Reversibilite de la dedifferenciation observee dans les cultures

/ . Embryol. exp. Morph. Vol. 35, 2, pp. 227-240, 1976
Printed in Great Britain
227
Reversibilite de la dedifferenciation
observee dans les cultures cellulaires de foie
embryonnaire d'oiseau
ParE. HOUSSAINT1
Laboratoire d'Embryologie, Universite de Nantes, France
SUMMARY
Reversibility of the morphological and functional dedifferentiation occurring
in cultures of avion embryonic liver cells
Primary cell cultures are established from 8-day quail embryo livers. During the first three
days the culture is made up of areas of epithelial-like cells and scattered fibroblasts. The
cytoplasm of the epithelial cells shows a high glycogen content as detected by the PAS
reaction controlled with salivary amylase digestion. During the following days an important increase in the number of fibroblastic cells is observed. After 6-7 days of cultivation,
the epithelial cells have disappeared and the culture is entirely fibroblastic. PAS technique does
not show any trace of glycogen in these cultures which have been prolonged up to 45 days.
Six- to 45-day primary cultures entirely made up of fibroblasts were associated with hepatic
or pulmonary mesenchyme in organotypic culture for 3-4 days. In some cases the explant
was first cultivated in vitro for 2 days and then grafted into a 5-day-old chick embryo on the
chorioallantoic membrane for 6 days. In the secondary cultures hepatocytes showing an
epithelial arrangement and a high glycogen content were observed.
It appears from this observation that some of the primary culture fibroblasts are in fact
dedifferentiated parenchymal cells. Such a dedifferentiation is a reversible phenomenon since
the cells retain the ability to express their initial determination if they are placed in convenient
environmental conditions. The role of the specific tissular arrangement in the stability of the
differentiated state is discussed.
INTRODUCTION
De nombreux auteurs ont tente d'etablir des lignees cellulaires a partir de
cultures de tissu hepatique d'oiseaux et de mammiferes. Les cellules du foie de
mammifere peuvent etre cultivees pendant de longues periodes et des cultures
clonales ont meme pu etre obtenues a partir de foie de rat nouveau ne (Coon,
1969; Lambiotte, Susor & Cahn, 1972; Chessebeuf et ah 1974); de foie de souris
(Evans et ah 1952; Waymouth, Chen & Wood, 1971); de foie humain foetal ou
adulte (Chang, 1954) et de foie de veau (Pieck & Kuyper, 1961).
Le but des recherches effectuees dans ce domaine etait d'etablir des cultures
massives de cellules hepatiques metaboliquement actives. Le plus souvent les
1
Adresse de Vauteur: Laboratoire d'Embryologie, Universite de Nantes, U.E.R. des
Sciences de la Nature, 38 Boulevard Michelet, B.P. 1044-44037 Nantes Cedex, France.
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E. HOUSSAINT
cultures de foie de mammifere sont constitutes de cellules presentant un aspect
epithelial. Cependant, bien que dans certains cas il ait ete possible de deceler
dans les cellules certaines proprietes des hepatocytes (production de proteines
seriques - Coon, 1969; Namba, Hirox & Kishimoto, 1968; Kaighn & Prince,
1971; Waymouth et al. 1971; Bissell & Tilles, 1971; presence de glycogeneGerschenson, Andersson & Molson, 1970; existence de la forme B de l'aldolase
- Chessebeuf et al. 1974), le plus generalement les caracteristiques biochimiques
et fonctionnelles du tissu hepatique disparaissent rapidement en culture (Evans
et al. 1952; Perske, Parks & Walker, 1957; Auerbach & Walker, 1959; Hillis &
Bang, 1962; Watanabe, 1966; Fogel, 1968; Rose, Kumegawa & Cattoni, 1968;
Alexander & Grisham, 1970; Lambiotte et al. 1972).
L'explantation de foie embryonnaire de poulet n'a donne lieu qu'a des
cultures de duree limitee ne supportant pas de repiquages successifs (Kuroda &
Nagatani, 1965; Angulo, 1968; Laschi & Rizzoli, 1968; Verne & Hebert, 1968;
Skea & Nemeth, 1969; Lambiotte, 1970; Verne, Hebert, Richshoffer & Roux,
1971). Elles sont constitutes au cours des premiers jours, de plages epitheliales
et de cellules d'aspect fibroblastique qui deviennent rapidement predominates.
Apres quelques jours, les plages epitheliales disparaissent et les fibroblastes sont
alors le seul type cellulaire de la culture.
II apparait done que les conditions de la culture cellulaire sont defavorables
au maintien de l'activite fonctionnelle de la cellule hepatique. Nous nous
sommes pose la question de savoir si les fibroblastes resultant de l'explantation
prolongee du foie d'oiseau derivaient exclusivement des cellules endotheliales et
conjonctives du tissu hepatique ou si certains d'entre eux pouvaient provenir de
cellules parenchymateuses morphologiquement et physiologiquement dedifferenciees. Dans ce dernier cas il etait interessant de rechercher si la dedifferenciation imposee par les conditions de la culture etait ou non reversible.
Dans des recherches precedentes de notre groupe le role de la composante
mesodermique du foie sur la differenciation de l'endoderme en hepatocytes et
sur le maintien de l'activite fonctionnelle de ces cellules a ete demontre (Le
Douarin, 1964; Le Douarin & Houssaint, 1967; Le Douarin, 1968; Houssaint,
1972). De plus il a ete etabli que l'ensemble du mesoderme des lames laterales
peut jouer le meme role que le mesenchyme propre du foie sur la differenciation
des cellules endodermiques en parenchyme hepatique (Le Douarin, Bussonnet
& Chaumont, 1968).
Dans le present travail nous avons etudie revolution morphologique et le
contenu en glycogene des cellules hepatiques d'embryons de caille de 8 jours
dissociees par action de la trypsine puis transplanted en milieu liquide. Le
temps de culture maximum a ete de 45 jours. Lorsque les cultures ont atteint
un etat fibroblastique homogene nous les avons associees en culture organotypique avec du mesenchyme d'origine splanchnique et nous avons pu montrer
que des cellules hepatiques fonctionnelles derivant de la culture primaire
apparaissent dans les explants.
Reversibilite de la dedifferenciation
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MATERIEL ET METHODES
(a) Cultures pritnaires de cellules hepatiques
Les cultures cellulaires sont realisees a partir de foies d'embryons de caille de 8
jours. Les organes preleves sterilement sont decoupes en minces fragments dans
du liquide de Tyrode puis incubes a 37 °C, pendant 30 min, dans une solution de
trypsine (NBC) a 0,25 % dans du liquide de Tyrode sans Ca ni Mg. Au cours de
cette incubation, la solution est agitee a trois reprises par pipetages repetes.
Apres nitration sur gaze, les cellules isolees ainsi que les petits agregats cellulaires sont laves deux fois dans du milieu de Eagle additionne de 20 % de serum
foetal de veau. Les cellules sont alors mises en culture dans des boites de Petri
Falcon de 35 mm de diametre, a raison de 106 cellules par ml de milieu. On
place le plus souvent une lamelle de verre dans le fond du recipient de culture.
Nous avons egalement realise des cultures dans des boites dont le fond est
recouvert d'un film de collagene. Nous utilisons le milieu MEM de Eagle
(Wellcome) additionne de 10 % de serum foetal de veau. De la penicilline
(100 unites/ml) et de la streptomycine (lOO^g/ml) sont ajoutees au milieu. Les
cultures sont incubees en atmosphere humide dans une etuve Nacional a
circulation gazeuse (95 % air-5 % CO2) et le milieu de culture est renouvele tous
les trois jours. Les cultures sont observees avec un microscope a contraste de
phase Wild M40.
(b) Obtention des mesenchymes hepatique et pulmonaire
Mesenchyme hepatique
La technique qui permet d'obtenir du mesenchyme hepatique a l'etat pur a
ete mise au point par Le Douarin (1964). On peut isoler la partie posterieure de
l'aire presomptive du mesenchyme hepatique en empechant experimentalement
la progression des cellules endodermiques dans ce territoire. Pour cela, on
excise un fragment de l'aire laterale au niveau des somites anterieurs, au-dessous
du niveau de la levre anterieure de l'ombilic intestinal, chez des embryons de
6 a 13 somites (Fig. 1 A). La progression caudale des cordons endodermiques est
arretee par Foperation. En arriere du territoire excise, du mesenchyme hepatique
se developpe; il est preleve du 6eme au 9eme jour de l'incubation. Le mesenchyme
hepatique ainsi obtenu est dans tous les cas totalement depourvu d'hepatocytes
(Fig. 1B). Ceci a ete eprouve au cours de nombreuses experiences realisees avec
le mesenchyme propre du foie isole experimentalement (Le Douarin, 1964;
Houssaint & Le Douarin, 1971; Houssaint, 1972) (Fig. 1A, B).
Mesenchyme pulmonaire
On preleve les ebauches pulmonaires sur des embryons de poulet de 4 jours.
La separation du mesenchyme et de la bronche est obtenue par action d'une
solution de trypsine a 1 % dans du liquide de Tyrode sans Ca ni Mg selon une
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E. HOUSSAINT
mh
B
Fig. 1. (A) Isolement du mesenchyme hepatique (mh). On excise un fragment de
l'aire laterale (ex) au niveau des somites anterieurs./: region ou le foie se differencie
normalement. (D'apres Le Douarin, 1964.) (B) Mesenchyme hepatique preleve sur
un embryon de poulet de 6£ jours. Les travees mesenchymateuses (tm) sont depourvues d'hepatocytes. Hematoxyline-eosine. x 315.
technique decrite par Dameron (1961). Le mesenchyme est rince dans du
Tyrode normal additionne de 10 % de serum de poulain pour epuiser la trypsine
avant la mise en culture.
(c) Cultures secondaires
Dans une premiere serie experimentale, les cellules hepatiques cultivees pendant 6 a 45 jours sont decollees de la lamelle de verre, a laquelle elles adherent, a
l'aide d'une spatule puis elles sont retransplantees soit sur un milieu semi-solide
(Wolff & Haffen, 1952) soit sur un filtre millipore pose sur une grille de type
Trowell. Dans ce dernier cas, le milieu a la meme composition que celui que nous
utilisons pour les cultures primaires de cellules hepatiques (milieu MEM de
Eagle +10 % de serum foetal de veau). L'explant est cultive pendant 3 a 4 jours
dans ces conditions puis fixe pour l'examen histologique.
Dans une deuxieme serie experimentale, nous avons realise des associations de
cultures primaires avec le mesenchyme hepatique ou pulmonaire. La culture
primaire que Ton a laisse evoluer pendant 6 a 45 jours, est alors placee en culture
organotypique au contact d'un mesenchyme hepatique ou pulmonaire. Cette
association est realisee sur un milieu de Wolff et Haffen ou sur un filtre millipore
Reversibilite de la de differentiation
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Culture primaire
(6 a 45 jours)
mh
Culture
secondaire
(3 a 5 jours)
Greffe coelomique
ou
Greffe chorioallantoidienne
Fig. 2. Realisation de cultures secondaires par association de cultures primaires de
6 a 45 jours avec du mesenchyme hepatique. L'association est realisee in vitro
pendant 3 a 4 jours. Dans certains cas elle est prolongee en greffe in ovo pendant
6 jours.
reposant sur une grille de type Trowell. L'explant est cultive pendant 3 a 4 jours
puis fixe par le liquide de Gendre. Dans certaines series experimentales, l'explant
est cultive 1 ou 2 jours puis retransplante in ovo pendant 6 jours dans le ccelome
d'un embryon de poulet de 3 jours d'incubation ou sur la membrane chorioallantoidienne (CAM) d'un embryon de 6 jours (Fig. 2).
(d) Detection du glycogene
Les lamelles portant les cultures cellulaires, ainsi que les explants resultant de
la combinaison des cultures primaires et du mesenchyme hepatique ou pulmonaire sont fixes par le liquide de Gendre a - 20 °C pendant 10 min, puis 20
min a 4 °C. La deshydratation est egalement effectuee a 4 °C. Des resultats
anterieurs ont en effet montre que la fixation par le liquide de Gendre pratiquee
a basse temperature et tres rapidement, permet de preserver de tres petites
quantites de glycogene (Houssaint et Le Douarin, 1974). Les tissus sont
ensuite soumis a la reaction a l'acide periodique Schiff (APS) selon la methode
de Hotchkiss-MacManus (1948), en vue de la detection du glycogene, puis
post colores par l'hematoxyline de Groat.
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E. HOUSSAINT
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RESULTATS
/. Evolution des cultures primaires d'hepatocytes
Observation au microscope a contraste de phase
Quelques heures apres leur mise en culture, les cellules adherent a la lamelle de
verre placee au fond de la boite de Petri. Dans les cultures de 12 h on observe de
petites plages epitheliales constitutes de 8 a 10 cellules arrondies pourvues d'un
gros nucleole. Entre ces plages sont dispersees quelques volumineuses cellules
isolees d'aspect fibroblastique possedant un noyau hypertrophie. Ces cellules
se multiplient rapidement et apres 48 heures les plages epitheliales sont beaucoup
plus larges tandis que les cellules fibroblastiques deviennent beaucoup plus
nombreuses (Fig. 3 A).
A partir du 4 erne jour, les cellules de type fibroblastique prennent de plus en
plus d'importance par rapport aux cellules epitheliales. Apres 96 h, la culture
forme une couche continue constitute en majorite de fibroblastes. On reconnait
encore a ce stade quelques grandes plages de cellules epitheliales dont le cytoplasme apparait charge de vacuoles. Au bord des plages epitheliales on observe
des cellules d'aspect intermediate a noyau ovale qui semblent s'echapper.
Les cellules continuent a se multiplier activement formant meme plusieurs
couches superposees dans certaines zones. Apres 6 a 7 jours les cellules epitheliales ne sont pratiquement plus decelables et la culture revet un aspect
uniquement fibroblastique (Fig. 4A) qu'elle gardera par la suite. Les cultures
realisees sur substrat de collagene montrent la meme evolution. Certaines cultures ont ete prolongees jusqu'a 45 jours. Des essais de repiquage, par dissociation de la culture primaire sous Faction de la trypsine, se sont soldes par un
echec.
L'evolution des cultures de cellules hepatiques d'embryons de caille permet
done d'observer une disparition progressive des cellules epitheliales tandis que
les fibroblastes deviennent les elements dominants puis exclusifs de la culture.
FIGURES 3 ET 4
Cultures primaires realisees a partir de foies d'embryon de caille de 8 jours.
Fig. 3(A). Culture de 48 h observee au microscope a contraste de phase. Quelques
volumineux fibroblastes (/) sont observes au bord des plages epitheliales (c.ep). x 540.
(B). Culture de 48 h traitee par la reaction a TAPS. Certaines cellules epitheliales
(c.ep.) sont riches en glycogene, d'autres en sont deja depourvues. La reaction est
negative au niveau des fibroblastes (/). APS-hematoxyline. x 125.
Fig. 4(A). Culture primaire de 6 jours observee au contraste de phase. Toutes les
cellules ont un aspect fibroblastique. x 540.
(B). Culture primaire de 6 jours traitee par la reaction a TAPS. La reaction est
negative. Le cytoplasme des fibroblastes contient seulement des mucopolysaccharides qui ne disparaissent pas apres action de l'amylase salivaire. APS-hematoxyline.
x315.
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Reversibilite de la dedifferenciation
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Detection du glycogene dans les cultures d'hepatocytes
La reaction a TAPS appliquee aux cultures de 24 et 48 h est fortement positive
au niveau des plages epitheliales (Fig. 3B) et le controle a l'amylase salivaire
montre que le polysaccharide present dans les cellules est du glycogene. Apres
3 jours de culture, seules quelques unes des cellules epitheliales constituant les
plages sont APS positives et apres 4 jours on n'observe plus aucune trace de
glycogene. Dans les cultures plus agees, le reactif de Schiff permet de raettre
en evidence des polysaccharides resistants a Faction de 1'amylase salivaire
(Fig. 4B).
//. Realisation de cultures secondaires
Dans une premiere etape, nous laissons evoluer des cultures histiotypiques
pendant 6 a 45 jours, puis le film cellulaire detache a l'aide d'une spatule est
place en culture organotypique sur un milieu de Wolff et Haffen ou sur un filtre
supporte par une grille de type Trowell. Au bout de 3 jours de culture l'observation histologique des explants, apres fixation par le liquide de Gendre et
traitement par la reaction a TAPS, montre que les cellules degenerent rapidement. Elles apparaissent dispersees dans une substance fondamentale riche en
polysaccharides. Aucune structure de type hepatique n'est reconstitute dans ce
cas et les cellules ne possedent aucune des caracteristiques des cellules parenchymateuses. En particulier elles ont un noyau de petite taille et sont totalement
depourvues de glycogene.
Dans un deuxieme temps, nous avons associe des cultures cellulaires primaires
de 6 a 45 jours au mesenchyme hepatique ou pulmonaire.
Lorsque la culture primaire est associee au mesenchyme hepatique apres 6 a
22 jours de culture, l'examen histologique des explants ou des greffons permet
d'observer que des hepatocytes sont presents au sein du mesenchyme hepatique.
Us sont caracterises par une structure de type epithelial et un noyau contenant
FIGURE 5
Cultures secondaires: association de cultures primaires avec du mesenchyme
hepatique d'embryon de Poulet. On observe au sein du mesenchyme des cellules
hepatiques (ch) riches en glycogene (g).
(A). Culture primaire de 6 jours. Duree de la culture secondaire: 3 jours en culture
in vitro. APS-hematoxyline. x 900.
(B). Culture primaire de 10 jours associee au mesenchyme hepatique pendant
3 jours en culture in vitro. APS-hematoxyline. x 1100.
(C). Culture primaire de 12 jours associee au mesenchyme hepatique pendant 4 jours
en culture in vitro. Les cellules hepatiques possedent le volumineux nucleole caracteristique des cellules de caille (fleches) et elles sont riches en glycogene (g).
APS-hematoxyline. xll50.
(D). Culture primaire de 18 jours associee avec du mesenchyme hepatique pendant
24 h en culture in vitro puis pendant 6 jours en greffe dans le coelome d'un embryon
de poulet de 3 jours. Les cellules hepatiques sont organisees en cordons (ch) separes
par des sinusoides sanguins (ss). APS-hematoxyline. x 600.
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Tableau 1. Recuperation de la capacite de synthetiser du glycogene par des cultures
primaires de foies d'embryons de caille de 8 jours associees au mesenchyme
hepatique ou pulmonaire d'embryons de poulet
Duree de la culture primaire
A
(
Culture secondaire 6 a 10 jours
Culture primaire
26 cas positifs
sur 33
+
mesenchyme
hepatique
Culture primaire
4 cas positifs
sur 10
+
mesenchyme
pulmonaire
11 a 18 jours
19 a 22 jours
22 a 45 jours
12 cas positifs
sur 38
12 cas positifs
sur 54
21 cas negatifs
2 cas positifs
sur 6
4 cas positifs
sur 10
5 cas negatifs
un nucleole particulierement volumineux comme c'est le cas dans les cellules
parenchymateuses de foie de caille normal. II est possible en effet de reconnaitre
les cellules de caille des cellules de poulet apres une simple coloration du noyau
par l'hematoxyline de Groat (Le Douarin, 1969, 1973). De plus, la reaction a
TAPS montre que leur cytoplasme est tres riche en glycogene (Fig. 5 A a D).
Lorsque l'association est realisee in vitro, le tissu hepatique forme le plus souvent
un ou deux ilots compacts au voisinage desquels on observe des cellules qui
possedent un noyau de petite taille et qui sont depourvues de glycogene. Lorsque
l'association est prolongee en greffe in ovo, le tissu hepatique qui se reconstitue a
une structure proche de celle du foie normal. II est alors forme de cordons
d'hepatocytes separes par des sinusoides sanguins (Fig. 5D). Des resultats
similaires ont ete obtenus dans les associations de mesenchyme pulmonaire avec
des cultures primaires de foie de 6 a 22 jours (Tableau 1).
Lorsque la culture primaire a ete prolongee entre 22 et 45 jours, aucune cellule
hepatique n'a ete observee dans les cultures secondaires quel que soit le type
d'association realisee (Tableau 1).
CONCLUSION ET DISCUSSION
Lorsque du tissu hepatique differencie d'embryons de caille de 8 jours est
cultive in vitro les cellules subissent des transformations morphologiques et
physiologiques profondes. Des plages de cellules d'aspect epithelial subsistent
quelques jours puis font place a des cellules fibroblastiques qui deviennent
apres 6 jours le seul constituant de la culture. Simultanement, les
cellules se modifient du point de vue physiologique et le glycogene decelable dans les plages epitheliales disparait totalement a partir du 4eme jour
de culture.
La perte des fonctions et des caracteristiques structurales des constituants
Reversibilite de la dedifferenciation
237
cellulaires du foie en culture in vitro a ete tres generalement constatee par divers
auteurs quelle que soit l'espece utilisee. Sauf dans quelques cas particuliers tels
que les cultures de foie humain etablies par Kaighn & Prince (1971) dans lesquelles on a pu mettre en evidence la synthese d'une molecule antigeniquement
semblable a la serum albumine, les cellules d'aspect fibroblastique ne presentent
pas les proprietes biochimiques caracteristiques des hepatocytes. La 'transformation' fibroblastique des cellules de foie en culture pose le probleme d'une
dedifferenciation morphologique et fonctionnelle possible des elements parenchymateux. On peut concevoir en effet que dans le cas du foie d'oiseau les
fibroblastes derivent non seulement des cellules mesenchymateuses mais correspondent aussi a des hepatocytes apparemment dedifferencies.
Cette conception s'est revelee exacte. En effet, si une culture primaire de foie
purement fibroblastique est associee a du mesenchyme splanchnique d'origine
hepatique ou pulmonaire, elle fournit des groupes de cellules parenchymateuses
riches en glycogene.
L'association interspecifique d'une culture primaire de foie de caille avec du
mesenchyme hepatique de poulet permet de se rendre compte que les cellules
parenchymateuses derivent de la culture fibroblastique primaire de caille. Les
proprietes du noyau chez la caille permettent en effet de reconnaitre les cellules
de cette espece de celles du poulet (Le Douarin, 1969, 1973).
Dans les cultures secondaires obtenues par l'association des 'fibroblastes'
avec le mesenchyme splanchnique, on constate que les cellules contenant du
glycogene sont organisees en un epithelium et sont en contact avec les elements
mesenchymateaux. Ainsi, l'architecture tissulaire caracteristique du foie est
reconstitute en meme temps qu'est retablie dans les hepatocytes la capacite
d'accumuler le glycogene. Le role des contacts specifiques, etablis entre les cellules
d'une ebauche, sur la differenciation et l'activite fonctionnelle des elements qui la
composent a ete demontre dans d'autres systemes tels que le tissu cartilagineux
(Holtzer & Abbott, 1968) et la retine nerveuse (Moscona, 1971). Dans le cas du
foie, il est vraisemblable que l'invasion du tissu mesenchymateux par les cellules
endodermiques s'accompagne de processus de division. Quoiqu'il en soit, ces
observations montrent que la dedifferenciation morphologique apparente des
cellules parenchymateuses qui s'effectue en culture n'est pas irreversible.
L'association des cultures primaires avec le mesenchyme hepatique organise
permet en effet de faire reapparaitre dans ces cellules les caracteres phenotypiques specifiques du parenchyme hepatique. II est interessant de souligner a
cet egard que 1'etat de differenciation fonctionnelle des hepatocytes n'est stable
que si les cellules sont placees dans des conditions d'environnement favorables.
Le mesenchyme splanchnique qui s'est revele indispensable a la differenciation
de l'endoderme hepatique (Le Douarin, 1964; Le Douarin & Houssaint, 1967;
Le Douarin, 1968; Houssaint, 1972) joue done par la suite un role fondamental
dans le maintien des caracteres de la differenciation. Des experiences anterieures
ont montre que ^interposition entre l'endoderme et le mesenchyme hepatique
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E. HOUSSAINT
d'une seule couche de mesenchyme somitique suffit a empecher la differentiation
de Pendoderme en hepatocytes (Fontaine & Le Douarin, 1972). Les resultats que
nous rapportons ici montrent que seules les cellules qui enhavissent le mesenchyme hepatique ou pulmonaire recuperent une morphologie et un fonctionnement de type hepatique. 11 semble done que les interactions cellulaires s'exercant
entre les deux constituants du foie, aussi bien au cours de l'organogenese que dans
le tissu hepatique differencie, ne peuvent s'effectuer que si les cellules etablissent
entre elles des contacts etroits.
RESUME
Des cultures cellulaires primaires sont etablies a partir de foies d'embryons de caille de 8
jours. Au cours des trois premiers jours, la culture est constitute de plages epitheliales
separees par quelques cellules d'aspect fibroblastique. Le cytoplasme des cellules epitheliales
est alors riche en glycogene decelable par la reaction histochimique a l'acide periodique Schiff
(APS) controlee par le test de Pamylase salivaire. Au cours de revolution de la culture, les
elements fibroblastiques deviennent de plus en plus nombreux et apres 6 a 7 jours, les plages
epitheliales ont disparu et la culture est totalement fibroblastique. Aucune trace de glycogene
ne peut alors y etre decelee par la methode a TAPS. La culture qui garde ensuite cet aspect a
pu etre prolongee dans certains cas jusqu'a 45 jours.
Des cultures primaires de 6 a 45 jours, ayant acquis un aspect purement fibroblastique, ont
ete associees a un mesenchyme d'origine splanchnique, hepatique ou pulmonaire. Ces cultures
secondaires sont realisees in vitro pendant 3 a 4 jours, soit sur un milieu de Wolff et Hafifen
soit sur un filtre millipore pose sur une grille de type Trowell. Dans certains cas, l'association
est maintenue pendant deux jours en culture in vitro puis elle est prolongee en greffe in
ovo pendant 6 jours. L'observation des cultures secondaires, fixees par le liquide de Gendre
et traitees par la reaction a TAPS, montre que des cellules hepatiques ayant une structure
epitheliale caracteristique et dont le cytoplasme est riche en glycogene sont presentes dans
les explants.
On peut conclure de cette observation que certains fibroblastes de la culture primaire
sont en fait des cellules parenchymateuses apparemment dedifferenciees. Ces cellules gardent
cependant la capacite de reexprimer leur determination initiale quand on les associe a un
mesenchyme splanchnique.
Le role des contacts cellulaires dans le maintien de la differentiation est envisage dans la
discussion.
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(Regu le 16 juin 1975, revise le 23 octobre 1975)