An ecological perspective on microbes and immune defences in avian eggs Grizard, Stephanie IMPORTANT NOTE: You are advised to consult the publisher's version (publisher's PDF) if you wish to cite from it. Please check the document version below. Document Version Publisher's PDF, also known as Version of record Publication date: 2015 Link to publication in University of Groningen/UMCG research database Citation for published version (APA): Grizard, S. (2015). An ecological perspective on microbes and immune defences in avian eggs [Groningen]: University of Groningen Copyright Other than for strictly personal use, it is not permitted to download or to forward/distribute the text or part of it without the consent of the author(s) and/or copyright holder(s), unless the work is under an open content license (like Creative Commons). Take-down policy If you believe that this document breaches copyright please contact us providing details, and we will remove access to the work immediately and investigate your claim. Downloaded from the University of Groningen/UMCG research database (Pure): http://www.rug.nl/research/portal. For technical reasons the number of authors shown on this cover page is limited to 10 maximum. Download date: 19-04-2017 RÉSUMÉ FRANÇAIS L’organisation des défenses immunitaires chez les vertébrés “supérieurs” est particulièrement flexible. Dans le but d’identifier quels éléments sont responsables de la variation immunitaire, il est essentiel de considérer les systèmes immunitaires dans le contexte écologique et évolutif de leurs hôtes, dépassant ainsi les simples aspects physiologique et moléculaire de l’immunité. Étant donné que l’architecture immunitaire évolue en même temps que d’autres traits d’histoire de vie, l’exposition aux antigènes et les conditions environnementales, une approche éco-immunologique est indispensable pour clarifier la variation naturelle des propriétés immunitaires. Souvent négligés, les microorganismes - pathogènes autant que commensaux et bénéfiques - sont cependant d’importants acteurs du développement du système immunitaire. Ils peuvent également exercer une pression “immunobiotique” déterminante sur celui-ci. Par conséquent, intégrer la diversité et l’abondance des communautés microbiennes apportera un nouvel éclairage à la compréhension du système immunitaire. Élucider les relations entre micro-organismes et défenses immunitaires dans une perspective éco-immunologique sous-tend cette thèse. Chez les oiseaux adultes, la compréhension de la variabilité immunitaire est entravée par le grand nombre de composantes, liées à l’hôte, en interaction (ex. susceptibilité de l’hôte aux infections, statut infectieux ou sain de l’hôte) et par le vaste nombre de variables biotiques et abiotiques qui caractérisent le(s) environnement(s) de l’hôte et qui sont difficilement comptabilisables. Recherchant un modèle simplifié aux défenses immunitaires limitées et au nombre de micro-organismes ou de pathogènes restreint, je me suis intéressée aux œufs d’oiseaux. Les œufs possèdent des défenses immunitaires plus simples que celles des oiseaux adultes et sont confrontés à moins de micro-organismes que ces derniers non immobiles. Il existe vraisemblablement des risques d’intrusions microbiennes à l’intérieur des œufs pendant la période d’incubation, potentiellement nuisibles à l’embryon. De ce fait, les femelles doivent allouer des défenses immunitaires dans leurs œufs pour réduire ces risques de mort embryonnaire. Les femelles, ne pouvant ajuster le niveau des composés antimicrobiens une fois leurs œufs pondus, doivent investir une quantité optimale initiale qui doit être équivalente au risque potentiel d’infections causées par les micro-organismes interagissant avec les œufs. Ce concept étaye l’hypothèse principale de ma thèse. Dans le but d’explorer le lien entre les communautés microbiennes présentes sur les coquilles d’œufs et les composés antimicrobiens contenus dans l’albumen, j’ai étudié la famille des alouettes (Alaudidae). Ses membres apparentés ont une distribution cosmopolite et font face à une large gamme de conditions climatiques et environnementales tandis qu’ils ont en commun leurs comportements de nidification, leurs patrons d’incubation et leurs régimes alimentaires. Ces éléments font des alouettes un modèle d’études attractif pour examiner comment les microbes influencent les défenses immunitaires à l’échelle de l’œuf, 215 entre et au sein des populations et des espèces, et entre habitats présentant des conditions environnementales distinctes, le tout dans un contexte écologique. La première difficulté a été d’associer des méthodes d’échantillonnage adéquates avec les approches moléculaires les plus appropriées pour détailler de manière fiable la diversité, structure et composition des communautés microbiennes associées aux coquilles d'œufs. Jusqu’à présent, la majorité des études a employé une méthodologie basée sur la culture des micro-organismes et sur des techniques consistant à frotter, à l’aide d’un coton-tige, la surface de l’œuf pour en prélever les cellules microbiennes. Ces études conduisent à une évaluation biaisée des microbiomes associés aux coquilles d'œufs. Dans le chapitre 2, en ciblant le gène de l’ARN ribosomique 16S (ARNr 16S), j’ai décrit les communautés bactériennes des coquilles d'œufs de pigeons élevés en captivité (Columba livia) et prouvé que la méthode d’échantillonnage affectait les résultats. Le prélèvement par coton-tige a mené à une plus faible efficacité d’extraction d’ADN et a révélé différents profils de communautés bactériennes comparé à une méthode ayant recours aux coquilles d'œufs écrasées. À l’aide de cette méthode indépendante, basée sur l’utilisation des outils moléculaires, j’ai commencé à déchiffrer le microbiome des coquilles d'œufs et à explorer en premier lieu ses potentiels changements au cours de l’incubation. Dans le chapitre 2, les communautés bactériennes et fongiques (espaceur transcrit interne ou ITS (Internal Transcribed Spacer)) des coquilles d'œufs ont été caractérisées en deux instants (premiers et derniers jours) de la période d’incubation et d’importants changements ont été observés entre les deux. La diversité bactérienne a décru alors que son abondance a augmenté; la diversité fongique a diminué mais son déclin est accompagné d’une baisse de l’abondance. Pour améliorer nos connaissances sur le dynamisme des communautés bactériennes associées aux coquilles d'œufs, j’ai ensuite examiné ces communautés tout au long de la période d’incubation chez l’alouette cendrille (Calandrella cinerea) qui vit en milieu naturel au Kenya (chapitre 3). Une fois encore, les communautés bactériennes sont apparues hautement dynamiques. SAMENVATTING - SUMMARY - RÉSUMÉ L’abondance a baissé entre le début et la fin de l’incubation, la diversité Alpha (α) a augmenté pendant les premiers jours de l’incubation et l’analyse de la diversité Beta (β) a démontré que les communautés associées aux coquilles d'œufs vieilles d’un jour sont phylogénétiquement plus similaires les unes par rapport aux autres que celles des couvées incubées plus longtemps. Avec l’objectif d’intégrer les informations acquises sur les changements observés au niveau des microbiomes des coquilles d'œufs dans un contexte écologique, j’ai évalué l’investissement immunitaire maternel dans l’albumen et son lien potentiel avec les microbes associés à ces coquilles. D’importantes variations dans les propriétés immunitaires ont ainsi été observées. Au fil de l’incubation, l’activité de la protéine lysozyme et le pH de l’albumen ont diminué alors que la concentration de la protéine ovotransferrine s’est accrue. De tels changements dans le temps sont probablement liés à la croissance de l’oisillon. De plus, en ce qui concerne la séquence de ponte, j’ai également constaté que deux œufs appartenant à une même couvée partagent un 216 niveau similaire de protection immunitaire. Cependant, les preuves de corrélations entre les composés antimicrobiens de l’albumen et les microbiomes des coquilles d'œufs restent limitées. Dans le but d’éclaircir les origines du microbiome associé aux coquilles d’œufs, j’ai examiné des œufs d’alouette cendrille dans deux sites au climat tropical (South et North Kinangop, Kenya) et ceux d’alouette des champs (Alauda arvensis) dans un site au climat tempéré (Aekingerzand, Pays-Bas). Bien que ces deux espèces d’alouettes vivent éloignées l’une de l’autre, et sous des climats distincts, les microbiomes des coquilles d’œufs de deux des trois populations (North Kinangop et Aekingerzand) possèdent une structure de communautés particulièrement semblable et partagent jusqu’à 60% de leurs espèces bactériennes (chapitre 4). J’ai également analysé trois sources possibles d’inoculation (les plumes et le cloaque d’origine maternelle et les composants du nid) qui pourraient contribuer au microbiome des coquilles. Il s’est avéré que les espèces bactériennes relatives au plumage maternel ont contribué davantage au microbiome des coquilles. Ceci souligne la dominance de la transmission microbienne horizontale sur la transmission verticale dans la structuration des microbiomes associés aux coquilles d'œufs. Comme les environnements divergent en termes d’ “immunobiome” auquel les individus sont exposés, il est attendu que les défenses immunitaires diffèrent d’un habitat à l’autre. À l’échelle de l’œuf, les variations des propriétés immunitaires en lien avec les conditions environnementales ont été peu explorées et les études menées sur ce sujet ont rapporté des résultats opposés (absence/présence de variations dans les activités des protéines antimicrobiennes). Les communautés microbiennes sont généralement contraintes par les facteurs environnementaux et écologiques (ex. la distribution biogéographique), accentuant la nécessité d’étudier les relations entre le microbiome des coquilles d'œufs et les protéines antimicrobiennes de l’albumen, entre et au sein des habitats. Grâce aux œufs d’alouettes cendrilles collectés dans trois habitats au climat distinct au Kenya, j’ai observé d’importantes variations dans les microbiomes des coquilles d’œufs. J’ai noté une abondance bactérienne plus élevée au sein du site frais et humide mais des indices de diversité α supérieurs pour les œufs des deux autres sites les plus chauds. Les microbiomes associés aux coquilles de ces deux habitats les plus chauds sont aussi phylogénétiquement plus semblables entre eux et présentent une plus large distribution taxonomique comparés aux microbiomes du troisième habitat, plus frais. Malgré l’absence de variation dans les propriétés immunitaires entre habitats, il est intéressant de noter que quelques corrélations entre composés antimicrobiens et caractéristiques bactériennes ont été trouvées au sein même de ces habitats. Les concentrations en lysozyme et les valeurs de pH sont positivement corrélées à deux unités taxonomiques opérationnelles (OTUs (Operational Taxonomic Units); les genres Pelomonas et Pantoea); les concentrations en ovotransferrine et les valeurs de pH ont varié négativement avec l’abondance bactérienne et positivement avec les indices de diversité α. Enfin, j’ai étendu cette comparaison entre les microbiomes de coquilles d'œufs et les composés antimicrobiens à une plus grande échelle 217 SAMENVATTING - SUMMARY - RÉSUMÉ géographique et à de multiples espèces d’alouettes vivant en climat tropical ou tempéré (chapitre 6). En plus des alouettes cendrilles, j’ai examiné les alouettes à nuque rousse (Mirafra africana) qui vivent en environnement tropical et deux espèces d’alouettes néerlandaises, les alouettes des champs et les alouettes lulu (Lullula arborea) qui nichent en zone tempérée. D’une manière intéressante, à l’échelle de l’OTU, bien que les analyses de la diversité phylogénétique β ont montré que les communautés bactériennes du Kenya se regroupent à l’écart des communautés issues des Pays-Bas, une analyse en réseau a révélé que 47 des 75 principales OTUs sont communes, desquelles aucun pathogène potentiel n’a été identifié. De plus, malgré l’absence de différences dans les propriétés immunitaires parmi les œufs des diverses espèces d’alouettes entre habitats (excepté les alouettes lulu dont la concentration en ovotransferrine est supérieure), chaque protéine antimicrobienne a une fois encore été corrélée avec plusieurs caractéristiques bactériennes (ex. présence ou absence de certaines OTUs et/ou abondance bactérienne). Dans l’ensemble, les résultats de cette thèse fournissent de nouvelles perspectives dans les relations entre les microbiomes associés aux coquilles d'œufs et les composés antimicrobiens contenus dans l’albumen de ces œufs. Premièrement, la croissance sélective d’espèces bactériennes singulières pourrait exister à la surface des coquilles d'œufs. Mis à part les approches structurelle, phylogénétique et de diversité taxonomique abordées dans cette thèse pour décrire le microbiome de ces coquilles, identifier les rôles fonctionnels de ces micro-organismes devrait sans doute améliorer les connaissances portant sur les stratégies qui contrôlent la survie embryonnaire. De plus, si les pathogènes sont rarement présents dans les communautés microbiennes des coquilles d'œufs, comme cette thèse le suggère, la quantité de protéines antimicrobiennes contenues dans les œufs d’oiseaux pourrait alors être le reflet d’un investissement optimal. Ainsi, les fortes corrélations entre les composés antimicrobiens et les micro-organismes des coquilles d'œufs seraient limitées. Les risques restreints d’infections pourraient par conséquent réduire l’investissement immunitaire maternel, généralement coûteux. Seules des études basées sur des expériences ciblant des marqueurs fonctionnels (approche métagénomique) et leur expression (approche transcriptomique) permettront l’identification des pathogènes et amélioreront nos connaissances sur la sélection du microbiome des coquilles d'œufs. Plus généralement, la plasticité génétique et phénotypique des femelles pourrait réguler l’investissement immunitaire dans les œufs, constituant un aspect capital à approfondir pour comprendre l’importance des microbes dans l’investissement maternel. La manipulation des communautés microbiennes dans l’environnement de la femelle avant la ponte permettra d’étudier si et dans quelle mesure la quantité de protéines antimicrobiennes déposées dans l’albumen varie réellement en réponse à la pression microbienne environnementale. D’un point de vue global, l’ensemble des résultats de cette thèse ouvre la voie à de futurs travaux en éco-immunologie qui devront approfondir le rôle du microbiome des coquilles d'œufs, via la sélection naturelle, sur l’investissement immunitaire maternel, ainsi que la nécessité d’explorer la flexibilité physiologique des femelles au regard de la protection immunitaire. 218 219