaison aux méthodes
conventionnelles de diagnostic. Ces méthodes
sont les méthodes moléculaires utilisées dans
les laboratoires de microbiologie. De plus,
certains isolats de bactéries sensibles aux
antibiotiques ont été utilisés et analysés pour
servir de référence et montrer l’absence de
l’enzyme induisant la résistance.
IV - Conclusion
En résumé, la solution ID Plus Performance peut
apporter :
- une détection des marqueurs de résistance
dans des souches de bactéries identiques ou non
identiques,
- une diff érenciation des souches résistantes
aux antibiotiques basée sur le génotype et le
phénotype,
- l’évaluation des mécanismes de résistance en
LC-MALDI pour la recherche et dans un avenir
proche pour le diagnostic.
Isolat TEM1 CTX-M15 KanR
1 Résistant Sensible Sensible
2Résistant Résistant Résistant
3 Résistant Sensible Résistant
4 Sensible Sensible Sensible
Tableau I
Résistance à la bêta-lactamase des isolats analysés
Tableau II
Mécanisme de résistance et nombre de biomarqueurs détectés pour chaque isolat
Résistance Nombre de biomarqueurs Isolats
TEM1 5 1,2 et 3
CTX-M 15 14 2
KanR 6 2 et 3
(1) WEY E., HART P., VANSTONE G., OPENSHAW M., HOPKINS K., WOODFORD N. et al., Detection of β-lactamase, aminoglycoside
modifying enzyme and carbapenemase resistance biomarkers directly using MALDI-TOF Tandem MS, ECCMID 2014
RÉFÉRENCES