An ecological perspective on microbes and immune defences in

An ecological perspective on microbes and immune defences in avian eggs
Grizard, Stephanie
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2015
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Grizard, S. (2015). An ecological perspective on microbes and immune defences in avian eggs
[Groningen]: University of Groningen
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RÉSUMÉ FRANÇAIS
L’organisation des défenses immunitaires chez les vertébrés “supérieurs” est
particulièrement flexible. Dans le but d’identifier quels éléments sont responsables de la
variation immunitaire, il est essentiel de considérer les systèmes immunitaires dans le
contexte écologique et évolutif de leurs hôtes, dépassant ainsi les simples aspects
physiologique et moléculaire de l’immunité. Étant donné que l’architecture immunitaire
évolue en même temps que d’autres traits d’histoire de vie, l’exposition aux antigènes et les
conditions environnementales, une approche éco-immunologique est indispensable pour
clarifier la variation naturelle des propriétés immunitaires. Souvent négligés, les microorganismes - pathogènes autant que commensaux et bénéfiques - sont cependant
d’importants acteurs du développement du système immunitaire. Ils peuvent également
exercer une pression “immunobiotique” déterminante sur celui-ci. Par conséquent, intégrer
la diversité et l’abondance des communautés microbiennes apportera un nouvel éclairage à
la compréhension du système immunitaire. Élucider les relations entre micro-organismes et
défenses immunitaires dans une perspective éco-immunologique sous-tend cette thèse.
Chez les oiseaux adultes, la compréhension de la variabilité immunitaire est entravée
par le grand nombre de composantes, liées à l’hôte, en interaction (ex. susceptibilité de
l’hôte aux infections, statut infectieux ou sain de l’hôte) et par le vaste nombre de variables
biotiques et abiotiques qui caractérisent le(s) environnement(s) de l’hôte et qui sont
difficilement comptabilisables. Recherchant un modèle simplifié aux défenses immunitaires
limitées et au nombre de micro-organismes ou de pathogènes restreint, je me suis
intéressée aux œufs d’oiseaux. Les œufs possèdent des défenses immunitaires plus simples
que celles des oiseaux adultes et sont confrontés à moins de micro-organismes que ces
derniers non immobiles. Il existe vraisemblablement des risques d’intrusions microbiennes
à l’intérieur des œufs pendant la période d’incubation, potentiellement nuisibles à
l’embryon. De ce fait, les femelles doivent allouer des défenses immunitaires dans leurs
œufs pour réduire ces risques de mort embryonnaire. Les femelles, ne pouvant ajuster le
niveau des composés antimicrobiens une fois leurs œufs pondus, doivent investir une
quantité optimale initiale qui doit être équivalente au risque potentiel d’infections causées
par les micro-organismes interagissant avec les œufs. Ce concept étaye l’hypothèse
principale de ma thèse.
Dans le but d’explorer le lien entre les communautés microbiennes présentes sur les
coquilles d’œufs et les composés antimicrobiens contenus dans l’albumen, j’ai étudié la
famille des alouettes (Alaudidae). Ses membres apparentés ont une distribution cosmopolite
et font face à une large gamme de conditions climatiques et environnementales tandis qu’ils
ont en commun leurs comportements de nidification, leurs patrons d’incubation et leurs
régimes alimentaires. Ces éléments font des alouettes un modèle d’études attractif pour
examiner comment les microbes influencent les défenses immunitaires à l’échelle de l’œuf,
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entre et au sein des populations et des espèces, et entre habitats présentant des conditions
environnementales distinctes, le tout dans un contexte écologique.
La première difficulté a été d’associer des méthodes d’échantillonnage adéquates avec
les approches moléculaires les plus appropriées pour détailler de manière fiable la diversité,
structure et composition des communautés microbiennes associées aux coquilles d'œufs.
Jusqu’à présent, la majorité des études a employé une méthodologie basée sur la culture des
micro-organismes et sur des techniques consistant à frotter, à l’aide d’un coton-tige, la
surface de l’œuf pour en prélever les cellules microbiennes. Ces études conduisent à une
évaluation biaisée des microbiomes associés aux coquilles d'œufs. Dans le chapitre 2, en
ciblant le gène de l’ARN ribosomique 16S (ARNr 16S), j’ai décrit les communautés
bactériennes des coquilles d'œufs de pigeons élevés en captivité (Columba livia) et prouvé
que la méthode d’échantillonnage affectait les résultats. Le prélèvement par coton-tige a
mené à une plus faible efficacité d’extraction d’ADN et a révélé différents profils de
communautés bactériennes comparé à une méthode ayant recours aux coquilles d'œufs
écrasées.
À l’aide de cette méthode indépendante, basée sur l’utilisation des outils moléculaires,
j’ai commencé à déchiffrer le microbiome des coquilles d'œufs et à explorer en premier lieu
ses potentiels changements au cours de l’incubation. Dans le chapitre 2, les communautés
bactériennes et fongiques (espaceur transcrit interne ou ITS (Internal Transcribed Spacer)) des
coquilles d'œufs ont été caractérisées en deux instants (premiers et derniers jours) de la
période d’incubation et d’importants changements ont été observés entre les deux. La
diversité bactérienne a décru alors que son abondance a augmenté; la diversité fongique a
diminué mais son déclin est accompagné d’une baisse de l’abondance. Pour améliorer nos
connaissances sur le dynamisme des communautés bactériennes associées aux coquilles
d'œufs, j’ai ensuite examiné ces communautés tout au long de la période d’incubation chez
l’alouette cendrille (Calandrella cinerea) qui vit en milieu naturel au Kenya (chapitre 3). Une
fois encore, les communautés bactériennes sont apparues hautement dynamiques.
SAMENVATTING - SUMMARY - RÉSUMÉ
L’abondance a baissé entre le début et la fin de l’incubation, la diversité Alpha (α) a
augmenté pendant les premiers jours de l’incubation et l’analyse de la diversité Beta (β) a
démontré que les communautés associées aux coquilles d'œufs vieilles d’un jour sont
phylogénétiquement plus similaires les unes par rapport aux autres que celles des couvées
incubées plus longtemps. Avec l’objectif d’intégrer les informations acquises sur les
changements observés au niveau des microbiomes des coquilles d'œufs dans un contexte
écologique, j’ai évalué l’investissement immunitaire maternel dans l’albumen et son lien
potentiel avec les microbes associés à ces coquilles. D’importantes variations dans les
propriétés immunitaires ont ainsi été observées. Au fil de l’incubation, l’activité de la
protéine lysozyme et le pH de l’albumen ont diminué alors que la concentration de la
protéine ovotransferrine s’est accrue. De tels changements dans le temps sont
probablement liés à la croissance de l’oisillon. De plus, en ce qui concerne la séquence de
ponte, j’ai également constaté que deux œufs appartenant à une même couvée partagent un
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niveau similaire de protection immunitaire. Cependant, les preuves de corrélations entre
les composés antimicrobiens de l’albumen et les microbiomes des coquilles d'œufs restent
limitées.
Dans le but d’éclaircir les origines du microbiome associé aux coquilles d’œufs, j’ai
examiné des œufs d’alouette cendrille dans deux sites au climat tropical (South et North
Kinangop, Kenya) et ceux d’alouette des champs (Alauda arvensis) dans un site au climat
tempéré (Aekingerzand, Pays-Bas). Bien que ces deux espèces d’alouettes vivent éloignées
l’une de l’autre, et sous des climats distincts, les microbiomes des coquilles d’œufs de deux
des trois populations (North Kinangop et Aekingerzand) possèdent une structure de
communautés particulièrement semblable et partagent jusqu’à 60% de leurs espèces
bactériennes (chapitre 4). J’ai également analysé trois sources possibles d’inoculation (les
plumes et le cloaque d’origine maternelle et les composants du nid) qui pourraient
contribuer au microbiome des coquilles. Il s’est avéré que les espèces bactériennes relatives
au plumage maternel ont contribué davantage au microbiome des coquilles. Ceci souligne la
dominance de la transmission microbienne horizontale sur la transmission verticale dans la
structuration des microbiomes associés aux coquilles d'œufs.
Comme les environnements divergent en termes d’ “immunobiome” auquel les
individus sont exposés, il est attendu que les défenses immunitaires diffèrent d’un habitat à
l’autre. À l’échelle de l’œuf, les variations des propriétés immunitaires en lien avec les
conditions environnementales ont été peu explorées et les études menées sur ce sujet ont
rapporté des résultats opposés (absence/présence de variations dans les activités des
protéines antimicrobiennes). Les communautés microbiennes sont généralement
contraintes par les facteurs environnementaux et écologiques (ex. la distribution
biogéographique), accentuant la nécessité d’étudier les relations entre le microbiome des
coquilles d'œufs et les protéines antimicrobiennes de l’albumen, entre et au sein des
habitats. Grâce aux œufs d’alouettes cendrilles collectés dans trois habitats au climat
distinct au Kenya, j’ai observé d’importantes variations dans les microbiomes des coquilles
d’œufs. J’ai noté une abondance bactérienne plus élevée au sein du site frais et humide mais
des indices de diversité α supérieurs pour les œufs des deux autres sites les plus chauds. Les
microbiomes associés aux coquilles de ces deux habitats les plus chauds sont aussi
phylogénétiquement plus semblables entre eux et présentent une plus large distribution
taxonomique comparés aux microbiomes du troisième habitat, plus frais. Malgré l’absence
de variation dans les propriétés immunitaires entre habitats, il est intéressant de noter que
quelques corrélations entre composés antimicrobiens et caractéristiques bactériennes ont
été trouvées au sein même de ces habitats. Les concentrations en lysozyme et les valeurs de
pH sont positivement corrélées à deux unités taxonomiques opérationnelles
(OTUs (Operational Taxonomic Units); les genres Pelomonas et Pantoea); les concentrations en
ovotransferrine et les valeurs de pH ont varié négativement avec l’abondance bactérienne
et positivement avec les indices de diversité α. Enfin, j’ai étendu cette comparaison entre les
microbiomes de coquilles d'œufs et les composés antimicrobiens à une plus grande échelle
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SAMENVATTING - SUMMARY - RÉSUMÉ
géographique et à de multiples espèces d’alouettes vivant en climat tropical ou tempéré
(chapitre 6). En plus des alouettes cendrilles, j’ai examiné les alouettes à nuque rousse
(Mirafra africana) qui vivent en environnement tropical et deux espèces d’alouettes
néerlandaises, les alouettes des champs et les alouettes lulu (Lullula arborea) qui nichent en
zone tempérée. D’une manière intéressante, à l’échelle de l’OTU, bien que les analyses de la
diversité phylogénétique β ont montré que les communautés bactériennes du Kenya se
regroupent à l’écart des communautés issues des Pays-Bas, une analyse en réseau a révélé
que 47 des 75 principales OTUs sont communes, desquelles aucun pathogène potentiel n’a
été identifié. De plus, malgré l’absence de différences dans les propriétés immunitaires
parmi les œufs des diverses espèces d’alouettes entre habitats (excepté les alouettes lulu
dont la concentration en ovotransferrine est supérieure), chaque protéine antimicrobienne
a une fois encore été corrélée avec plusieurs caractéristiques bactériennes (ex. présence ou
absence de certaines OTUs et/ou abondance bactérienne).
Dans l’ensemble, les résultats de cette thèse fournissent de nouvelles perspectives dans
les relations entre les microbiomes associés aux coquilles d'œufs et les composés
antimicrobiens contenus dans l’albumen de ces œufs. Premièrement, la croissance sélective
d’espèces bactériennes singulières pourrait exister à la surface des coquilles d'œufs. Mis à
part les approches structurelle, phylogénétique et de diversité taxonomique abordées dans
cette thèse pour décrire le microbiome de ces coquilles, identifier les rôles fonctionnels de
ces micro-organismes devrait sans doute améliorer les connaissances portant sur les
stratégies qui contrôlent la survie embryonnaire. De plus, si les pathogènes sont rarement
présents dans les communautés microbiennes des coquilles d'œufs, comme cette thèse le
suggère, la quantité de protéines antimicrobiennes contenues dans les œufs d’oiseaux
pourrait alors être le reflet d’un investissement optimal. Ainsi, les fortes corrélations entre
les composés antimicrobiens et les micro-organismes des coquilles d'œufs seraient limitées.
Les risques restreints d’infections pourraient par conséquent réduire l’investissement
immunitaire maternel, généralement coûteux. Seules des études basées sur des expériences
ciblant des marqueurs fonctionnels (approche métagénomique) et leur expression
(approche transcriptomique) permettront l’identification des pathogènes et amélioreront
nos connaissances sur la sélection du microbiome des coquilles d'œufs. Plus généralement,
la plasticité génétique et phénotypique des femelles pourrait réguler l’investissement
immunitaire dans les œufs, constituant un aspect capital à approfondir pour comprendre
l’importance des microbes dans l’investissement maternel. La manipulation des
communautés microbiennes dans l’environnement de la femelle avant la ponte permettra
d’étudier si et dans quelle mesure la quantité de protéines antimicrobiennes déposées dans
l’albumen varie réellement en réponse à la pression microbienne environnementale. D’un
point de vue global, l’ensemble des résultats de cette thèse ouvre la voie à de futurs travaux
en éco-immunologie qui devront approfondir le rôle du microbiome des coquilles d'œufs,
via la sélection naturelle, sur l’investissement immunitaire maternel, ainsi que la nécessité
d’explorer la flexibilité physiologique des femelles au regard de la protection immunitaire.
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