Reversibilite de la dedifferenciation observee dans les cultures
/. Embryol.
exp.
Morph. Vol.
35, 2, pp.
227-240, 1976
227
Printed
in
Great Britain
Reversibilite
de la
dedifferenciation
observee dans
les
cultures cellulaires
de
foie
embryonnaire d'oiseau
ParE. HOUSSAINT1
Laboratoire d'Embryologie, Universite
de
Nantes, France
SUMMARY
Reversibility
of
the morphological and functional dedifferentiation occurring
in cultures
of
avion embryonic liver cells
Primary cell cultures
are
established from
8-day
quail embryo livers. During
the
first three
days
the
culture
is
made
up of
areas
of
epithelial-like cells
and
scattered fibroblasts.
The
cytoplasm
of
the
epithelial cells shows
a
high glycogen content
as
detected
by the
PAS
reaction controlled with salivary amylase digestion. During
the
following days
an im-
portant increase
in the
number
of
fibroblastic cells
is
observed. After
6-7
days
of
cultivation,
the epithelial cells have disappeared
and the
culture
is
entirely fibroblastic. PAS technique does
not show
any
trace
of
glycogen
in
these cultures which have been prolonged
up to 45
days.
Six-
to
45-day primary cultures entirely made
up of
fibroblasts were associated with hepatic
or pulmonary mesenchyme
in
organotypic culture
for
3-4
days.
In
some cases
the
explant
was first cultivated
in
vitro
for
2
days
and
then grafted into
a
5-day-old chick embryo
on
the
chorioallantoic membrane
for 6
days.
In the
secondary cultures hepatocytes showing
an
epithelial arrangement
and
a
high glycogen content were observed.
It appears from this observation that some
of
the
primary culture fibroblasts
are
in
fact
dedifferentiated parenchymal cells. Such
a
dedifferentiation
is
a
reversible phenomenon since
the cells retain
the
ability
to
express their initial determination
if
they
are
placed
in
convenient
environmental conditions.
The
role
of
the
specific tissular arrangement
in
the
stability
of
the
differentiated state
is
discussed.
INTRODUCTION
De nombreux auteurs
ont
tente d'etablir
des
lignees cellulaires
a
partir
de
cultures
de
tissu hepatique d'oiseaux
et de
mammiferes.
Les
cellules
du
foie
de
mammifere peuvent etre cultivees pendant
de
longues periodes
et des
cultures
clonales
ont
meme
pu
etre obtenues
a
partir
de
foie
de rat
nouveau
ne
(Coon,
1969;
Lambiotte, Susor
&
Cahn, 1972; Chessebeuf
et
ah 1974);
de
foie
de
souris
(Evans
et
ah 1952; Waymouth, Chen
&
Wood, 1971);
de
foie humain foetal
ou
adulte (Chang, 1954)
et de
foie
de
veau (Pieck
&
Kuyper, 1961).
Le
but des
recherches effectuees dans
ce
domaine etait d'etablir des cultures
massives
de
cellules hepatiques metaboliquement actives.
Le
plus souvent
les
1 Adresse
de
Vauteur: Laboratoire d'Embryologie, Universite
de
Nantes, U.E.R.
des
Sciences
de
la
Nature,
38
Boulevard Michelet,
B.P.
1044-44037 Nantes Cedex, France.
15-2
228 E. HOUSSAINT
cultures de foie de mammifere sont constitutes de cellules presentant un aspect
epithelial. Cependant, bien que dans certains cas il ait ete possible de deceler
dans les cellules certaines proprietes des hepatocytes (production de proteines
seriques - Coon, 1969; Namba, Hirox & Kishimoto, 1968; Kaighn & Prince,
1971;
Waymouth et al. 1971; Bissell & Tilles, 1971; presence de glycogene-
Gerschenson, Andersson & Molson, 1970; existence de la forme B de l'aldolase
- Chessebeuf et al. 1974), le plus generalement les caracteristiques biochimiques
et fonctionnelles du tissu hepatique disparaissent rapidement en culture (Evans
et al. 1952; Perske, Parks & Walker, 1957; Auerbach & Walker, 1959; Hillis &
Bang, 1962; Watanabe, 1966; Fogel, 1968; Rose, Kumegawa & Cattoni, 1968;
Alexander & Grisham, 1970; Lambiotte et al. 1972).
L'explantation de foie embryonnaire de poulet n'a donne lieu qu'a des
cultures de duree limitee ne supportant pas de repiquages successifs (Kuroda &
Nagatani, 1965; Angulo, 1968; Laschi & Rizzoli, 1968; Verne & Hebert, 1968;
Skea & Nemeth, 1969; Lambiotte, 1970; Verne, Hebert, Richshoffer & Roux,
1971).
Elles sont constitutes au cours des premiers jours, de plages epitheliales
et de cellules d'aspect fibroblastique qui deviennent rapidement predominates.
Apres quelques jours, les plages epitheliales disparaissent et les fibroblastes sont
alors le seul type cellulaire de la culture.
II apparait done que les conditions de la culture cellulaire sont defavorables
au maintien de l'activite fonctionnelle de la cellule hepatique. Nous nous
sommes pose la question de savoir si les fibroblastes resultant de l'explantation
prolongee du foie d'oiseau derivaient exclusivement des cellules endotheliales et
conjonctives du tissu hepatique ou si certains d'entre eux pouvaient provenir de
cellules parenchymateuses morphologiquement et physiologiquement
dedif-
ferenciees. Dans ce dernier cas il etait interessant de rechercher si la dedifferen-
ciation imposee par les conditions de la culture etait ou non reversible.
Dans des recherches precedentes de notre groupe le role de la composante
mesodermique du foie sur la differenciation de l'endoderme en hepatocytes et
sur le maintien de l'activite fonctionnelle de ces cellules a ete demontre (Le
Douarin, 1964; Le Douarin & Houssaint, 1967; Le Douarin, 1968; Houssaint,
1972).
De plus il a ete etabli que l'ensemble du mesoderme des lames laterales
peut jouer le meme role que le mesenchyme propre du foie sur la differenciation
des cellules endodermiques en parenchyme hepatique (Le Douarin, Bussonnet
& Chaumont, 1968).
Dans le present travail nous avons etudie revolution morphologique et le
contenu en glycogene des cellules hepatiques d'embryons de caille de 8 jours
dissociees par action de la trypsine puis transplanted en milieu liquide. Le
temps de culture maximum a ete de 45 jours. Lorsque les cultures ont atteint
un etat fibroblastique homogene nous les avons associees en culture organo-
typique avec du mesenchyme d'origine splanchnique et nous avons pu montrer
que des cellules hepatiques fonctionnelles derivant de la culture primaire
apparaissent dans les explants.
Reversibilite de la dedifferenciation 229
MATERIEL ET METHODES
(a) Cultures pritnaires de cellules hepatiques
Les cultures cellulaires sont realisees a partir de foies d'embryons de caille de 8
jours.
Les organes preleves sterilement sont decoupes en minces fragments dans
du liquide de Tyrode puis incubes a 37 °C, pendant 30 min, dans une solution de
trypsine (NBC) a 0,25 % dans du liquide de Tyrode sans Ca ni Mg. Au cours de
cette incubation, la solution est agitee a trois reprises par pipetages repetes.
Apres nitration sur gaze, les cellules isolees ainsi que les petits agregats cellu-
laires sont laves deux fois dans du milieu de Eagle additionne de 20 % de serum
foetal de veau. Les cellules sont alors mises en culture dans des boites de Petri
Falcon de 35 mm de diametre, a raison de 106 cellules par ml de milieu. On
place le plus souvent une lamelle de verre dans le fond du recipient de culture.
Nous avons egalement realise des cultures dans des boites dont le fond est
recouvert d'un film de collagene. Nous utilisons le milieu MEM de Eagle
(Wellcome) additionne de 10 % de serum foetal de veau. De la penicilline
(100 unites/ml) et de la streptomycine (lOO^g/ml) sont ajoutees au milieu. Les
cultures sont incubees en atmosphere humide dans une etuve Nacional a
circulation gazeuse (95 % air-5 % CO2) et le milieu de culture est renouvele tous
les trois jours. Les cultures sont observees avec un microscope a contraste de
phase Wild M40.
(b) Obtention des mesenchymes hepatique et pulmonaire
Mesenchyme hepatique
La technique qui permet d'obtenir du mesenchyme hepatique a l'etat pur a
ete mise au point par Le Douarin (1964). On peut isoler la partie posterieure de
l'aire presomptive du mesenchyme hepatique en empechant experimentalement
la progression des cellules endodermiques dans ce territoire. Pour cela, on
excise un fragment de l'aire laterale au niveau des somites anterieurs, au-dessous
du niveau de la levre anterieure de l'ombilic intestinal, chez des embryons de
6 a 13 somites (Fig.
1
A). La progression caudale des cordons endodermiques est
arretee par Foperation. En arriere du territoire excise, du mesenchyme hepatique
se developpe; il est preleve du 6eme au 9eme jour de l'incubation. Le mesenchyme
hepatique ainsi obtenu est dans tous les cas totalement depourvu d'hepatocytes
(Fig. 1B). Ceci a ete eprouve au cours de nombreuses experiences realisees avec
le mesenchyme propre du foie isole experimentalement (Le Douarin, 1964;
Houssaint & Le Douarin, 1971; Houssaint, 1972) (Fig. 1A, B).
Mesenchyme pulmonaire
On preleve les ebauches pulmonaires sur des embryons de poulet de 4 jours.
La separation du mesenchyme et de la bronche est obtenue par action d'une
solution de trypsine a 1 % dans du liquide de Tyrode sans Ca ni Mg selon une
230E. HOUSSAINT
mh
B
Fig. 1. (A) Isolement du mesenchyme hepatique (mh). On excise un fragment de
l'aire laterale (ex) au niveau des somites anterieurs./: region ou le foie se differencie
normalement. (D'apres Le Douarin, 1964.) (B) Mesenchyme hepatique preleve sur
un embryon de poulet de 6£ jours. Les travees mesenchymateuses (tm) sont depour-
vues d'hepatocytes. Hematoxyline-eosine. x 315.
technique decrite par Dameron (1961). Le mesenchyme est rince dans du
Tyrode normal additionne de 10 % de serum de poulain pour epuiser la trypsine
avant la mise en culture.
(c) Cultures secondaires
Dans une premiere serie experimentale, les cellules hepatiques cultivees pen-
dant 6 a 45 jours sont decollees de la lamelle de verre, a laquelle elles adherent, a
l'aide d'une spatule puis elles sont retransplantees soit sur un milieu semi-solide
(Wolff & Haffen, 1952) soit sur un filtre millipore pose sur une grille de type
Trowell. Dans ce dernier cas, le milieu a la meme composition que celui que nous
utilisons pour les cultures primaires de cellules hepatiques (milieu MEM de
Eagle +10 % de serum foetal de veau). L'explant est cultive pendant 3 a 4 jours
dans ces conditions puis fixe pour l'examen histologique.
Dans une deuxieme serie experimentale, nous avons realise des associations de
cultures primaires avec le mesenchyme hepatique ou pulmonaire. La culture
primaire que Ton a laisse evoluer pendant 6 a 45 jours, est alors placee en culture
organotypique au contact d'un mesenchyme hepatique ou pulmonaire. Cette
association est realisee sur un milieu de Wolff et Haffen ou sur un filtre millipore
Reversibilite de la
de differentiation
231
Culture primaire
(6 a 45 jours)
mh
Culture
secondaire
(3 a 5 jours)
Greffe coelomique
ou
Greffe chorioallantoidienne
Fig. 2. Realisation de cultures secondaires par association de cultures primaires de
6 a 45 jours avec du mesenchyme hepatique. L'association est realisee in vitro
pendant 3 a 4 jours. Dans certains cas elle est prolongee en greffe in ovo pendant
6 jours.
reposant sur une grille de type Trowell. L'explant est cultive pendant 3 a 4 jours
puis fixe par le liquide de Gendre. Dans certaines series experimentales, l'explant
est cultive 1 ou 2 jours puis retransplante in ovo pendant 6 jours dans le ccelome
d'un embryon de poulet de 3 jours d'incubation ou sur la membrane chorio-
allantoidienne (CAM) d'un embryon de 6 jours (Fig. 2).
(d) Detection du glycogene
Les lamelles portant les cultures cellulaires, ainsi que les explants resultant de
la combinaison des cultures primaires et du mesenchyme hepatique ou pul-
monaire sont fixes par le liquide de Gendre a - 20 °C pendant 10 min, puis 20
min a 4 °C. La deshydratation est egalement effectuee a 4 °C. Des resultats
anterieurs ont en effet montre que la fixation par le liquide de Gendre pratiquee
a basse temperature et tres rapidement, permet de preserver de tres petites
quantites de glycogene (Houssaint et Le Douarin, 1974). Les tissus sont
ensuite soumis a la reaction a l'acide periodique Schiff (APS) selon la methode
de Hotchkiss-MacManus (1948), en vue de la detection du glycogene, puis
post colores par l'hematoxyline de Groat.
6
7
8
9
10
11
12
13
14
1
/
14
100%
