La colonisation des ebauches gonadiques par les cellules

/. Embryol. exp. Morph. Vol. 20, 2, pp. 189-213, September 1968
With 4 plates
Printed in Great Britain
La colonisation des
ebauches gonadiques par les cellules germinales de
Fembryon de Poulet, en culture in vitro
Par REGIS DUBOIS1
Institut (VEmbryologie du College de France et du C.N.R.S.
(Directeur: Professeur Etienne Wolff)
Chez les Vertebres, la segregation de la lignee germinate s'effectue des les
stades les plus precoces du developpement. Les cellules germinales primordiales
(CGP) apparaissent toujours hors des gonades et se trouvent souvent localisees
dans des territoires bien delimites, plus ou moins eloignes des ebauches gonadi-
ques presomptives. La destinee des gonocytes etant liee de facon irreductible a
leur installation dans les ebauches genitales, ces cellules entreprennent, a chaque
generation, une migration qui les conduit infailliblement aux epitheliums
germinatifs.
Les nombreux travaux consacres a ce sujet ont permis de distinguer deux
modes de migration:
— la migration interstitielle qui intervient lorsque les CGP sont situees
posterieurement, a proximite des ebauches gonadiques;
— la migration vasculaire qui entre en jeu des que les CGP se trouvent
eloignees des epitheliums germinatifs.
La migration interstitielle s'effectue par des deplacements actifs des CGP qui
progressent grace a leurs mouvements amoeboides. L'idee d'une attraction par
la region sexuelle et d'une migration orientee par chimiotactisme
s'est imposee:
'les gonocytes se comportent comme un essaim de microorganismes ou de
leucocytes attires vers un but par un stimulus chimique' (Witschi, 1948).
Chez les Oiseaux, les faits sont un peu plus complexes. Les CGP naissent a la
partie posterieure du germe, a proximite des futures ebauches sexuelles, mais
les mouvements morphogenes precoces les portent dans le croissant germinal
anterieur, loin de leur but (Dubois, 1967 a, b). Dans une premiere etape, les
CGP migrent par la voie sanguine en se laissant passivement entrainer jusqu'aux
epitheliums germinatifs (Simon, 1960). Dans une seconde etape, on assiste a la
sortie des gonocytes hors du reseau vasculaire et a leur fixation au niveau des
1 Adresse de Vauteur: Laboratoire d'Embryologie Experimentale, 49 bis, avenue de la
Belle Gabrielle, 94 Nogent-sur-Marne, France.
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Types d'associations in vitro
region gonadique
non radioactive
Interposition
d'une
membrane filtrante
Fig. 1. Schemas r6sumant les principales associations rSalisees en culture in vitro.

Cellules germinales de Poulet 191
territories sexuels presomptifs. Le present travail est consacre a l'etude ex-
perimentale du mecanisme qui preside, au cours de cette ultime etape, a l'installa-
tion des CGP dans les epitheliums germinatifs.
MATERIEL ET METHODES — GENERALITES
Nous nous bornerons ici aux generalites. Les details techniques particuliers
seront precises avec les series experimentales auxquelles ils se rapportent.
Toutes les experiences sont faites sur l'embryon de Poulet de la race Leghorn
blanche. Le milieu de culture est celui de Wolff
& Haffen (1952), enrichi par du
serum de Poulain.
La plupart de nos experiences consistent dans des associations in vitro que
la figure 1 resume. L'hote utilise dans une association est la region gonadique
d'un embryon precocement sterilise et ayant differencie 27 a 35 paires de
somites. La sterilisation precoce des embryons est obtenue in vitro par excision
du croissant germinal, aux stades 7 a 10 paires de somites (technique de Simon,
1960). Nous avons egalement sterilise les notes aux memes stades, in ovo, selon
la technique de Wolff
(1936), par une double irradiation aux rayons X, de l'aire
extra-embryonnaire anterieure (Dubois, 1962). Les deux modes de sterilisation
conduisent aux memes resultats: dans la grande majorite des cas, les notes sont
totalement steriles (tableaux 2, 3, 4).
Les greffons sont de differentes natures:
— lorsque le greffon est le croissant germinal fertile d'un embryon normal de
10 a 12 paires de somites, nous l'associons etroitement a une region gonadique
sterile et reduite par la dissection aux epitheliums germinatifs, aux canaux de
Wolff, aux mesenchymes avoisinants et a l'endoderme. L'ensemble est cultive
dans un repli de membrane vitelline selon la technique mise au point par Wolflf
(1960):
— lorsque le greffon est une gonade embryonnaire gauche nous l'associons a
l'hote en l'introduisant dans la cavite coelomique gauche de la region gonadique
sterile.
— enfin, lorsque le greffon est une gonade embryonnaire gauche radioactive,
ou enfermee dans un sac anhiste, l'hote est une region gonadique normale.
Dans la plupart des cas, les echantillons sont fixes au liquide de Bouin apres
des temps de culture variant de 15 a 24 h, rarement plus. Les coupes de 5 fi a
7 /* sont colorees par l'hematoxyline eosine.
Caracteres des
cellules germinales. Les criteres qui nous permettent de recon-
naitre les gonocytes, et notamment les cellules germinales primordiales avant
leur installation dans les gonades, sont les suivants: ce sont des cellules de
forme arrondie et de grande taille (15 [i de diametre en general); leur noyau,
clair et turgescent, est plus volumineux que celui des cellules somatiques (environ
9/t de diametre); il montre frequemment deux nucleoles. Ces caracteres suffisent
generalement pour reconnaitre les CGP sans ambiguite, et ne pas les confondre
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avec d'autres elements libres comme par exemple les cellules-souches de la
lignee sanguine. Toutefois, on a recherche dans les gonocytes un caractere
specifique qui permettrait de les identifier avec certitude. La reaction histo-
chimique au Periodic Acid Schiff (PAS) a permis de mettre en evidence une forte
concentration de glycogene dans ces cellules (Mintz, 1960; Meyer, 1961;
Meyer & O'Rahilly, 1961; Clawson & Domm, 1963; Reynaud, 1967). Ce
polysaccharide est si abondant dans le cytoplasme des CGP que la reaction
permet de les colorer electivement et de les suivre aux differentes etapes de leur
migration (Meyer, 1964). Recemment,Dubois&Cuminge(1967,1968)ontmontre
que les CGP du croissant germinal contiennent des lipides figures en quantite
considerable. Cette reserve lipidique est encore abondante dans les cellules
germinales qui colonisent les cretes genitales et dans les gonocytes primaires de
la gonade morphologiquement indifferenciee. La richesse en gouttelettes
lipidiques est telle qu'elle marque electivement les cellules germinales et qu'elle
permet de les reconnaitre aisement avant et apres leur installation dans les
epitheliums germinatifs (planche 1, figs. B a G).
Grace a ces techniques particulieres de l'histochimie, il a ete possible de
reperer avec certitude les gonocytes et de suivre avec precision leur comporte-
ment et leur destinee. II est remarquable que, dans tous les cas, les resultats
acquis par l'application de ces methodes sont rigoureusement identiques a ceux
obtenus par i'emploi des techniques histologiques classiques.
11 n'est done pas
douteux qu'a partir du stade du croissant germinal (environ 24 h d'incubation)
les seuls criteres morphologiques (taille, forme, aspect de la cellule et de son
noyau) sont sufiisants pour qu'un observateur initie puisse reconnaitre avec
certitude une cellule germinale.
I. ASPECTS MORPHOLOGIQUE ET NUMERIQUE DE LA COLONISATION
DES EPITHELIUMS GERMINATIFS PAR LES CGP, DANS LES
CONDITIONS NORMALES DU DEVELOPPEMENT
L'ultime etape de la migration des CGP des Oiseaux a souvent ete decrite,
mais a donne lieu a des interpretations differentes. Actuellement, le probleme se
resume a deux propositions:
— la retention des CGP au niveau des ebauches gonadiques est purement
mecanique et e'est la disposition particuliere du reseau vasculaire agissant a la
facon d'un filtre qui la determine (Dantchakoff, 1934, 1950):
— la fixation des CGP resulte de l'amceboidisme oriente de ces cellules; elle
est determined par un mecanisme analogue a celui qui commande la migration
inter stitielle.
Cette derniere hypothese, historiquement la plus ancienne, est acceptee par
le plus grand nombre des chercheurs. Rubaschkin (1908), Swift (1914), Firket
(1914), Reagan (1916), Defretin (1924) et Blocker (1933) expliquent la colonisa-
tion des epitheliums germinatifs par les proprietes amoeboides des CGP. Firket

Cellules germinales de Poulet 193
(1914) qui observe un plus grand nombre de gonocytes a gauche ira jusqu'a
interpreter cette dissymetrie de repartition par une action chimiotactique plus
intense de la glande gauche. Simon (1960) apporte une contribution experimen-
tale a ce probleme en demontrant que des modifications apportees a la disposi-
tion du reseau vasculaire n'ont aucune repercussion sur la retention des CGP
au niveau des epitheliums germinatifs. L'auteur conclut que la configuration
de la circulation n'est pour rien dans la fixation des cellules germinales et que
l'hypothese chimiotactique est la plus vraisemblable. Simon note par ailleurs
que des gonocytes peuvent quitter de larges vaisseaux comme les aortes, mais
ne dit pas dans quelle proportion. Ce detail a son importance car la plupart des
auteurs decrivent l'arrivee des gonocytes par les capillaires de la splanchno-
pleure ou les calibres sont reduits et le debit faible. La sortie des cellules germi-
nales au niveau des aortes est-elle accidentelle? le calibre des vaisseaux joue-t-il
un role dans la retention des CGP? y
a-t-il une influence du debit sanguin?
Methodes. Des embryons temoins de 32 paires de somites sont fixes en entier
afin de prevenir toute hemorragie. Nous explorons la region gonadique sur des
coupes transversales afin de reconnaitre l'activite amoeboide des gonocytes et de
denombrer les CGP qui sortent des vaisseaux de la splanchnopleure et ceux qui
atteignent le mesenchyme a partir des aortes. Les cellules germinales installees
dans les epitheliums germinatifs ne sont pas comptees. En effet, les gonocytes
qui se trouvent dans repithelium germinatif au niveau des aortes ne proviennent
pas obligatoirement de ces vaisseaux: ils peuvent avoir ete entraines par les
mouvements tissulaires qui deplacent vers Tangle ccelomique et sous le blas-
teme mesonephritique repithelium germinatif situe primitivement en position
ventrale (Defretin, 1924; Dantchakoflf, 1934; Meyer, 1964). Nous faisons la
meme statistique sur une serie de blastodermes de 32 paires de somites, cultives
in vitro selon la technique de Wolff
& Simon (1955), et dont la circulation de la
region gonadique est bloquee par un poids de plomb convenablement taille
(planche 1, fig. A1, A2). Les denombrements sont faits apres 2 h de culture.
Afin de reperer des cellules germinales par leurs inclusions lipidiques, les
embryons sont fixes au liquide de Bouin. Une post-fixation par le tetroxyde
d'osmium permet de complexifier les lipides non satures reducteurs et d'inclure
les echantillons dans la paraffine. Les coupes de 5 fi sont deparaffinees par le
benzene, hydratees puis blanchies par H2O2, 4 volumes (liberation des lipides,
Chou, 1958). Les lipides ainsi liberes sont reveles par la coloration au Noir
Soudan (voir Dubois & Cuminge, 1967, 1968).
(1) Resultats (planche 1)
(a) Observations histologiques
En accord avec nos predecesseurs, nous avons constate que la majorite des
gonocytes colonisent les epitheliums germinatifs a partir des capillaires de la
splanchnopleure (planche 1, fig. B; tableau 1). Toutefois, il arrive qu'une