La colonisation des ebauches gonadiques par les cellules

/. Embryol. exp. Morph. Vol. 20, 2, pp. 189-213, September 1968
With 4 plates
Printed in Great Britain
La colonisation des
ebauches gonadiques par les cellules germinales de
Fembryon de Poulet, en culture in vitro
Par REGIS DUBOIS1
Institut (VEmbryologie du College de France et du C.N.R.S.
(Directeur: Professeur Etienne Wolff)
Chez les Vertebres, la segregation de la lignee germinate s'effectue des les
stades les plus precoces du developpement. Les cellules germinales primordiales
(CGP) apparaissent toujours hors des gonades et se trouvent souvent localisees
dans des territoires bien delimites, plus ou moins eloignes des ebauches gonadiques presomptives. La destinee des gonocytes etant liee de facon irreductible a
leur installation dans les ebauches genitales, ces cellules entreprennent, a chaque
generation, une migration qui les conduit infailliblement aux epitheliums
germinatifs.
Les nombreux travaux consacres a ce sujet ont permis de distinguer deux
modes de migration:
— la migration interstitielle qui intervient lorsque les CGP sont situees
posterieurement, a proximite des ebauches gonadiques;
— la migration vasculaire qui entre en jeu des que les CGP se trouvent
eloignees des epitheliums germinatifs.
La migration interstitielle s'effectue par des deplacements actifs des CGP qui
progressent grace a leurs mouvements amoeboides. L'idee d'une attraction par
la region sexuelle et d'une migration orientee par chimiotactisme s'est imposee:
'les gonocytes se comportent comme un essaim de microorganismes ou de
leucocytes attires vers un but par un stimulus chimique' (Witschi, 1948).
Chez les Oiseaux, les faits sont un peu plus complexes. Les CGP naissent a la
partie posterieure du germe, a proximite des futures ebauches sexuelles, mais
les mouvements morphogenes precoces les portent dans le croissant germinal
anterieur, loin de leur but (Dubois, 1967 a, b). Dans une premiere etape, les
CGP migrent par la voie sanguine en se laissant passivement entrainer jusqu'aux
epitheliums germinatifs (Simon, 1960). Dans une seconde etape, on assiste a la
sortie des gonocytes hors du reseau vasculaire et a leur fixation au niveau des
1
Adresse de Vauteur: Laboratoire d'Embryologie Experimentale, 49 bis, avenue de la
Belle Gabrielle, 94 Nogent-sur-Marne, France.
13
J E EM 20
190
REGIS DUBOIS
Types d'associations in vitro
region gonadique
non radioactive
Interposition
d'une
membrane filtrante
Fig. 1. Schemas r6sumant les principales associations rSalisees en culture in vitro.
Cellules germinales de Poulet
191
territories sexuels presomptifs. Le present travail est consacre a l'etude experimentale du mecanisme qui preside, au cours de cette ultime etape, a l'installation des CGP dans les epitheliums germinatifs.
MATERIEL ET METHODES — GENERALITES
Nous nous bornerons ici aux generalites. Les details techniques particuliers
seront precises avec les series experimentales auxquelles ils se rapportent.
Toutes les experiences sont faites sur l'embryon de Poulet de la race Leghorn
blanche. Le milieu de culture est celui de Wolff & Haffen (1952), enrichi par du
serum de Poulain.
La plupart de nos experiences consistent dans des associations in vitro que
la figure 1 resume. L'hote utilise dans une association est la region gonadique
d'un embryon precocement sterilise et ayant differencie 27 a 35 paires de
somites. La sterilisation precoce des embryons est obtenue in vitro par excision
du croissant germinal, aux stades 7 a 10 paires de somites (technique de Simon,
1960). Nous avons egalement sterilise les notes aux memes stades, in ovo, selon
la technique de Wolff (1936), par une double irradiation aux rayons X, de l'aire
extra-embryonnaire anterieure (Dubois, 1962). Les deux modes de sterilisation
conduisent aux memes resultats: dans la grande majorite des cas, les notes sont
totalement steriles (tableaux 2, 3, 4).
Les greffons sont de differentes natures:
— lorsque le greffon est le croissant germinal fertile d'un embryon normal de
10 a 12 paires de somites, nous l'associons etroitement a une region gonadique
sterile et reduite par la dissection aux epitheliums germinatifs, aux canaux de
Wolff, aux mesenchymes avoisinants et a l'endoderme. L'ensemble est cultive
dans un repli de membrane vitelline selon la technique mise au point par Wolflf
(1960):
— lorsque le greffon est une gonade embryonnaire gauche nous l'associons a
l'hote en l'introduisant dans la cavite coelomique gauche de la region gonadique
sterile.
— enfin, lorsque le greffon est une gonade embryonnaire gauche radioactive,
ou enfermee dans un sac anhiste, l'hote est une region gonadique normale.
Dans la plupart des cas, les echantillons sont fixes au liquide de Bouin apres
des temps de culture variant de 15 a 24 h, rarement plus. Les coupes de 5 fi a
7 /* sont colorees par l'hematoxyline eosine.
Caracteres des cellules germinales. Les criteres qui nous permettent de reconnaitre les gonocytes, et notamment les cellules germinales primordiales avant
leur installation dans les gonades, sont les suivants: ce sont des cellules de
forme arrondie et de grande taille (15 [i de diametre en general); leur noyau,
clair et turgescent, est plus volumineux que celui des cellules somatiques (environ
9/t de diametre); il montre frequemment deux nucleoles. Ces caracteres suffisent
generalement pour reconnaitre les CGP sans ambiguite, et ne pas les confondre
13-2
192
REGIS DUBOIS
avec d'autres elements libres comme par exemple les cellules-souches de la
lignee sanguine. Toutefois, on a recherche dans les gonocytes un caractere
specifique qui permettrait de les identifier avec certitude. La reaction histochimique au Periodic Acid Schiff (PAS) a permis de mettre en evidence une forte
concentration de glycogene dans ces cellules (Mintz, 1960; Meyer, 1961;
Meyer & O'Rahilly, 1961; Clawson & Domm, 1963; Reynaud, 1967). Ce
polysaccharide est si abondant dans le cytoplasme des CGP que la reaction
permet de les colorer electivement et de les suivre aux differentes etapes de leur
migration (Meyer, 1964). Recemment,Dubois&Cuminge(1967,1968)ontmontre
que les CGP du croissant germinal contiennent des lipides figures en quantite
considerable. Cette reserve lipidique est encore abondante dans les cellules
germinales qui colonisent les cretes genitales et dans les gonocytes primaires de
la gonade morphologiquement indifferenciee. La richesse en gouttelettes
lipidiques est telle qu'elle marque electivement les cellules germinales et qu'elle
permet de les reconnaitre aisement avant et apres leur installation dans les
epitheliums germinatifs (planche 1, figs. B a G).
Grace a ces techniques particulieres de l'histochimie, il a ete possible de
reperer avec certitude les gonocytes et de suivre avec precision leur comportement et leur destinee. II est remarquable que, dans tous les cas, les resultats
acquis par l'application de ces methodes sont rigoureusement identiques a ceux
obtenus par i'emploi des techniques histologiques classiques. 11 n'est done pas
douteux qu'a partir du stade du croissant germinal (environ 24 h d'incubation)
les seuls criteres morphologiques (taille, forme, aspect de la cellule et de son
noyau) sont sufiisants pour qu'un observateur initie puisse reconnaitre avec
certitude une cellule germinale.
I. ASPECTS MORPHOLOGIQUE ET NUMERIQUE DE LA COLONISATION
DES EPITHELIUMS GERMINATIFS PAR LES CGP, DANS LES
CONDITIONS NORMALES DU DEVELOPPEMENT
L'ultime etape de la migration des CGP des Oiseaux a souvent ete decrite,
mais a donne lieu a des interpretations differentes. Actuellement, le probleme se
resume a deux propositions:
— la retention des CGP au niveau des ebauches gonadiques est purement
mecanique et e'est la disposition particuliere du reseau vasculaire agissant a la
facon d'un filtre qui la determine (Dantchakoff, 1934, 1950):
— la fixation des CGP resulte de l'amceboidisme oriente de ces cellules; elle
est determined par un mecanisme analogue a celui qui commande la migration
inter stitielle.
Cette derniere hypothese, historiquement la plus ancienne, est acceptee par
le plus grand nombre des chercheurs. Rubaschkin (1908), Swift (1914), Firket
(1914), Reagan (1916), Defretin (1924) et Blocker (1933) expliquent la colonisation des epitheliums germinatifs par les proprietes amoeboides des CGP. Firket
Cellules germinales de Poulet
193
(1914) qui observe un plus grand nombre de gonocytes a gauche ira jusqu'a
interpreter cette dissymetrie de repartition par une action chimiotactique plus
intense de la glande gauche. Simon (1960) apporte une contribution experimentale a ce probleme en demontrant que des modifications apportees a la disposition du reseau vasculaire n'ont aucune repercussion sur la retention des CGP
au niveau des epitheliums germinatifs. L'auteur conclut que la configuration
de la circulation n'est pour rien dans la fixation des cellules germinales et que
l'hypothese chimiotactique est la plus vraisemblable. Simon note par ailleurs
que des gonocytes peuvent quitter de larges vaisseaux comme les aortes, mais
ne dit pas dans quelle proportion. Ce detail a son importance car la plupart des
auteurs decrivent l'arrivee des gonocytes par les capillaires de la splanchnopleure ou les calibres sont reduits et le debit faible. La sortie des cellules germinales au niveau des aortes est-elle accidentelle? le calibre des vaisseaux joue-t-il
un role dans la retention des CGP? y a-t-il une influence du debit sanguin?
Methodes. Des embryons temoins de 32 paires de somites sont fixes en entier
afin de prevenir toute hemorragie. Nous explorons la region gonadique sur des
coupes transversales afin de reconnaitre l'activite amoeboide des gonocytes et de
denombrer les CGP qui sortent des vaisseaux de la splanchnopleure et ceux qui
atteignent le mesenchyme a partir des aortes. Les cellules germinales installees
dans les epitheliums germinatifs ne sont pas comptees. En effet, les gonocytes
qui se trouvent dans repithelium germinatif au niveau des aortes ne proviennent
pas obligatoirement de ces vaisseaux: ils peuvent avoir ete entraines par les
mouvements tissulaires qui deplacent vers Tangle ccelomique et sous le blasteme mesonephritique repithelium germinatif situe primitivement en position
ventrale (Defretin, 1924; Dantchakoflf, 1934; Meyer, 1964). Nous faisons la
meme statistique sur une serie de blastodermes de 32 paires de somites, cultives
in vitro selon la technique de Wolff & Simon (1955), et dont la circulation de la
region gonadique est bloquee par un poids de plomb convenablement taille
(planche 1, fig. A1, A2). Les denombrements sont faits apres 2 h de culture.
Afin de reperer des cellules germinales par leurs inclusions lipidiques, les
embryons sont fixes au liquide de Bouin. Une post-fixation par le tetroxyde
d'osmium permet de complexifier les lipides non satures reducteurs et d'inclure
les echantillons dans la paraffine. Les coupes de 5 fi sont deparaffinees par le
benzene, hydratees puis blanchies par H2O2, 4 volumes (liberation des lipides,
Chou, 1958). Les lipides ainsi liberes sont reveles par la coloration au Noir
Soudan (voir Dubois & Cuminge, 1967, 1968).
(1) Resultats (planche 1)
(a) Observations histologiques
En accord avec nos predecesseurs, nous avons constate que la majorite des
gonocytes colonisent les epitheliums germinatifs a partir des capillaires de la
splanchnopleure (planche 1, fig. B; tableau 1). Toutefois, il arrive qu'une
194
REGIS DUBOIS
Tableau 1. Nombre de gonocytes sortant des aortes et des vaisseaux de la
splanchnopleure dans les conditions normales et experimentales
S6rie temoin
Serie experimentale
CG sortant
Echantillon
<
Vaisseaux
splanch.
1
2
3
4
5
6
7
8
9
139
231
54
110
71
155
96
121
35
Totaux
1012
85%
Pourcentages
absolus
—
Pourcentages
relatifs des CGP
sortant des aortes
CG sortant
Aortes
Echantillon
2
6
3
13
12
42
22
56
27
183
A
B
C
D
E
F
G
H
I
15%
38%
Vaisseaux
splanch.
59
38
53
43
56
71
122
109
39
590
66%
—
Aortes
6
7
13
14
25
41
80
81
32
299
34%
62%
EXPLICATIONS DES PLANCHES
(ao = aorte; eg = epithelium germinatif; Ps = pseudopodes; end = endoblaste; epi =
epiblaste; G = greffon non radioactif; Gr = greffon radioactif; Gt = greffon testiculaire;
Go = greffon ovarien; cw = canal de Wolff; mv = membrane vitelline; fa = film d'aga r.
PLANCHE 1
Fig. A l . Blastoderme normal de 3,5 jours d'incubation (stade: environ 32 somites), x 1,4.
Fig. A2. Blastoderme au meme stade que le precedent et cultive in vitro. Un poids de plomb
convenablement taille arrete les battements cardiaques et stoppe la circulation, notamment
dans la region gonadique. x 1,4.
Fig. B. Coupe dans la region gonadique d'un embryon normal de 32 paires de somites. Trois
gonocytes provenant des capillaires de la splanchnopleure se sont fix£s dans l'epithelium
germinatif. x270.
Fig. C. Region gonadique d'un embryon experimente avec le dispositif d&rit en A 2. Deux
CGP quittent l'aorte et gagnent l'epithdlium germinatif proche. x 240.
Fig. D-G. Ces figures illustrent quatre etapes de la migration d'un gonocyte a partir de
l'aorte. En F, la cellule germinale franchit l'endothelium du vaisseau par diapSdese. On voit
qu'un gonocyte peut s'evader d'un vaisseau de fort calibre, x 600.
Fig. H. Aspect ultrastructural d'une cellule germinale primordiale situee dans un capillaire
de la splanchnopleure, a proximite de l'epithelium germinatif. Remarquer les pseudopodes
remarquablement deVeloppes (Ps) et les gouttelettes lipidiques de cette cellule germinale
en migration, x 4000.
(Pour les figures B a G, fixation au liquide de Bouin, post-fixation au tetroxyde d'osmium;
coloration par le Noir Soudan.)
J. Embryo!, exp. Morph., Vol. 20, Part 2
PLANCHE 1
*"%. •mm
RF.C.1S DUBOIS
facing p. 194
J. Embryol. exp. Morph., Vol. 20, Part 2
REGIS DUBOIS
PLANCHE 2
Cellules germinales de Poulet
195
proportion non negligeable de CGP gagnent les territories sexuels presomptifs, a
partir des aortes (tableau 1). Bien que ces faits soient plus rares, nous insisterons
particulierement sur leur etude car ils permettent d'eliminer categoriquement
un role hypothetique du calibre des vaisseaux sanguins sur la retention des
CGP. Parmi les gonocytes qui transitent librement dans les aortes (planche 1,
fig. D) quelques-uns peuvent sefixera la paroi de ces larges vaisseaux (planche 1,
fig. E). Ils franchissent l'endothelium probablement par diapedese (planche 1,
fig. F). Ensuite, ils traversent le mesenchyme et gagnent les epitheliums germinatifs proches (planche 1, fig. G). Aussi courte soit-elle, cette phase de la migration
des CGP du Poulet s'effectue grSce aux mouvements propres des gonocytes.
Nous avons pu identifier, a ce stade, des cellules germinales emettant des pseudopodes (planche 1,fig.H; etude ultrastructurale, en collaboration avec Cuminge).
Ces observations demontrent qu'a proximite des epitheliums germinatifs les
gonocytes ont une activite amoeboide orientee. Elles permettent egalement de
refuter l'hypothese d'une retention mecanique des CGP, determinee par le
calibre des vaisseaux.
(b) Resultats numeriques
Les denombrements de gonocytes dans les series temoin et experimentale ont
donne les resultats consignes dans le tableau 1. (Les CGP qui circulent librement
dans les vaisseaux et celles qui sont deja installees dans les epitheliums germinatifs n'entrent pas dans cette statistique.)
(2) Interpretation des resultats — discussion
Nous voyons que la proportion des CGP qui sortent des aortes dans les conditions normales du developpement est tres variable selon les cas. Elle peut etre
negligeable (echantillons 1, 2 et 3) ou importante (embryons 8 et 9). Les raisons
de cette diversite sont dirficiles a preciser. Notre etude portera done sur les
pourcentages etablis pour l'ensemble des observations. Les pourcentages absolus
montrent que dans la serie temoin, sur environ 1200 gonocytes denombres,
15 % ont franchi la paroi des aortes. Cette proportion, qui n'est pas negligeable,
prouve que le calibre des vaisseaux ne joue pas un role determinant dans la
retention des CGP au niveau de la region gonadique.
PLANCHE 2
Fig. I. Association d'un croissant germinal fertile avec une region gonadique sterile. L'attraction exercee par la jeune region gonadique s'exprime par la sortie et la migration orientee des
cellules germinales. Remarquer le cytoplasme amoeboide de Tune d'entre elles. x 270.
Fig. J. Meme type d'association que precedemment. Les gonocytes provenant du croissant
germinal fertile ont colonise l'epithelium germinatif de Thote pr6alablement sterilised x 270.
Fig. K. Premier type d'association d'une gonade fertile du 6e jour de l'incubation avec une
region gonadique sterile. Cinq gonocytes primaires ont quittS le greffon gonadique et se sont
installed dans l'epithelium germinatif de l'hote precocement sterilis6. Une cellule germinale
en migration penetre dans les tissus de l'hote, au niveau de l'epithelium germinatif attractif.
x 270. (En regard de chaque illustration figure un schema interpr6tatif.)
196
REGIS DUBOIS
On pourrait penser que la proportion importante de CG qui se fixent dans
les epitheliums germinatifs a partir des vaisseaux de la splanchnopleure (85 %)
est due au fait que la surface d'epithelium germinatif qui flanque ces vaisseaux
est plus grande que celle qui borde les aortes. La serie experimentale, dans
laquelle la dynamique sanguine est supprimee, montre que cette explication
n'est pas entierement satisfaisante et que le debit circulatoire joue un role. Dans
cette serie, le nombre de gonocytes quittant les aortes (planche 1, fig. C) peut
etre faible (echantillons A et B) ou tres grand (echantillons F a I). Les pourcentages absolus montrent que sur environ 900 gonocytes denombres, 34% proviennent des aortes. Le pourcentage des gonocytes quittant les aortes aurait
done plus que double par rapport a la serie temoin. En fait, les nombres de CGP
sortant des vaisseaux de la splanchnopleure dans les deux series (590 contre 1012)
sont tres differents et prouvent que les pourcentages absolus sont fausses. La
raison en est qu'un plus grand nombre de gonocytes provenant des capillaires
de la splanchnopleure se sont installes dans les epitheliums germinatifs au cours
des deux heures de culture et ont echappe a nos denombrements. Pour apprecier
la difference qui existe entre les deux series, il est preferable de comparer les
pourcentages relatifs des gonocytes sortant des aortes. On voit ainsi que sur 482
de ces gonocytes, 62 % se rapportent a la serie experimentale contre 38 % pour
la serie temoin. Ces resultats demontrent neanmoins que le debit sanguin
empeche la fixation d'un certain nombre de gonocytes qui, dans les conditions
normales du developpement, transitent par les aortes. Pour amener un plus
grand nombre de cellules germinales a franchir la paroi de ces larges vaisseaux,
il suffit d'y prolonger leur sejour en supprimant le flux sanguin qui les entraine.
(3) Interpretation des resultats — conclusion
Ces resultats permettent de refuter l'hypothese selon laquelle la retention des
cellules germinales au niveau de la region gonadique serait purement mecanique.
La configuration du reseau vasculaire (calibre des vaisseaux, debit sanguin) peut
influencer la fixation des CGP, mais elle ne la determine pas. Les gonocytes
charries par la circulation semblent soumis a deux forces: l'une est le debit sanguin
qui les entraine; l'autre serait une attraction exercee par la region gonadique.
Lorsque les conditions imposees par le reseau vasculaire sont favorables, le
stimulus attractif deviendrait predominant et orienterait la migration des CGP
par un mecanisme analogue a celui qui commande la migration interstitielle.
Nous avons cherche a verifier cette hypothese en eliminant par la methode des
cultures in vitro toute intervention du reseau vasculaire.
Cellules germinales de Poulet
197
II. ASPECT MORPHOLOGIQUE DE L'ATTRACTION EXERCEE PAR
LA JEUNE REGION GONADIQUE SUR LES CG DANS LES
ASSOCIATIONS IN VITRO
(1) Attraction des CGP par la jeune region gonadique
Ann d'eprouver Peffet attractif de la region gonadique sur les CGP, nous
associons in vitro une jeune region gonadique prealablement sterilisee et des
fragments de croissants germinaux fertiles: disposees a proximite d'un epithelium
germinatif tres jeune, et independamment de tout reseau vasculaire, les CGP
quitteront-elles activement les feuillets du croissant germinal pour migrer vers
les ebauches sexuelles et les coloniser?
(a) Observations histologiques (planche 2)
Lorsque le croissant germinal est cultive seul, nous observons les cellules
germinales dans l'endoblaste, mais surtout dans le systeme lacunaire mesoblastique ou elles se divisent plus ou moins activement. Dans ces conditions, les
CGP s'agglutinent sans essaimer.
Par contre, nous voyons des cellules germinales en migration dans les cas
d'associations experimentales. Nous les trouvons alors dans des formations
variees, leurs differentes positions atypiques soulignant les voies d'invasion
qu'elles empruntent pour approcher Fexplant gonadique associe. Souvent, dans
leurs deplacements orientes, elles tirent parti des zones de moindre resistance,
des lacunes, des breches. Elles se detachent de la masse endoblastique et progressent vers la region gonadique a la faveur des trames de mesenchyme ou des
surfaces membraneuses (planche 2, fig. I). Leur cytoplasme prend parfois un
aspect amceboiide. Elles peuvent traverser Pepiblaste du croissant germinal
(planche 2, fig. J) et gagner l'assise endodermique de l'hote qu'elles transgressent
en certains endroits. Elles s'infiltrent dans le mesenchyme gonadique et finalement s'installent dans l'epithelium germinatif etranger (planche 2, fig. J).
(b) Resultats numeriques
Les faits que nous venons de decrire ne sont pas accidentels ainsi que le
prouvent les denombrements de gonocytes que nous avons entrepris, et que
nous rapportons dans le tableau 2.
(c) Conclusion
Les preuves histologiques de la migration des CGP d'origine exogene et celles
de leur penetration dans les epitheliums germinatifs de l'hote prealablement
sterilise se trouvent amplement confirmees, et renforcees, par ces resultats
numeriques.
La methode des associations in vitro realise artificiellement les conditions
d'une migration interstitielle. Elle permet de rejeter definitivement Vhypothese
d'un role fondamental du systeme vasculaire dans le mecanisme de fixation des
198
REGIS DUBOIS
CGP au niveau des territoires sexuels presomptifs. Tout se passe, au contraire,
comme si les CGP trouvaient leur lieu de destination a la faveur d'une substance
attractive elaboree par les epitheliums germinatifs.
Tableau 2. Nombre de gonocytes trouves dans Vepithelium germinatif et en
migration dans la region gonadique d'embryons precocement sterilises, associes —
ou non — a des croissants germinaux fertiles
Nombre de gonocytes trouves
l^i Will \JL C
d'embryons Dans la region Dans l'epith.
experiments
gonadique
germinatif
Total
A. Serie temoin (regions gonadiques cultivees seules)
13
0
0
0 (st6riles)
2
2
2
1
1
1
0
0
0
0
0
0
1
2
3
4
5
6
Totaux 22
2
4
6
4
5
6
27
Nombre moyen: 1,2
B. Serie experimentale (regions gonadiques associees a des
croissants germinaux fertiles)
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
Totaux 19
Nombres moyens
3
3
2
3
10
8
10
10
9
1
16
16
18
6
10
0
12
23
31
191
—
0
0
3
3
0 (necroses)
3
3
5
6
10
5
4
6
7
18
5
6
6
18
18
40
41
79
114
373
145
564
19,6
29,6
13
14
16
16
19
21
22
24
24
28
40
53
102
(2) Attraction des gonocytes primaires de la gonade
morphologiquement indifferenciee
Le pouvoir attractif de Pepithelium germinatif peut-il provoquer la migration
des gonocytes primaires deja installes dans les glandes sexuelles embryonnaires ?
Cellules germinales de Poulet
199
Methodes
Dans une premiere serie experimental, nous associons une mince laniere de
gonade gauche de 5,5 jours a 6 jours d'incubation avec une region gonadique
prealablement sterilisee. L'epithelium germinatif contralateral (droit) sert de
temoin pour le critere de sterilite.
Dans une seconde serie experimental, nous associons un fragment de gonade
radioactive avec une region gonadique normale. Les fragments de gonades
embryonnaires agees de 5,5 a 6 jours d'incubation proviennent d'embryons ayant
recu 15 ou 30 jtiCi de thymidine tritiee (Thymidine-methyPH; activite specifique:
3.300 mCi/mM; Section des Molecules marquees, Saclay — France). La solution
radioactive est diluee dans le liquide de Tyrode sterile pour etre administree aux
embryons, in ovo. Dans une premiere serie de 10 associations, nous avons
administre 15 /tCi par embryon en 5 fois pendant deux jours et demi a partir du
troisieme jour de l'incubation. Ce marquage s'etant revele insumsant, nous avons
utilise, dans une seconde serie de 9 associations, des gonades provenant d'embryons ayant recu 5 fois 6 /*Ci de TdR-3H dans les memes conditions que
precedemrnent. (L'administration du precurseur radioactif en une seule fois,
essayee dans une serie preliminaire, ne permet de marquer qu'un nombre
restreint de gonocytes.)
Les echantillons radioactifs sont fixes a l'alcool acetique, a la temperature
ambiante (alcool ethylique 9 5 % : 3 vol.; acide acetique glacial: 1 vol.). Les
operations d'autohistoradiographie ont ete conduites selon les donnees fournies
par Caro &Tubergen (1962). Deparafiinees et hydratees, les coupes sont soumises
a Faction menagee de l'acide perchlorique a 2,5 % pendant 30 min a 0°C afin
d'eliminer les petits polynucleo tides. Apres un rincage a l'eau distillee, elles sont
immediatement plongees dans l'emulsion nucleaire (methode du 'dipping'),
sans sechage preatable, afin de preserver au maximum les structures cellulaires.
L'emulsion employee est du type K5 de Ilford, diluee de moitie par l'eau distillee. Apres l'exposition de 12 a 15 jours et le developpement de l'emulsion,
les coupes sont colorees a l'hematoxyline-eosine.
Resultats
(a) Premiere serie experimental
Lorsque le fragment de gonade gauche est dispose contre la region gonadique
sterile, dans un repli de membrane vitelline, les gonocytes sortent du greffon,
envahissent le mesenchyme de l'hote et colonisent l'epithelium germinatif proche
(planche 2, fig. K). L'infiltration des gonocytes primaires dans les jeunes tissus
sexuels de l'hote est souvent importante, mais irreguliere (partie superieure du
tableau 3).
L'introduction du greffon dans la cavite coelomique de l'hote a ete pratiquee
dans 8 cas. La figure L de la planche 3 montre trois cellules germinales qui ont
emigre et se sont installees dans l'epithehum germinatif etranger. D'une fa^on
200
REGIS DUBOIS
generate, cette technique d'association permet d'obtenir des resultats plus constants et des migrations plus nombreuses (partie inferieure du tableau 3).
Les denombrements de gonocytes dans cette serie experimentale ont donne
les resultats numeriques consignees dans le tableau 3.
Tableau 3. Nombre de gonocytes identifies dans la region gonadique d'embryons
precocement sterilises, associee in vitro a une jeune gonade embryonnaire
Embryon
Gonade
gauche
(age en
jours)
Nombre de gonocytes identifies
f
Cote
temoin
Dans le
mesench.
En migrat. Dans l'epith.
(dans coel.)
germ.
Total
A. Premier type d'association (planche 2, fig.K)
5
Ex 49
5
Ex 57*
4
Ex 67
4
Ex 70
5
Ex 75
5
Ex 77
5
Ex 79
5
Ex 80
5,5
Ex 83
6
Ex 86
6
Ex 87
6
Ex 89
Nombres moyens
0
19 + 53
0
0
1
0
0
0
0
0
0
0
—
3
27
5
5
18
8
30
6
21
70
20
9
18
—
—
—
—
—
—
—
—
—
—
—
—
—
B. Second type d'association (planche 2, fig.L)
—
6
0
17
Ex 85
—
5,5
0
28
Ex 93
—
24
6
0
Ex 96
—
6
0
19
ExC29
—
6
0
7
ExC30
—
44
5,5
0
ExC33
—
5,5
0
30
ExC38
1
—
5,5
23
ExC39
—
—
24
Nombres moyens
12
85
9
5
24
0
43
1
21
67
17
4
26
15
72+112
14
10
42
8
73
7
42
137
37
13
44
24
127
36
53
30
222
98
104
41
155
60
72
37
266
128
127
86
110
* REMARQUES. Pour un seul cas (Ex 57), un fragment de gonade a ete place de chaque cote
de l'explant gonadique. L'echantillon est accompagne de 3 temoins (Ex 50, Ex 51, Ex 60)
cultives seuls et qui se sont reveles totalement steriles. Chez deux embryons experimented,
nous decelons un gonocyte dans l'epithelium germinatif droit: dans les deux cas, la cellule
germinale montre des signes de degenerescence par radiolesions.
Discussion — conclusion. Nos experiences demontrent que les cellules germinales primaires conservent leur pouvoir migrateur apres plusieurs jours d'evolution dans les gonades embryonnaires. L'analyse des resultats numeriques apporte
quelques renseignements sur le pouvoir attractif de la region gonadique. En
effet, le mode d'association influence le nombre total moyen de gonocytes ayant
migre, par embryon experimente (110 contre 44). Le nombre moyen de gonocytes ayant colonise l'epithelium germinatif dans le cas des associations
Cellules germinales de Poulet
201
intra-coelomiques est environ 3 fois plus grand que celui calcule pour le premier
type d'association (86 gonocytes contre 26). Ce fait exprime qu'une association
etroite entre l'epithelium germinatif attractif et la source de CG favorise les
attractions. En d'autres termes, le mesenchyme de la region gonadique, qui
s'interpose entre l'epithelium germinatif et le greffon, freine la migration. Nous
devons en conclure qu'il ne possede pas (ou peu) de proprietes attractives sur les
gonocytes pour lesquels il se presente plutot en obstacle. Les CG qui s'y trouvent
sont en migration. Cette deduction est confirmee par le fait que nous n'observons
pas de gonocytes dans le mesenchyme de la region gonadique lorsque l'epithelium germinatif de l'hote est tourne vers le greffon (0 gonocyte contre 18). C'est
done a l'epithelium germinatif qu'il faut exelusivement attribuer le pouvoir
attractif exerce sur les CG. Le terme de la migration des gonocytes est
Fig. 2. Association d'un fragment de gonade radioactive et d'une jeune region
gonadique normale (partie gauche de lafigure):les gonocytes marques par la thymidine-3H sortent du greffon radioactif et s'installent dans l'6pithelium germinatif
attractif de Phote non radioactif. Interposition d'une barriere filtrante entre l'hote
et le greffon (partie droite de la figure): un facteur emis par l'epithelium germinatif
attractif diffuse a travers la membrane interposee et provoque la sortie des cellules
germinales hors du greffon. L'amoeboidisme des gonocytes est oriente par le gradient
de diffusion du facteur attractif. (GR = greffon radioactif; G = greffon non
radioactif; EG = epitheliums germinatifs; MF = membrane filtrante; TN = tube
nerveux; CH = chorde dorsale; CW = canaux de Wolff; AO = aortes; END =
endoderme; S = somites.)
202
REGIS DUBOIS
l'epithelium germinatif; la situation des cellules germinates dans d'autres
formations est atypique ou provisoire.
(b) Seconde serie experimentale
L'association d'une region gonadique normale et d'un greffon radioactif est
susceptible d'apporter a l'hypothese d'une attraction elective exercee sur les
CG, une demonstration decisive. Dans ce type d'association, on doit s'attendre
a voir des gonocytes marques en migration et installes dans l'epithelium germinatif non radioactif de l'hote.
Resultats. Les conditions experimentales demeurant sensiblement les memes
que precedemment, les resultats sont identiques. L'effet attractif du territoire
sexuel presomptif se traduit par un exode massif des gonocytes hors du greffon.
L'emigration est suivie d'une colonisation de l'epithelium germinatif etranger
souvent nette, parfois considerable. Nous nous bornerons aux preuves histologiques. La figure M 1 de la planche 3 illustre le cas d'une association avec un
fragment de gonade prelevee sur un embryon ayant recu 30 /tCi de precurseur
radioactif et montre la position du greffon dans l'hote. Dans un detail de cette
image (planche 3,fig.M2), nous identifions une cellule germinate qui est sortie
du greffon radioactif dont nous apercevons l'extremite. Nous remarquons la
localisation nucleaire du marquage dece gonocyte installe dans un repli de
l'epithelium germinatif etranger et l'importance du deplacement que la CG a
effectue. Une association particulierement favorable (planche 3, fig. N) se
PLANCHE 3
Fig. L. Second mode d'association entre l'hote et le greffon. Le greffon est une gonade de 5,5
jours d'incubation. Trois cellules germinales sont sorties de leur environnement gonadique
et ont colonist l'epithelium germinatif etranger. x 250.
Fig. Ml. Association d'une gonade marquee par la thymidine-3H et d'un hote non radioactif:
positions respectives de l'hote et du greffon. x 215.
Fig. M2. Detail de la pr6c6dente. Un gonocyte marque, provenant du greffon radioactif, est
installe dans l'epithelium germinatif non radioactif de l'hote. Remarquer la localisation
exclusivement nucleaire des grains d'argent et l'importance du deplacement effectue par la
cellule germinale. x 630.
Fig. N. Trois gonocytes primaires radioactifs ont quitt6 le greffon fortement marqu6 et ont
p6n6tre dans l'epithelium germinatif attractif de l'hote. x 630.
Fig. P. Meme type d'association. Le greffon est ici un fragment de testicule de 8 jours d'incubation. Une spermatogonie provenant du greffon testiculaire est installed dans I'6pith61ium
germinatif etranger. x 600.
Fig. Q. Meme phenomene que precedemment, mais les deux spermatogonies proviennent
d'un fragment de testicule de 12 jours d'incubation. x 600.
Fig. R. Association avec un fragment d'ovaire gauche de 8 jours d'incubation. Plusieurs
ovogonies sont favorablement exposees a l'attraction de I'epith61ium germinatif de l'hote.
Aucune n'est parvenue a penetrer dans cet epithelium malgre les bonnes conditions de migration realisees dans cette association. D'une fa?on generate, il est relativement rare qu'une
ovogonie s'installe dans l'epithelium germinatif de l'hote (voir tableau 4, partie infSrieure).
x600.
J. Embryol. exp. Morph., Vol. 20, Part 2
REGIS DUBOIS
PLANCHE 3
facing p. 202
J. Embryol. exp. Morph., Vol. 20, Part 2
REGIS
DUBOIS
PLANCHE 4
Cellules germinales de Poulet
203
traduit par une sortie spectaculaire des cellules germinales radioactives. Ici, trois
gonocytes se sont detaches de l'explant gonadique et ont envahi les tissus de
l'hote. Grace au marquage intense de leurs noyaux, nous les reperons aisement
dans repithelium germinatif etranger depourvu de radioactivite.
(c) Conclusions
La technique de marquage des cellules germinales a l'aide de la thymidine
tritiee nous permet de verifier de facon demonstrative l'attraction exercee par le
jeune epithelium germinatif sur ces cellules (figure 2, partie gauche).
Les cellules germinales installees depuis plusieurs jours dans les gonades
embryonnaires conservent leurs proprietes migratrices. L'effet attractif qui
s'exerce a distance se traduit par l'exode des gonocytes primaires hors du greffon
non dissocie. II provoque une migration autonome et orientee des cellules
germinales qui s'installent finalement dans la region gonadique de l'hote.
Nous savons d'autre part, d'apres les resultats obtenus avec l'emploi d'un
radiomarqueur, que les gonocytes sont seuls a repondre a l'attraction de repithelium germinatif.
L'hypothese d'un chimiotactisme specifique semble Interpretation la plus
satisfaisante de ces faits.
(3) Attraction des cellules germinales de gonades embryonnaires
morphologiquement differenciees
II est remarquable que des gonocytes primaires installes depuis plusieurs
jours dans la gonade embryonnaire conservent un pouvoir migrateur apparemment superflu.
PLANCHE 4
Fig. S. Interposition d'une barriere filtrante, la membrane vitelline de l'ceuf de Poule. Les
debris mucilagineux de la membrane vitelline traitee par la trypsine sont interpos6s entre le
greffon et repithelium germinatif. La sortie des gonocytes s'effectue au pole du greffon tourne
vers l'epithelium germinatif de l'hote. x 250.
Fig. T. Attirees par un stimulus attractif, les cellules germinales sortent du greffon et progressent vers l'epitbilium germinatif. Les residus lamellaires de la membrane vitelline trypsinee arretent leur progression, x 630.
Fig. U. Cette coupe passant a l'extremite du greffon montre une dizaine de gonocytes primaires
qui ont quitt6 le fragment de gonade. x 290.
Fig. V. La membrane vitelline est reduite, par dissociation mScanique, a sa composante interne. L'effet attractif de l'epithelium germinatif traverse l'obstacle; il se traduit par un rassemblement des gonocytes contre la membrane interposed et une separation presque parfaite
des el&nents germinaux et somatiques de la gonade. x 340.
Fig. Wl. Interposition d'un film d'agar. Meme phenomene que precedemment. Le pole du
greffon tourn6 vers l'epithelium germinatif attractif est considerablement enrichi en gonocytes
primaires. x250.
Fig. W2. Detail de la precedente. Soumis a l'effet attractif qui diffuse a travers la mince couche
d'agar, les gonocytes effectuent des defacements discrets qui les rassemblent et les pressent
contre l'obstacle interposed x 630.
204
REGIS DUBOIS
Les cellules germinates qui ont subi les effets de la differentiation sexuelle
sont-elles encore capables de repondre a l'attraction d'un jeune epithelium
germinatif? Afin de repondre a cette question, nous avons eprouve le stimulus
attractif de l'epithelium germinatif sur les cellules germinales au moment de la
differenciation sexuelle morphologique (7,5 a 8 jours d'incubation), et apres
cette differenciation (12 a 13 jours d'incubation).
Resultats
(a) Observations histologiques
Cas de la lignee germinale male: de nombreuses spermatogonies se liberent du
fragment de testicule et migrent, par mouvements amceboiides, vers le jeune
epithelium germinatif proche. Les figures P et Q de la planche 3 montrent des
spermatogonies installees dans l'epithelium germinatif etranger. Les greffons
sont ici des fragments de gonades males de 8 jours d'incubation (fig. P) et de 12
jours d'incubation (fig. Q).
Cas de la lignee germinale femelle (ovaire gauche): lorsque le greffon est de
nature ovarienne, la migration des elements germinaux est beaucoup plus faible,
souvent inexistante (partie inferieure du tableau 4). Quelques ovogonies du 7e
jour de l'incubation peuvent migrer et meme coloniser Pepithelium germinatif
de l'hote. A partir du 8e jour de l'incubation, il est encore plus rare de voir les
ovogonies quitter l'ovaire. Nous illustrons par la figure R de la planche 3 le cas
d'une association avec un fragment d'ovaire gauche du 8e jour de l'incubation.
Les tissus sont sains. Bien que plusieurs ovogonies soient favorablement exposees a l'attraction de l'epithelium germinatif proche, aucune ne s'echappe du
greffon.
(b) Resultats numeriques
Afin de donner une idee quantitative de la difference qui apparait entre le
pouvoir migrateur des spermatogonies et des ovogonies, nous avons entrepris
le denombrement des gonocytes dans les deux series experimentales (tableau 4).
(c) Conclusions
Lorsque le greffon est de nature testiculaire, il se produit un exode important
des cellules germinales males hors du fragment fertile. Au terme de leur migration, les spermatogonies s'installent dans repithelium germinatif de l'hote. Au
contraire, a partir du 8e jour de l'incubation, un tres petit nombre d'ovogonies
demeurent capables de coloniser un epithelium germinatif qui a conserve son
pouvoir attractif sur les CG males. Pourquoi l'activite des CG femelles decroitelle? Ces cellules ont-elles perdu leur pouvoir migrateur? Sont-elles devenues
insensibles au stimulus attractif de repithelium germinatif? Y a-t-il une influence
de la structure de la gonade? Nous examinerons plus loin quelques faits qui
plaident en faveur de la premiere hypothese.
205
Cellules germinales de Poulet
Tableau 4. Nombre de cellules germinales retrouvees dans Vepithelium germinatif
temoin, dans Vepithelium germinatif experiments (EG) et en migration entre
Vepithelium experimente et le greffon (en migration)
Nombre de cellules germinales
Echantillon
Age du
greffon
(jours)
ExC59
ExC80
ExC48
ExC65
ExC88
7,5
7,5
8
8
8
Cote experimente
C6t6
itemoin
A
dans EG
en migration
Total
A. Greffon de ]nature testiculaire
2
0
0
1
0
7
53
7
58
27
7
14
21
5
27
12
74
12
85
39
ExC22
12
0
0
13
ExC20
Nombres moyens par embryon:: 0,4
55
26
33
5
13
13
60
39
46
9
15
11
14
B. Greffon de nature ovarienne
ExC54
Ex 63
Ex 69
ExC81
ExC43
ExC46
ExC49
ExC58
7
7,5
7,5
7,5
8
8
8
8
0
0
1
0
0
0
0
0
1
2
0
0
1
11
5
3
0
0
1
0
ExC21
ExC23
12
12
0
0
2
5
0
1
2
ExC24
12
0
2
0
2
2,5
2,7
5,2
Nombres moyens par embryon:: 0,1
6
0
9
4
2
0
1
1
6
III. ASPECT CHIMIOTACTIQUE DE LA COLONISATION
DES EBAUCHES GONADIQUES
La migration des gonocytes primordiaux vers les ebauches gonadiques est un
phenomene actif. Les CGP gagnent les epitheliums germinatifs par mouvements amoeboides.
Par quel mecanisme la migration est-elle dirigee? Le facteur attractif est-il une
substance diffusible ou bien un element cellulaire figure? Nous nous sommes
demande si l'attraction de l'epithelium germinatif pouvait s'exercer a distance,
a travers une barriere filtrante.
Methodes
Le greffon est une fine bandelette longitudinale de gonade du 6e jour de
l'incubation, enfermee dans un sac anhiste. Le sac et son contenu sont introduits
14
JEEM 20
206
REGIS DUBOIS
dans la cavite ccelomique de la jeune region gonadique et l'ensemble est transfere sur le milieu de culture.
Dans une premiere serie experimentale, nous avons employe la technique
d'interposition de la membrane anhiste constitute par la membrane vitelline
de l'oeuf non incube de Poule (Wolff, 1961). La membrane vitelline peut etre
traitee par la trypsine a 5%0 pendant 5 a 10 min a 37 ° C , afin d'eliminer la couche
interne et de modifier la composante externe (Wolff & Wolff, 1961). Nous avons
egalement dissocie mecaniquement les deux couches de la membrane afin
d'eliminer l'intervention d'un agent chimique. Dans un certain nombre de cas,
le greffon est soumis a une action menagee par le versene (EDTA) a l%0 pendant
5 min a 37 °C.
Dans une seconde serie experimentale, nous avons substitue a la membrane
vitelhne un film d'agar a 1 %. L'agar (Bactoagar Difco) est lave a l'eau distillee,
puis par l'alcool ethylique absolu. Le precipite est repris par l'eau distillee afin
d'obtenir une preparation a 1 % qui sera coulee sur une lame de verre.
(1) Resultats
(a) Le greffon est traite par le versene a 1%Q et la membrane
vitelline par la trypsine a 5%0
La trypsine elimine la couche interne de la membrane vitelline tandis que la
couche externe se gonfle et devient visqueuse. Le greffon est separe de l'epithelium
germinatif par des structures lamellaires de la couche externe de la membrane
vitelline et par des residus mucilagineux (planche 4, fig. S). Nous voyons les
gonocytes sortir du greffon du cote tourne vers l'epithelium germinatif. La
figure T de la planche 4 montre un cas analogue: plusieurs gonocytes s'echappent du fragment de gonade et migrent vers l'epithelium germinatif proche en
penetrant dans la couche mucilagineuse de la membrane. Ces cellules germinales
s'arretent finalement contre les structures lamellaires interposees qui constituent
un obstacle plus resistant, mais qu'elles deforment parfois. II arrive qu'une sortie
massive de gonocytes se fasse a l'extremite du greffon: on voit alors des amas de
cellules germinales purifies de tout element somatique de la gonade (planche 4,
fig. U).
(b) Le greffon ne subit aucun traitement et la membrane vitelline est
dissociee mtcaniquement
Dans ces conditions experimentales, les couches mucilagineuses laches
n'existent pas et le greffon adhere intimement au sac constitue par la membrane
anhiste. De la sorte, l'effet attractif ne peut se traduire par une sortie des
gonocytes primaires. Le greffon reagit cependant a l'attraction de l'epithelium
germinatif: les cellules germinales repondent electivement au stimulus attractif
en effectuant des deplacements discrets qui les rassemblent finalement contre la
membrane interposee, a proximite immediate de l'epithelium germinatif de
l'hote (planche 4, fig. V). Ainsi, lorsque les conditions mecaniques de l'associa-
Cellules germinales de Poulet
207
tion ne permettent pas la sortie des gonocytes hors du greffon, l'effet attractif se
traduit par une segregation des elements germinaux et somatiques de la gonade.
Le facteur attractif responsable de cette segregation diffuse aussi bien a travers
la couche interne de la membrane vitelline qu'a travers la couche externe.
(c) Le greffon ne subit aucun traitement et la barriere filtrante
est constituee par un film d'agar a 1%
L'agar purifie presente sur la membrane vitelline l'avantage d'avoir une
structure et une composition chimique moins complexes. En interposant une
mince couche de cette substance entre l'epithelium germinatif attractif et le
greffon, nous verifierons la diffusibilite du facteur attractif et sa faculte d'impregner l'agar. Les conditions de l'association ne different pas de celles decrites
a propos de la membrane vitelline dissociee mecaniquement. Les resultats sont
rigoureusement comparables: nous assistons a une separation presque parfaite
des cellules germinales et somatiques de la gonade (planche 4, fig. W l et W2).
Les groupements de gonocytes se font presque exclusivement au pole du greffon
tourne vers l'epithelium germinatif. Le pole oppose peut servir de temoin: les
groupements de cellules germinales y sont rares ou les sorties accidentelles.
(2) Interpretation des resultats — conclusion
Le pouvoir attractif du jeune epithelium germinatif peut s'exercer a travers
une barriere filtrante. L'interposition d'une membrane vitelline ou d'une mince
couche d'agar ne stoppent pas les effets du stimulus attractif sur les gonocytes
primaires. Ces experiences montrent que le facteur responsable des attractions
peut filtrer a travers un obstacle poreux et agir electivement sur les cellules
germinales. II peut impregner l'agar, puis diffuser. Un contact direct entre
l'epithelium germinatif et les CGP n'est pas necessaire pour que la migration se
produise. L'amceboidisme oriente des gonocytes du Poulet vers les territoires
sexuels presomptifs est un phenomene d'ordre chimiotactique (figure 2).
(3) Discussion — conclusions generates
L'hypothese d'un chimiotactisme specifique explique quelques points precis,
verifies experimentalement. Mais elle pose un certain nombre de problemes
nouveaux et complexes.
(a) Le pouvoir migrateur des cellules germinales du Poulet
Les proprietes migratrices des CGP du Poulet se manifestent tres tot au cours
du developpement. Des le stade de la jeune ligne primitive, les initiates germinales
quittent activement le massif endophyllien qui les contient primitivement pour
gagner les feuillets embryonnaires en formation (Dubois, 1967a, b). Ces attractions semblent s'exercer electivement sur les cellules germinales, mais elles ne
seraient pas l'effet de facteurs tres specifiques. En effet, nous avons pu demontrer
14-2
208
REGIS DUBOIS
qu'a ce meme stade, les CGP penetrent dans l'ectoblaste, dans le mesoblaste
(reseau vasculaire en formation), mais aussi dans le mesonephros, le poumon
ou la peau d'embryons de 9 jours d'incubation (Dubois, resultats non publies).
Or nous savons que les gonocytes primaires de la jeune gonade sont insensibles
a l'attraction de ces organes alors qu'ils respondent activement au stimulus
attractif de l'epithelium germinatif (figure 2). Pour expliquer ces faits, on peut
admettre que l'attraction de l'epithelium germinatif est d'une autre nature que
celle exercee par ces tissus divers. Mais on peut aussi supposer qu'au cours de
l'ontogenese les CGP perdent certaines de leurs proprietes migratrices et qu'une
fois installees dans les feuillets embryonnaires, elles ne demeurent sensibles
qu'a l'appel de la region gonadique. Dans cette hypothese, les initiates germinales de l'endoblaste vitellin seraient particulierement irritables et des excitations
variees pourraient provoquer leur essaimage. Enfin, il n'est pas impossible que
ces cellules soient expulsees du massif endophyllien.
II n'en demeure pas moins qu'a partir du stade du croissant germinal les CGP
sont specialement sensibles a l'attraction des epitheliums germinatifs. II est
remarquable de constater que les gonocytes primaires conservent ce pouvoir
migrateur apres 3 a 4 jours devolution dans la gonade femelle et les spermatogonies plus tardivement encore. Leurs proprietes migratrices latentes — et
apparemment superflues — se manifestent des que l'experimentateur dispose a
proximite de la gonade un jeune epithelium germinatif. Un autre tissu ou organe
(peau, mesonephros, poumon, foie) reste inefficace. Nous sommes done amene
a concevoir l'entree en jeu d'un chimiotactisme precis et specifique. II n'existe
aucune explication satisfaisante des chimiotactismes. Sur quels effecteurs de la
cellule germinale le stimulus attractif s'exerce-t-il ? Comment la migration
est-elle declenchee, entretenue, orientee? Par quel mecanisme les gonocytes
migrent-ils? Aucun element ultrastructural (filaments contractiles, canalicules)
analogue a ceux qui ont ete decrits chez l'Amoebe (McManus & Roth, 1965) n'a
pu etre identifie dans les cellules germinales en migration (Dubois & Cuminge,
1967, 1968). La presence de pseudopodes, parfois considerablement developpes
(planche 1, fig. H) atteste neanmoins l'activite migratrice des CGP.
Dans un meme ordre d'idee, il etait egalement interessant de voir s'il existait
une difference ultrastructurale entre les ovogonies qui ont perdu leur pouvoir
migrateur et les spermatogonies qui l'ont garde. Des experiences in vitro ont
montre que vers le 8e jour de l'incubation, la plupart des ovogonies de l'ovaire
gauche ne repondent plus au stimulus attractif du jeune epithelium germinatif.
Par contre, les spermatogonies conservent leurs proprietes migratrices. II resulte
de nos observations que la seule difference notable entre les deux lignees cellulaires concerne les reserves energetiques. En effet, les inclusions lipidiques, dont
les CGP et les gonocytes primaires sont si riches, disparaissent exclusivement
dans la lignee germinale femelle, precisement a partir du 8e jour de l'incubation.
Ces resultats s'accordent assez bien dans les faits comme dans la chronologie
pour suggerer un role du metabolisme lipidique dans l'activite migratrice des
Cellules germinales de Poulet
209
cellules germinales des Oiseaux. Mais ce n'est la qu'une hypothese et qui n'a
recu, jusqu'alors, aucune verification experimentale.
(b) Le pouvoir attractif de Vepithelium germinatif
Le jeune epithelium germinatif est le seul tissu qui peut attirer les CGP du
croissant germinal et les gonocytes primaires. L'attraction s'exerce a distance et
•a travers une membrane filtrante. Ces faits experimentaux prouvent que le
facteur attractif emis par les territoires sexuels presomptifs est une secretion
diffusible plutot qu'un element cellulaire figure (partie droite de la figure 2).
Le stimulus attractif agit electivement sur les gonocytes ainsi que l'ont notamment demontre les experiences avec des cellules germinales radioactives. Quelques arguments plaident done en faveur d'une substance specifique, elaboree par
les seuls epitheliums germinatifs. II est actuellement impossible d'emettre une
hypothese precise sur la nature chimique du facteur attractif.
Sur un autre plan, le fait qu'un jeune epithelium germinatif provoque l'exode
des gonocytes primaires hors d'une gonade de cinq jours d'incubation est instructif. II demontre que cette gonade n'est plus capable de retenir ses propres
Elements germinaux et constitue une preuve a contrario de la decroissance —
sinon de la disparition — du pouvoir attractif avant le 5e jour de l'incubation.
(c) Conclusions generates
L'embryon de Poulet est un organisme particulierement favorable a l'etude
du determinisme qui preside a la fertilisation des ebauches genitales par les
futures cellules reproductrices. Grace a ce materiel et a la technique des cultures
et associations in vitro, nous verifions experimentalement, par des methodes
simples, les hypotheses avancees par plusieurs auteurs. Des proprietes, jusqu'alors insoupc.onnees, des cellules germinales des Oiseaux sont mises en evidence.
II est prouve que la circulation sanguine n'a aucun role determinant sur la
fixation des CGP au niveau de la region gonadique de l'embryon. Le transport
passif des cellules germinales par le sang est une solution commode et spectaculaire au probleme de leur eloignement de la sphere genitale. Nous avons la
un remarquable exemple de l'etonnant pouvoir adaptatif des organismes vivants
des les stades embryonnaires.
Nous montrons que l'ultime etape de la colonisation des ebauches gonadiques
par les cellules germinales primordiales du Poulet se fait selon les modalites de
la migration interstitielle.
Parmi les theories qui peuvent etre proposees pour expliquer la migration des
gonocytes, nous retiendrons la 'selective contact guidance' (Weiss, 1941) et le
chimiotactisme. Les conceptions de Weiss ont relegue au second plan la theorie
du chimiotactisme et du gradient de diffusion proposee pour la comprehension
des migrations cellulaires. Elles semblent fort suggestives pour Pinterpretation
de la migration des cellules germinales: dans ce cas particulier, en effet, il s'agit
d'un groupe cellulaire defini qui chemine dans les tissus avant de s'installer dans
210
REGIS DUBOIS
une region precise de l'organisme. On pourrait done admettre que ces cellules
sont repoussees par les tissus dans lesquels les affinites de surface ne sont pas
favorables. Refoulees ainsi de proche en proche, elles migreraient pour finalement se fixer la ou les meilleures conditions d'adhesivite sont reaiisees, c'est a
dire dans la gonade. II s'agirait en somme d'une migration passive que les
gonocytes subiraient, guides par un systeme d'aiguillages.
Nos experiences apportent trois faits, d'ordre different, dont la 'selective
contact guidance' ne peut rendre compte:
— tout d'abord, les cellules germinales peuvent migrer en traversant des
lacunes, alors qu'aucun contact avec les cellules des tissus avoisinants n'est
realise.
— l'attraction peut s'exercer a distance, a travers une membrane filtrante. La
encore, il n'y a pas de contact direct entre les cellules germinales et les cellules
de l'epithelium germinatif. II est done necessaire d'admettre l'existence d'un
vecteur qui informerait les CGP de la proximite de meilleures conditions
d'adhesivite.
— mais surtout, l'attraction d'un jeune epithelium germinatif fait sortir les
gonocytes primaires de la gonade embryonnaire. Pour expliquer ce phenomene,
il faudrait admettre que l'epithelium germinatif etranger modifie a distance et a
travers un nitre les conditions d'adhesivite realisees dans la gonade. Ici encore
apparait la necessite d'un vecteur.
II est beaucoup plus simple et plus conforme aux faits d'interpreter nos resultats par un chimiotactisme positif. Les epitheliums germinatifs sont la source
d'un facteur attractif dont le gradient de diffusion declenche et oriente electivement l'amceboidisme des cellules germinales. Dans les conditions normales du
developpement, ce chimiotactisme preside a l'installation des futures cellules
reproductrices dans les gonades et assure la fertilite des individus. C'est done un
mecanisme vital essentiel.
RESUME
Le present travail est consacre a l'etude experimental du mecanisme qui,.
chez l'embryon de Poulet, preside a l'installation des cellules germinales primordiales (CGP) dans la future region gonadique.
Les principaux resultats obtenus grace aux techniques de cultures et d'associations in vitro sont les suivants:
(1) La configuration du reseau vasculaire dans lequel transitent les CGP peut
influencer la fixation des gonocytes, mais elle ne la determine pas. Lorsque le
debit n'est pas trop important (dans les capillaires de la splanchnopleure par
exemple), les CGP peuvent quitter la circulation. II est plus rare de voir les
gonocytes quitter les aortes ou le debit sanguin est fort et saccade. Mais il est
possible de supprimer, experimentalement, la dynamique circulatoire, et de
provoquer la sortie d'un plus grand nombre de CGP a partir de larges vaisseaux.
Ces faits montrent que la retention des gonocytes au niveau de la region gona-
Cellules germinales de Poulet
211
dique n'est pas purement mecanique, mais qu'elle depend plutot de l'attraction
des epitheliums germinatifs proches.
(2) L'attraction de la jeune region gonadique s'exerce sur les CGP du croissant
germinal dans un systeme d'association in vitro qui supprime totalement toute
intervention du reseau vasculaire. Les CGP du greffon migrent par mouvements
autonomes et orientes et colonisent l'epithelium germinatif prealablement
sterilise de l'hote. Ces experiences refutent l'hypothese d'un role fondamental du
systeme vasculaire dans le mecanisme de fixation des CGP au niveau des territoires sexuels presomptifs.
(3) Le stimulus attractif provoque egalement in vitro l'exode des gonocytes
primaires hors d'une jeune gonade morphologiquement indifferenciee. L'association d'une jeune region gonadique normale et d'une gonade radioactive permet
d'obtenir la colonisation d'un epithelium germinatif non radioactif par les
gonocytes marques provenant du greffon.
(4) Les spermatogonies montrent les memes proprietes migratrices que les
CGP et les gonocytes primaires. Elles conservent leur pouvoir migrateur et leur
aptitude a coloniser un epithelium germinatif attractif, au moins jusqu'au 12e
jour de l'incubation. Par contre, a partir du 8e jour de l'incubation la grande
majorite des ovogonies ne repondent plus a l'attraction des territoires sexuels
presomptifs.
(5) Le stimulus attractif s'exerce in vitro a travers une barriere filtrante (membrane vitelline d'oeuf de Poule ou film d'agar) interposee entre l'hote et le greffon.
(6) La discussion generate porte sur le pouvoir migrateur des cellules
germinales et sur le pouvoir attractif des epitheliums germinatifs. L'existence
d'un chimiotactisme positif et electif est Interpretation la plus satisfaisante
de l'ensemble de ces resultats. Mais il est actuellement impossible d'emettre
une hypothese precise sur la nature du facteur attractif.
SUMMARY
The colonization of the gonadal region of chick embryos
by germ cells in culture
The mechanisms leading to the settlement of primordial germ cells (PGC) in
the future gonadal region of the chick embryo have been studied experimentally
in culture.
(1) The region of the vascular system in which the PGC exist can influence the
positioning of the gonocytes but does not determine it. Where the blood flow
diminishes, e.g. in the capillaries of the splanchnopleur, the PGC can leave the
circulatory system; they rarely leave the aorta, where blood flow is stronger and
less even. Experimental reduction of blood flow causes a greater number of
PGC to leave the large vessels. This indicates that the retention of gonocytes
in the gonadal region is not simply mechanical but depends upon the attraction
of the proximal germinal epithelia.
212
REGIS DUBOIS
(2) The attraction of the PGC of the germinal crescent by the gonadal region
is demonstrated in a system of association in vitro which totally eliminates all
influence of the vascular system. The PGC of the graft migrate by independent
orientated movements and colonize the germinal epithelium of the previously
sterilized host. These experiments disprove any hypothesis involving a fundamental role of the vascular system in the fixation of the PGC in the presumptive
sexual territories.
(3) The attraction also causes the migration of primary gonocytes from a
young morphologically undifferentiated gonad in vitro. The association of a
normal early gonadal region and a radioactive gonad in vitro permits the
colonization of a non-radioactive germinal epithelial by labelled gonocytes from
the graft.
(4) The spermatogonia possess the same migratory ability as the PGC and the
primary gonocytes. They retain their migratory power and ability to colonize a
germinal epithelium at least to the 12th day of incubation. On the other hand,
from the eighth day a large majority of the oogonia no longer respond to the
attraction of the presumptive sexual territories.
(5) The gonadal attraction is exerted in vitro across a permeable barrier such
as egg vitelline membrane or a film of agar interposed between the host and the
graft.
(6) The migratory ability of the germinal cells and the power of attraction of
the germinal epithelia are discussed. The most satisfactory explanation of the
results presented is of a positive selective chemotaxis, but it is impossible at
present to put forward any hypothesis on the nature of the attractive factor.
TRAVAUX CITES
H. W. (1933). Embryonic history of the germ cells in Passer domesticus. Acta ZooL
14, 111-52.
CARO, L. G. & TUBERGEN, R. P. van (1962). High resolution autoradiography. /. Cell BioL
15, 173-99.
CHOU, J. T. Y. (1958). Experiments on the fixation of lipids by osmium tetroxide. Q. J.
Microsc. Sci. 99, 285-7.
CLAWSON, R. C. & DOMM, L. V. (1963). Developmental changes in glycogen content of
primordial germ cells in chick embryo. Proc. Soc. exp. BioL Med. 112, 533-7.
DANTCHAKOFF, V. (1934). La cellule germinale dans le dynamisme de l'ontogenese. Actual.
scient. ind. Hermann, Paris.
DANTCHAKOFF, V. (1950). La differenciation du sexe chez les Vertebres (Colloque C.N.R.S.
sur la differenciation sexuelle chez les Vertebres). Archs Anat. microsc. Morph. exp. 39,,
185-212.
DEFRETIN, R. (1924). Origine et migration des gonocytes chez le Poulet. C.r. Seanc. Soc. BioL
91, 1082-4.
DUBOIS, R. (1962). Sur la sterilisation de l'embryon de Poulet par irradiation aux rayons
X du croissant germinal extra-embryonnaire. Archs Anat. microsc. Morph. exp. 51, 85-94.
DUBOIS, R. (1967 a). Sur l'origine et l'amceboidisme des cellules germinales de l'embryon de
Poulet en culture in vitro et leur localisation dans le germe non incube. C.r. hebd. Seanc.
Acad. Set, Paris 265, 497-500.
BLOCKER,
Cellules germinales de Poulet
213
R. (1967&). Localisation et migration des cellules germinales du blastoderme non
incube de Poulet, d'apres les resultats de cultures in vitro. Archs Anat. microsc. Morph. exp.
56, 245-64.
DUBOIS, R. & CUMINGE, D. (1967). Aspect ultrastructural des cellules germinales de l'embryon de Poulet. C.r. hebd. Seam. Acad. Sci., Paris 264, 2803-6.
DUBOIS, R. & CUMINGE, D. (1968). Sur l'aspect ultrastructural et histochimique des cellules
germinales de l'embryon de Poulet. Anno. Histochim. 13, 33-50.
FIRKET, J. (1914). Recherches sur l'organogenese des glandes sexuelles chez les Oiseaux.
Archs Biol., Paris 29, 201-351.
MCMANUS, M. A. & ROTH, L. E. (1965). Fibrillar differentiation in Myxomycete plasmodia.
J. Cell Biol. 25, 305-18.
MEYER, D. B. (1961). The intra-embryonic migration of primordial germ cells in staged
chick embryos. Anat. Rec. 139, 314-15.
MEYER, D. B. (1964). The migration of primordial germ cells in the chick embryo. Devi Biol.
10, 154-90.
MEYER, D. B. & O'RAHILLY, R. (1961). The distribution of PAS+ material during early
morphogenesis in staged chick embryos. Anat. Rec. 139, 253-4.
MINTZ, B. (1960). Formation and early development of germ cells. Symp. Germ Cells and
Develop, pp. 1-24. Inst. Intern. d'Embryol. and Fondazione A. Baselli.
REAGAN, F. (1916). Some results and possibilities of early embryonic castration. Anat. Rec.
11, 251-267.
REYNAUD, G. (1967). Mise en evidence des cellules germinales dans les jeunes blastodermes
d'Oiseau par la technique de coloration P.A.S. C.r. hebd. Seanc. Acad. Sci., Paris. 265,
1636-9.
RUBASCHKIN, W. (1908). Uber das erste Auftreten und Migration der Keimzellen bei Vogelembryonen. Anat. Hefte 1, 241-61.
SIMON, D. (1960). Contribution a l'etude de la circulation et du transport des gonocytes
primaires dans les blastodermes d'Oiseau cultives in vitro. Archs Anat. microsc. Morph.
exp. 40, 93-176.
SWIFT, C. (1914). Origin and early history of the primordial germ cell in the chick. Am. J.
Anat. 15, 483-516.
WEISS, P. (1941). Nerve patterns. The mechanics of nerve growth. Growth Symp. 3, 163-203.
WITSCHI, E. (1948). Migration of germ cells of human embryos from the yolk-sac to the
primitive gonadal folds. Contr. Embryol. 209, 32, 67-80.
WOLFF, ET. (1936). Les bases de la teratogenese experimentale des Vertebres Amniotes
d'apres les resultats de methodes directes. Archs Anat. Hist. Embryol. 22, 1-382.
WOLFF, ET. (1960). Sur une nouvelle modalite de la culture organotypique. C.r. hebd. Seanc
Acad. ScL, Paris 250, 3881-2.
WOLFF, ET. (1961). Utilisation de la membrane vitelline de l'oeuf de Poule en culture organotypique. I. Technique et possibility. Devi Biol. 3, 767-86.
WOLFF, ET. & HAFFEN, K. (1952). Sur une methode de culture d'organes embryonnaires in
vitro. Texas Report Biol. Med. 10, 463-72.
WOLFF, ET. & SIMON, D. (1955). L'explantation et la parabiose in vitro de blastodermes
incubes d'embryons de Poulet. L'organisation de la circulation extra-embryonnaire. C.r.
hebd. Seanc. Acad. Sci., Paris 241, 1994-6.
WOLFF, ET. & WOLFF, EM. (1961). Le role du meson6phros de l'embryon de Poulet dans la
nutrition des cellules cancereuses. II. Etude par la methode de la membrane vitelline.
/. Embryol. exp. Morph. 9, 678-690.
DUBOIS,
(Manuscrit regu le 15 fevrier 1968)