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UNIVE.R8ITE CHEIKH ANTA DIOP DAKAR
FACULTE DES SCIENCES ET TECHMQUES
DEPARTEMENT DE BIOLOGIE VEGETALE
THESE
POUR L'OBTENTION DU GRADE DE DOCTEUR DE 3ème CYCLE DE BIOLOGIE
VÉGETALE
Présentée par
l\1me Ndèye Fatou Diaw ép. GUENE
Sujet:
.------
._------~._-----------------,
Utilisation des inoculums de rhizobium pour la
culture du haricot (Phaseolus vul aris) au Séné al.
Soutenue le 22 Juillet 2002
devant la commission d'Examen composée de :
Président:
M. Amadou Tidiane BA, Professeur titulaire, UCAD
Directeur:
M. Mamadou GUEYE, Chercheur,
l'~SRA
Rapporteur: M. Ibrahima NDOYE, Maître de conférence, UCAD
Examinateur: M. Abdoulaye Tahir Diop, Maître assistant, UCAD
Examinateur: M. Marc Neyra Chargé de recherche, l'FRD
n
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Im~mOIre
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...J monpere
• - .~
A la
Amadou Lamine
A ma mère
A mon mari et mes enfants
A mes frères et soeurs
Au monde paysan
A mes amis
.....
~
REMERCIEMENTS
Ce travail a été réalisé à l'Institut Sénégalais de Recherche Agricole (ISRA), laboratoire de
~
microbiologie du centre ISRAIIRD de Bel Air et l'Institut National de Recherche Agricole (INRA) en
France (UMR: Sols Symbioses Environnement). Je tiens tout d'abord à remercier le Directeur
Général de l'ISRA.
JI m'est agréable d'exprimer ici ma sincère reconnaissance à tous ceux qui de près ou de loin, ont
contribué à la réussite de ce travail. Ma reconnaissance va tout d'abord à :
* Monsieur Mamadou Gueye, chercheur
à l'ISRA qui a suivi ce travail pas à pas et qui m'a
beaucoup aidée par ses compétences scientifiques. Je tiens à lui exprimer ma reconnaissance pour
l'appui qu'il m'a toujours assuré depuis //lon inscription au Diplôme d'Etudes Approfondies
(DEA) jusqu'à aujourd 'hui.
* Monsieur Ibrahima Ndoye maître de conférence
à l'université Cheikh Anta Diop de Dakar,
pour avoir accepté d'être le rapporteur de celle thèse. Ses remarques et suggestions nous ont été
d'un grand apport. Qu'il soit assuré de m 'a profonde gratitude.
* Monsieur le Professeur Amadou Tidiane Bâ, chef du département de Biologie Végétale de la
faculté des sciences et techniques de l'université Cheikh Anta Diop de Dakar, qui préside ce jury,
je tiens à lui exprimer toute ma reconnaissance.
* Monsieur Marc Neyra chargé de recherche
à l'IRD et responsable du laboratoire de
microbiologie de Bel Air, pour l'honneur qu'il m 'a fait en acceptant de participer à ce jury. Sa
simplicité et son humanisme ont toujours forcé notre admiration.
* Monsieur Abdoulaye Tahir Diop maître assistant
à l'université Cheikh Anta Diop de Dakar
pour avoir accepté de juger ce travail. Ces conseils pratiques et sa disponibilité m'ont été très
utiles.
* Monsieur Jean Jacques Drevon chargé de recherche
à l'Institut National de Recherche
Agronomique de Montpellier, qui m'a accueillie dans son laboratoire. Qu'il trouve ici
l'expression de ma profonde gratitude.
Sans l'aide d'expert en statistiques, ce travail n'aurait sans doute pas abouti. Mr Ciré Sali, bio
métricien à l'ISRA a gentiment accepté de m'initier aux logiciels d'analyse statistique avec
l'assistance de Madame Ndiaye Marie Claire Dasylva qui, en plus de son assistance technique a suivi
de près le traitement statistique des données.
~
./
Ce travail n'aurait pu être mené à bien sans une prééieuse assistance technique. J'adresse tous mes
remerciements à l'ensemble du personnel du laboràtoire de microbiologie mais aussi. à Madame
Hélène Payré assistante de recherche au laboratoire des symbiotes racinaires de Montpellier. Un
,
~
'. grand remerciement à Omar Touré qui m 'a initiée aux techniques de microbiologie.
Je tiens à remercier tous les stagiaires du laboratoire de microbiologie.
Enfin, j'exprime ma gratitude à toutes les agences qui ont jinancièrement contribué à la réalisation de
mes travaux particulièrement:
* l'Institut~Sénégalais de Recherche Agricole (fSRA) driffl j'ai été la première~à- bénéjicier d'une
allocation de recherche, inaugurant ainsi une nouvelle approche dans la politique scientifique de
l'fSRA.
* l'agence internationale pour l'énérgie atomique (AlEA), pour le biais de son projet RAF-S-045
ajinancé mon séjour dans le laboratoire des symbiotes racinaires de Montpellier.
*1 'institut du Sahel/CILSS, à travers son pôle « Gestion des Ressources Naturelles - Système de
Production »..
./
./ \
\
Nom: DIAW ép:'~~NE . .
Prénoms': Ndèye Fatou
Titre: Utilis'ation des ino~ulums de rhizobium pour l'amélioration de la prodtÎ~tion du haricot
(Phaseolus vulgaris) dans la zone des Niayes au Sénégal.
~
~
~
~
Résumé:
Le haricot est une légumineuse cultivée au Sénégal avec de l'engrais azoté apporté en très
grande quantité (250 à 300 kg urée/ha). Ceci constitue une source de pollution en nitrate de la
nappe phréatique, par suite du lessivage des sols sableux dans cette zone. Une des alternatives
à l'utilisation de ces engrais azotés serait l'inoculation du haricot avec des souches de
Rhizobium.
Dans le but de substituer les souches de rhizobiums aux engrais azotés, le besQi(l~u haricot à
être inoculé a été confirmé dansune-eXperience conduite en station expérimentale.
L'inoculation du haricot avec la souche de Rhizobium rSRA 353 a permis d'améliorer les
rendements en gousses de 52% par rapport au témoin non inoculé. L'inhibition de la
nodulation par le nitrate étudiée avec six souches de Rhizobium a montré que la souche rSRA
353, induisait mieux la nodulation du haricot en présence de 2,5 mM de nitrate. Toutefois,
compte tenu de la pauvreté des sols des Niayes en phosphore, l'apport de différentes doses de
phosphore a montré une stimulation de 17% de la nodulation pour les doses de 36 et 48 kg
P20s/ha et une amélioration de la quantité d'azote fixé de 63% quelle que soit la dose de
phosphore appliquée.
Le dichlofenthion-thiram (OCT) est un fongicide généralement employé pour enrober les
semences de haricot. Son effet sur l'infectivité des souches de Rhizobium rSRA 353 ou rSRA
554 a été étudié: rSRA 353 a été plus sensible au OCT que rSRA 554. Aucun nodule n'a été
formé avec l'utilisation de rSRA 353 chez les plantes dont les semences ont été traitées avec
le fongicide. Par contre avec la souche rSRA 554, la nodulation n'a pas été inhibée mais
diminuée de 46% chez les plantes dont les semences ont été traitées au OCT avec cependant
une fixation d'azote (%Ndfa et Ndfa) non affectée par le fongicide.
L'action de la souche bactérienne productrice de facteurs de croissance pour les plantes
(PGPR) Pseudomonas f1uorescens 6F16 n'a été positive ni sur l'infectivité des souches de
Rhizobium rSRA 353 et rSRA 554 ni sur la croissance de la variété Nérina. Par contre la coinoculation avec le champignon mycorhizien Glomus aggregatum a amélioré la nodulation de
4 à 9 fois, la croissance (biomasse) d'environ 30%, la teneur et la quantité en phosphore dans
les parties aériennes respectivement de 40% et 72%.
Enfin la validation dans quatre localités de la zone Niayes des inoculums produits avec les
souches de Rhizobium sélectionnées a confirmé la possibilité de remplacer les pratiques
paysannes par les inoculums de Rhizobium dans certaines localités. En effet, avec l'utilisation
des inoculums de Rhizobium rSRA 353 et rSRA 554 les rendements en gousses obtenus ont
été équivalents à ceux des pratiques paysannes. Par rapport aux parcelles témoins ce
rendement a été supérieurs de 64%. Cependant dans d'autres localités les souches indigènes
ont été plus compétitives que les souches rSRA 353 et rSRA 554. Cela nécessite, pour
chacune de ces localités, une sélection d'autres souches de Rhizobium.
Mots-clés: fixation biologique de l'azote, fongicide, Glomus aggregatum, mycorhize à
arbuscules, [SN, nitrate, Phaseolus vulgaris, phosphore, Pseudomonas f1uorescens,
Rhizobium.
IV
SOMMAIRE
,
"'INTRODUCTION
""'
1
CHAPITRE 1: REVUE BIBLIOGRAPHIQUE
1. Le haricot.
1.1.Description morphologique et botanique du haricot.
1.2.0rigine et extension de la culture du haricot..
1.3. Importance économique du haricot..
1.4. Conditions de culture du haricot.
-- 1.5. Nutrition
azotée
chez le haricot..
- _--
,
-
..
3
3
5
7
7
8
2. Les rhizobiums associés au haricot
2.1. Historique
2.2. Classification actuelle
9
9
3. La symbiose fixatrice d'azote................................................................
3.1. La nodulation..............................................................................
3.2. Le métabolisme de la fixation d'azote
3.2.1. La nitrogénase
3.2.2. Importance du phosphore dans la fixation atmosphérique d'azote
3.3. Facteurs de l'environnement (cas du nitrate)
3.4. Potentiel fixateur d'azote du haricot.
10
10
12
12
14
14
16
4. Mesure de la fixation
4.1. Méthodes directes
4.2. Méthodes indirectes
4.2.1. Activité réductrice d'acéthylène (ARA)
4.2.2. Uréides
9
;
'"
5. Amélioration de la fixation d'azote: inoculation des plantes
17
17
, 18
18
18
19
6. AméHoration de la fixation d'azote: Inoculation avec des bactéries stimulatrices
20
de croissance: cas des Pseudomonas
CHAPITRE II : MATERIEL ET METHODES
1. Les sols
22
2. Matériel végétal
;
2.1. Les variétés de haricot vert.
"
2.2. Le soja
2.3. Germination des graines
2.4. Culture en tube Gibson..................................................................
2.5. Culture en flacon sérum et en bac
2.6. Culture en jarre-Léonard... . .. . .
. . . . . . .. . . . .. .. . . . . . . .
.. . .. .
2.7. Culture en pots...........................................................................
2.8. Culture au champ
22
22
24
24
24
25
25
25
25
3. Les souches de microorganisme............................................................. 27
27
3.1. Les souches de Rhizobium
3.2. La souche de champignon mycorhizien Glomus aggregatum
3.3. Souche de Pseudomonasfluorescens
27
27
"
4. Production d'inoculum de Rhizobium....................................................
4.1. Production d'inoculum de Rhizobium
4.1.1. Inoculum liquide..............................................................
4.1.2. Inoculum solide
4.2. Contrôle de la qualité des inoculums de Rhizobium produits
4.2.1. Détermination du nombre de Rhizobium des inoculums
4.2.2. Détermination de la dose d'application des inoculums produits
5. Coloration des fragments de racines mycorhlzées
28
28
28
28
28
28
29
~. 31
6. Estimation de l'azote fixé par la méthode de dilution isotopique Is N
6.1. Définition
6.2. Principe de la dilution..........................................................
31
31
31
7. Inoculation du haricot avec des souches de Rhizobium en station expérimentale. 33
8. Evaluation de la fixation d'azote chez le haricot vert..
8.1. Potentiel fixateur d'azote du haricot
8.2. Azote réellement fixé
33
33
34
9. Influence du phosphore dans l'inoculation au champ
34
10. Effet du N03 - sur la nodulation du haricot vert........................................
10.1. Expériences en jarres-Léonard
10.2. Expériences en condition d'hydroaéroponie.........................................
10.2.1. Variabilité liée à la souche de Rhizobium
10.2.2. Variabilité liée à la plante
10.2.3. Interaction phosphore et nitrate...........
35
35
35
35
36
36
Il. Effet des fongicides sur la nodulation
36
12. Effet de la co-inoculation Rhizobium, Mycorhize et Pseudomonas jluorescens ..... 37
13. Mise en évidence de la production de substance inhibitrice par la
souche de Pseudomonasejluorescens 6FI6
38
14. Essais multilocaux d'inoculation du haricot avec des souches de Rhizobium ...... 38
15. Etude de la compétitivité
14.1. Extraction et purification d'ADN nodulaire
14.2. Dosage de l'ADN extrait
14.3. Amplification enzymatique de l'IGS 16S/23S
14.4. RFLP sur les fragments amplifiés
39
39
40
40
41
CHAPITRE III: RESULTATS
I. Réponse du haricot à l'inoculation avec des souches de Rhizobium.... .
1.1
1.2
Sélection des associations à fort potentiel fixateur d'azote
Sélection des associations à fort capacité réelle de fixation d'azote
42
42
43
,
1.2.1. Variabilité génétique dans le rendement et la nodulation entre variétés.... 47
1.2.2. Variabilité génétique dans la fixation biologique d'azote entre variétés ... 47
,
2: Effet du phosphore sur la croissance, la nodulation et la fixation d'azote chez la
variété Nérina associée à la souche de Rhizobium ISRA 353
50
50
2.1. Croissance, rendement en gousses et nodulation du haricot
2.2. Teneur en phosphore et excès isotopique en azote-15
50
3. Effet du nitrate sur la symbiose Rhizobium-haricot.
3.1. Sur la nodulation
3.2. Effet du macrosymbionte sur la nodulation sous nitrate
- 3.3. Effet du macrosymbionte sur la croissance N 2-dépendante
;7
~
3.4. Interaction phosphore nitrate sur la nodulation et la croissance du haricot
4. Effet du traitement des graines avec un fongicide sur l'infectivité et l'effectivité
des souches de Rhizobium ISRA 353 et ISRA 554
4.1. Infectivité et effectivité de la souche de Rhizobium ISRA 353
4.2. Infectivité et effectivité de la souche de Rhizobium ISRA 554
52
52
54
54
56
59
59
59
5. Co-inoculation du haricot avec les souches de Rhizobium ISRA 353, ISRA 554 associées
aux souches de P. fluorescens 6F16 et de Glomus aggregatum
"
5.1. Inoculation avec la souche de Rhizobium ISRA 353
5.1.1. Croissance et nodulation du haricot
5.1.2. Teneur en azote et en phosphore
5.1.3. Excès isotopique en azote-15, proportion et quantité d'azote fixé
dans les parties aériennes
5.2. Inoculation avec la souche de Rhizobium ISRA 554
5.3. Production de substance par P.fluorescens
62
62
67
6. Essais multilocaux d'inoculation du haricot avec des souches de Rhizobium
67
7. Compétitivité des souches de Rhizobium ISRA 554 et ISRA 353
71
IV : DISCUSSION
73
CONCLUSION ET PERSPECTIVES
83
REFERENCES BIBLIOGRAPIQUES
86
ANNEXES
96
61
61
61
61
INTRODUCTION
Introductio/l
L'azote est un constituant essentiel des acides aminés ct des protéines ct est par
conséquent un élément minéral nécessaire pour tout organisme vivant. L'azote existe en très
grande quantité dans l'atmosphère: l'air en renferme 78% (Tableau 1). Il constitue le
principal facteur limitant la croissance de la plante qui ne peut l'utiliser que sous forme
combinée (nitrate, ammoniaque ou urée) car ne pouvant pas convertir l'azote gazeux de
l'atmosphère en forme ammoniacale. Cc processus est sous ]a dépendance de certains
organismes procaryotes (bactéries ct cyanobactéries) capables de réduire l'azote (N 2) en
ammoniac (NHJ) grâce au complexe enzymatique nitrogénasique qu'ils renferment. Ce
processus est appelé Fixation Biologique de l'Azote (FBA).
Tableau
J :
Les réserves d'azote dans la nature
Siége
Atmosphère
Terre, mers, sédiments marins
Roches sédimentaires et primaires
Quantité (tonnes)
3,9 109
24,5 10 6
193,4 105
La FBA représente environ 10 8 t N par an dans le cycle biologique de l'azote, soit la moitié
de la fixation totale de N2 sur terre (Kaminski, 1991).
Différents micro-organismes en sont responsables. Ce sont : (i) les micro-organismes
libres tels Azospiriffum, Azotobacter, K/ebsie/a, des endophytes fixateurs associés par
exemple à la canne à sucre; (ii) les micro-organismes symbiotiques telles que les bactéries du
genre Rhizobium, qui s'associent aux légumineuses, ou les actinomycètes du genre Frankia
s'associant aux non légumineuses comme Casuarina, ou encore les cyanobactéries
filamenteuses telles que Anabaena azoffae qui s'associe à la fougère aquatique Azoffa.
Dans notre travail, nous avons étudié la F!3A dans le cas précis du haricot vert (Phaseo/us
vu/garis), une légumineuse tropicale qui s'associe aux bactéries du genre Rhizobium. Le
haricot constitue un aliment de base pour environ 500 millions de personnes, en Amérique du
sud, en Afrique et en Chine. Sa consommation est liée à sa forte teneur en protéine (25%).
Cependant, pour certains pays, le haricot est une culture de rente. Au Sénégal par exemple,
80% de la récolte est exporté vers les pays d'Europe du nord qui fournissent aux producteurs
les intrants agricoles nécessaires: semences enrobées de fongicides, engrais, produits
phytosanitaires. Le haricot est souvent cultivé dans des zones où plus de 50% des sols sont
pauvres en azote et en phosphore, deux éléments majeurs dans la nutrition minérale d'une
Introdûction
plante. Dans la zone des Niayes (Tableau 6) qui est la principale zone de culture du haricot
vert au Sénégal, le haricot est cultivé avec un très grand apport d'engrais azoté: 250 à 300 kg
urée/ha (Diouf, 1997). Ceci est une des causes de la pollution en nitrate de la nappe
phréatique. La FBA y revêt donc un intérêt particulier car elle offre une alternative à l'emploi
des engrais azotés trop coûteux et très polluant pour les eaux souterraines.
Ainsi l'objectif général de notre étude est d'améliorer les revenus et le statut nutritionnel des
populations de la zone des Niayes en maximisant la FBA chez le haricot, une des principales
sources de protéine dans cette zone.
-NoS" objectifs spécifiques sont:
~
Sélectionner des souches de Rhizobium aptes à induire la nodulation du haricot en
présence de nitrate,
~
Evaluer, dans les conditions de culture du haricot les performances symbiotiques des
souches de Rhizobium sélectionnées.
~
Améliorer les performances symbiotiques du haricot associé à des souches de
rhizobium par action des rhizobactéries productrices de facteurs de croissance pour la
plante et des champignons mycorhiziens,
~
Valider les inoculums de rhizobuim pour la culture du haricot dans la zone des
Niayes.
2
Il
CHAPITRE l
REVUE BIBLIOGRAPHIQUE
Revue bibliographique
1. Le haricot
La famille des Leguminosae a une distribution mondiale et est estimée entre 16000 et
19000 espèces reparties dans environ 750 genres. Les taxonomistes, sur la base de différences
florales, avaient divisé cette famille en trois sous familles distinctes, les Mimosacées, les
Caesalpinacées et les Papilionacées.
Le genre Phaseolus appartient à la sous tribu des Phaseolinae, elle-même incluse dans la
tribu des Phaseoleae qui font partie de la sous-famille des Papilionacées. Ce genre Phaseolus
renferme environ 55 espèces (Tableau 2). Les caractéristiques botaniques de cinq de ccs
espèces ont été décrits: P. coccineus, P. acut!folius; P. lunatus, P. polyanthus et P. vulgaris.
1.1. Description morphologique et botanique du haricot
Le haricot est une plante herbacée annuelle à croissance déterminée ou indéterminée. A la
germination, la plante est généralement à racines pivotantes mais peu après des racines
adventives longues de 10 à 15 cm se développent sur toute la racine principale. Al' issue de la
germination, épigée, il y a f0n11ation de deux feuilles opposées simples puis des feuilles
trifoliées à folioles cordifonnes. Les fleurs sont portées en grappes axillaires et terminales.
Elles sont zygomorphes composées de deux pétales en carène, deux pétales latéraux ailés et
un pétale standard disposé extérieurement. La couleur de la fleur est généralement
indépendante de celle des graines, mais l'association entre fleurs particulières et couleur des
graines est connue. Ces fleurs peuvent être blanches, roses ou violettes (souvent rouges chez
P. Coccineus). La fleur contient dix étamines et un sac ovarien multiple. Dans la plupart des
cas, la fleur réalise une autofécondation et développe un fruit ou gousse droit ou légèrement
courbé. Les graines, sans albumen, sont riches en protéines et en glucides (Tableau 3). Elles
sont rondes, ellipticales quelque peu aplaties ou arrondies. La période de remplissage des
gousses peut s'étendre du 23" jour dans le cas des variétés déterminées à prés de 50 jours chez
les variétés indéterminées et grimpantes
3
Il
Revue bibliographique
~
Tableau 2 : Taxonomie des Phaseolae comestibles (1) et différentes espèces répertoriées à ce jour dans
le genre Phaseolus (2), Debouck (1991).
1)
Nom vernaculaire
Nom Latin
Sub tribu
Càmmon bean
Lima bean
Scarlet runner bean
Year-bean
Tepary bean
Cowpea
Mung bean
Urd
Adzuki bean
Phaseolinae
Phaseolinae
Phaseolinae
Phaseolinae
Phaseolinae
Phaseolinae
Phaseolinae
Phaseolinae
Phaseolinae
Jack bean
Sword bean
Yam bean
Phaseolus vulgaris L.
Phaseolus lunatus L.
Phaseolus coccineus L.
Phaseolus polyanthusGreenman
Phaseolus acutifolius A. Gray
Vigna unguiculata (L.) Wap.
Vigna radiata (L.) Wilczek
Vigna mungo (L.) Hepper
Vigna angulaire (Willd.)
Ohwi et Ohashi
Vigna umbellata (Thunb.)
Ohwi et Ohashi
Vigna aconitifolia (Jacq.)
Maréchal
Voandzeia subterranea (L.)
Thouars
Psophocarpus tetragonolobus (L.) OC
Lablab purpureus (L.) Sweet
Macrotyloma geocarpum (Harms)
Maréchal et Baudet
Canavalia ensiformis (L.) OC
Canavalia gladiata (Jacq.) OC
Pachyrrhizus tuberosus (Lam.) A. Spreng
Diocleinae
Diocleinae
Diocleinae
Soybean
Pigeonpea
Glycine max (L.) Merrill
Cajanus cajan (L.) Millsp.
Glycininae
Cajaninae
"
Rice bean
Moth bean
Bambara groundnut
Winged bean
Hyacinth bean
Kersting' s groundnut
Phasèdlinaé
Phaseolinae
Phaseolinae
Phaseolinae
Phaseolinae
Phaseolinae
2)
P. acutifolius A.Gray
P. amabilis Standley
P. amblyosepalus (Piper) Morton
P. angustissimus Asa Gray
P. aug/lsti Harms
P. brevicalyx Micheli
P. chiapasanus Piper
P. coccineus L.
P. esperanzae Seaton
P. filiformis Bentham
P. floribundus Piper
P.foliaceus Piper
P. glabellus Piper
P. glaucocarpus Norvell
P. grayanus Woot. Et Stand!.
P. griseus Piper
P. hintonii Delgado
P.jaliscanus Piper
P. leptostachyus Bentham
P. lunatus L.
P. macrolepis Piper
P. maculatus Scheele
P. micranthus Hook. Et Am.
P. minimiflorus Norvell
P. neglectus Hermann
P. nelsonii M.M.S.
P. oaxacanus Rose
P. oligospermus Piper
P. ovatifolius Piper
Ppachyrrhizoides Harms
P. palmeri Piper
Pparvulus Greene
P. pauciflorus Sessé Mocino
P. pedicellatus Bentham
P. pluriflorus M.M.S
P. polyanthus Greenman
P. polystachys (L.) S.S.P.
P. ritensis Jones
P. salicifolius Piper
P. scabrell/ls Bentham
P. schajJneri Piper
P. sempervirens Piper
P. sinuatus Nutt
P. smilacifolius Pollard
P. sonorensis Standley
P. P. striatus Brandegee
P. tuberckheimii Donn. Smith
P. venosus Piper
P. vulgans L.
P. xanthotrichus Piper
4
.-/"\
Revue bibliographique
.~-'
On classe les variétés du haricot en quatre groupes selon leur type de croissance, qui dépend
n6tàmment de la caractéristique du bourgeon terminal. Le-type l, est déterminé, c'est à dire
que la croissance du bourgeon terminal reproductif est déterminée. Même si au sens strict, on
ni·,peut pas parler de croissance déterminée du bourgepn terminal chez le haricot, sa
croissance est de type buissonnant avec une ramification importante. Les types II et III sont
eux aussi à port buissonnant mais le bourgeon terminal est végétatif et sa croissance est
indéterminée. Le type IV a également un bourgeon terminal végétatif à croissance
indéterminée mais à port grimpant typique sans ramification. C'est la forme de croissance la
pluu>roche du phénotype sauvage.
Approximativement 500 variétés de haricot sont connues. Cette liste n'est pas exhaustive.
Singh et al. (1991) ont regroupé sur la base des caractéristiques «allozymes» et de la teneur en
protéine des graines 76 accessions de haricot de l'Amérique latine (Andes) et du
Mésoamérique en neuf groupes. Plus récemment, Tohme et al. (1996) utilisant la technique de
l'amplification aléatoire de fragments de restriction (AFLP), ont distingué 16 groupes dans
les accessions sauvages du Mésoamérique, de la Colombie et de la région sud des Andes. Une
collection mondiale comprenant plus de 40000 accessions existe au Centre International de
l'Agriculture Tropical (ClAT) en Colombie.
Tableau 3 : Composition nutritionnelle des graines sèches du haricot
Composés
Teneurs (%)
-----------'------
Protéines
25-30
Glucides
58-63
Lipides
7-17
1.2. Origine et extension de la culture du haricot
Le haricot est originaire d'Amérique latine et centrale où il a été domestiqué depuis plus de
8000 ans, (Gepts et Debouck, 1991). La distribution géographique du haricot dans des zones
très diversifiées, tant du point de vu climatique que du point de vue pédoclimatique, en fait
une culture adéquate pour des systèmes agro-culturaux très variés (Fig. 1). En effet, il peut
être cultivé en grande culture, sans limitation en intrants dans les grandes plaines du
Minnesota aux USA ou celles de l'Alberta au Canada, mais aussi dans la province du Goianîa
au Brésil ou en Argentine. On le trouve aussi dans les assolements de systèmes vivriers,
extensifs ou non, des zones d'agriculture marginales comme dans le cas du "frijol tapado" au
Costa Rica (une culture sur jachère en zone très pointue), ou cultivé en association avec
5
Revue bibliographique
'18"
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1000 km
Figure l : Zones géographiques d'origine du haricot en Amérique Centrale (Gepts et
Debouck, 1991)
6
....
Revue bibliographique
d'autres cultures telle que le maïs comme au Rwanda ou dans certaines zones Andines
(Woolley et Davis, 1991) ou encore en rotation avec d'autres cultures non légumineuses
(maïs, patate douce) comme à Cuba.
1.3. Importance économique du haricot
Le haricot est, en Amérique latine et dans plusieurs pays d'Afrique et d'Asie l'une des plus
importantes cultures vivrières, et constitue une grande source de protéines végétales pour la
consommation humaine et animale.
Près de 500 mi llions de personnes consommenL le haricot comf!:l.e
~se
dans leur ration
quotidienne, essentiel pour sa forte teneur en protéine (25-30% de la graine sèche). Pour les
populations consommant souvent le maïs, le haricot permet d'assurer la complémentation en
fournissant les acides aminés essentiels. 11 est cultivé largement en Amérique Latine et
Centrale où le Mexique et le Brésil en sont les principaux producteurs. La consommation
moyenne par an et par habitant est de 13,3 kg et varie selon les pays et les régions. La
production est moindre en Afrique. Le haricot y prend cependant une part importante dans la
diète de pays de l'Afrique de l'Est et du centre comme, le Burundi, le Kenya, le Rwanda ou la
Tanzanie, l'Ouganda où la consommation de 30 kg par habitant et par an est supérieure à celle
moyenne d'Amérique du Sud.
Au Sénégal, la culture du haricot revêt un caractère particulier dans l'agriculture car elle
est une culture de rente pendant la période sèche de soudure d'Octobre à Avril. La production
annuelle est de 5000 tonnes en moyenne dont 80% sont exportés vers les pays développés.
1.4. Conditions de culture du haricot
Généralement le haricot se développe sur des substrats à pH neutre ou légèrement alcalin
(Khachani, 1981). 11 préfère les sols sableux humiféres et silico-argileux et craint les terres
battantes, sèches et pauvres. C'est une espèce très sensible au manque d'eau, ses besoins
hydriques étant estimés à 250 mm de pluie pour un cycle végétatif. Une nutrition phosphatée
adéquate est aussi essentielle pour une croissance vigoureuse du haricot et une bonne fixation
d'azote (Graham et Rosas 1979). Un excès de sel lui est défavorable, la dose létale est de 2,35
g de NaCi/kg de sol (Khachani, 1981). C'est une espèce qui a son optimum de croissance à
10000 lux à une température comprise entre 20°C et 30°C (Khachani, 1981). Sa reproduction
ainsi que son développement sont très sensibles à la température. En effet, l'interaction
pollen-stigmate, la germination du grain de pollen, le développement du tube pollénique, la
7
./
Revue bibliographique
fécondation et la fonnation des gousses sont très affectés par les fortes températures (Gross
and Kigel, 1994).
~n trouve fréquemment la culture du haricot dans ,des zones agricoles relativement
défavorisées comme dans la région de région de Jalisco ou Puebla au mexique. C'est aussi le
cas dans la vallée du Cauca en Colombie ou au Brésil où la culture du haricot, maintenant
supplantée par celle du soja, est repoussée dans des zones moins fertiles. On estime d'ailleurs
que 90% du haricot serait produit sous contrainte environnementale forte (Singh, 1991),
notamment acidité, toxicité aluminique et manganésique ou déficit hydrique, ou encore la
présence de pathogène~omme l'antracnose ou le virus de la mosaïque. Une étude menée par
le CLAT a en plus montré que 60% des sols où est cultivé le haricot sont carencés en
phosphore. Il a été aussi rapporté que le haricot est plus sensible aux conditions extrêmes
d'environnement que les céréales telles que le blé ou le riz. Paradoxalement, la grande
versatilité du haricot en fait la culture la plus adaptée à certains habitats. Le défi des
améliorateurs du haricot est donc double : il faut améliorer son potentiel en conditions
favorables afin de faire du haricot une culture compétitive (selon les critères actuels du
marché) et augmenter son adaptation aux sols peu fertiles pour satisfaire la demande
croissante dans ces zones. Les rendements moyens mondiaux atteignent à peine 10
quintaux/ha et sont très inférieurs à de nombreuses autres légumineuses. Pour son importance
alimentaire et afin de satisfaire les populations qui en dépendent, il est donc important
d'améliorer le rendement du haricot et notamment dans des conditions hostiles.
1.5. Nutrition azotée chez le haricot
Comme pour la plupart des légumineuses la nutrition azotée du haricot se fait ainsi soit par
assimilation des nitrates du sol (par la nitrate réductase de la plante) soit par fixation
biologique d'azote atmosphérique (par la nitrogénase de la bactérie). Ces deux processus sont
complémentaires au cours du cycle de croissance de la plante. La nitrate réductase intervient
essentiellement avant la floraison et la nitrogénase prend la relève au début de la floraison soit
2 semaines après le semis chez le haricot (Franco et al., 1979) et se poursuit jusqu'au début de
la formation des gousses. Une deuxième période d'activité maximale de la nitrate réductase
peut apparaître après la fonnation des gousses et les deux processus peuvent être concurrents
lors d'un apport d'azote nitrique, qui augmente l'activité de la nitrate réductase tout en
diminuant l'activité de la nitrogénase (Félix et al., 1981). L'activité nitrogénasique suit une
courbe de croissance exponentielle avec une activité maximale pendant la période de
floraison et diminue pendant le remplissage des gousses. Thibodeau et Jaworski (1975), puis
8
Revue bibliographique
Obaton et al. (1982) ont montré qu'au champ c'est essentiellement l'assimilation du nitrate qui
prédomine au début du cycle, la fixation d'azote intervient au dernier stade.
2. Les rhizobiums associés au haricot
2.1. Historique
Le terme Bacillus-phaseolus a été appliqué au Rhizobium du haricot par Beijerinck (1888)
afin de le distinguer de toutes les autres souches de Rhizobium. Plus tard, Schneider (1892)
proposa le nom de Rhizobium frankü var majus pour les Rhizobium symbiotiques en les
distinguant de Rhizobium frankü var minus po!!!" P. vulgaris. Cependant les désignations de
_. _ _0 -
• _ _
Schneider n'étaient pas valables sur le plan taxonomique et Rhizobium Phaseolus devient la
forme acceptée en 1926. C'était une des 10 genres de Rhizobium décrits par Dangar dans une
nouvelle tribu des Hyphodea de la famille des Bacteriaceae.
L'appellation R. phaseolus fut cependant surestimée. R. phaseolus est couramment utilisé
pour l'identification des Rhizobium munis de flagelles, bien vacuolisé et est petit que le
Rhizobium de l'haricot. Les bactéroïdes sont généralement rondes avec des formes branchées
et leur culture au laboratoire est rapide. Les colonies sont à moitié translucides, glissantes et
blanches.
2. 2. Classification actuelle
Le haricot est une plante capable de former des nodules effectifs avec des groupes
bactériens génétiquement hétérogènes d'origines différentes (Pifiero et al., 1988; Martinez et
al., 1988; Laguerre et al., 1993 ; Eardly et al., 1995). En plus de R. leguminosarum bv.
phaseoli (Jordan 1984), R. tropici (Martinez-Romero et al., 1991), R. etli (Segovia et al.,
1993), S. meliloti et R. leguminosarum bv. trifolii (Michiels et al., 1998), deux nouveaux
genres capables de former des nodules sur les racines du haricot ont été récemment décrits R.
gallicum bv. phaseoli et R.giardinii bv. phaseoli (Amarger et al., 1997). D'autres espèces déjà
caractérisées mais non classées génétiquement, Rhizobium sp. BR816 ( Hungria et al., 1993),
Rhizobium sp. NGR234 (Van Rhijn et al., 1994a) et Rhizobium sp. GRH2 (Herrera et al.,
1985) sont également capables d'induire la nodulation du haricot. Le tableau 4 donne la
classification des Rhizobium nodulant le haricot.
Selon la littérature, ces souches de Rhizobium nodulant le haricot peuvent être séparées en
deux groupes. Le premier groupe contient les Rhizobium qui forment des nodules effectifs
chez le haricot. Ces sont R. leguminosarum bv. phaseoli (Jordan 1984), R. leguminosarum bv.
trifolii, R. etli, R. Tropici, Rhizobium sp. BR816, GRH2, et Rhizobium sp. NGR234. Le
9
Revue hihliographique
./\
second groupe contient les rhizobiums qui sont capables de former des nodules ineffectifs tels
que B.japonicum, A. caulinodans, and R. leguminosarum bv. viciae (Sardowsky et a1., 1988;
Waelkens et a1., 1995; Michiels et a1., 1998).
,
Tableau 4 : Classification des bactéries nodulant le haricot dans le genre Rhizobium. Extrait de la classification
des bactéries symbiotiques fixatrices d'azote de la famille des Rhizobiaceae.
Genres
Rhizobium
(croissance rapide)
Espèces
Plantes hôtes
R. leguminosarum
biovar viciae
biovar trifolii
biovar phaseoli
R. galegae
biovar orientalis
biovar officinalis
R. tropici type lIA
R. tropici type IIB
R. etli
R. hainanensis
R. gallicum
biovar gallicum
biovar phaseoli
R. giardinii
biovar giardinii
biovar phaseoli
R. mongolense
R. huaullense
Jordan, 1984
__Jmdan.. 1984
Jordan, 1984
Jordan, 1984
Lindstrom, 1989
Lindstrom el al., 1998
Galega orienlalis
Lindstrom el al., 1998
Galega officinalis
Martinez-Romero et al., 1991
Phaseolus vulgaris L., Leucaena
Martinez-Romero el al., 1991
Phaseolus vulgaris L., Leucaena
Phaseolus vulgaris L.
Segovia el al., 1993
Desmodium sinualum
Chen el al., 1994a ; Chen el al., 1997
Références
Pisum. vicia, Lalhyrtls. Lens
Trifolium
Phaseolus vulgaris L.
Phaseolus vulgaris L.
Phaseolus vulgaris L.
Amarger el al., 1997
Amarger el al., 1997
Phaseolus vulgaris L.
Phaseolus vulgaris L.
Medicago ruthenica L. Ledebour
Sesbania herbacea
Amarger el al., 1997
Amarger et al., 1997
van Berkum el al., 1998a
Wang el al., 1998
3. La symbiose fixatrice d'azote
3.1. La nodulation
Dans l'interaction entre la plante hôte et le Rhizobium, les composés phénoliques
(tlavonoïdes, chémoattracteurs) exsudés par la plante hôte entraînent chez la bactérie la
production de lipo-oligosaccharides spécifiques dénommés les facteurs nod. Ce sont des
signaux moléculaires qui déclenchent la division des cellules corticales de la racine
conduisant à la formation d'un nouveau organe différencié chez la plante, le nodule ou
nodosité. Il existe deux types de nodules: des nodules déterminés et des nodules
indéterminés.
Les nodules déterminées sont issus de l'auxèse des cellules du méristème apical qui cesse
son activité à maturation de la nodosité (Tableau 5). Les nodules indéterminés sont issues de
mérèses du méristème apical persistant qui leur confère une croissance longitudinale. Le
nodule du haricot est de type déterminé. Un coupe transversale (Fig. 2) montre un cortex qui
10
[1
Revue bibliographique
--
entoure la zone infectée. Ce cortex nodulaire est divisé en cortex externe (CE), moyen (CM)
et interne (CI), les traces vasculaires étant localisées entre le CI et le CM (Ianetta et al., 1993 ;
Drevon et al., 1995a). Une assise, dite zone de distribution (ZD), séRarerait le CI de la
~
~
infectée (ZI) centrafè, siége de la fixation de l'azote atmosphérique (Parsons'èt Day, 1990).
•
A
..,
'.
.
("F. ---~"-"'?r--
CM ------;ia+-----:lIIII:-Cortex
TV=~~
[ -
z
("fN
Zf
[
-("Nf - - - -
Figure 2 : Coupe transversale d'un nodule de haricot (A) montrant la zone infectée
(ZI) entourée du cortex nodulaire. Agrandissement (8) d'une zone corticale proche
d'une trace vasculaire (TV), on observe les subdivisions en cortex externe (CE),
cortex moyen (CM), cortex interne (CI) et zone de distribution (ZO), on distingue
des cellules infectées (C[N) et des cellules non infectées (CNI). (Orevon, (995)
Il
Revue bibliographique
Tableau 5: Différences principales entre les nodules de type détenniné et indétenniné (Sutton, 1983 et Hirsch,
1992). "'.
"
Type de nodosité
détenninée
Exemples
Glycine, Phaseolus, Vigna, Lotus Acacia, Medicago, Trifolium, Pisum
Cordon d'infection
étroit
large
Site d'initiation du primordium nodulaire
cortex externe
cortex interne
Méristème nodulaire
activité limitée
apical et persistant
Croissance nodulaire
division cellulaire
expansion cellulaire-
Morphologie
circulaire
allongée, ramifiée petites vacuoles
Cellules infectées matures
non vacuolisées
acides aminés
Fonne d'exportation de l'azote fixé
uréides (allantoïne ... )
(asparagine, glutamine)
indétenninée
3.2. Le métabolisme de la fixation d'azote
Dans la symbiose fixatrice d'azote chacun des deux symbiontes constitue pour l'autre une
source d'un élément clef de leu: métabolisme: l'azote moléculaire réduit par les bactéroïdes
est assimilé dans les cellules de la plante hôte et exporté aux autres organes de la plante par le
flux xylémien en échange de photosynthétats acheminés sous forme essentiellement d'acide
dicarboxylique (Fig. 3). La plante fournit en outre un micro environnement très particulier
nécessaire à la fixation de l' aZüte et synthétise les enzymes permettant l'assimilation rapide
de l'ammoniaque produit.
3.2.1. La nitrogénase
La nitrogénase est un complexe enzymatique à deux composants: la dinitrogénase ,)u
composant l, protéine tétraméJ'ique de 200 à 270 kd suivant les microorganismes et la
dinitrogénase réductase ou composant II, ferroprotéine dimérique d'environ 65 kd. Celte
dernière porte un cofacteur peptidométallique : le FeMoCo, qui est le site actif de la réduction
de N 2 en NH).
12
/.'
".~-------~,-------------...
Uréides
Ac. Aminés
FEUILLE
NODOSITÉ
glu ta mine ~---l GS-GOGAT
Acides aminés
Uréides
1NITROGÉNASE
CQ)2
Figure 3:. Schéma illustrant le métabolisme général de la fixation
symbiotique
13
.
-
/'
Revue bibliographique
3.2.2. Importance du phosphore dans laflXation atmosphérique d'azote
La carence phosphatée est très fréquente en zones tropicales et difficilement remédiable
-"
dans les pays dépourvus de gisement de,phosphate.
La quantité d'azote fixé par le haricot est fortement limité par la carence des sols en
phosphore (Graham et Rosas, 1979; Pereira et Bliss, 1987). Ssali et Keya (1983) ont démontré
que l'application de 150 kg P 20/ha sur le haricot, dans un Nitosol du Kenya, permet de
multiplier par trois le nombre des nodules et par dix la quantité d'azote atmosphérique fixée
et le rendement en graines a augmenté de 29%, tandis que le prélèvement de N combiné du
,
"
_0.-
_
sol à diminué. En Tanzanie, Amijee et al. (1988) avaient obtenu une forte nodulation et des
rendements très importants chez le haricot inoculé avec la souche de Rhizobium ClAT 899 et
ayant reçu 180 kg P20/ha sous forme de triple superphosphate.
Chez le haricot, la formation des nodules est très sensible à la concentration en P. La
teneur en P des nodules est plus élevée que celle des racines. Le nodule est un puits très
attractif: en milieu pauvre en phosphore. Graham et Rosas (1979), Pereira et Bliss (1987) ont
montré que dans ces conditions, les nodules s'enrichissent plus rapidement en P que les autres
parties végétales. C'est le poids total de nodules qui augmente, et non l'activité spécifique de
l'organe.
. Le phosphore joue donc un rôle particulier pour le nodule. Chez le haricot, Whiteaker et al.
(1976), Gerloff (1977) et Pereira et Bliss (1987) ont montré qu'il existe des différences entre
cultivars quant à leur tolérance à la carence phosphatée. Cependant, dans une étude réalisée
en Colombie sur 30 variétés de Phaseolus, Graham et Rosas (1979) n'ont pu identi fier un
matériel capable de fixer l'azote dans des sols pauvres en phosphore. Ils suggèrent l'épandage
de faible quantité de phosphore dans la raie de semis. Pour pallier à la carence en phosphore
des sols, l'inoculation des plantes avec les champignons mycorhiziens peut être envisagée. En
effet, la symbiose mycorhizienne avec la formation du réseau de Hartig au niveau des racines
augmente le volume de sol exploré, entraînant ainsi une meilleure utilisation du phosphore
disponible.
3.3. Facteurs de l'environnement (cas du nitrate)
Dans un sol riche en azote combiné, l'activité fixatrice des légumineuses est très réduite.
Ce phénomène est généralement observé dans les sols tempérés souvent trop riches en nitrate.
Cependant, l'excès temporaire de nitrate a été également observé dans les sols tropicaux.
Selon Blondel (1971) et Ganry (1977), au Sénégal, après la saison sèche, les premières pluies
14
Revue bibliographique
provoquent un 'flush' de nitrification susceptibfe d'inhiber la nodulation et de nuire au
rendement.
"
Les effets négatifs provoqués par le nitrate sur"rétablissement de la symbiose et son
fonctionnement ont été rapportés par beaucoup d'auteurs (Stephens et Neyra, 1983; Drevon et
a1.l988; Streeter, 1988). Il y a plusieurs explications: l'ion nitrate peut perturber la
pénétration du Rhizobium dans le poil absorbant; l'augmentation de la teneur en nitrate peut
interrompre le développement des nodules; lorsque la nodosité est active, le nitrate peut
entraver le mécanisme biochimique de fixation de l'azote à différents niveaux. Dans le
troisième cas, plusieurs hypothèses ont été formulées pour expliquer ces-erfets-:- Ou bien, il y a
fermeture très rapide des barrières de diffusion de l'oxygène des nodules (Sheehy et al.,
1983 ; Minchin et al., 1986), ce qui entraîne la réduction ou la suppression de l'apport de
substrats énergétiques aux bactéroïdes. Ou bien, dans le nodule, les cellules possèdent une
nitrate réductase active, qui peut accumuler le nitrite dépendant de la pression en oxygène
(Hekmann et Drevon, 1987). Ce nitrite pourrait se combiner avec le transporteur d'oxygène
de la nodosité, la leghémoglobine, pour former un composé inactif, d'où l'interruption de
l'apport d'oxygène, donc de l'ATP nécessaire au fonctionnement de la nitrogénase (Rigaud et
Puppo, 1977). Une autre hypothèse est que le nitrite inhiberait le composant 1 de la
nitrogénase et, par conséquent, l'activité fixatrice (Trinchant et Rigaud, 1980).
Bien que les mécanismes d'inhibition de la nodulation et de la fixation soient nombreux, il
existe des possibilités pour minimiser l'effet du nitrate. Des études suggèrent la sélection
d'associations rhizobiums/légumineuses peu sensibles à cette inhibition (nodules possédant
des réserves importantes de substrat énergétique, une faible activité nitrate réductase ainsi
qu'une teneur élevée en uréides). Le criblage des variétés pour leur capacité de nodulation et
la fixation en présence de nitrate peut être réalisé simplement en observant la nodulation et la
fixation d'azote des légumineuses cultivées sur des milieux riches en nitrate. Ainsi Imsande
(1985) et Serraj (1990) ont pu sélectionner des variétés de soja hautement fixatrices d'azote
dans un milieu renfermant 3 mM de nitrate, alors que cette concentration inhibe totalement la
fixation dans la majorité des variétés de soja. De même, en mesurant la fixation par un indice
de nodulation et la teneur de la sève en uréides, Betts et Herridge (1987) ont isolé, parmi 489
lignées de soja, des lignées capables de fixer en serre en présence de 2,5 mM de nitrate, puis
au champ sur un sol riche en nitrate. En outre, des lignées super et hyper-nodulantes, ainsi
que tolérantes au nitrate, ont été sélectionnées. Certaines d'entre elles présentent un grand
intérêt agronomique (Carroll et al., 1988).
15
<./ \
--
Revue bibliographique
3.4. PoteritÎel fixateur d'azote du haricot
Le haricot a été décrit par plusieurs auteurs comme étant une légumineuse à faible capacité
de fixation d'azot,.e, comparée à d'autres espèces de légumineuses cOInfl:le le soja (Preira et
~,
,
Bliss, 1987; Isoi et Yoshida, 1991) (Fig. 4). Ce phénomène est dû en partie aux conditions des
sols de la culture mais aussi, à la compétitivité des souches de Rhizobium indigènes
ineffectifs. Le rendement et le développement du haricot sont très dépendants de la teneur en
azote du sol. Or les sols tropicaux sont pour la plupart déficients en cet élément (Graham,
1981). De ce fait le haricot produit en système intensif est fertilisé en azote et la gestion des
intrants azotés dans l'agricultufe--génereâ'importants reliquats azotés en debut de culture;-·cequi empêche le haricot d'exprimer au mieux son potentiel de fixation symbiotique. C'est le cas
dans les exploitations maraîchères du haricot de la zone des Niayes où la nodulation est en
partie limitée par les apports d'engrais azotés à des taux très élevés (250 à 300 kg urée/ha).
Cependant, l'existence d'une grande variabilité génotypique pour le potentiel fixateur
d'azote du haricot décrit par Bliss (1993) permet de sélectionner des variétés à très fort
potentiel fixateur d'azote. Ainsi, des efforts ont été faits dans la sélection des variétés RHIZ à
nodulation profuse (Kipe-Nolt et Giller, 1993), ou dans la sélection de variétés précoces
(Chaverra et Graham, 1992) ou dans la sélection de variétés présentant une sénescence tardive
des nodules (Vikman et Vessey, 1993,a,b,c).
16
./
Revue bibliographique
Figure 4: Quantité d'azote fixé par le haricot comparé à différentes espèces de légumineuses
en conditions de champ
4. Mesure de la fixation
4.1. Méthodes directes
Il existe deux méthodes directes de mesure de la quantité d'azote fixée par une plante: la
méthode par différence et celle faisant appel à l'utilisation de l'azote-l5 ('sN). La première
n'a été que très peu utilisée dans le cas du haricot. Par contre beaucoup de mesures ont été
effectuées avec la seconde, compte tenu des nombreuses discussions (voir ci-dessous) sur la
faible capacité du haricot à fixer l'azote et le besoin suscité pour la sélection d'une variété à
haut potentiel fixateur.
Dans la nature, l'azote existe sous forme de mélange de deux isotopes stables 14N et ISN.
Delwiche et Steyn (L 970), observant des différences dans les abondances naturelles en 'SN
entre plantes fixatrices et non fixatrices, d'azote suggèrent la possibilité d'utiliser ces
différences pour la mesure de la fixation de l'azote. Ainsi, deux principales méthodes
d'estimation de la fixation d'azote se sont développées en, utilisant l'isotope 'SN comme
traceur: méthode de la valeur A et méthode de la dilution isotopique (Fried et Broeshart,
17
Revue bibliographique ./
1975).
En Amérique latine, l'utilisation des isotopes dans les études d'amélioration de rendement
et de la fixation d'azote chez le haricot a commencé en 1986. En Chilie, L. Longeri en
~
utilisant sept cultivars des différents types de haricot, type 1, II et III a montré qu'il existait
une légère différence entre les types en terme de %Ndfa. Hardarson et al. (1988), en
comparant la fixation d'azote chez plusieurs espèces dans les conditions au champ ont
indiqué que le haricot (Phaseolus vulgaris) a une fixation d'azote équivalente à celle du pin
(Pisum sativum) (%Ndfa approximativement de 30%), et inférieure à celle de la fève (Vicia
faba),_dulupin (Lupinus spp.), du pois d'angola (Cajanus cajan), _Qu soja (Glycine max), de
l'arachide (Arachis hypogaea) et du niébé (Vigna unguiculata) comprise entre 40% et 70%.
4.2. Méthodes indirectes
4.2.1. Activité réductrice d'acéthylène (ARA)
L'activité nitrogénasique est mesurée par la méthode indirecte de réduction de l'acétylène
en éthylène (Hardy et al., 1973). Cette technique met à profit la faible spécificité de la
nitrogénase pour son substrat; en effet, cette enzyme responsable de la réduction de l'azote
atmosphérique en ammonium, peut également réduire d'autres substrats caractérisées par une
double liaison tel que l'acétylène (C 2H 2) en éthylène (C 2H 4). Après la mesure effectuée au
chromatographe en phase gazeuse à ionisation de flamme, l'activité réductrice est exprimée
en nanomoles d'éthylène/h/plante. Selon le niveau de cette activité, les nodules sont répartis
en
quatre
groupes
éthylène/h/plante),
d'efficience:
nodules
nodules
très
efficients (activité
efficients
(activité
comprise entre
100
> 600
nmoles
et 350 nmoles
éthylène/h/plante) et nodules inefficients (activité < 100 nmoles éthylène/h/plante).
4.2.2. Uréides
Quand l'association symbiotique est fonctionnelle, les bactéroïdes transforment l'azote
gazeux N 2 en ammonium directement assimilable par la plante (Smith et Gallon, 1993).
L'ammonium est alors incorporé dans les molécules organiques servant de transport de
l'azote jusqu'aux parties aériennes. Ces molécules sont des amides ou des uréides. On
distingue ainsi deux types de plantes : les plantes à amides groupant les légumineuses des
régions tempérées, et les plantes à uréides, regroupant essentiellement les légumineuses des
régions tropicales (Schubert et Boland, 1990). Ainsi chez le haricot 80% de la sève
ascendante est composée d'uréides (Cookson et al., 1980). Diatloff et al., (1991) avaient
rapporté avec 100 kg N/ha une inhibition de la nodulation corrélée à une baisse du taux
18
~
Revue bibliographique/'
d'uréides chez le haricot.
5. Amélioration de la fixation d'azote: inoculation des plantes.
L'inoculation des légumineuses aveC'des souches de Rhizobium sélectionnées pour leur
"'-
grande effectivité est une des approches pour améliorer la fixation biologique d'azote.
Cependant, le bénéfice de l'inoculation a été réellement précisé dans plusieurs situations. En
France par exemple übaton (1987) a obtenu chez le soja une fixation jusqu'à 60% de l'azote
total de la plante. En Australie Pannell et Fa1coner en 1988 ont montré de réelles économies
d'engrais azotés. Au Sénégal, des essais d'inoculation ont été réalisés avec succès sur le soja
-"---
de 1978 à 1983 avec une production moyenne en graines dëT570-l(g/ha soit une plus-value de
60% par rapport au témoin non inoculé (Ganry et al., 1984). L'inoculation des arbres a été
expérimentée avec Casuarina. L'inoculation de l'arachide et du niébé a été un échec à cause
de la richesse des sols en souches de Rhizobium indigènes très infectifs sur ces deux
légumineuses. L'inoculation du haricot a été faite récemment avec les travaux de Diouf
(1997).
Chez le haricot, les résultats antérieurs obtenus sur sa réponse à l'inoculation était d'une
grande variabilité, ne montrant parfois aucune réponse ou parfois des réponses positives.
Bohlool, 1988 indique que généralement l'inoculation n'augmente pas le rendement du
haricot. Au Nigeria, des observations faites par Masefield, 1952 ont montré une absence
totale de nodule sur les racines du haricot ou une faible nodulation donnant des petits nodules
blancs. En Jamaica, McLaughlin et Ahmed (1985) avaient reporté une pauvre nodulation du
haricot au champ. Aux caraïbes où l'inoculation du haricot n'est pas fréquente, plusieurs
essais d'inoculation ont été mis en place pour évaluer l'utilité de la pratique. Les rendements
dans les traitements inoculés n'étaient pas statistiquement différents des témoins et étaient
compris entre 30 et 80% des traitements avec fertilisation azoté (Huntington et al., 1986). Par
contre en Porto Rico, le haricot inoculé a produit 112 Kg de matière sèche de plus que le
témoin non inoculé (Mangual-Crespo et al., 1987). Au Brésil aussi, l'inoculation avec
différentes souches de Rhizobium a augmenté le rendement en grains de façon non
significative (Bliss, 1990). Duque et al. (1985) ont obtenu une réponse à l'inoculation
seulement chez certaines variétés de haricot.
Ces travaux, réalisés en Amérique latine, en plus de ceux de Weiser et al. (1985) et de
Velàzquez et al. (1988) indiquent que l'inoculation du haricot peut améliorer sa nodulation
mais cette réponse n'est pas toujours accompagnée d'une augmentation significative de
rendement.
19
JI
Revue bibliographique
En Afrique, il y a les exemples de Madagascar, Rwanda, Burundi et ceux du Sénégal.
A Madagascar, Samson et al. (1989) ont eu un effet de l'inoculation du haricot dans les
champs de riz. L'expérience indique que l'inondation de rizière après une période sèche
réduisait le'nombre de Rhizobium indigènes. Kucey (1989) dans uri- essai conduit en serre a
montré que des réponses à l'inoculation pouvaient être obtenues dans des sols où la teneur en
azote ainsi que la population de Rhizobium indigènes sont faibles. Inversement quand le sol
contient des souches indigènes efficientes il n'y a pas de réponse à l'inoculation (Lalande et
al., 1986). En Argentine, le haricot a une nodulation spontanée mais pauvre.
6. Amélioration de la
fixati()!Ld'~ote
: Inoculation avec des bactéries
stimulatric~s <!~
croissance: cas des Pselldomo/las.
Les bactéries stimulatrices de la croissance des plantes existent naturellement à l'état libre
dans l'environnement racinaire. Les Pseudomonas fluorescents (P. jluorescens-putida)
représentent l'un des groupes les plus étudiés. Certaines souches de ce groupe (5 à 10%)
stimulent indirectement la croissance en déplaçant la microflore concurrente, délétère ou
pathogène, présente dans la spermosphère et dans la rhizosphère, et parfois en coopérant avec
certains micro-organismes bénéfiques. Elles agissent aussi directement en induisant une
stimulation de la germination et de la croissance des systèmes racinaires, en produisant des
effets semblables à ceux de certains hormones de croissance. Les anglo-saxons Kloepper et
al. (1978) ont qualifié ces bactéries de stimulatrices de la croissance des plantes ou par
l'abréviation PGPR pour plant growth-promoting-rhizobacteria.
Outre la production de substance stimulatrice, certaines souches de Pseudomonas du
groupe jluorescens-putida synthétisent diverses substances antibiotiques qui inhibent les
bactéries et les champignons se trouvant dans leur environnement. Cependant, d'autres
souches de ce groupe agissent au contraire en synergie et facilitent la croissance, l'installation
et les effets de certaines micro-organismes bénéfiques.
Certaines souches de P. jluorescens sont spécifiquement associées au champignon
ectomycorhizien Laccaria laccata et facilitent l'établissement de la symbiose en agissant
essentiellement sur la stimulation de la croissance du mycélium avant sa phase symbiotique
(Ouponnois et al., 1991) et la coinoculation d'une souche de P. putida avec une
endomycorrhize stimule davantage la croissance du trèfle que l'inoculation avec le seul
champignon (Meyer et al., 1986). Il faut cependant se garder de généraliser, car d'autre
souches de P. jluorescens-putida se montrent, au contraire, antagonistes de symbiotes tels que
la truffe noire (Tuber melanosporum) causant l'arrêt de l'expansion mycorhizienne, voir la
20
••
Revue bibliographique
régression de la symbiose (Mamoun et al., 1992).
Une inoculation mixte de P. putida avec le Rhizobium phaseoli pour tenter de mieux
contrôler les agents pathogènes du haricot (Phaseolus vulgaris) a permis de constater que le
nombre de nodules était augmenté sous certaines conditions, mais que la croissance de la
plante n'était pas améliorée par rapport au témoin inoculé avec le Rhizobium seul (Grimes et
Mount, 1984). D'autres travaux ont démontré que la coinoculation de Rhizobium avec
certaines souches de P. fluorescens-putida et d'autres bactéries (Bacillus, Serratia) peut
améliorer nettement la nodulation chez le soja tant en nombre qu'en poids des nodules
(Po[cYrlefïko etaI., 1987 ).
21
./
CHAPITRE II
MATERIEL & METHODES
.,
./
1.
./.\
Matériel et Méthodes
Les:sols
Les sols ont été prélevés dans 22 localités du Sénégal (Fig. 5) parmi lesquelles Bel Air,
Keur Ndiaye Lô, Sangalkam et Sébikotane situés dans la zone des Niayes principale zone de
~
~
culture du ha~icot. Le tableau 6 indique les caractéristiques physico-~himiques du sol de Bel
Air, de Keur Ndiaye Lô, Sangalkam, Sébikotane et Dakar (Yoff).
Les sols dunaires de Dakar (Yoff) dont la teneur en azote total est très faible 0.028% (Ndoye
et Dreyfus, 1988; Sougoufara et al., 1990) ont été également prélevés pour les manipulations
relatives à la détermination de la dose minimale de nitrate inhibitrice de la nodulation du
haricot.
Tableau 6: Caractéristiques physico-chimiques des sols de Bel Air, Keur Ndiaye Lô, Sangalkam, Sébikotane et
Dakar (Yoff).
Localités
pH
Hp
Bel Air
7,23
Keur Ndiaye Lô 7,53
Sangalkam
6,74
Sébikotane
7,36
Yoff
7,70
nd : non détenniné
pH
KCI
6,02
6,93
5,81
6,70
6,75
Argile
(%)
3,5
5,6
5,5
26,4
5
Limon Sable
(%)
(%)
2,9
94,7
3,8
92,2
7,5
87
16
56,3
5,5
89,5
Carbone
total (%)
0,034
2,60
4,41
9,19
0,27
Azote
total (%)
0,044
0,32
0,50
0,75
0,028
NO]"
(mg/l)
nd
55
42,5
75
nd
P total
(ppm)
[31
nd
nd
nd
nd
P. assimilable
(ppm)
30,7
nd
nd
nd
nd
2. Matériel végétal
2.1. Les variétés de haricot vert
Les variétés de haricot utilisées dans nos expériences sont mentionnées dans le tableau 7.
Tableau 7 : Les différentes variétés de haricot utilisées dans nos expériences et leurs provenance.
Variétés de haricot
Bronco
Nérina
Rudy
BAT 477
DOR367
Linex
Coco
DB 96
T 815
T260
DB 7080
DB 8054
DB 175
Antare
Bonus
Portugal
Paulistra
Fournisseurs
Tropicasem (société privée de production et de commercialisation de semences horticoles)
Fédération des Producteurs Maraîchers de la zone des Niayes (FPMZN)
«Les Niayes» (société privée de commercialisation de semences et de petit matériel agricole)
ClAT (Cali, colombie)
ClAT (Cali, colombie)
Vilmorin France
Graphopast Tunisie
Dominique Blotton France
ClAT (Cali, colombie)
ClAT (Cali, colombie)
Dominique Blotton France
Dominique Blotton France
Dominique Blotton France
Dominique Blotton France
Dominique Blotton France
Marché local au Portugal
Royal Sluis : société hollandaise de commercialisation des semences
* : Toutes ces variétés n'ont pas été disponibles en même temps dans notre collection.
22
li
.
.
./
Matériel et Méthodes
f\[
MAURITANIE
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1
1
1
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1
1
,
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MALI
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__ ~r" - -- - -" ~
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~
GUINEE BISSAU
GUI~;E-"
.-.-- ...... '--
t
,"
Figure 5 : Zones de cu!ture(W) et de prélévement des sols (c:::::J) au Sénégal
23
Matériel et Méthodes
2.2. Le soja
La vari'été de soja non nodulant m129 a été utilisée comme pla'rite de référence dans toutes
les expériences d'estimation de la fixation d'azote utilisant l'isotope stable de l'azote-15
C5N).
2.3. Germination des graines
Les --graines
de haricot ont été stérilisées superficiellement avec de l'alcool éthylique 70°
.-._--"
. . . __. pendant 3 min. Après plusieurs rinçages successifs à l'eau distillée stérile, les graines ont été
trempées dans du chlorure mercurique à 10/00 pendant 3 min et rinçées à nouveau à l'eau
distillée stérile avant d'être mises à germer à l'obscurité pendant 48 h à 37°C dans des boîtes
de Petri contenant de l'eau gélosée 8%0 stérile. En fonction du type d'expérience conduite en
chambre de culture, les plantules obtenues après germination ont été repiquées dans des tubes
Gibson, ou dans des jarres Léonard.
Dans les expériences en hydroaéroponie les graines de haricot, ont été trempées dans
l'hypochloride de calcium à 300/00 (Vincent, 1970) pendant 30 min puis rincées plusieurs fois à
l'eau distillée stérile et mises à germer dans des bacs contenant de la perlite stérilisée à
l'autoclave à 120°C pendant 20 min. Les bacs ont été préalablement stérilisés par trempage
dans l'eau de Javel pendant 30 min. Les bacs ont été ensuite recouverts de papier kraft
(permettant ainsi la germination des graines à l'obscurité) et disposés dans une serre vitrée
dont la température est contrôlée et régulée à 28°C. Un système de drainage adéquat permet
une bonne alimentation de la graine en eau et une bonne aération.
2.4. Culture en tube Gibson
La culture des plantules de haricot dans les tubes Gibson (Gibson, 1963) a été effectuée à
raison d'une plantule par tube. Un tube Gibson est un tube à essai contenant 30 ml de milieu
nutritif de Jensen (Vincent, 1970) gélosé, stérile et incliné. Il est recouvert d'un papier
aluminium pourvu de deux trous servant pour le repiquage, l'arrosage ou l'inoculation des
plantules. Au moment du repiquage des plantules, le volume du tube laissé libre par le milieu
de Jensen gélosé est rempli par de l'eau distillée stérile. Les tubes ont été ensuite placés sous
une atmosphère confinée humide pendant 48 h afin d'éviter le dessèchement des cotylédons et
pour leur permettre de se libérer facilement de l'enveloppe de la graine. Ensuite, tous les tubes
Gibson ont été placés en culture dans une chambre thermostatée à 28°C, à éclairage continu,
dont le rayonnement photosynthétique est de 120 Ilmole-2.S-'.
24
Matériel etMéthodes
2.5. Culture en flacon sérum et en bac
,
,
Les plantules ont été mises à croître dans des flacons sérum de 1000 ml contenant une
solution nutritive (Drevon et al., 1988) à raison d'une plantule par flacon. Dans les bacs, elles
ont
été~
disposées sur les
plaques en polystyrène percées et servant en même temps de
couvercle pour chaque bac. L'aération des solutions nutritives s'effectue à l'aide d'un système
de tuyau reliant les flacons ou les bacs avec une arrivée par bullage d'air comprimé à un débit
d'environ 400 ml min· 1 1- 1 solution. La consommation en solution nutritive des plantules a été
~rajustée
en permanence par addition d'eau distillée.-e1 la solution nutritive renouvelée tous-tes
15 jours
2.6. Culture en jarre-Léonard
La culture des plantules de haricot a été effectuée à raison d'une plantule par jarre. Une
jarre Léonard (Vincent, 1970) est un système constitué de deux pots «magenta» emboîtés l'un
sur l'autre (0 sup : 7,5 cm, 0 inf : 6,5 cm H : 9,5 cm). Le pot inférieur contenait de l'eau; le pot
supérieur, 600 g de sable stérilisé à l'autoclave (l h, 120°C) et était recouvert d'un papier
aluminium en double épaisseur maintenu par du scotch. Par un trou (0 : l cm) aménagé au
milieu de la base du pot supérieur, une mèche relie les deux pots. La mèche permet l'arrosage
par capillarité de la plante. Les jarres ainsi préparées ont été stérilisées à 120°C pendant 20
min avant le repiquage des plantules.
2.7. Culture en pots.
Le sol a été stérilisé à l'autoclave à 120°C pendant l h et réparti dans des pots (0 sup
:
25
cm, 0 inf : 20 cm H : 25 cm) à raison de 4 kg de sol par pot. Les graines de haricot ont été
semées en raison de trois graines par pot. Les plantules ont été arrosées quotidiennement avec
100 ml d'eau distillée stérile. Après une bonne levée, les plantules ont été démariées à une
plantule par pot.
2.8. Culture au champ
Les essais ont été réalisés pendant la saison froide allant du mois de Novembre à Avril,
période de culture du haricot au Sénégal. Dans tous les dispositifs expérimentaux, le même
type de parcelle élémentaire (Fig. 6) a été adopté. Cette parcelle élémentaire mesure 2,25 m x
1,35 m. Les graines de haricot ont été semées à raison d'une graine par poquet avec des
écartements de 0,15 m sur la ligne et 0,45 m entre les lignes. Les parcelles élémentaires sont
séparées entre elles par des allées de 1 m de large. Al' intérieur de chaque parcelle, une
microparcelle A de 0,45 m x 0,75 m a été délimitée pour l'application de l'engrais azoté
25
.
... 45 cm
225 cm
o
o
o
o
o
o
o
o
o
0
0
0
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o
A
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0
0
B
0
0
0
0
o
o
o
o
o
/\
Matériel et Méthodes
15 cm
o
o
o
o
o
135 cm
Figure 6 : Schéma d'une parcelle élémentaire utilisée dans les dispositifs
expérimentaux des essais conduits au champ.
A : microparcelle réservée aux mesures des paramétres de croissance et de
Fixation Biologique d'Azote (FBA) à mi-floraison.
Nota: Pour les mesures de FBA faisant appel à la méthode de dilution isotopique, toute la microparcelle
est enrichie avec de l'engrais marqué 15N.
B : microparcelle reservée aux mesures de rendement au stade de
maturation des gousses.
Dans l'ensemble des parcelles élémentaires de l'engrais de fond a été épandu:
120 kg KCllha et 60 kg kg P20Slha
26
/.\
_ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _--'-
----0.:===--==..:=-'-===
Matériel et Méthodes
marqué 'SN dans le cas des expériences de mesure de fixation d'azote faisant appel à
l'utilisation de l'azote ('sN) (cf. chapitre 6), une micro-parcelle B, de mêmes dimensions que
A \"été délimitée pour les mesures de rendements. D'ans tous les essais au champ (à
l'exception de celui portant sur l' (ipplication de différentes doses phosphore), de l'engrais de
fond a été apporté à l'ensemble des parcelles à raison de 120 kg KCllha et 60 kg PzO/ha.
3. Les souches de microorganismes
3.1. Les souches de Rhizobium
Sept souches de Rhizobium nodulant le haricot ont été utilisées. Six ont été sélectionnées
dans la collection ISRA-MIRCEN et recommandées pour l'inoculation du haricot. Ce sont:
ISRA 350, ISRA 353, ISRA 355, ISRA 554 (Diouf, 1997) et ISRA 699, ISRA 700 (cette
étude) isolées des racines du haricot respectivement dans les localités de Thiawaré, BoulaI,
Baba Garage, Darha, Sangalkam et Bel Air.
La souche de Rhizobium tropici CLAT 899 provenant du Centre International pour
l'Agriculture Tropicale (CLAT) constitue la septième souche de Rhizobium. C'est une souche
de référence recommandée pour les études sur le haricot notamment à cause de sa grande
effectivité sur le haricot.
Le milieu Yeast Extract Mannitol (YEM) stérilisé à l'autoclave (l20°C, 20 min) a été utilisé
pour la culture de ces souches (Annexe).
3.2. La souche de champignon mycorhizien Glomus aggregatum
Le champignon mycorhizien à vésicules et à arbuscules servant à l'inoculation est Glomus
aggregatum Schenck & Smith emend. Koske (DAüM 227 128). Cette souche appartient à la
collection de souches de mycorhize du laboratoire de l'IRD-UCAD-ISRA. IL a été multiplié
en serre sur une plante de maïs cultivée dans du sable de plage abondamment lavé puis
autoclavé et servant de support d'inoculum. L'inoculum mère constituée d'un mélange de
spores et de fragments de mycorhize de la souche a été déposée dans le sable à 3 cm de
profondeur. Au bout de 3 mois, les plantes de maïs ont été récoltées, le sable séché et les
racines soigneusement rincées et placées dans des tubes fennés. L'ensemble des tubes et des
sachets récoltés ont été conservé au froid à 4°C jusqu'à leur utilisation.
3.3. Souche de Pseudomonas jluorescens
La souche de Pseudomonas fluorescens 6F 16 a été isolée par Sarr et al. (2000) dans la
mycorhizosphère d'un jujubier en plantation à Sokhone (région de Kaolack). L'inoculum a
27
Matériel et Méthodes
J
été préparé dans un milieu liquide Tryptone Soy Agar (TSA) en agitation pendant 48 h à
37°C. Elle croit aussi dans le milieu KingB où elle présente une fluorescence sous la lumière
ultra violette (UV).
.""
4. Production d'inoculum de rhizobium
De l'inoculum a été produit pour les souches de Rhizobium indiquées au § 3.1
4.1. Production d'inoculum de rhizobium
Nous avons produit, au cours de nos expériences deux fonnes d'inoculum :
4.1.rlhoculum liquide.
Cet inoculum a été utilisé pour les plantules de haricot repiquées dans les tubes Gibson, les
jarres Léonard, les flacons sérum, les bacs et les graines semées directement dans les pots.
Les inoculums de rhizobium qui renfennaient 10 8 à 10 9 cellules/ml ont été apportés à raison
de 1 ml par plantule dans le cas des tubes Gibson et des jarres Léonard et de 5 ml par graine
dans le cas des pots.
4.1.2 Inoculum solide.
La tourbe prélevée à Touba Ndiaye, dans le département de Tivaouane a été utilisée
comme support. Cette tourbe, non toxique aux rhizobiums et facilement stérilisable, a un
pouvoir absorbant très élevé. Elle est disponible en grande quantité, peu coûteuse et adhère
très facilement aux graines. Avant son utilisation, la tourbe a été séchée, finement broyée et
son pH acide (pH 3) a été ajusté à 7 avec de la chaux vive. Ensuite, la tourbe a été stérilisée à
l'autoclave (l20°C, 2 h) et répartie dans des sachets plastiques à raison de 100 g par sachet.
Quarante millilitres d'une suspension (10 9 cellules/ml) d'une souche appropriée de rhizobium
ont été injectés à l'aide d'une séringle stérile dans chaque sachet. L'inoculum de rhizobium,
ainsi conditionné a été mis en incubation à la température ambiante pendant 7 jours, puis
conservé à 4°C jusqu'à utilisation.
4.2. Contrôle de la qualité des inoculums de rhizobium produits (solide)
4.2.1. Détermination du nombre de rhizobium des inoculums
Il s'agit, pour chaque inoculum produit d'estimer le nombre de rhizobiums viables et
infectifs pour la légumineuse considérée en se fondant sur le principe d'extinction et en
utilisant une table de «Most Probable number : nombre le plus probable» (MPN) (Vincent,
1970). Le· contrôle est effectué sur un échantillon représentatif (nombre de sachets
significatifs) de l' inoculum produit en se fondant sur les postulats suivants:
28
Matériel et Méthodes.
•
dans un milieu stérile dépourvu d'azote, quand une légumineuse est inoculée avec un
rhizobium spécifique, il ya formation d'un nodule sur le système racinaire.
•
~
dans un milieu stérile dépourvu d'azote, la présence d'un nodule sur le système
racinaire d'une légumineuse préalablement inoculée avec une bactérie est la preuve que la
bactérie est un rhizobium viable et infectif sur cette légumineuse.
dans un milieu dépourvu d'azote, l'absence de nodules sur le système racinaire d'une
légumineuse est la preuve que le milieu ne renferme pas de rhizobiums infectifs sur cette
.. -légumineuse.
--- --
Le dénombrement des rhizobiums infectifs a été réalisé dans des unités de croissance dans
lesquelles la légumineuse considérée a été cultivée aséptiquement (Fig. 7). Les unités de
croissance sont constituées de tubes Gibson dans lesquels des plantules de haricot ont été
repiquées. Dix grammes de chaque inoculum ont été mis en suspension dans 90 ml de
solution tampon peptone maintenue à 4°C (annexe).
A partir de cette suspension mère (dilution 10- 1), une première série de dilutions de 10 en
10 a été effectuée jusqu'à la dilution 10-4 à partir de laquelle une deuxième série de dilutions
de 5 en 5 a été initiée jusqu'à 1 : 15625. Chacune des dilutions de cette seconde série a servi à
inoculer quatre unités de croissance (l ml par unité de croissance) qui ont été ensuite placées
en chambre de culture dans les mêmes conditions décrites au § 2.5. Au bout de 3 semaines, le
nombre d'unités de croissance positives (unités dans lesquelles il y a présence d'au moins un
nodule par plante) par dilution constitue un nombre caractéristique qui, rapporté à une table
MPN basée sur des séries de dilution en 5, permet d'évaluer le nombre de rhizobiums
contenus dans un inoculum.
4.2.2. Détermination de la dose d'application des inoculums produits
La dose d'application d'un inoculum désigne généralement le poids d'inoculum (P)
nécessaire par kilogramme de semence. Elle est déterminée par la formule suivante:
P-N
-xS
-
(1)
R
Dans cette formule, N représente le nombre de rhizobiums viables et infectifs requIs par
graine pour une fixation d'azote efficiente, S désigne le nombre de graines par kilogramme de
semence, R désigne le nombre de rhizobiums par gramme d'inoculum.
En ce qui concerne le haricot, S = 30.000 graines/kg de semence, N
par graine. Dans ces conditions, l'équation (1) devient: P = 3.109
R
=
10 5 rhizobiums requis
(2)
29
~
Matériel et Méthodes
10- 1
10ml ~
1O~
90ml
10ml
10-
10-3
90ml
90ml
2
~
(Tampon peptone pH = 7.0)
1 ml
1:5
1:25
1: 125
1:625
1:3125
1: 15625
Témoin
4 unités de croissance par dilution
Figure 7 : Contrôle de la qualité d'un inoculum solide fondé sur le principe d'extinc%>n
Matériel et Méthodes
5. Coloration des fragments de racines mycorhizées
Pour évaluer le taux de"mycorhization, les fragments de racines ont été coloré~ selon la
méthode de Philips et Hayman (1970). Les racines excisées ont été rinçées à l' èau afin
d'éliminer les particules de sable, puis trempées dans l' alcool
70~
pendant 24 h. Elles ont été
ensuite placées dans des tubes à essais contenant du KOH à 10%. Ce traitement permet de
décolorer les racines et de vider le contenu du cytoplasme des cellules racinaires. Les tubes
ont été placés au bain-marie à 100°C pendant 30 min. Les racines ont été par la suite rincées
plusieurs fois à l'eau etcûlorées au bleu de-Trypan (0,05%) pendant 30 min. L'examen
microscopique des racines a été effectué en déposant des fragments de racine (0,5 cm) sur des
lames avec quelques gouttes de glycérol.
6. Estimation de l'azote fixé par la méthode de dilution isotopique
15N
6. 1. Définition
La méthode de dilution isotopique (Fried et Broeshart, 1975), consiste à marquer le sol par
ajout d'engrais marqué en '5N. On cultive simultanément dans des parcelles (ou dans des
pots) distinctes, des plantes fixatrices (haricot) et des plantes témoins non fixatrices (soja), le
sol ayant reçu dans les deux cas, la même quantité d'engrais azoté marqué en '5N.
L'engrais marqué avec l'azote-15 est ajouté au sol en petites quantités sous forme d'azote
organique ou inorganique. Les excès isotopiques en azote-15 dans la plante fixatrice et dans
la plante de référence sont utilisés pour calculer la proportion d'azote dérivé de l'atmosphère
(%Ndfa) dans la plante fixatrice.
L'hypothèse est que les racines de la plante fixatrice et celles de la plante de référence
explorent le même volume de sol en ce qui concerne l'absorption de l'azote, même si les
quantités d'azote sont différentes.
La formule de Fried et Middelboe 1977 donne le pourcentage d'azote dérivant de la fixation
dans la plante fixatrice d'azote (%Ndfa) en considérant l'excès isotopique (% '5Nei ) dans les
plantes fixatrices et non fixatrices d'azote.
%Ndfa _
(L
% 15Nei de la plante fixatrice
_
) x 100
% 15Nei de la plante non fixatrice
6.2. Principe de la dilution isotopique
Dans toutes nos expériences en serre ou au champ, l' azote-15 a été apporté aux plantes
sous forme de sulfate d'ammonium marqué à 5%. La quantité d'engrais marqué apporté au
31
./
Matériel et Méthodes
champ ·ou dans les pots a été calculée en se basant sur l'excès isotopique de l'azote-15
contenudarKle sulfate d'ammonium et sur le nombre de plante à traiter.
Au champ, l'azote est appliqué au haricot à raison de 20 kg N/ha. La densité de semis des
~
~
plantes étanf',de 375.000 plantes à l'hectare pour des écartements de 15 cm sur 40 cm,
l'application de 20 kg N/ha correspondrait à 53 mg N/plante.
Dans ces conditions, si X est le nombre de plantes à traiter dans une expérience et sachant que
le sulfate d'ammonium contient 21,2% d'azote, la quantité Q de sulfate d'ammonium (SA)
requise par expérience est de:
1Of) ._
Q=
=-
5CX
235,85 mg S A x X
(1)
?I?
Cette quantité
Q correspond aux masses ml + m 2 respectives de sulfate d'ammonium marqué
AS· et de sulfate d'ammonium non marqué AS. La dilution isotopique a été faite à partir de
ces masses ml et m 2.
Les dilutions isotopiques sont effectuées en se fondant sur la formule suivante (AIEA, 1983)
m, =
---lm,+m 2) M&~.~
(2)
M2a' ,+(M ,-M2) a-'
Dans cette formule, on désigne par:
a' ,: l'excès isotopique de SA marqué
a'2: l'excès isotopique de SA ordinaire
MI: la masse moléculaire de SA marqué
M 2: la masse moléculaire de SA ordinaire
ml: masse (quantité) de SA marqué
m2: masse (quantité) de SA ordinaire
ml + m 2 = masse (quantité) de SA final dilué qUI correspond à la quantité de sulfate
d'ammonium requis pour chaque expérience.
a-': excès isotopique de SA dilué final.
Le sulfate d'ammonium marqué utilisé dans nos expériences a un excès isotopique (a' ,) égal à
10,32% avec une masse molaire (M,) de 132,2 g mol- I •
Le sulfate d'ammonium ordinaire a une masse molaire M 2 égale à 132 g mol-Jo Le volume (V)
d'eau distillée nécessaire pour diluer le sulfate d'ammonium marqué, doit être ajouté à V+200
ml pour avoir, après épandage de l'engrais marqué, un reliquat suffisant pour la détermination
au spectromètre de l'excès isotopique (a-') exact de la solution finale épandue, qUi
théoriquement est égal à 5% dans toutes nos expériences. Ainsi la formule (2) devient:
32
/'
Matériel et Méthodes
/
V+200
Q x 132,2 x 5
. ml =
------------x
132 x 10.32 + (132.2 - 132) x 5
V
"-.
V+200
ou encore ml = Q x 0,485 x - - V
7. Inoculation du haricot avec des souches de Rhizobium en station expérimentale
Une expérience a été mise en place à la station de Bel Air. Dans cette expérience, la variété
Bronco a été associée à@ souche de Rhizobium ISRA 353. L'expérience coITlPortait trois
~--
---
traitements répétés cinq fois : le haricot inoculé avec la souche ISRA 353 ( traitement
inoculation, 1); le haricot non inoculé et n'ayant pas reçu d'azote ( traitement témoin, T); le
haricot non inoculé et ayant reçu de l'azote sous forme d'urée apportée à la dose de 100 kg
urée/ha (traitement azote, N). Un dispositif totalement aléatoire a été adopté. Dans le
traitement l, les graines ont été inoculées au moment du semis en les enrobant avec un
inoculum-tourbe contenant 10 7 cellules (ISRA 353)/g à la dose de 300 g d'inoculum par
kilogramme de semence. Deux mois après le semis, les 10 plantes de la zone de prélèvement
(zone A, Fig. 6) de chaque parcelle élémentaire ont été récoltées pour mesurer la fixation de
l'azote exprimée par l'activité réductrice d'acétylène (ARA) des plantes, le poids sec des
parties aériennes, l'azote total des parties aériennes et des gousses. Au stade de maturi té des
gousses, les 10 plantes de la zone B des mêmes parcelles ont été récoltées pour déterminer les
rendements en gousses.
8. Évaluation de la fixation d'azote chez le haricot vert
La fixation biologique de l'azote chez le haricot a été mesurée sur les variétés Nérina,
Bronco et Rudy associées aux souches de Rhizobium ISRA 350, ISRA 353, [SRA 355, ISRA
554, ISRA 699 et ISRA 700. Elle a été mesurée au cours de deux expériences: la première;
mise en place dans une chambre de culture, en contrôlant les facteurs limitant la fixation de
l'azote (fixation potentielle) ; la seconde, conduite au champ où aucun facteur limitant la
fixation d'azote n'est contrôlée (fixation réelle).
8.1. Potentiel fixateur d'azote du haricot
Les trois variétés ont été cultivées en jarre Léonard et inoculées avec les six souches de
Rhizobium. Chaque traitement (variété de haricot x souche de Rhizobium) a été répété quatre
fois. L'inoculation a été réalisée une semaine après repiquage en apportant à chaque plantule 1
ml d'une suspension de Rhizobium contenant 109 cellules. Au bout de 40 jours de culture, les
33
/'
Matériel et Méthodes
plantules ont été~récoltées. La fixation biologique a été mesurée par l'activité réductrice
d'acétylène (ARA).
8.2. Azote
réeIIem~nt
fixé
Au champ, la quantité d'azote réellement fixé par les trois variétés inoculées avec les six
souches de Rhizobium a été mesurée à la station de Bel Air. L'expérience comprenait 18
traitements répétés quatre fois. L'inoculum à base de tourbe que nous avons produit contenait
pour chacune des six souches 10 7 cellules/g en moyenne. En se fondant sur l'équation (2) du
chapitre 4.2.2 le poids d'inoculum tourbe (P) nécessaire pour chaque traitemel!_!_a été de P =
"- " 3. 109 .10- 7 = 300 g tourbe par kilogramme de semences. Une solution adhésive de gomme
arabique à 10% a permis l'enrobage des graines avec l'inoculum. La fixation réelle au champ
a été évaluée par la méthode de dilution isotopique. Du sulfate d'ammonium marqué
C5NH4)2S04 à 5% d'excès isotopique en 15N a été épandu à la dose de 20 kg N/ha dans la zone
A de chaque parcelle. Dans le reste de la parcelle, la même dose de sulfate d'ammonium non
marquée a été appliquée. Au stade de remplissage des gousses (8 semaines après semis) les 10
plantes de la micro parcelle A ont été récoltées pour déterminer l'activité réductrice
d'acétylène, le poids sec des parties aériennes, la teneur en azote (%N) et l'excès isotopique
(%15Nei) des parties aériennes et des gousses ont été déterminés au laboratoire de l'AlEA à
Seibersdorf, Autriche et le pourcentage d'azote provenant de l'atmosphère (%Ndfa), de
l'engrais (%Ndff) et du sol (%Ndfs). A la fin de la douzième semaine, 10 autres plantes ont
été récoltées dans la micro parcelle B afin d'évaluer le rendement en gousses.
9. Influence du phosphore dans l'inoculation au champ
Des graines de la variété Nérina ont inoculées avec la souche de Rhizobium ISRA 353.
L"inoculum a été apporté sous forme de tourbe contenant 107 cellules/g à la dose de 300 g
d'inoculum par kilogramme de semences. Elles ont été semées immédiatement après
enrobage avec la tourbe dans les parcelles élémentaires, comme décrit au chapitre 2.8. Il y
avait cinq traitements répétés quatre fois : (i) un traitement témoin sans application de
phosphore; (ii) quatre traitements correspondant à quatre doses d'application de phosphore
apporté sous forme de phosphate supertriple : 12,24,36 et 48 kg P 20s/ha.
La fixation d'azote a été évaluée par la méthode de dilution isotopique. Du sulfate
d'ammonium marqué C5NH4)2S04 à 5% d'excès isotopique en 15N a été épandu à la dose de
20 kg N/ha dans la zone A de chaque parcelle. Dans le reste de la parcelle, la même dose de
sulfate d'ammonium non marquée a été appliquée. Huit semaines après semis les 10 plantes
34
Matériel et Méthodes
de la microparcelle A ont été récoltées. Les parties aériennes, les gousses et les nodules ont
été séchés et pesés. Les teneur en azote (%N) et en phosphore des parties aériennes ont été
déterminées au laboratoire d'analyse
sols~plantes-eaux
de l'ISRA/Centre National de
Recherches Agronomiques (CNRA) de Bambey. Les excès isotopiques en azote-15 (% 15Nei)
des parties aériennes et des gousses ont été déterminés au laboratoire de biochimie des sols du
centre ISRA-IRD de Dakar, Bel Air. Le pourcentage d'azote, dans les parties aériennes,
provenant de l'atmosphère (%Ndfa) a été calculé selon l'équation de Fried et Middelboe
( 1977).
10. Effet du N03- sur la nodulation du haricot vert
L'effet du nitrate sur la nodulation du haricot a été d'abord étudié sur la variété Bronco
associée à la souche de Rhizobium lSRA 353 en serre sur du sol dunaire. Puis en culture
hydroaéroponique, diverses souches de Rhizobium, dont la souche lSRA 353 ont été
comparées avec la souche de référence Rhizobium tropici CIAT899 associées à la variété
Nérina, ou diverses variétés de haricot inoculées avec la souche ISRA 353. Enfin une
troisième expérience consistait à observer l'interaction de la nutrition phosphatée avec
l'inhibition de la nodulation par N0 3-.
Ces dernières expériences ont été réalisées au laboratoire des symbioses racinaires de l'INRA
à Montpellier, en France.
10.1. Expériences en jarres Léonard
La variété Bronco a été cultivée en serre dans des jarres Léonard (l graine/jarre) et
inoculée avec la souche de Rhizobium lSRA 353. L'inoculum a été apporté sous forme liquide
(109 cellules/ml) à raison de 5 ml/jarre. Il y avait quatre traitements répétés quatre fois: 0 ;
2,5 ; 5 et 10 mM KN0 3 . Après 30 jours de culture, les plantes ont été récoltées et les nodules
ont été dénombrés sur chaque système racinaire.
10.2. Expériences en condition d'hydroaéroponie
10.2.1 Variabilité liée à la souche de Rhizobium
Des plantules de la variété Nérina prégermées en perlite ( cf. chapitre 2.3) ont été inoculées
avec chacune des six souches de Rhizobium, lSRA 355, ISRA 353, ISRA 554, ISRA 699,
lSRA 700 et ClAT 899 en trempant les racines préalablement lavées à l'eau distillée dans les
inoculums liquides respectifs contenant 109 cellules/ml pendant 20 min. Les plantules ont été
ensuite transférées dans des flacons sérum de 1 l contenant la solution nutritive de Drevon et
35
./
Matériel et Méthodes
al. (1988) comprenant des doses différentes de nitrate. Au moment du transfert des plantules
dans les flacons de sérum, une· deuxième inoculation avec les souches de Rhizobium a été
effectuée à raison de 1 ml par plantule avec quatre traitements correspondant à quatre"doses
"
.
de nitrate apporté sous fonne d~ Ca(NO})2: 0; 1 ; 2,5 et 10 mM NO}-. La solution a été
renouvelée chaque 2 semaines. Le pH a été maintenu 7,2 par ajout de 30 g de CaCa}. Pendant
les 15 premiers jours de croissance, les plantules ont reçu 2 mM d'urée leur pennettant ainsi
de subvenir à leurs besoins azotés entre l'épuisement des réserves cotylédonaires et le
démarrage du processus de la fixation d'azote. Le nitrate a été apporté dès l'apparition des
_R.remiers nodules fonctionnels, soit au premier changement de la solution, 15 jours après
repiquage. Les traitements sans nitrate ayant uniquement au premier changement 1 mM
d'urée. Le dispositif expérimental était en blocs avec trois répétitions
p~r
traitement.
. 10.2.2. Variabilité liée à la plante
Dans une deuxième expérience, 14 variétés (Antaré, BAT 477, Bonus, Coco, DB 96, DB
175, DB 7080, DB 8054,
DaR 364, Linex, Nérina, Portugal, T 260 et T 813) ont été
inoculées avec la souche de Rhizobium rSRA 353 comme décrit précédemment. Les plantules
ont été ensuite cultivées dans des bacs en PVC contenant la solution nutritive sans nitrate ou
avec 2,5 mM NO}", Le dispositif expérimental était en blocs de 2 bacs correspondant aux deux
traitements répétés cinq fois.
10.2.3. Interaction phosphore et nitrate
Les variétés BAT 477 et Nérina ont été inoculées comme précédemment avec les souches
de Rhizobium rSRA 353 et CrAT 899 et cultivées dans des flacons sérum en solution nutritive
sans nitrate et avec 2,5 mM de NO}". Les quatre traitements phosphore de 50, 75, 250 et 400
~mol
de phosphore par semaine ont été comparés en ajoutant dans les flacons chaque semaine
le volume correspondant en microlitre d'une solution molaire de KH 2P0 4 • Le dispositif
expérimental était en bloc de 16 traitements répétés quatre fois.
11. Effet des fongicides sur la nodulation
Les graines de la variété Paulista enrobées d'un fongicide: le Dichlofenthion-thiram
(DCT), ont été utilisées dans une expérience mise en place à la station de Bel Air.
L'expérience comprenait quatre traitements répétés cinq fois et disposés en blocs aléatoires:
semences sans DCT et inoculées avec la souche de Rhizobium rSRA 353 ; semences enrobées
avec DCT et inoculées avec la souche de Rhizobium rSRA 353 ; semences sans DCT et
36
./
Matériel et Méthodes
inoculées avec lasouche de Rhizobium ISRA 554 ; semences enrobées avec DCT et inoculées
avec la souche de Rhizobium ISRA 554.
L"inoculum de rl1izobium a été apporté sous forme de tourbe contenant )-0 7 cellules/g à la
dose de 300 g d'inoculum par kilogramme de semence.
La fixation d'azote a été évaluée comme précédemment par la méthode de dilution
isotopique. Du sulfate d'ammonium marqué ('5NH4)2S04 à 5% d'excès isotopique en 15N a été
épandu à la dose de 20 kg Nlha dans la zone A de chaque parcelle. Dans le reste de la
parcelle, la même dose--<ie sulfate d'ammonium non marqué a été appliquée.-l:Iuit semaines
après semis, les 10 plantes de la microparcelle A ont été récoltées. Les parties aériennes et les
nodules ont été séchés et pesés. La teneur en azote (%N) des parties aériennes a été
déterminée au laboratoire d'analyse sols-plantes-eaux de l'ISRA/Centre National de
Recherches Agronomiques (CNRA) de Bambey. L'excès isotopique en azote-15 (% 15 Nei) des
parties aériennes et des gousses a été déterminé au laboratoire de biochimie des sols du centre
ISRA-IRD de Dakar, Bel Air. Le pourcentage d'azote, dans les parties aériennes, provenant
de l'atmosphère (%Ndfa) a été calculé selon l'équation de Fried et Middelboe (1977).
12. Effet de la co-inoculation Rhizobium, Mycorhize et Pseudomonas fluorescens
Dans cette expérience réalisée en serre, du sol prélevé à la station de Bel Air a été réparti
dans des pots à raison de 5 kg par pot. La variété Nérina a été cultivée et arrosée
quotidiennement avec 100 ml d'eau distillée stérile. Les souches de Rhizobium rSRA 353 et
ISRA 554, la souche de champignon mycorhizien Glomus aggregatum et la souche de
Pseudomonas fluorescens 6F 16 ont été utilisées. Elles ont été cultivées dans leur milieu de
culture respectif (cf. chapitre 3). L'expérience comportait huit traitements répétés quatre fois:
(i) haricot inoculé avec la souche de Rhizobium ISRA 353 (plantes témoins) ; (ii) : haricot
inoculé avec la souche de Rhizobium rSRA 554 (plantes témoins); (iii) : haricot inoculé avec
la souche de Rhizobium rSRA 353 et la souche de Pseudomonas fluorescens 6F16 ; (iv) :
haricot inoculé avec la souche de Rhizobium rSRA 554 et la souche de Pseudomonas
fluorescens 6F 16 ; (v) : haricot inoculé avec la souche de Rhizobium ISRA 353 et la souche
de champignon mycorhizien Glomus aggregatum ; (vi) : haricot inoculé avec la souche de
Rhizobium ISRA 554 et la souche de champignon mycorhizien Glomus aggregatum ; (vii) :
haricot inoculé avec la souche de Rhizobium rSRA 353, la souche de champignon
mycorhizien Glomus aggregatum et la souche de Pseudomonas fluorescens 6F16 ; (viii) :
haricot inoculé avec la souche de Rhizobium rSRA 554, la souche de champignon
mycorhizien Glomus aggregatum et la souche de Pseudomonas fluorescens 6F16. Un
37
Matériel et Méthodes
dispositif en blocs aléatoires a été adopté. L'inoculation avec la souche de champignon
mycorhizien G. aggregatum a été effectuée au moment du semis en déposant dans le trou
d'inoculation 20 g de sable de plage contenant 261 spores de G. aggregatum. Les graines de
""'-,haricot ont été ensuite déposées sur ce sable. Les inoclIlums de chaque souche de Rhizobium
contenant 109 cellules/ml ont été apportés au même moment sur la graine à raison de 10 ml
par graine. Une semaine après le semis, l'inoculation avec la souche de P.jluorescens 6F16 a
été faite en déposant directement au niveau du système racinaire 5 ml de la culture
bactérienne contenant 109 bactéries/ml. Une solution de sulfate d'ammonium marqué
_CNH4)2S04 à 5°~~'excès isotopique en 15N a été apportée, 15 jours après_~e"!is à l'ensemble
des pots au taux de 50 mg N/plante. Trente cinq jours après le semis, les plantes ont été
récoltées. Le nombre de nodules, le poids sec des parties aériennes, les teneur en azote et en
phosphore, le taux de mycorhization et l'excès isotopique, le pourcentage d'azote provenant
de la fixation (%Ndfa), de l'engrais (%Ndff) et du sol (%Ndfs) ont été déterminés.
13. Mise en évidence de la production de substance inhibitrice par la souche de
Pseudomonas fluorescens 6F16
L'inhibition de la croissance des souches de Rhizobium ISRA 353 et ISRA 554 par des
substances toxiques produites par la souche de P. jluorescens 6F 16 a été testée conformément
à la méthode décrite par Gross et al. (1978).
Dix microlitres de la culture de P. jluorescens 6F 16 contenant 108 unités formant
colonie/ml ont été déposés à la surface du milieu TSA gélosé contenu dans des boîtes de Petri
en verre de façon à avoir trois dépôts sur la boîte. Les boîtes de Petri ont été ensuite incubées
dans l'étuve à 30 0 e pendant 24 h jusqu'à apparition de colonies. Les colonies obtenues ont
été exposées pendant 5 min aux vapeurs de chloroforme (2 ml) létale pour les Pseudomonas.
Les boîtes ont été par la suite ensemencées en inondant le milieu gélosé avec 4 ml de la
culture liquide de chaque souche de Rhizobium (ISRA 353 ou ISRA 554). Après avoir éliminé
l'excédant d'inoculum de rhizobium, les boîtes ont été laissées ouvertes pendant 10 min sous
la hôte afin de les sécher. Elles ont été de nouveau incubées à l'étuve à 30 0 e pendant 24 h.
Après cette période d'incubation, la présence ou l'absence d'auréole d'inhibition autour de la
souche de P. jluorescens a été notée.
14. Essais multilocaux d'inoculation du haricot avec des souches de Rhizobium
Des essais multilocaux d'inoculation de la variété Nérina avec des souches de Rhizobium
ISRA 353 et ISRA 554 ont été réalisés en 1999 et 2000 dans quatre localités de la zone des
38
Matériel et Méthodes
~
Niayes: Bambilor, Gorom 1, Km50 et Sangalcam. Lé dispositif expérimental, identique dans
ces quatre localités, était totalement aléatoire. Les différents traitements ont été : (i) haricot
non inoculé et n'ayant pas reçu d'azote, témoin; (ii) haricot non inoculé mais ayant reçu de
~
~
l'àzote sous forme d'amendement organique apportée selon la pratique paysanne locale (PP) ;
(iii) haricot inoculé avec la souche de Rhizobium ISRA 353 ; (iv) haricot inoculé avec la
souche de Rhizobium ISRA 554. L'inoculum de rhizobium a été apporté aux graines au
moment du semis sous forme de tourbe: les graines ont été enrobées avec l' inoculum tourbe
. contenant 10 7 cellules/g à la dose de 300 g d'inoculum par kilogramme de semences. Une
solution de sulfate.__d.:.ammonium marqué C5NH4)2S04 à 5o/o-d'excès isotopique.en 15N a été
apportée, à la dose de 20 kg N/ha dans la zone A de toutes les parcelles 15 jours après semis.
Deux mois après le semis, les plantes de la zone A de chaque parcelle élémentaire ont été
récoltées. Les parties aériennes et les gousses ont été séchées et pesées, et leur excès
isotopique (% '5 Nei) déterminé au laboratoire de biochimie des sols du centre ISRA-IRD de
Dakar, Bel Air. Au stade de maturité, le rendement en gousses a été déterminé sur les plantes
de la zone B où deux récoltes ont été effectuées en 1999 et une seule en 2000.
15. Étude de la compétitivité
La compétitivité des souches de Rhizobium ISRA 353 et ISRA 554 a été étudiée sur trois
sols de la zone des Niayes : station expérimentale de ENDA SYSPRO, à Yenne et Keur
Daouda Ndiaye. Les pH eau respectifs ont été de : 8,18 ; 7,65 et 7,75. Les graines de la
variété Nérina enrobées avec de l'inoculum tourbe pour chaque souche ont été semées dans
des pots contenant 2 Kg de sol. Pour chaque traitement, quatre répétitions ont été effectuées et
dans chaque sol quatre plantes non inoculées ont servi de témoins. Au bout de 30 jours de
croissance, les plantes ont été récoltées, les nodules récupérés pour l'extraction de l'ADN
nodulaire (bactérien).
15.1. Extraction et purification d'ADN nodulaire
Avant l'extraction, les nodules ont été d'abord stérilisés superficiellement à l'hypochlorite
de calcium saturé pendant 5 min et lavés plusieurs fois à l'eau distillée stérile puis trempés
dans l'alcool 96° pendant 5 min avant d'être lavés à nouveau à l'eau distillée. Les nodules ont
été conservés à - 20 0 e dans du glycérol 60%.
L'extraction de l'ADN a été effectuée dans un tube Eppendorf stérile contenant le nodule
dans lequel 150 ,.ll d'eau ultra pure ont été rajoutés. Le nodule a été ensuite broyé à l'aide d'un
poter en plastique stérilisé à l'alcool 96° et passé à la flamme. 150 III du tampon d'extraction
39
,/\
Matériel et Méthodes
2X ont été rajoutés au broyat. Pour la lyse des celluies les tubes ont été trempés pendant 1 h
au bain-marie à 65°C. Après une centrifugation pendant 15 min à 13000 rpm le surnageant a
été recueilli (débris cellulaire éliminés). Au surnageant, 300 j..tl de phénol chloroforme ont été
'.::::
ajoutés et le mélange des deux phases s'effectue pâr retournement jusqu'à ce qu'il se forme
une émulsion. Une deuxième centrifugation à 13000 rpm pendant 15 min permet de récupérer
la phase aqueuse dans laquelle du chloroforme-alcool iso amylique a été ajouté. Après cette
extraction au chloroforme-alcool iso amylique, la phase supérieure est récupérée tout en
notant le volume exact. On ajoute 11 10 volumes d'acétate de sodium 3 M pour un volume de
surnageant-et-2-,S-volumes d'éthanol absolu froid:---èes tubes ont été..placés à -20°C pendant
une nuit, ensuite centrifugés pendant 30 min à 13000 rpm, le surnageant a été éliminé et un
volume d'éthanol à 70 % ajouté pour laver le culot d'ADN. Après une centrifugation pendant
15 min à 13000 rpm, le surnageant a été soigneusement éliminé puis les culots sont séchés 30
min au Speed Vac. Ces culots ont été par la suite dissous dans 20
~I
d'eau ultra pure stérile et
l'ADN conservé à -20°e.
15.2. Dosage de l'ADN extrait
Un volume de 50 III de l'ADN extrait a été dosé au spectrophotomètre pour faire une
analyse quantitative et qualitative de l'ADN. Un balayage des longueurs d'ondes comprises
entre 200 et 360 nm a été effectué pour l'ensemble des échantillons analysés. La densité
optique à 260 nm a été corrélée à la concentration d'ADN en solution, il a été montré qu'une
solution d'ADN à 50
~glml
à une densité optique de 1. La quantité d'ADN a été déterminée
de la manière suivante:
QADN (Ilg/ml)
= 50 x D0260 x facteur de dilution
Pour contrôler la pureté de l'ADN en suspension, il faut vérifier que:
a = 00260/00280 est compris entre 1,8 et 2.
15.3. Amplification enzymatique de l'ICS 16S/23S
L'ADN extrait des nodules constitue l'ADN matrice employé pour l'amplification de l'IGS.
La réaction d'amplification s'effectue sur un volume total de 25
~I
contenant pour chaque
réaction une bille lyophilisée renfermant 1,5 U de taq polymérase, 10 mM Tris-HCl, (pH 9 à
la température ambiante), 50 ng d'ADN génomique (un témoin négatif sans ADN est inclus
dans l'expérience). La PCR est une succession d'étapes de dénaturation, hybridation et
d'élongation. Les échantillons ont été ensuite laissés 3 min à
noc
afin de terminer
40
... / \
Matériel et Méth6dès
l'élongation des brinscompléme!l~ires.
Afin de_visualiser les produits de l'amplification, 3 JlI du mélange réactionnel ont été
déposés sur un gel d'agarose 1%. Après 1 h de migration à 80 V dans une cuve horizontale
~
~
contenant un tampon TBE (Tris Borate EDTA), le gel a été coloré pendant 30 min dans une
solution de BET (Bromure d'Ethidium) et photographié sous UV avec le Gel Doc.
15.4. RFLP sur les fragments amplifiés
La RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) consiste à couper par différentes
endonucléases de restriction, un fragment d'ADN donnant, pour chaque endonucléase, un
.. - profilde restriction type.
Suivant l'intensité de la bande d'amplification 5 à 10 Jll sont digérés par lOU d'enzymes dans
un volume réactionnel de 20 Jll à 37°C pendant 2 h. Les fragments digérés ont été déposés sur
gel d'agarose Métaphor horizontal à 2,5%. Ils ont été ensuite soumis à une électrophorèse.
Après 3 h de migration à 80 V dans une cuve horizontale contenant du tampon TBE, le gel a
été coloré pendant 30 min dans une solution de BET et photographié sous UV avec le Gel
Doc.
Traitements et analyse des données
Pour toutes les expériences les données ont été statistiquement traitées avec une analyse de
variance (ANDVA P = 0,05) en utilisant les logiciels informatique Microsoft Excel et Staticf.
41
t
CHAPITRE III
RESULTATS
t.
/\
·/
Résultats
I. Réponse du haricot à l'inoculation avec des souches de Rhizobium _
Lors de l'inoculation de la variété Bronco'avec la souche de Rhizobium ISRA 353,
aucun~
"'"
différence significative n'a été observée sur le poids sec des parties aériennes entre les plantes
témoins, les plantes ayant reçu 100 kg d'uréelha et les plantes inoculées avec la souche de
Rhizobium ISRA 353 (Tableau 8). Par contre, le poids de nodules secs, très négligeable chez
les plantes témoins, a été quatre fois supérieur chez les plantes inoculées avec la souche de
Rhizobium ISRA 353 (poids sec moyen de 257 mg/pl) que chez les plantes ayant reçu 100 kg
d'urée (poicfssec moyen de 60 mg/pl). Le rendement en gousses,- identique chez les plantes
inoculées et celles ayant reçu 100 'kg d'urée (rendement moyen de 3200 kglha) a été plus
élevé (+52%) que chez les plantes témoins alors qu'il n'y a-pas eu de différence significative
entre les trois traitements en ce qui concerne l'azote total accumulé dans les parties aériennes
ou dans les gousses (Tableau 8).
Tableau 8 : Poids sec des parties aériennes (PA) et des nodules, rendement (Rdt) en gousses et azote total des
parties aériennes et des gousses de la variété Bronco cultivée à la station expérimentale de Bel Air inoculée avec
la souche de Rhizobium ISRA 353, ou ayant reçu de l'urée apportée à la dose de 100 kglha.
Poids sec Nodules
(mg/pl)
Poids sec PA·
(kglha)
,
2142,0 a
Rdt gousses
(kglha)
Azote total PA
(kg/ha)
Azote total Gousses
(kglha)
2100 b
36,5 a
23,5 a
1,2 c
Azote (urée: 1OOkg /ha)
2490,5 a
2900 a
44,5 a
29,5 a
60,0 b
ISRA 353
2268,5 a
3500 a
46,0 a
35,0 a
256,6 a
17,6
20,2
18,6
26,9
129,6
Traitements
Témoin
CV (%)
• : parties aériennes comprend les feuilles et les tiges
Dans chaque colonne, les valeurs suivies d'une même lettre ne sont pas significativement différentes au seuil de 5% d'après
le test de Newman et keuls.
Il ya eu donc à la station de Bel Air un effet significatif de l'inoculation avec la souche de
Rhizobium rSRA 353 sur le rendement en gousses de la variété Bronco. Il devenait alors
nécessaire de sélectionner dans nos collections de variétés et de souches de Rhizobium
disponibles à ce stade de notre étude, l'association «variété x souche de Rhizobium» la plus
effective en estimant la quantité d'azote fixé en conditions contrqlées (fixation potentielle) et
en conditions non contrôlées (fixation réelle).
1.1. Sélection des associations à fort potentiel fixateur d'azote
L'ANOVA effectuée sur les différents paramètres mesurés (Tableau 9) a montre que quelle
42
· Résultats
que soit la souche de Rhizobium utilisée pour itlOculer les plantes, les variétés Rudy et Nérina
ont eu un poids sec des parties aériènnes identique, et significativement supérieur (+ 45,7%) à
celui de la variété Bronco (Fig. 8). Les variétés Nérina et Rudy pourraient être sélectionnées
pour l'inoculation du haricot.
"-
L' ANOVA a également montré un effet significatif des souches de Rhizobium sur le poids
sec des parties aériennes et sur l'activité réductrice d'acétylène (Tableau 9). Quelle que soit la
variété de haricot, on a distingué trois groupes de souches de Rhizobium classées en fonction
de leur effectivité exprimée par le poids des parties aériennes sèches des plantes (Tableau 10)
: un premier-groupe représenté par la souche de Rhizobium ISRA 70ü significativement plus
effective (+67%) que la souche ISRA 350 représentant le second groupe; il Y a un troisième
groupe représenté par les souches ISRA 353, ISRA 355, ISRA 554 et ISRA 699 qui, avec une
effectivité équivalente, peut être considéré comme intermédiaire entre les deux groupes
décrits précédemment. En exprimant l'effectivité des souches de Rhizobium par l'ARA par
plante ou par l'ARA spécifique, la souche ISRA 554 a eu en moyenne une activité deux fois
supérieure à la moyenne des activités de toutes les autres souches. La souche ISRA 554
pourrait donc être sélectionnée pour l'inoculation du haricot.
Par contre, l'ANOVA (Tableau 9) n'a montré aucun effet significatif des souches de
Rhizobium ou des variétés de haricot sur le poids sec des nodules. Il n'y a pas eu non plus
d'interaction entre les deux facteurs, quelque soit le paramètre observé.
1.2. Sélection de associations à fort capacité réelle de fixation d'azote
Le choix des variétés Nérina et Rudy et de la souche ISRA 554 pour l'inoculation du
haricot devrait être confimlé en reconduisant la même expérience en station expérimentale. A
la station de Bel Air, un effet principal significatif des variétés a été observé sur tous les
paramètres de croissance, de rendement et de fixation d'azote mesurés chez les trois variétés
de haricot Bronco, Nérina et Rudy (Tableau Il) à l'exception de l'excès isotopique en azote15 (% '5Nei) et de la teneur en azote (%N). La variabilité génétique ainsi observée est décrite
en détail dans les paragraphes 1.2.1. et 1.2.2. Par contre, aucun effet principal significatif des
souches de Rhizobium n'a été mis en évidence par l'ANOVA des mêmes paramètres: il n'y a
donc pas eu de différence significative entre les six souches de Rhizobium testées sur le poids
sec des parties aériennes, l'excès isotopique en azote-15, le pourcentage et la quantité d'azote,
dans ces parties aériennes, dérivé de l'atmosphère (Tableau 12). Il n'y a pas eu non plus
d'interaction significative entre les deux facteurs sur les paramètres mesurés (Tableau Il).
43
./
\
Résultats
~
~
600
5, 500
Il)
2
Il)
ï:::
.~
400
300
'" 200 .
O€.__
'~"
. ....
-
0.
'"
'"
·ô
-0
100
0
+-_-----.J'-_ _-'-L_ _..---_ _ J'-_ _-'-
c..
..---_ _J'-_ _-'-_----,
Rudy
Bronco
Nérina
Variétés de haricot
Figure 8 : Poids sec des parties aériennes de trois variétés de haricot (Bronco,
Nérina et Rudy) cultivées en jarre Léonard pendant 40 jours et inoculées avec
les souches de Rhzobium ISRA 350, ISRA 353, ISRA 355, ISRA 554, ISRA
699 et ISRA 700.
Tableau 9 : Valeurs de F obtenues dans l'analyse de variance (ANOVA) du poids des parties aériennes et des
nodules secs et de l'activité réductrice d'acétylène (ARA) de trois variétés de haricot (Phaseolus vulgaris),
Nérina, Bronco et Rudy, cultivées pendant 40 jours en jarre Léonard contenant du sol stérile et inoculées avec
les souches de Rhizobium ISRA 350, ISRA 353, ISRA 355, ISRA 554, ISRA 699 et ISRA 700.
Poids sec
Sources de variation
ddl
P. aériennes
Nodules
ARA
Par Plante
Spécifique
Variétés de haricot (A)
2
11,86*
0,75
0,28
1,40
Souches de Rhizobium (8)
5
3,95*
3,00·
3,76·
3,27*
10
1,35
1,65
1,17
1,09
28,80
45,20
78,50
74,50
AxB
CV (%) ••
• : significatif à p=0,05 d'après le test de Newman et Keuls.
•• les coefficients de variation (C.V.) élevés au niveau de l'ARA et ARAS sont dus aux nuctuations intervenant lors de la mesure.
44
"\ .
.
Résultats
Tableau 10: Poids sec des parties aériennes (PSPA) et activité réductrice d'acétylène (ARA, ARAS) de trois
variétés de haricot, Nérina, Bronco et Rudy, cultivées pendant 40 jours en jarre Léonard contenant du sol stérile
et inoculées avec les souches de Rhizobium ISRA 350, ISRA 353, ISRA 355, ISRA 554, ISRA 699 et ISRA
700.
PSPA
(g/plante)
Poids sec nodules ARA
(mg/plante)
(mmole C 2H/plante/h)
ISRA 350
0,40 b
31,29 b
2,5 b
64,9 ab
ISRA 353
0,50 ab
46,00 a
1,6 b
36,1 b
ISRA 355
0,51 ab
45,69 a
2,9 b
65,1 ab
ISRA 554
0,46 ab
~7,36
a
4,3 a
104,6 a
ISRA 699
0,47 ab
59,80 a
1,8 b
48,6 b
ISRA 700
0,61 a
52,93 a
2,1 b
48,7 b
Souche de Rhizobium
---- - -
ARAS
(nmole C 2H/plantelh/mg)
Dans chaque colonne, les valeurs suivies d'une même lettre ne sont pas significativement différentes au seuil de 5% d'après le test de
Newman et Keuls.
45
R'ésultats
.,
Tableau II : Le test F de l'analyse de variance du poids sec des parties aériennes, des gousses et des nodules, l'activité réductrice d'acétylène (ARA) et la fixation d'aZote de
trois variétés de haricot cultivées à la station expérimentale de Bel Air pendant 2 mois et inoculées avec les souches ISRA 350, ISRA 353, ISRA 355, ISRA 554, ISRA 699 et
ISRA 700.
Poids sec
Sources de variation
Souches de Rhizobium (A)
Variétés de haricot (B)
AxB
CV (%)
ddl
5
2
10
P. aériennes
0,16
4,35*
1,51
34,6
Gousses
Nodules
0,55
0,36
4,56*
0,93
52,7
N%df
ARA
5,93*
1,21
126,6
Par plante Spécifique
0,79
1,90
8,43*
4,81*
1,42
0,82
127,60
64,30
%N
1,61
%lsNei
0,78
NTotal
0,28
1,07
2,48
5,12
1,07
0,81
1,67
18,5
12,9
Atm.
38,4
i
Nd f
Engrais Sol
Atm.
(Engrai~ Sol
0,78
0,94
0,78 1
0,6~
0,06
2,48
2,69
2,48
4,57*
4,83*
3,8(
0,81
0,77
0,81
0,92
1,32
1,0:
62,0
13,2
78,3
13,2
\
·36,9
40,4
* : sÎgnificatif à p=O,OS d'après le test de Newman et Keuls.
\
/
46
O,il
/'
Résultats
Tableau 12: Poids sec des parties aériennes (PSPA) et des nodules (PSNod), activité réductrice d'acétylène
(ARA et ARAS), excès isotopique en azote-15 (%,sNei) et pourcentage (%Ndfa) et quantité (Ndfa) d'azote
dérivé de l'atmosphère de trois variétés de haricot (Phaseolus vulgaris), cultivées à la station expérimentale de
Bel Air pendant 2 mois et inoculées avec les souches de Rhizobium ISRA 350, ISRA 353, ISRA 355, ISRA 554,
ISRA 699 et ISRA 700.
Souches de Rhizobium
PSPA (kg/ha)
ARNplante
(mmole C 2H/h)
PSNod
ARA spécifique
(mg/plante) (nmole C 2H/hlg) %,sNei
%Ndfa
Ndfa (kg N:ha)
ISRA 350
168 c
4,06 a
358,08 a
76,63 a
0,37 a
18,01 a
4,85 a
ISRA 353
429 a
2,88 a
403,92 a
67,48 a
0,38 a
15,08 a
4,00 ab
ISRA 355
231 b
1,95 a
283,05 a
79,78 a
0,39 a
13,15 a
3,00 b
ISItA: 55'r
193 c
3,37 a
354,J7a
79~r-2
0,37 a
17,46 a
4,00 ab
ISRA 699
205 b
2,04 a
455,42 a
34,34 a
0,36 a
19,50 a
4,60 ab
ISRA 700
225 b
1,94 a
245,88 a
64,14 a
0,36 a
20,42 a
5,10 a
a-
Dans chaque colonne, les valeurs suivies d'une même lellre ne sont pas significativement différentes au seuil de 5% d'après le test de
Newman et Keuls.
1.2.1. Variabilité génétique dans le rendement et la nodulation entre les variétés
Quel que soit la souche de Rhizobium utilisée pour inoculer les trois variétés de haricot, le
poids sec des parties aériennes de la variété Nérina, identique à celui de la variété Bronco, a
été significativement plus élevé (+ 350%) que celui de la variété Rudy (Tableau 13) qui, par
contre, avec la variété Nérina a eu le meilleur rendement en gousses. La variété Nérina a eu
également un poids sec des nodules respectivement deux et trois fois plus élevé que ceux des
variétés Bronco et Rudy : 98 mg/pl contre une moyenne de 38, 5 mg/pl (Tableau 13). Ainsi la
variété Nérina a été plus perfonnante que les deux autres variétés Bronco et Rudy, confinnant
la sélection faite quand les variétés étaient cultivées dans les jarres Léonard.
1.2.2. Variabilité génétique dans laflXation biologique d'azote entre les variétés
Bien que la teneur en azote des parties aériennes des plantes ait été la même chez toutes les
variétés, l'azote total, similaire chez les variétés Nérina et Bronco a été plus élevé (+36,8%)
que chez la variété Rudy (Tableau 14) mesuré par l'ARA, la capacité fixatrice d'azote des
variétés a été significativement différente (Tableau 14). En effet, l'ARA par plante de la
variété Nérina a été respectivement deux et quatre fois plus élevée que celle de la variété
Bronco et de celle de la variété Rudy. Cependant les activités spécifiques (ARAS) des
variétés Nérina et Bronco ont été similaires et supérieures à celle de la variété Rudy (+ 55%).
Avec la méthode de dilution isotopique de l'azote-15, le pourcentage (%Ndfa) et la quantité
(Ndfa) d'azote fixé estimés dans les parties aériennes chez les variétés Nérina et Bronco
(respectivement + 42% et + 95% en moyenne) ont été plus élevés que chez la variété Rudy
47
Résultats
(Tableau 14). La technique de dilution isotopique de l'azote-15 nous a permis également de
monter que bien qu'aucune différence statistique n'ait été observée sur le pourcentage d'azote
dans les parties aériennes provenlltlt du sol (%Ndfs) entre les trois variétés, la valeur qu
%Ndfs estimée chez la variété Nérina a été moins élevée que celle estimée chez les deux
autres variétés (Tableau 14). Ceci confirme encore la sélection de la variété Nérina en mettant
en valeur la variété Bronco.
La variété Nérina, présentant un meilleur rendement, une meilleure capacité fixatrice
d'azote et une meilleure aptitude à économiser l'azote du sol, a donc été retenue pour la suite
des expérimentations visant en particulier à proposer le.s souches de Rhizobium comme une
alternative à l'emploi des engrais azotés minéraux pour améliorer la production du haricot
dans la zone des Niayes où les principaux facteurs limitant la FBA sont les fortes teneurs des
sols en nitrate et leur pauvreté en phosphore. Dans ces expérimentations, la variété Nérina
sera associée avec une des souches de Rhizobium rSRA 353 ou ISRA 554.
Tableau 13 : Poids sec des parties aériennes, des gousses et des nodules des trois variétés de haricot: Bronco,
Nérina et Rudy, inoculées avec les souches de Rhizobium ISRA 350, ISRA 353, ISRA 355, ISRA 554, ISRA
699 et ISRA 700 et cultivées à la station expérimentale de Bel Air pendant 2 mois.
Poids sec
Variété de haricot
Partie aérienne Gousse
(kglha)
(kglha)
Nodule
Bronco
845 ab
175 b
49,73 b
Rudy
685 b
280 a
27,40 b
Nérina
925 a
225 ab
98,91 a
(mg/pl)
Pour chaque colonne, les valeurs suivies d'une même lettre ne sont pas significativement différentes au seuil de 5% d'après le test de
Newman et Keuls
48
Résultats
Tableau 14: Teneur et quantité d'azote (%Net Ntotal), excès isotopique (% '5 Nei), pourcentage et quantité d'azote dérivant de la fixation (Ndfa), de l'engrais (Ndfl) et.du sol
(Ndfs) et activité réductrice d'acétylène des trois variétés de haricot: Bronco, Nérina et Rudy, inoculées avec les souches de Rhizobium ISRA 350, ISRA 353, ISRA 355~
ISRA 554, ISRA 699 et ISRA 700 et cultivées à la station expérimentale de Bel Air pendant 2 mois.
ARAJplante
Variété de
ARA Spécifique
Ntotal
Ndfa
Ndff
Ndfs
haricot
%N
%15Nei
(mmoleC 2HiPl/h)
(nrnole C 2Hipl/h/mg)
(kgNlha)
%Ndfa
%Ndff
%Ndfs
(kgNlha)
(kgNlha)
(kgNlha)
Bronco
2,72 a
0,37 b
3,9 b
79,08 a
22,93 a
18,59 a
7,38 a
74,04
4,80 a
1,68 ab
15,83 ab
Rudy
2,58 a
0,39 a
1,4 c
52,04 b
17,52 b
13,36 b
7,88 a
78,79
2,59 b
1,35 b
Nérina
2,79 a
0,36 b
8,1 a
82,60 a
25,03 a
19,86 a
7,26 a
72,88
5,30 a
1,88 a
\
/
i
13,69 b
18,89 a
Pour chaque colonne, les valeurs suivies d'une même lettre ne sont pas significativement différentes au seuil de 5% d'après le test de Newman et Keuls.
\
/
./
Résultats
2. Effet du phosphore sur la croissance, la nodulation et la fixation d'azote chez la
variété Nérina associée à la souche de Rhizobium ISRA 353
L'association «variété Nérina x souche 'oe Rhizobium ISRA 353» a été utilisée pour
détenniner la dose minimale de phosphore applicable au champ à Bel Air (30 ppm P) pour
une fixation d'azote efficiente. Suite à une très mauvaise croissance des plantes (nécrose des
racines d'origine inconnue) au niveau de deux répétitions du traitement avec 24 kg P20/ha,
les valeurs observées sur les plantes de ce traitement n'ont pas été tenues en considération
dans l'interprétation de nos résultats.
2.1. Croissance, rendement en gousses et nodulation du haricot
Aucune différence significative n'a été observée entre les doses d'application de
phosphore sur le poids sec des parties aériennes (Tableau 15). Il Y a eu cependant une
augmentation par rapport au traitement témoin n'ayant pas reçu de phosphore: + 41 % en
moyenne. Par contre, l'apport de phosphore à des doses croissantes a significativement
diminué les rendements en gousses: - 14%, - 22% et - 20% respectivement pour les doses de
12,36 et 48 kg P20/ha, bien qu'aucune différence n'ait été observée entre les deux dernières
doses. En ce qui concerne les nodules, l'apport de 12 kg P20/ha n'a pas augmenté
significativement le poids sec, mais une augmentation significative a été observée pour les
doses de 36 et 48 kg P20/ha : + 17% en moyenne.
2.2. Teneur en phosphore et excès isotopique en azote-15
Le phosphore, apporté à 12 kg P20/ha, n'a pas eu d'effet sur la teneur en phosphore (%P)
et l'excès isotopique (%,sNei) des parties aériennes qui ont été significativement diminués
avec un apport de 36 kg P20/ha : - 20% (Tableau 15) et - 15% (Tableau 16) respectivement.
Cette diminution a été corrigée par l'apport de 48 kg Pp/ha: augmentation de 15% par
rapport à l'apport de 36 kg Pp/ha dans les deux cas.
Sur les gousses, il n' y a pas eu de différence significative entre les doses de phosphore sur
la teneur en phosphore (Tableau 15). Par contre, l'excès isotopique a significativement été
diminué avec l'apport de 36 kg P20/ha (- 28%) par rapport à la moyenne obtenue sur les
plantes n'ayant pas ou ayant reçu 12 kg P 20/ha qui n'ont pas présenté de différence
significative entre elles (Tableau 16). L'apport de 48 kg P20/ha a eu également un effet
similaire à celui de 12 kg P 20/ha sur l'excès isotopique en azote-IS.
Au niveau des parties aériennes, il n'y a pas eu de différence significative sur le
50
./
Résultats
pourcentage d'azote dérivé de l'atmosphère (%Ndfa) entre d'une part, les plantes n'ayant pas
reçu du phosphore et les plantes ayant reçu 12 kg P20/ha, et d'autre part, les plantes ayant
reçu 36 et 48 kg P20/ha (Tableau 16). Cependant, le %Ndfa a été significativement plus
~
~
.
élevé dans le second groupe de plantes (+ 15%) que dans le premier groupe. Néanmoins, il
n'y a pas eu de différence significative entre les doses d'application de phosphore sur la
quantité d'azote fixé (Ndfa) dans les parties aériennes, qui, avec une moyenne de 9,86 kg
N/ha a été significativement plus élevée (+ 63%) que celle des plantes n'ayant pas reçu de
phosphore.
-- Au niveau des gousses des différences significatives n'ont pas été obtenues avec
l'application de différentes doses de P, aussi bien pour le pourcentage d'azote que pour la
quantité d'azote fixé.
Tableau 15 : Poids sec des parties aériennes, rendement en gousses, pourcentage en phosphore (%P) et quantité
de phosphore de la variété Nérina cultivée à la station de Bel Air à différentes doses de phosphore et inoculée
avec la souche de Rhizobium rSRA 353.
Organes de la
plante
Partie aérienne
Pp~
Poids sec
(kg!ha)
(kg!ha) *
%P
Ptotal
(kglha)
0
875 b
0,349 a
3,05 a
12
1265 a
0,308 a
4,15 a
36
1085 a
0,276 b
2,95 b
48
1340 a
0,317 a
4,20 a
20,9
C.V. (%)
Gousse
C.V. (%)
26,5
0
1040 a
0,420 a
3,20 a
12
915 b
0,399 a
3,65 a
36
850 c
0,385 a
3,20 a
48
865 c
0,398 a
3,35 a
C.V. (%)
Nodules
8,4
28,9
0
264 b
12
267 b
36
311 a
48
307 a
7,5
26,3
31,5
Pour chaque colonne, et pour chaque organe de la planle, les valeurs suivies d'une même lettre ne sont pas significativement différentes au
seuil de 5% d'après le test de Newman et Keuls.
* : le poids sec des nodules est exprimé en mgll 0 plantes
51
Résultats
Tableau 16 : Excès isotopique (%lsNei), pourcentage et quantité d'azote dérivant de la fixation (Ndfa), de
l'engrais (Ndfl) et du sol (Ndfs) des parties aériennes et gousses de la variété Nérina cultivée à la station de Bel
Air à différentes doses de phosphQre et inoculée avec la souche de Rhizobium rSRA 353.
"
Organes de la plante
Partie aérienne
%lsNei
%Ndfa
%Ndff
%Ndfs
°
0,429 a
46,78 b
8,58 a
12
0,458 a
43,21 b
36
0,364 b
0,419 a
P20S
(kglha)
48
---10,4
C.V. (%)
Gousse
Ndfa
(kg/ha)
Ndff
(kg/ha)
Ndfs
(kg/ha)
44,64 a
6,05 b
1,2 b
5,95 b
9,16 a
47,64 a
8,65 a
1,8 a
9,35 a
54,90 a
7,27 b
37,83 b
10,80 a
1,5 a
7,65 a
48,74 a
8,39 a
43,63 a
10,15 a
1,6 a
9,15 a
10,4
21,2
21,2
L1,2
10,7
--10,4-
°
0,360 a
55,40 a
7,19 a
37,42 a
22,15 a
2,60 a
13,35 a
12
0,311 a
61,35 a
6,23 b
32,42 b
15,00 a
1,55 a
8,00 b
36
0,262 b
67,49 a
5,24 b
27,27 b
22,30 a
1,85 a
9,70 a
0,356 a
55,86 a
7, Il a
37,02 a
12,50 a
1,45 b
7,60 b
20,7
15,9
20,7
20,7
51,4
44,6
44,9
48
C.V. (%)
Pour chaque colonne, et pour chaque organe de la plante, les valeurs suivies d'une même lettre ne sont pas significativement différentes au
seuil de 5% d'après le test de Newman et Keuls_
3. Effet du nitrate sur la symbiose Rhizobium- haricot
3.1. Sur la nodulation
En jarre Léonard, un accroissement significative de + 146% de la nodulation a été noté
après 30 jours de culture avec 2,5 mM de KNO J comparé au témoin sans nitrate (Fig. 9). Pour
des concentrations supérieures de nitrate, la nodulation diminue considérablement de 172 à 5
puis 0 nodules par plante à 2,5 ; 5 et 10 mM KNO] respectivement. La dose de 2,5 mM NO]'
était donc la dose seuil de nitrate au delà de laquelle, il y a une inhibition de la nodulation de
la variété Bronco inoculée avec la souche lSRA 353.
En culture hydroaéroponie, les résultats ont montré une variabilité dans la réponse du
haricot à l'inoculation selon la souche de Rhizobium (Fig. 10). En effet la concentration de 2,5
mM stimule différemment la nodulation par rapport au témoin 0 mM NO] -. Les nodules sont
généralement plus nombreux dans le groupe de souches formé par les Rhizobium lSRA 353,
lSRA 699, lSRA 700 et lSRA 554 avec une augmentation respective en nombre de 340%,
>
93%, 37% et 246%. Dans ce groupe le poids de nodules formés a été 13 fois plus chez lSRA
353, 3 fois plus chez lSRA 699 et 2 fois plus chez les deux autres. Avec lSRA 355 le nombre
de nodule a été augmenté de 84% avec par contre une baisse de -20% de poids des nodules.
Avec la souche ClAT 899 on observe une baisse en nombre (-34%) et en poids des nodules (-
52
Résultats
35%). A la concentration de 10 mM N0 3-, seule les nodules fonnésJpar la souche lSRA 353
ont été augmentés en nombre (+62%) et en poids (+24%), chez les autres souches, la
nodulation a diminué de -72%, -36%, -93%, -31 % et -92%, respectivement pour lSRA 699,
".
"
ISRA 700, lSRA 554, lSRA 355 et ClAT 899 ainsi que le poids des nodulès : -85%, 80%, 98%, -83% et -98%.
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nitrate (KND3 mMlI)
Figure 9: Nombre de nodules de la variété Bronco inoculée
avec la souche de Rhizobium ISRA 353 et cultivée en jarreLéonard à différentes concentration en nitrate
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4
6
8
10
12
Nitrate mM N03-/semaine
Figure 10 : Nombre de nodules de la variété Nérina inoculée avec les
souches de Rhizobium ISRA 700, ISRA 353, ISRA 699, ISRA 554; ISRA
355 et ClAT 899 cultivée en hydroaéroponie à différentes concentration en
nitrate.
53
Résultats
J.2. Effet du macrosymbionte sur la nodulation sous nitrate Les données du tableau 17 montrent une variabilité génétique de la nodulation du haricot
en condition d'hydroaéroponie. Ces données permettent de distinguer pour la concentration
de 2,5 mM NO)-, 4 groupes de sensibilité avec des différences sign'incatives de nombre et/ou
de poids sec des nodules.
- DB 7080 a une moyenne de 61 nodules par plante, correspondant à un poids de· matière
sèche nodulaire de 71,94 mg.
- les variétés BAT 477, DOR 364 et Coco constituent un autre groupe de sensibilité à l'effet
du nitrate avec un nombre denoëlUlecompris entre 21 et 41 nodule"s par plante et un p-oitlçde
matière sèche nodulaire moyen de 21 mg.
- ce troisième groupe est formé par les variétés DB 96, Linex, et DB 8054 significativement
plus sensibles, avec un nombre de nodule respectif de 20, 8 et 2, avec 1 à 6 mg de poids sec
des nodules.
- le quatrième groupe est constitué des variétés présentant une nodulation très faible avec un
nombre de nodule inférieur ou égale à 1 et un poids de nodule inférieure à 1 mg, ce sont: T
815, T 260, DB 175, Antaré, Bonus, Nérina et Portugal.
3.3. Effet du macrosymbionte sur la croissance Nz-dépendante
En milieu de culture sans nitrate, la croissance des variétés est déterminée par la quantité
d'azote fixée et l'efficacité d'utilisation de cet azote. L'analyse de variance des données de
poids sec des parties aériennes présentée dans le tableau 16 permet de distinguer deux
groupes:
- DB 175, Antaré, Bonus, Nérina et Portugal ont une croissance aérienne moyenne variant
entre 2 et 3,6 g de poids sec des parties aériennes par plante.
- Les autres ont une masse sèche aérienne comprise entre 4,5 et 9,8 g par plante avec
cependant une croissance relativement meilleure chez les variétés T 815 et Linex.
- Cependant, pour l'ensemble des variétés, la croissance du haricot n'est pas significativement
supérieure quand la plante reçoit un apport de 2,5 mM NO-) par semaine, avec une moyenne
de 5,6 g de poids sec des parties aériennes que lorsqu'elle dépend de la symbiose pour sa
nutrition azotée dont la moyenne générale est de 5,34 g. La fixation d'azote chez le haricot
aurait donc le même effet sur la croissance que la nutrition minérale azotée. Il y a toutefois
54
Résultats
trois variétés pour lesquelles la croissance a été significativement supérieure avec 2,5 mM
N0 3-: DB 8054, DB 175 et Portugal.
~
~
- Dans cette"'expérience, l'efficacité des nodules à soutenir la crôissance aérienne appelé
Efficacité d'Utilisation de la Symbiose Rhizobienne (EUSR ) a été calculée individuellement
pour chaque variété de haricot en retranchant à la croissance aérienne total, 2 g qui
correspondent à la croissance non dépendante de la fixation d'azote. L'analyse statistique des
résultats permet de distinguer quatre groupes (Tableau 16):
- T 815, Coco;-Linex, T 260 et-Portugal ont l'EUSR les plus élevéesavec une moyenne-de
553 mg de poids sec des parties aériennes par mg de nodule sec.
- Bonus, DB 8054, Bat 477, DB 96 et DB 7080 avec une EUSR plus faible, ont une moyenne
de 128 mg de poids sec des parties aériennes par mg de nodule sec.
- Nérina et DüR 364 ont une EUSR très faible de l'ordre de 34 mg de poids sec des parties
aériennes par mg de nodule sec.
- DB 175 et Antaré ont une EUSR égale à zéro
Tableau 17: Poids sec des parties aérienne (PA), nodulation (poids sec et nombre de nodules) et Efficacité
d'Utilisation de la Symbiose Rhizobienne (EUSR) chez quatorze variétés de haricot inoculées avec la souche
ISRA 353 et cultivée en solution hydroaéroponique sans nitrate ou à 2,5 mM de N0 3-.
Poids sec PA
Nombre de nodule
Variétés
OmM
2,5 mM
OmM
T815
9,8 a
8,4 a
19 b
1c
Nérina
1,8 b
1,5 b
2c
Bonus
2,8 b
2,3 b
DB 8054
5,6 a
Coco
2,5 mM
Poids sec nodule
OmM
2,5 mM
EUSR
26 b
0,1 c
741 a
1c
2c
0,1 c
26 c
2c
Oc
2c
0,0 c
82 b
7,8 a
3c
2c
1c
1,0 c
231 b
6,6 a
7,3 a
29 b
41 a
38 b
18,0 b
411 a
Linex
8,8 a
9,3 a
14 b
8a
32 b
5,0 c
505 a
DüR 364
4,5 a
5,1 a
43 b
28 b
76 a
28,0 b
42 c
T260
5,9 a
6,4 a
lib
Oc
10 b
0,0 c
695 a
Portugal
2,2 b
3,8 b
2c
2c
1c
0,1 c
414 a
Bat 477
7,3 a
7,3 a
21 b
21 b
77a
19,0 b
134 b
DB 96
6,9 a
6,7 a
94 a
21 b
68 a
6,0 c
98 b
DB 7080
5,4 a
6,2 a
78 a
61 a
79 a
72,0 a
93 b
DB 175
3,2 b
4,7 b
Oc
Oc
Oc
0,0 c
Od
Antaré
2b
1,5 b
Oc
Oc
Oc
0,0 c
Od
Dans chaque colonne, les valeurs suivies d'une même lettre ne sont pas significativement différentes au seuil de 5% d'après le test de
Newman et Keuls.
55
Résultats
3.4. Interaction phosphore nitrate sur Îa nodulation et la croissance du haricot
Dans cette expérience la nodulation de la variété Nérina a été inhibée par les bases
températures qui ont existé dans la serre. Les 'interprétations seront faites sur la variété BAT
477.
Les courbes de tendance de la figure Il A montrent qu'avec BAT 477 en solution nutritive
sans nitrate, les doses de phosphore appliquées stimulent la nodulation des souches lSRA 353
et CLAT 899 avec des optimums de croissance se situant à 250 flM (ISRA 353) et 300 flM
(CLAT 899). Pour ces concentrations en phospho~, la meilleure nodulation a été obtenue avec
lSRA 353 comparée à la souche ClAT 899. En solution nutritive contenant 2,5 mM nitrate, la
production de nodules n'a pas été stimulée par les apports de phosphore. Cependant la souche
lSRA 353 produit plus de nodules que ClAT 899 pour les concentrations en phosphore
inférieures ou égales à 300 flM, (donc 2,5 mM NO)' est moins inhibiteur avec lSRA 353
qu'avec CLAT 899, Fig. Il B). Mais on observe une relation inverse aux forts apports de P :
le phosphore diminue l'inhibition par 2,5 mM nitrate de la nodulation de ClAT 899, tandis
qu'elle augmente celle avec ISRA 353. La figure 12 illustre bien l'inhibition de la nodulation
des souches par le nitrate. La nodulation à 2,5 mM de nitrate est plus exigeante en P que la
nodulation en milieu de culture sans nitrate chez la souche ClAT 899 et que la dose optimale
pour sa nodulation en milieu de culture sans nitrate se situe à 300 flM de P par semaine (Fig.
12 A). Par contre la souche lSRA 353 ne semble pas très exigeante en P pour sa nodulation
que se soit en milieu de culture sans ou avec nitrate, la dose optimale en P pour sa nodulation
en absence de nitrate se situe à 250 flM de P par semaine (Fig. 12 B).
Chez les plantes inoculées avec la CLAT 899, aux apports croissants de P, les biomasses
aériennes sont plus faibles quand elles ne dépendent que de la fixation contrairement aux
plantes cultivées en présence de 2,5 mM de nitrate (Fig. 13 A).
Chez les plantes inoculées avec lSRA 353, la croissance des plantes évaluée par la
biomasse aérienne a la même dépendance en P à 0 mM qu'en présence de 2,5 mM de nitrate
(Fig. 13 B).
56
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Résultats
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o
100
200
300
400
500
P (~M Plplanle/semaine)
Figure Il : Influence des apports de phosphore sur la
nodulation de BAT 477 inoculée avec les souches de
Rhizobium ClAT 899 (A) ou ISRA 353 (B) et cultivée
en présence ou en absence de 2,5 mM de nitrate en
hydroaéroponie.
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200
300
P
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500
P/plante/semaine)
Figure 12 : Influence des apports de phos phore s ur la
nodulation de la variété BAT 477 inoculée avec les
souches de Rhizobium ClAT 899 (A) ou lSRA 353 (B) et
cultivée en absence ou en présence de 2,5 mM de nitrate
en hydroaéroponie.
57
Résultats
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400
500
P (fiM P/planle/semaine)
Figure 13 : Influence des apports de phosphore sur la croissance
de la variété BAT 477 inoculée avec la souche de Rhizobium
C\AT 899 (A) ou \SRA 353 (B) cultivée en hydroaéroponie en
absence ou en présence de 2,5 mM de nitrate.
58
.. /
Résultats
4. Effet du traitement des graines avec un fongicide sur l'infectivité et l'effectivité des
souches de Rhizobium ISRA 353 et ISRA 554
"4.1. Infectivité et effectivité de la souche de Rhizôbium ISRA 353
Que les semences aient été traitées ou non avec le OCT, il Y a eu un bon développement
végétatif des plantes et une bonne production de gousses. Il n'y a pas eu de différence
significative sur le poids sec des parties aériennes et des gousses entre les plantes pour
lesquelles les semences ont été traitées avec le OCT et celles pour lesquelles les semences ne
l'ont pas
étê~-tes
rendements moyens ont été de
1232~
kg/ha et 1190-kglha respectivement
pour les parties aériennes et les gousses (Tableau 18).
Par contre, la nodulation des plantes a été inhibée par action du OCT. En effet, chez les
plantes pour lesquelles les graines ont été enrobées avec le OCT, aucun nodule n'a été induit
avec la souche de Rhizobium ISRA 353 et il n'y a pas eu de fixation d'azote, alors que chez
les plantes pour lesquelles les graines n'ont pas été enrobées avec le OCT, il y a eu induction
de la nodulation (production moyenne de 31,5 mg de nodules secs par plante). En ce référant
aux excès isotopique (0,532 pour la partie aérienne et 0,598 pour les gousses) du soja non
nodulant pris comme plante de référence et cultivé dan les mêmes conditions, le pourcentage
d'azote (%Ndfa) dans les parties aériennes et les gousses de ces dernières plantes dérivé de
l'atmosphère ont été respectivement de 18,4% et 35% correspondant à 6 kg et 15,4 kg N fixé
par hectare (Tableau 19).
4.2. Infectivité et effectivité de la souche de Rhizobium ISRA 554
Les plantes se sont également bien développées. Il n'y a pas eu de différence sur le poids
sec des parties aériennes entre les plantes pour lesquelles les semences ont été traitées avec le
OCT et celles pour lesquelles les semences ne l'ont pas été: la production moyenne de
matière sèche a été de 2472,5 kg/ha. Par contre, le rendement en gousses a été diminué de
19,7% par le traitement des semences avec le OCT (Tableau 18).
La nodulation du haricot induite par la souche ISRA 554 n'a pas été inhibée par le OCT
contrairement à la nodulation induite par la souche rSRA 353. Il Y a eu néanmoins une
diminution de 45,6% du poids sec des nodules chez les plantes pour lesquelles les semences
ont été traitées avec le OCT, par rapport à celui des plantes pour lesquelles les semences n'ont
pas été traitées. Toutefois, cette différence observée dans la nodulation des plantes n'a pas été
suivie d'une différence sur la proportion et la quantité d'azote fixé qui, en moyenne, ont
59
Résultats
respectivement été de 38,2% et 18,5 kg Nlha dans les parties aériennes; 54% et 48,9 kg Nlha
dans les gousses (Tableau 19).
Tableau 18 : Poids sec des parties aériennes et des nodules, rendement en gousses, pourcentage d'azote (%N),
azote total (N total) et excès isotopique (% 15Nei) de la variété Paulista inoculée avec les souches de Rhizobium
ISRA 353 et ISRA 554 avec ou sans le fongicide DCT et cultivée à la station de Bel Air.
Souches de Rhizobium
Organes de la plante
Fongicide
Poids sec
(kglha)*
%N
N Total
(kglha)
%'5Nei
ISRA 353
Parties aériennes
Sans OCT
Avec OCT
1400 a
1065 a
2,0 a
2,3 a
27,2 a
24,3 a
0,439 b
0,64La
Gousses
Sans OCT
Avec OCT
1390 a
990 a
3,4 a
3,4 a
46,1 a
34,0 b
0,389 b
0,689 a
Nodules
Sans OCT
Avec OCT
31,5
0,0
Parties aériennes
Sans OCT
Avec OCT
2330 a
2615 a
1,8 a
2,2 a
43,3 a
54,5 a
0,334 a
0,331 a
Gousses
Sans OCT
Avec OCT
2640 a
2205 b
3,6 a
4,0 a
95,1 a
81,6 a
0,250 b
0,301 a
Nodules
Sans OCT
Avec OCT
86,2 a
59,2 b
ISRA 554
Dans chaque colonne pour chaque souche de Rhizobium et pour chaque organe de plante, les valeurs suivies d'une même lellre ne sont pas
significativement différentes à p=O,OS d'après le test de Newman et Keuls.
• : le poids sec des nodules est exprimé en mg/plante
Tableau 19 : Pourcentage (%Ndfa) et quantité d'azote dérivant de la fixation atmosphérique d'azote (Nd fa) de la
variété Paulista inoculée avec les souches de Rhizobium rSRA 353 et rSRA 554 avec ou sans le fongicide DCT
et cultivée à la station de Bel Air.
Souches de Rhizobium
Organes de la plante
Fongicide
%Ndfa
Ndfa
(kglha)
ISRA 353
Parties aériennes
Sans OCT
Avec OCT
18,4
nd
6,0
nd
Gousses
Sans OCT
Avec OCT
35,0
nd
15,4
nd
Parties aériennes
Sans OCT
Avec OCT
37,9 il
38,5 a
16,2 a
20,7 a
Gousses
Sans OCT
Avec OCT
58,3 a
49,7 a
56,4 a
41,1 a
ISRA 554
Dans chaque colonne pour chaque souche de Rhizobium et pour chaque organe de plante, les valeurs suivies d'une même lellre ne sont pas
significativement différentes à p=O,OS d'après le test de Newman et Keuls.
ND: Non détenniné
60
Résultats
5. Co-inoculation du haricot avec les souches de Rhizohium I8RA 353, I8RA 554
associées aux souches de P.fluorescens 6F16 et de Glomus aggregatum .
En serre, la variété Nérina a été inoculée avec la souche de Rhizobium ISRA353 et avec la
souche de Rhizobium ISRA 554. Dans les deux cas chaque souche de Rhizobium a été utilisée
seule ou en association avec la souche de Pseudomonas fluorescens 6F 16, ou avec la souche
de champignon mycorhizien Glomus aggregatum, ou cumulativement avec ces deux
.
.
mIcroorgamsmes.
5.1. Inoculation avec-la souche de RJziz.obiym ISRA 353
5.1.1. Croissance et nodulation du haricot
La croissance (exprimée par le poids sec des parties aériennes) et la nodulation (exprimée
par le nombre de nodules formés) des plantes inoculées avec la souche de Rhizobium rSRA
353 utilisée seule (plantes témoins non mycorhizées) et celles des plantes inoculées avec la
souche de P. fluorescens 6F 16 ont été statistiquement identiques (Tableau 20). Cependant, la
croissance et la nodulation des plantes mycorhizées, inoculées avec la souche de G.
aggregatum ont été significativement améliorées par rapport à celles des plantes témoins: +
22% pour la croissance et production de quatre fois plus de nodules. L'action de la souche de
p. fluorescens 6F 16 a donc été sans effet sur la croissance et la nodulation de la variété
Nérina inoculée avec la souche de Rhizobium ISRA 353 alors que l'action de G. aggregatum
a été positive sur ces paramètres.
La croissance des plantes inoculées avec la souche de G. aggregatum a été également
identique à celle des plantes inoculées avec la souche de G. aggregatum associée à la souche
de P. fluorescens 6F 16 alors que le nombre des nodules observé sur les dernières a été deux
fois supérieur à celui des premières bien que le taux de mycorhization ait été
significativement réduit (-35%) (Tableau 20). Comparativement aux plantes témoins, il y a eu
une amélioration similaire de la croissance (+24% en moyenne) et de la nodu1ation avec en
moyenne Il fois plus de nodules induits.
5.1.2. Teneur en azote et en phosphore
Les souches P. fluorescences 6F 16 et G. aggregatum, utilisées individuellement ou en
association n'ont pas significativement amélioré la teneur (%N) et la quantité d'azote (N
total) des parties aériennes des plantes témoins: aucune différence significative n'a été
observée entre les quatre traitements (Tableau 20). A l'inverse, la teneur (%P) et la quantité
(P total) de phosphore des parties aériennes ont été significativement augmentées dans les
61
Résultats
plantes mycorhizées (inoculées avec G. aggregatum seul ou associée à P. jluorescens 6F16)
par rapport à celles non mycorhizées (plantes témoins ou plantes inoculées avec P.
jluorèsc,ens) 6F 16 : + 40% dans le premier cas et + 81 % dans le deuxième cas.
5.1.3. Excès isotopique en azote-15, proportion et quantité d'azote fIXé dans les
parties aériennes
Les plantes inoculées avec P. jluorescens 6F16, ou avec G. aggregatum ou avec les
deux souches à la fois Qn.1 ~l!,_dans leurs parties aériennes, un excès isotopique.igel1tique et
significativement plus élevé que celui des plantes témoins (Tableau 21). Cela s'est traduit par
une diminution du pourcentage d'azote fixé (%Ndfa), certes, non significative dans les deux
premiers cas, mais très significative (-77%) dans le dernier cas. Cependant, la quantité d'azote
fixé (Ndfa) dans les parties aériennes des plantes témoins a été la même que celle estimée
chez les plantes inoculées avec G. aggregatum avec une valeur moyenne: 40,75 g N/plante.
Par contre, identique chez les plantes inoculées avec P. jluorescens 6F 16, mycorhizées ou pas
(valeur moyenne estimée à 31,12 g N/plante), la quantité d'azote fixé (Ndfa) a été
significativement inférieure (-31%) à celle des plantes témoins ou inoculées avec G.
aggregatum.
5.2. Inoculation avec la souche de Rhizobium ISRA 554
Contrairement à l'utilisation de la souche de Rhizobium rSRA 353, le poids sec des parties
aériennes de la variété Nérina n'a pas été significativement différent entre les plantes témoins
et celles inoculées avec P. jluorescens ou avec G. aggregatum ou avec les deux à la fois
(Tableau 20).
De même, le nombre de nodules formés sur les plantes témoins a été similaire à celui des
plantes inoculées avec P. jluorescens : en moyenne 22 nodules par plante. Par contre, le
nombre de nodules a été augmenté de cinq fois sur les plantes inoculées avec G. aggregatum
et de quatre fois sur celles inoculées avec P. jluorescens et G. aggregatum.
Cependant, les teneurs en azote (%N) mesurées dans les parties aériennes des plantes
inoculées avec P. jluorescens, ou avec G. aggregatum, ou avec les deux à la fois, identiques
entre elles (valeur moyenne égale à 3,72%), ont été significativement supérieures à celles
mesurées chez les plantes témoins: + 13,6%. Il en a été de même pour l'azote total accumulé
dans les parties aériennes: l'augmentation a été de 10,4%. En ce qui concerne la teneur (%P)
62
· ./
Résultats
et la quantité (P total) de phosphore, les mêmes variations obtenues avec la souche ISRA 353
ont été également observées: + 44% et + 6~,4% respectivement pour %P et P total.
Comme dans le cas de la souche ISRA 353, l'excès isotopique des parties aériennes des
~
~
plantes inoculées avec la souche de P.fluorescens 6F16 et/ou G. aggregatum a été supérieur à
celui des plantes témoins (Tableau 21). Toutefois, deux groupes de valeurs, significativement
différentes, ont été observées sur la proportion (%Ndfa) et la quantité (Ndfa) d'azote fixé. Le
premier groupe constitué par les valeurs mesurées chez les plantes témoins et celles inoculées
avec P. fluorescens ; le deuxième groupe constitué par les plantes inoculées avec G.
aggregatum eLcelles inoculées.avef._Q. aggregatum et P. fluorescensJJFl6. Les valellrs
~~_
premier groupe ont été supérieures à celles du second groupe : +62,8% et +57,8% pour
respectivement %Ndfa et Ndfa.
63
Résultats
Tableau 20 : Croissance (poids sec des parties aérienne: PSP A.), teneur en azote (%N) et en phosphore (%P), azote (N total) et phosphore total (P total) ainsi que le nombre
de nodule (Nbre nod) et le taux de mycorhization (% Myc) des plantes de la variété Nérina inoculées avec les souches de Rhizobium ISRA 353 et ISRA 554, la souche de
Pseudomonas fluorescens 6F 16 et la souche de mycorhize G/omus aggregatum et cultivées en serre dans des pots pendant 40 jours.
Traitements
PSPA (g/pl) Nbre nod
%N
%P
N total (mg/pl)
P total (mg/pl)
% Mycorhization
ISRA 353
5,12 b
9c
3,81 b
0,26 b
196,00 b
13,50 b
0,00
ISRA 353+ P. fluorescens 6F 16
4,25 b
8c
4,14 a
0,27 b
174,00 b
11,75 b
0,00
ISRA 353 + G.aggregatum.
6,25 a
42 b
3,82 b
0,35 a
226,25 a
21,50 a
92,25 a
ISRA 353+ G. aggregatum + P. fluorescenss 6F 16
6,50 a
106 a
3,76 b
0,38 a
242,25 a
24,25 a
68,50 b
C.V. (%)
25,1
74,1
9,1
7,7
21,3
26,8
17,2
ISRA 554
6,55 a
26 b
3,27 b
0,26 b
215,00 b
17,25 b
ISRA 554+ P.fluorescens 6F16
5,33 b
19 b
3,89 a
0,27 b
232,25 ab
14,00 b
0,00
ISRA 554 + G.aggregatum
6,73 a
113 a
3,59 a
0,37 a
246,50 a
26,00 a
86,00 a
ISRA 554+ G. aggregatum + P. fluorescens 6F 16
6,25 a
81 a
3,67a
0,39a
233,50 ab
24,75 a
60,25 b
C.V. (%)
15,1
7,5
7,3
7,2
15,0
29,7
/
87,1
1
0,00
Pour chaque colonne et pour chaque souche de Rhizobium, les valeurs suivies d'une même lettre ne sont pas significativement différentes au seuil de 5% d'après le test de Newman et Keuls.
/
t::A
Résultats
('
\
/
Tableau 21: Excès isotopique (% lS Nei) et pourcentage et quantité d'azote dérivant de la fixation (%Ndfa), de l'engrais (%Ndff) et du sol (%Ndfs) des plantes de la variété
Nérina inoculées avec les souches de Rhizobium rSRA 353 et ISRA 554, la souche de Pseudomonas fluorescens 6F 16 et la souche de mycorhize Glomus aggregatum ,
cultivées en serre dans des pots pendant 40 jours et ayant reçu de l'azote marqué en 'SN.
Traitements
%JSNei*
%Ndfa
%Ndff
%Ndfs
Ndfa (mg/pl)
Ndff (mg/pl)
Ndfs (mg/pl)
1
rSRA 353
0,29 b
23 a
9,91 b
68 b
43,25 a
19,75 b
133,25 b
rSRA 353+ P. fluorescens 6F 16
0,32 a
18 ab
·IO,54ab
72 ab
31,50 b
18,25 b
124,00 b
rSRA 353 + G.aggregatum.
0,32 a
17 ab
10,71 ab
73 ab
38,25 a
24,00 a
163,75 a
rSRA 353+ G. aggregatum + P. fluorescens 6F 16
0,34 a
13 b
11,25 a
na
30,75 b
27,00 a
184,50 a
C.V. (%)
6,3
30,7
6,6
6,2
35,7
21,2
21,5
rSRA 554
0,27 b
31 a
8,98 a
60 b
66,75 a
19,00 b
129,75 b
rSRA 554+ P. fluorescens 6F 16
0,29 a
26 a
9,75 a
65 b
66,25 a
21,00 b
144,25 b
rSRA 554 + G.aggregatum
0,33 a
15 b
10,83 a
74 a
38,00 b
26,75 a
182,00 a
rSRA 554+ G. aggregatum + P. fluorescens 6F 16
0,31 a
20 b
10,50 a
70 a
46,25 b
24,00 a
Hb,25 b
C.V. (%)
12,4
41,7
12,3
12,3
40,0
11,3
11,9
\
/
• Le %llNei du soja a été de 0,385
Pour chaque colonne, et pour chaque souche de Rhizobium. les valeurs suivies d'une même lettre ne sont pas significativement différentes au seuil de 5% d'après le test de Newman et Keuls.
65
Résultats
5.3. Production de substance inhibitric~ de la croissance des souches par P. fluorescens
La production de substance inhibitrice du développement des souches de Rhizobium ISRA 353
et ISRA 554 par la souche de P. fluorescens 6F 16 a été testée sur des boîtes de Petri contenant un
milieu gélosé.
Après 24 h d'incubation, dans les boîtes de Petri ensemencées avec la souche de Rhizobium
-ISRk 55-4 une auréole d'inhibition de 3mm de largueur -a- été notée autour de la colonie
développée par la souche de P. fluorescens 6F 16. Par contre dans les boîtes où la souche de
Rhizobium ISRA 353 a été ensemencée l'auréole d'inhibition n'a pas été obtenue (Fig. 14).
6. Essais multilocaux d'inoculation du haricot avec des souches de Rhizobium
Les essais multilocaux ont été réalisés en 1999 et en 2000 à Bambilor, à Gorom l, au km 50 et
à Sangalcam pour valider l'utilisation des inoculums de rhizobium en vue d'améliorer la
production du haricot dans les petites exploitations des producteurs maraîchers en utilisant la
variété Nérina.
En 1999, pour des raisons techniques, nous n'avons pas pu obtenir les résultats d'analyse 15N
envoyés au laboratoire. Au stade de maturation des gousses, deux récoltes ont été effectuées. Aux
deux récoltes effectuées à Bambilor et à Gorom l, les rendements en gousses obtenus avec la
pratique paysanne et avec l'utilisation des inoculums de rhizobium ISRA 353 et ISRA 554, ont
été significativement identiques (rendement moyen de lt/ha) et supérieurs (+ 64%) à ceux
observés dans les parcelles témoins (Tableau 22). La même observation a été faite à la deuxième
et à la première récoltes effectuées respectivement au km 50 et à Sangalcam. Par contre, au km
50, le rendement obtenu à la première récolte avec la pratique paysanne a été significativement
supérieur (+ 29%) à celui obtenu en utilisant les inoculums de rhizobium qui a été identique au
témoin. A la deuxième récolte effectuée à Sangalcam, les rendements obtenus en utilisant les
inoculums de rhizobium ont été supérieurs (+ 33%) à ceux obtenus par la pratique paysanne qui a
été identique au témoin.
En 2000, le haricot a été récolté une seule fois avec un rendement moyen en gousses de 4,2
t/ha. A Bambilor et à Sangalcam les rendements obtenus avec la pratique paysanne et l'utilisation
des inoculums de rhizobium ont été identiques et supérieurs à ceux des témoins : +59% à
Bambilor, 51 % à Sangalcam. En plus, à Gorom l, en utilisant ces inoculums, les rendements ont
été supérieurs à ceux obtenus avec la pratique paysanne: +35% avec l'inoculum ISRA 353 et
67
'"
Résultats
Nappe fonnée par
ISRA 554
Auréole d'inhibition
P. fluorescens 6F 16
Figure 14: Croissance de la souche de Rhizobium ISRA 554 sur milieu TSA préalablement
encemencé avec la souche de P.jluorescens 6F 16.
68
/'
./
Résultats
+62% avec l'inoculum rSRA 554. Au km 50, la même observation a été fait avec l'inoculum
"
rSRA 554: +50% (Tableau 23).
Le pourcentage et la quantité d'azote contenu dans les parties aériennes et provenant de
l'atmosphère, de l'engrais ou du sol ont été déterminés. Dans toutes les localités, le pourcentage
d'azote provenant de l'atmosphère (%Ndfa) dans les plantes témoins a été extrêmement faible et
n'a pas été tenu dans le traitement statistique des donnés. Celui des plantes pour lesquelles les
inoculums de rhizobium ont été utilisés (70% en moyenne) a été trois supérieur à celui des
plantes pour lesquelles la pratique paysanne a été effectuée (Tableau 23). Il en a été de même en
ce qui concerne la quantité (Ndfa = 3,3 t Nlha en moyenne (Tableau 24).
Tableau 22. Rendement en gousses du haricot (Phaseolus vulgaris), variété Nérina cultivé au champ en 1999 dans
différentes localités au Sénégal et inoculé avec des souches de Rhizobium (ISRA 353 et ISRA 554) ou ayant reçu un
amendement azoté selon la pratique paysanne locale.
Localités
Traitements
Rendement en gousses
(t/ha)
1cr récolte
2e récolte
Bambilor
Témoin
Pratique paysanne
ISRA 353
ISRA 554
0,7 b
1,0 a
1,2 a
1,1 a
0,8 b
1,2 a
1,3 a
1,2 a
Gorom 1
Témoin
Pratique paysanne
ISRA 353
ISRA 554
0,4 b
0,8 a
0,9 a
0,9 a
0,5
0,8
0,8
0,9
b
a
a
a
Km 50
Témoin
Pratique paysanne
ISRA 353
ISRA 554
0,8 b
1,0 a
0,8 b
0,7 b
0,3
0,5
0,5
0,5
b
a
a
a
Sangalcam
Témoin
Pratique paysanne
ISRA 353
ISRA 554
0,6 b
1,0 a
0,9 a
1,0 a
0,7 b
0,7 b
0,9 a
1,0 a
Dans chaque colonne et pour chaque localité, les valeurs suivies d'une même lettre ne sont pas significativement différentes à p=O,OS d'après le
lest de Newman et Keuls.
69
/\
.. /
Résultats
Tableau 23. Rendement en gousses, pourcentage d'azote dans les parties aériennes dérivé de l'atmosphère (%Ndfa),
de la fertilisation (%Ndff) et du sol (%Ndfs), du haricot (Phaseolus vulgaris) variété Nérina cultivé au champ en
2000 dans différentes localités au Sénégal et inoculé avec des souches de Rhizobium (ISRA 353 et ISRA 554) ou
ayant reçu un amendement azoté selon la pratique paysanne locale.
Localités
Traitements
Rdt en gousses
%Ndfa
%Ndff
%Ndfs
(t ha"))
Bambilor
Gorom 1
Km 50
Sangalcam
Témoin
Pratique paysanne
ISRA 353
ISRA 554
3,1
4,5
4,8
5,5
b
a
a
a
22,3 b
67,5 a
70,3 a
25,6 a
9,8 b
9,0 b
52,1 a
22,7 b
20,7 b
Témoin
Pratique paysanne
ISRA 353
ISRA 554
2,2 c
3,4 b
4,6 a
5,5 a
21,6 b
76,5 a
69,8 a
16,2 a
11,3 b
10,5 b
62,2 a
12,2 b
19,7 b
Témoin
Pratique paysanne
ISRA 353
ISRA 554
3,4 c
4,3 b
4,5 b
5,1 a
19,7 b
72,8 a
73,7 a
26,9 a
10,8 b
10,8 b
53,4 a
16,4 b
15,5 b
Témoin
Pratique paysanne
ISRA 353
ISRA 554
3,0 b
4,2 a
4,5 a
4,9 a
21,4 b
71,7 a
65,0 a
10,3 a
10,5 a
9,8 a
68,3 a
17,8 b
25,2 b
Dans chaque colonne et pour chaque localité, les valeurs suivies d'une même lettre ne sont pas significativement différentes à p ; 0,05 d'après le
test de Newman et Keuls.
70
Résultats
Tableau 24. Quantité d'azote dans les parties aériennes dérivé de l'atmosphère (%Ndfa), de la fertilisation (%Ndff)
et du sol (%Ndfs), du haricot (Phaseolus vulgaris) variété Nérina cultivé au champ en 2000 dans différentes localités
au Sénégal et inoculé avec des souches de Rhizobium (ISRA 353 et ISRA 554) ou ayant reçu un amendement azoté
selon la pratique paysanne locale.
~ocaIilés
Traitements
Ndfa
(t ha'l)
Bambilor
Témoin
Pratique paysanne
ISRA 353
ISRA 554
1,0 b
3,2 a
3,9 a
1,2 a
0,5 b
0,5 b
2,3 a
1,1 b
1,1 b
Témoin
Pratique paysanne
ISRA 353
ISRA 554
l,lb
3,7 a
3,0 a
0,8 a
0,5 a
0,5 a
3,2 a
0,6 b
0,8 b
Témoin
Pratique paysanne
ISRA 353
ISRA 554
0,8 b
3,3 a
3,3 a
1,2 a
0,5 b
0,5 b
2,3 a
0,8 b
0,7 b
Témoin
Pratique paysanne
ISRA 353
ISRA 554
0,9 b
3,2 a
3,2 a
0,4 a
0,5 a
0,5 a
2,9 a
0,8 b
1,2 b
Gorom I
Km 50
Sangalcam
Ndff
_(tha")
Ndfs
(t ha'l)
Dans chaque colonne et pour chaque localité, les valeurs suivies d'une même lettre ne sont pas significativement différentes à p = 0,05 d'après le
test de Newman et Keuls.
7. Compétitivité des souches de Rhizobium ISRA 554 et ISRA 353
L'application de la technique de PCRlRFLP sur les extraits d'ADN de nodules récoltés sur les
racines des plantes de haricot cultivées en serre dans les sols de station expérimentale de ENDA
SYSPRO, à Yenne et Keur Daouda Ndiaye et inoculées avec les souches ISRA 353 ou ISRA 554
montre dans la plupart des extraits d'ADN nodulaire la présence d'un profil autre que celui des
deux souches de Rhizobium avec lesquelles l'inoculation avait été faite. Ce profil est le même
que celui obtenu dans les nodules fom1és chez les plantes témoins (Fig. 15).
71
...
/
\
Figure 15 : Electrophorèse sur gel de Metaphore (2,5% w/v) des produits de restriction
obtenus avec l'endonucléase HaeIII aprés digestion de l'lOS (l6S/23S) amplié.
NT : profils des nodules issus des plantes témoins, NSl, NS2, NS3 : profils des nodules
issus des plantes inoculées dans les solI, 2 et 3; profils des souches de Rhizobium lSRA 353 et
lSRA 554
72
./
.
CHAPITRE IV
DISCUSSIONS
_./
Discussion.
l.Variabilité dans la réponse du haricot à l'inoculation
L'ino«ulation du haricot a débuté en Amérique Latine et aUX--Etats Unies (Brésil, Colombie,
République Dominicaine, Equateur, en Salvador, Méxique, Péru et USA). Dans des expériences
réalisées en 1979 par le Centre International sur l'Agronomie Tropical (ClAT) dans les localités
de CIAT-Quilichao et à la Selva, l'inoculation de deux variétés de haricot: P566 et P590 avec
neufs souches de Rhizobium a été comparée à la fertilisation azotée par apport de 100 kg urée/ha.
Dans la localité de ClAT-Quilichao, des rendements identiques à ceux obtenus avec la
fertilisation azoté n'ont éŒübservés qu'avec quatre souches (ClAT 147, ClAT 25S;-CIÀT625 et
ClAT 676). Par contre à La Selva des effets de l'inoculation ont été obtenus dans plusieurs
traitements et les rendements ont été significativement les mêmes que ceux obtenus avec la
fertilisation azoté. Ces résultats ont été similaires à ceux obtenus dans notre étude où
l'inoculation de la variété Bronco avec la souche de Rhizobium ISRA 353 en station a donné des
rendements en gousses équivalents à ceux obtenus avec un apport de 100 kg urée/ha.
Au Sénégal, les premiers essais d'inoculation du haricot ont été faits en station expérimentale
par Diouf et al., 1997. Des résultats encourageants ont été obtenus avec une amélioration de 24%
du rendement en gousses chez les plantes inoculées avec la souche de Rhizobuim ISRA 355
comparées aux plantes non inoculées. Cependant, la nodulation naturelle des plantes dans la zone
des Niayes est très variable. Bien que (Diouf et al., 1997) y ont observé une faible nodulation du
haricot, il est nécessaire de faire des observations plus complètes et plus précises sur le besoin du
haricot à être inoculé avec des souches de Rhizobium dans la zone des Niayes. Cette faible
nodulation du haricot au champ, observée dans d'autres zones géographiques, particulièrement
en Amérique latine, a toujours été une des plus grandes difficultés rencontrées dans l'utilisation
des inoculums de rhizobium pour l'amélioration de la productivité des légumineuses (Graham,
1981). Cela pourrait être certainement dû au faible nombre de rhizobiums (10 2 par gramme)
présents dans les sols, comme dans le cas de la zone des Niayes (Diouf et al., 1999), ce qui n'est
pas le cas en Amérique latine ou en Afrique de l'Est où il ya plus de 10 3 rhizobiums par gramme
de sol (Giller, 1981). Dans ces zones d'Amérique Latine, une forte nodulation du haricot non
inoculé observée dans plusieurs sites où les inoculums de rhizobium ont été utilisés met en
évidence le problème de la compétition avec les rhizobiums indigènes du sol dans des régions où
le haricot a été cultivé traditionnellement. Ainsi, dans un site à Piracicaba, au Brésil, seulement
35% des nodules ont été induits par une souche de Rhizobium efficiente utilisée dans
73
Discussion
l'inoculation (Graham et al., 1981). Récemment des observations de la nodulation natùrelle faite
~
~
au champ à Sàngalcam dans la zone des Niayes a montré une nodulatidh profuse des plantes non
inoculées. A cause de ces problèmes de compétitivité des souches, le transfert des résultats
obtenus avec la souche rSRA 353 en milieu réel doit être envisagé avec précaution. Ce qui
motive les essais multilocaux réalisés à Bambilor, à Gorom r, au km 50 et à Sangalcam.
2. Quantification de l'azote fixé chez le haricot
L'azote fixé par le haricot a été estimé afin d'évaluer le bénéfice de l'inoculation du haricot
avec des souches de Rhizobium .La quantité d'azote fixé a été estimée en faisant appel à deux
méthodes : l'activité réductrice d'acétylène et la dilution isotopique de l'azote-15. Il a été
démontré que la dernière méthode, malgré son coût relativement élevé (Hudd et al., 1980), est
plus directe et plus précise que la première (Fried et al., 1983). En effet l'utilisation de l'isotope
1sN a l'avantage de fournir dans le temps la proportion de l'azote, dans la légumineuse, dérivé de
l'atmosphérique. La méthode intègre tous les changements de l'activité fixatrice d'azote qui
peuvent se produire pendant la période de mesure. C'est pourquoi nous avons préféré l'utiliser
dans l'estimation de l'azote réellement fixé au champ, après avoir bénéficié, au préalable, des
avantages de la méthode de réduction de l'acétylène, plus simple, plus rapide et plus sensible
(Beck et al., 1993), pour estimer le potentiel fixateur des variétés de haricot en un instant donné
et dans des conditions également détenninées.
Avec les deux méthodes nous avons abouti au même résultat: la sélection de l'association
«variété Nérina x souche de Rhizobium rSRA 554 ou rSRA 353». Il est important de prendre en
compte que le haricot est une légumineuse qui n'est pas originaire d'Afrique. Comme la plupart
des légumineuses introduites dans une zone écologique donnée, il y a souvent une diversité dans
la compatibilité avec les rhizobiums indigènes. C'est le cas des trèfles (Trifolium sp.) originaires
d'Afrique Centrale et introduites en Europe où la symbiose avec les rhizobiums indigènes a été
extrêmement hétérogène (Vincent, 1974). C'est le cas aussi des alfalfa (Medicago sp.) ou des
lupins (Lupinus sp) pour lesquels des rhizobiums à croissante lente et à croissance rapide avec
des pouvoirs effectifs différents ont été décrits par Vincent (1974). Une situation similaire avait
déjà été rapportée pour le haricot dont la nodulation effective induite par des souches de
Rhizobium à croissance rapide pouvait également l'être avec des souches à croissance lente des
sols tropicaux (Gregory et Allen, 1953 ; Rangaswami et Oblisami, 1962).
74
Discussion
La sélection des associations «variété Nérina x souche de Rhizobium ISRA 353» ou «variété
Nérina x souche de RhizobIum ISRA 554» panni d'autres associations confinne 'a,insi cette
diversité des associations symbiotiques chez les légumineuses fixatrices d'azote. Cette diversité
est accentuée par le fait que la souche ISRA 554 peut induire une nodulation des légumineuses de
type cowpea tel que le niébé (Vigna unguicufata) alors que la souche ISRA 353 en est incapable
(Diouf, 1997).
La capacité fixatrice d'azote du haricot, potentielle ou réelle, a été un des critères de sélection
du modèle expérimental pour la validation dé -rutiltsation des inoculums de rhizobium pour
augmenter la productivité du haricot. L'estimation de la fixation de l'azote doit en effet être
comprise comme l'étape ultime pour évaluer les effets des interactions entre la légumineuse hôte,
la souche de Rhizobium et l'environnement. A la station de Bel Air, la quantité d'azote fixé par la
variété Nérina pendant 2 mois a été de 5,30 kg N/ha (Tableau 14) en utilisant la variété de soja
non nodulant m129, qui dans nos conditions expérimentales, présentait le même enracinement
que le haricot. Il s'agit là d'une quantité très faible même si le haricot est certes, connu comme
une légumineuse à faible capacité fixatrice d'azote (Graham, 1981; Hardarson, 1988). Ruschel et
al. (1982), avaient estimé une quantité d'azote fixé par le haricot entre 24,59 et 64,91 kg N/ha ;
Duque et al. (1985) avaient obtenu des valeurs variant entre 18,4 et 31,7 kg N/ha. Dans des
expériences conduites au champ en Amérique latine (Brésil, Chili, Colombie, Guatemala,
Mexique et Pérou) de 1986 à 1988, avec la méthode de dilution isotopique utilisant des céréales
comme plantes de référence (avoine, blé ou sorgho), les variétés de haricot testées ont fixé entre
7 et 108 kg N/ha (Hardarson et al., 1991).
Ces différences dans la valeur estimée de la quantité d'azote fixé par le haricot sont
certainement dues à la principale contrainte de la méthode de dilution isotopique de l'azote-15
qui réside dans le choix de la plante de référence. La faible quantité d'azote fixé par le haricot au
Sénégal (station de Bel Air) pourrait être expliquée par ce choix de la plante de référence. Elle
pourrait être aussi expliquée par le fait que le sol, à l'endroit où l'estimation a été effectuée a une
teneur en azote non négligeable (0,044%, Tableau 6) pour influencer le taux de fixation. En effet,
à un autre endroit de la station de Bel Air, où la teneur du sol est plus faible (0,025%), Diouf et
al. (1999) avaient mesuré une fixation d'azote équivalente à 0,19 g N/plante, soit 57 kg N/ha
avec la variété Bronco inoculée avec la souche de Rhizobium ISRA 355. Il faut néanmoins garder
en mémoire l'influence du génotype de la plante hôte, donc celui de la variété, sur la capacité de
75
Discussion
l'espèce à fixer l'azote. Cependant, des critères agronomIques non performants (rendèment
inférielir,~ celui
de la variété Nérina, sensibilité à la rouille) ne no~s ont pas permis de choisir
cette variété dans notre perspective d'utilisation des inoculums de rhizobium pour augmenter la
productivité du haricot au Sénégal.
3. Le phosphore et le nitrate dans la symbiose fixatrice d'azote chez le haricot
Des facteurs pédologiques tels que le phosphore et le nitrate ont été également pris en compte
dans notre étude. En Afrique de l'Est, Ssali (1988), puis Giller et Wilson (1991) avaient montré
que maIgre une augmentation de la nodulation du haricot par suite- d'une inoculation ay'-ec des
souches de Rhizobium efficaces et compatibles, seule une application de phosphore a induit une
amélioration de la croissance et du rendement en grains. Récemment, sur les hauts plateaux où
les sols renferment entre 15 et 25 ppm Plkg, Amanuel et al. (2000) démontraient l'influence du
phosphore apporté à 20 kg Plha sur la nodulation de la fève (Vicia faba L), ce qui a été déjà
observé au Panama, dans le cas du pois d'angole (Cajanus cajan) cultivé en pots contenant du sol
renfermant des traces de phosphore. La similarité de ces études avec la nôtre est la pauvreté des
sols en phosphore : dans notre expérience, le sol contenait 30 mg Plkg, ce qui pourrait être le
principal facteur limitant la nodulation du haricot dans la zone des Niayes. C'est le cas dans la
majeure partie des sols tropicaux où le déficit en phosphore compromet la durabilité de
l'agriculture. L'effet du phosphore sur la nodulation du haricot n'a été suivi d'un effet similaire
sur le pourcentage et sur la quantité d'azote fixé qu'à partir d'un apport de 36 kg P/ha. Chez la
plupart des légumineuses dans des sols pauvres en phosphore, ['effet du phosphore sur l'azote
fixé est observé à 20 kg P/ha : le soja, le niébé.
En ce qui concerne le nitrate, ses effets sur la nodulation ont été rapportés par plusieurs
auteurs. Thibodeau and Jaworski, 1975; Bhangoo et al. 1976 et Tanner et aL, 1978) avaient
montré l'action positive du nitrate apporté à faible dose sur la nodulation. Ses effets négatifs ont
été décrits sur l'établissement et le fonctionnement de la symbiose; par ['inhibition de la
nodulation (Harper et Gibson, 1984) ou l'accélération de la sénescence (Chen et Phillips, 1977)
des nodules.
Les résultats de notre étude ont montré une variabilité de la nodulation en fonction de la
souche de Rhizobium utilisée mettant ainsi en évidence l'efficacité d'une souche par rapport à
l'autre dans des conditions excessives de nutrition nitrique. Les différences génotypes pour la
nodulation observées sous nitrate entre les quatorze variétés de haricot testées confirme les
76
ri
Discussion
résultats déjà obtenus sur d'autre légumineuses. Betts et Herrigge (1987) avaient isolé, parmi 489
lignées de soja, des lignées capaBle,s de nodu1er et de fixer en serre en présence de 2,5 rÙM de
nitrate, puis au champ sur un sol riche en nitrate. En outre des lignées super- et hyper-nodulantes,
ainsi que tolérantes au nitrate, ont été sélectionnées, certaines d'entre elles présentent un intérêt
agronomique potentiel (CaroIl et aL, 1988)
La comparaison des besoins en P de la lignée BAT 477 sous fixation et sous nitrate suggère
qu'avec la ClAT 899 les besoins en P pour la croissance aérienne des plantes ne dépendant que
------"
-
de la fixation est inférieur à ceux des plantes dépenël-ant de-la fixation et de la nutrition nitrique.
Ces résultats contrastent avec ceux du soja qui a des besoins en P supérieurs quand il dépend de
la fixation (Israel, 1987; Pereira et Bliss, 1987; Isoi et Yoshida, 1991) quand l'inoculation de
BAT 477 a été faite avec ClAT 899. Par contre les résultats de ces auteurs sont en accord avec
ceux obtenus quand l'inoculation a été faite avec ISRA 353.
D'autre part l'apport optimum en P pour la nodulation supérieur à celui pour la croissance
aérienne chez les plantes inoculées avec ClAT 899 et ne dépendant que de la fixation, suggère
que le besoin en P pour le métabolisme symbiotique est supérieur à celui pour la croissance, en
accord avec les conclusions antérieurs de Cassman et al. (1981), Israel (1987), Sa et Israel
(1991), Gunawardena et al. (1992).
4. Semences enrobées de fongicide: quel impact sur la symbiose fixatrice d'azote chez le
haricot?
L'effet des fongicides organiques le plus souvent toxiques aux rhizobiums (Diatloff, 1970;
Hofer, 1958), utilisés afin de protéger les graines d'éventuelles maladies causées par des
champignons a été étudié. Dans beaucoup de cas, les rhizobiums restent viables, mais perdent
leur habilité à induire une nodulation de la plante hôte ou ont une diminution de leur capacité à
fixer l'azote atmosphérique (Fisher 1976; Staphorst et aL, 1976). Nous avons testé la
compatibilité du OCT qui est dérivé du thiram (tetramthyl-thiuram-disulphide), un des fongiques
les moins toxiques aux rhizobiums, à l'inoculation de la variété Paulista avec les souches de
Rhizobium ISRA 353 et rSRA 554. Dans le premier cas il y a incompatibilité: aucune nodulation
n'a été induite et par conséquent, il n'y a pas eu de fixation d'azote. Dans le second cas, il y a
compatibilité avec une nodulation moins profuse, mais avec une fixation d'azote équivalente à
celle mesurée sur les plantes pour lesquelles les semences n'ont pas été enrobées avec le OCT.
Ces deux cas de figure reflètent et réactualisent la discussion sur l'inoculation des semences
77
Discussion
traitées avec des fongicides pour prévenir d'éventuelles maladies des plantes causées
généralemèn,t,par des microorganismes pathogènes (Schroth et al., 196~).
L'effet du DCT sur la nodulation de la variété Paulista induite par la souche de Rhizobium
ISRA 353 est identique à celui observé chez Geer arietinum (Thomas et Vyas, 1984; Welty et
al., 1988), Glycine max (Tesfai et Malik, 1986) et Pigeon pea (Rennie et al., 1985). La différence
de l'action du DCT sur l'infectivité ou l'effectivité des deux souches de Rhizobium (ISRA 353 et
ISRA 554), pourrait justifier la nécessité d'une étude sur la variabilité de l'action des fongicides
-
. _.-
-
-
----
----
sur les performances symbiotiques. Toutefois, le traitement des semences par des fongicides
commerciaux sur la viabilité des souches de Rhizobium a été décrit par plusieurs auteurs.
Revellin et al. 1993 ont reporté que le fongicide Apron réduisait de 61 % la viabilité de
Bradyrhizobium japonicum sur les semences de soja après 1 h d'incubation. De même, les
fongicides Captan et Pentachloronitrobenzene avaient réduit les bactéries viables de B.
japonicum respectivement de 18% et 78% après 1 h d'exposition (Curley et Burton, 1975).
Graham et al. (1980), en travaillant avec Rhizobium phaseoli avaient observé sur des semences
traitées au Captan que seulement 10% de rhizobiums survivaient après 24 h de contact avec le
fongicide comparé au 90% de survie des rhizobiums sur les semences non traitées.
5. Utilisation de rhizobactéries et champignons mycorhiziens
L'association des souches de Rhizobium avec d'autres microorganismes à effet bénéfique sur
la croissance des plantes tels que les Pseudomonas fluoreseens et les champignons mycorhiziens
a été étudiée. Les souches de Pseudomonas fluoreseens ont été décrites depuis plus de 15 ans
comme étant des producteurs de facteurs de croissance pour la plante. Parmi les PGPR, les
Pseudomonas, et particulièrement le groupe P. fluorescent sont parmi les germes les plus
abondants dans la rhizosphère et les plus étudiés durant ces dernières années. Leur action
synergique avec des microorganismes bénéfiques est un des mécanismes facilitant la croissance
des plantes (Digat, 1994). L'activation de la fixation biologique de l'azote par les PGPR a été
beaucoup plus observée chez les céréales: l'avoine, A vena sativa L. (Shabaev et al., 1991), la
canne à sucre, Saccharum officinarum (Sprent et al., 19.. ), le riz, Oryza saliva, (Malik et al.,
1993). Cette augmentation de la fixation biologique de l'azote avait été antérieurement observée
dans des cultures mixtes de Azotobacter et de Bradyrhizobium japonicum (Mil 'to et al., 1973) ou
de bactéries phototrophes du genre Rhodopseudomonas capsulata associées à Bradyrhizobium
78
..
Discussion
trifoUi (Kaboyashi et al., 1981). Cela a été récemment observée chez le soja (Glycine max), une
"
légumineuse tropicale qui a fait l'objet de plusieurs travaux (Shabaev et al., 1992; Dashti et al.,
"
1998). Nos résultats ont montré qu'il n'y a pas eu d'action synergique entre la souche de
Pseudomonas jluorescens 6Fl6 et les souches de Rhizobium que nous avons utilisées pour
inoculer la variété Nérina, mais plutôt, une tendance à diminuer la croissance des plantes et le
nombre de nodules induits comparativement aux témoins inoculés avec les souches de Rhizobium
utilisées seules. Nos résultats sont en accord avec ceux de Gupta et al. (1998) qui avaient obtenu
après 80 jours de-culture du mung bean (Vigna) dàhs des pots contenant-du sol non stérile, une
diminution du poids sec des parties aériennes et du nombre des nodules en utilisant une souche
de Bradyrhizobium sp. Cog associée à chacun des trois isolats de PGPR qu'ils avaient
sélectionnés, alors qu'avec une autre souche de Bradyrhizobium sp. S 24, ils obtenaient, dans les
mêmes conditions, une augmentation de la biomasse (parties aériennes et graines) des plantes. A
la même époque, chez du soja âgé de 1 mois, Dashti et al. (1998) n'avaient pas observé cette
augmentation du nombre de nodules par action des PGPR, contrairement à la stimulation de la
nodulation antérieurement décrite par Polonenko et al. (1987) chez le soja. Nos résultats sont
également contraires à ceux de Grimes et Mount (1984) qui avaient constaté chez le haricot, sous
certaines conditions, une augmentation du nombre de nodules sans amélioration de la croissance.
D'autres études montrant la diminution de la croissance et de la nodulation des légumineuses ont
été également rapportées dans le cas du lotier (Lotus corniculatus) inoculé avec Pseudomonas
spp. (Bagnasco et al., 1998), du pois (Pisum sativa) inoculé avec P. putida (Berggren et al., 2001)
et de Acacia holosericea inoculé avec P. jluorescens (Duponnois, comm. Pers.). Il est donc
nécessaire d'approfondir ces études pour expliquer ces observations, particulièrement chez le
haricot cultivé dans la zone des Niayes avec une perspective de l'utilisation, dans un futur peu
lointain des biofertilisants mixtes.
Cependant, contrairement au soja (Shabaev et al., 1998), la capacité fixatrice d'azote de la
variété Nérina a été diminuée par l'action de la souche de P.jluorescens 6F16. L'association des
souches de Rhizobium avec P. jluorescens 6F16, non seulement n'a pas amélioré la fixation
d'azote, mais a accentué l'absorption par la plante de l'azote du sol. P. jluorescens 6Fl6 ne
contribue donc pas dans l'économie d'azote ou la conservation de la fertilité des sols. Cela
démontre encore la faible aptitude du haricot dans le cas de la variété Nérina, à fixer l'azote et sa
tendance à plus utiliser l'azote du sol. P. jluorescens agirait donc plus comme un inhibiteur des
79
,.
Discussion
souches de Rhizobium. En effet in vitro, nous avons montré que P. jluorescens 6Fl6 produisait
une substance inhibitrice de la croissance d~ Rhizobium.
Contrairement à l'inoculation avec P. jluorescens, l'inoculation avec G. aggregatum
augmente la croissance et la nodulation du haricot. Cet effet stimulateur est la conséquence d'une
amélioration de la nutrition phosphatée par G. aggregatum. En mobilisant plus de phosphore au
niveau des racines, les mycorhizes stimulent la formation des nodules. Plusieurs auteurs ont
montrés l'effet d'une carence en P sur la nodulation se traduisant par une diminution du nombre
et du-poids-sec des nodules (Singleton et al;,---l985; Mullenet-al.,-1-988; Gates, 1974; Jacoben,
1985; Israël, 1987; Gunawardena et al., 1992). Sa et Israël (1991) ont suggéré qu'une forte
exigence en P des bactéroïdes était nécessaire pour la synthèse de l'ATP pour accroître l'activité
nitrogénasique. Une augmentation de l'azote total des parties aériennes avec une forte utilisation
de l'azote provenant de l'engrais et du sol a été notée avec l'inoculation avec G. aggregatum.
Ames et al. (1983) et Johansen et al. (1993) avaient montré que les champignons mycorhiziens
pouvaient souvent absorber l'azote provenant des fertilisants minéraux sous forme de NH/-N et
le transporter dans la plante hôte. En effet, les mycorhizes en induisant un meilleur
développement du système racinaire exploitent des horizons du sol plus profonds et exportent
plus d'azote à partir de la réserve du sol.
La colonisation des racines chez le haricot par le champignon mycorhizien G. aggregatum a
aussi été réduite par la présence de P. jluorescens au niveau de la rhizosphère des plantes. Cet
effet de P. jluorescens 6F 16 sur la mycorhization du haricot par G. aggregatum est contraire à
ceux obtenus d'une part Burla et al. (1996) qui avaient trouvé que deux souches de P. jluorescens
n'affectaient pas la colonisation des racines du coton (Gossypuim barbadense) par G/omus
mosseae et par Ravnskov et al. (1999) qui eux ont montré que P. jluorescens DF57 n'avait pas
d'effet sur la mycorhization de Cucumis sativus L. par G/omus intraradices et G/omus
ca/edonium. Meyer et Linderman (1986), Gryndler et Vosatka (1996) avaient déjà montré que la
souche de P. putida qui est taxonomiquement proche des P. jluorescens (Palleroni, 1984)
augmentait la colonisation des racines par le champignon mycorhizien.
L'inhibition de la mycorhization devrait s'accompagner d'une diminution de la teneur en
phosphore des plantes. Or des augmentations de teneur en phosphore ont été obtenues chez les
plantes inoculées simultanément avec les rhizobiums, P. jluorescens et G. aggregatum. Cette
stimulation de la teneur en phosphore des plantes mycorhizées en présence de P. jluorescens a
80
li
Discussion
été aussi décrit par Ravnskov et al. (1999) chez Cucumis sativus L. colonisé par Glomus
intraradices et Glomus caJedonium. Ceci peut être dû au fait que P. fluorescens stimule l'activité
~
",
phosphatasique au niveau de la rhizosphére des plantes colonisées par le champignon
mycorhizien entraînant ainsi une meilleure solubilisation du phosphore qui sera par la suite
assimilé par la plante. Vazquez et al. (2000) ont décrit chez le maïs (Zea mays L. var. Potro) coinoculé avec Pfluorescens WCS 365 et G. deserticola une augmentation d'activité phosphatique
de 142%. Ces mêmes auteurs ont obtenus une baisse de 87% d'activité phosphatique chez le maïs
inoculé avec P fluorescens seul. Ce qui pourrait expliquer les baisses de teneur
en phosphore
obtenues, dans notre étude, chez les plantes coinoculées avec le Rhizobium et P. fluorescens.
6. Essai multilocaux d'inoculation du haricot
L'inoculation du haricot a été pratiquée dans beaucoup de régions tropicales: Amérique latine
(Graham et al., 1982), Afrique de l'Est et du Centre (Berti, 1985; Martis, 1989). Dans la majeure
partie de ces régions, le haricot est une culture vivrière contrairement au Sénégal où il est
considéré comme culture de rente, nécessitant des intrants agricoles peu onéreux pour une bonne
rentabilité économique. L'utilisation de biofertilisants tels que les inoculums de rhizobium obéit
à cette démarche car ils constituent une alternative à l'emploi des engrais azotés connus pour leur
coût trop élevé. L'adoption des inoculums de rhizobium par les producteurs maraîchers pour la
culture du haricot dans la zone des Niayes implique une procédure de validation dont les essais
multilocaux tels que
nous
l'avons expérimentés.
Malgré
le faible
nombre de sites
d'expérimentation, les inoculums de rhizobium que nous avons utilisés dans les essais
multilocaux ont, en 1999 et en 2000, amélioré (de 51 % à 64%) le rendement en gousses du
haricot comparativement à du haricot témoin non inoculé avec des souches de Rhizobium et
auquel les paysans n'ont apporté aucun amendement azoté. La réponse du haricot à l'inoculation
avec des souches de Rhizobium est variable. En Amérique latine, l'amélioration des rendements a
été de 39 à 61% de 1978 à 1979 (Graham et al., 1982) alors qu'en Afrique de l'Est, malgré la
présence dans les sols de souches de Rhizobium indigènes, elle a été de 7 à 47% de 1979 à 1980
(Keya et al., 1982). Dans ces régions, les inoculums produits depuis ces dates et ceux qui ont été
produits ultérieurement ont été validés, manufacturés et actuellement commercialisés à l'exemple
de celui du Kenya avec l'inoculum BIOFIX (Karanja et al., 2000). Ce n'est pas encore le cas au
Sénégal où aucune différence n'ait été constatée sur le rendement du haricot entre les inoculums
de rhizobium et la pratique paysanne. Or, avec les inoculums de rhizobium, le pourcentage
81
Discussion
(%Ndfs) et la quantité (Ndfs) d'azote dans les parties aériennes du haricot provenant du sol ont
été, trois fois inférieurs à ceux observés avec la pratique pàysanne (Tableaux 23 et 24). Dans les
expériences de démonstration, cette contribution des inoculums de rhizobium au maintien de
fertilité des sols est difficile à mettre en évidence immédiatement après les récoltes. Le processus
de la validation de l'utilisation des inoculums de rhizobium sur la culture du haricot doit par
conséquent être étendu à leurs effets sur les cultures, généralement manioc (Mannihot cassava)
ou maïs (Zea mays) en association ou en rotation avec le haricot dans la zone des Niayes. Pour
._--_.
~-'
cela, des expériencëSëom-plémentaires incluant des études d'impact en coIlaooration avec des
économistes sont donc nécessaires.
7. Compétitivité des souches de Rhizobium sélectionnées
L'inoculation des légumineuses a toujours été un espoir pour améliorer leur croissance tout en
maintenant la fertilité des sols. Il est toutefois difficile de prévoir la réussite de l'inoculation
surtout si la légumineuse a été introduite comme c'est le cas pour le haricot. Plusieurs méthodes
ont été utilisées pour identifier la souche de Rhizobium ayant servi d'inoculum pour une
légumineuse donnée. En général, ces méthodes font appel soit au marquage préalable de la
souche par introduction de gène (exemple le gène GUS) ou la sélection de mutants résistants à un
ou plusieurs antibiotiques. Récemment la technique de PCRlRFLP appliquée aux nodules pennet
de détecter rapidement et spécifiquement des micro-organismes (Bej et al., 1990; Josephson et
al., 1991). L'habilité des souches de Rhizobium sélectionnées à compétir avec les souches
indigènes des sols a été testée par cette technique de PCRlRFLP dans certaines localités de la
zone des Niayes où l'inoculation du haricot nous a été proposée. La présence d'un profil
identique dans les nodules des plantes témoins dans les trois sols étudiés soulignant ainsi que
dans ces sols la quasi totalité des nodules est occupée par une «seule souche». Ce profil a été
aussi dominant dans les nodules issus des plantes inoculées avec ISRA 353 ou ISRA 554
pennettant ainsi de dire que la ou les souche (s) présentant ce profil ont été plus compétitives que
nos souches sélectionnées dans ces localités.
82
••
/.
CONCLUSION & PERSPECTIVES
ra
Conclusion
Notre travail a consisté dans un premier temps à confinner les résultats obtenus par Diouf et
al. sur l'inoculation du haricot avec uni souche de Rhizobium effective. L'inoculation de la '-variété Bronco avec la souche de Rhizobium rSRA 353 en station expérimentale a permis de
montrer que le haricot répondait positivement à l'inoculation en offrant des rendements en
gousses de 3200 kg/ha équivalents à ceux obtenus avec un apport de 100 kg uréelha. Cette
souche pourrait donc être substituer à un apport d'urée à 100 kglha.
Ensuite au cours de la sélection d'association « variété de haricot souche de rhizobium » dans
des deux expériences conduites au laboratoire et au champ sur les trois variétés de haricot
(Bronco, Rudy et Nérina) associées à la souche de Rhizobium rSRA 353 et à cinq autres souches
de Rhizobium de la collection ISRA-MIRCEN, nous avons montré qu'en conditions contrôlées,
les variétés Rudy et Nérina avaient les meilleurs poids secs des parties aériennes et que la souche
de Rhizobium ISRA 554 avait la meilleure fixation d'azote (avec une ARAS de 104,6 nmole
C 2Hiplante/h/mg). Au champ, les meilleurs rendements en gousses ont été obtenus avec ces deux
variétés. Cependant la variété Nérina avait la meilleure capacité fixatrice d'azote (deux fois plus
d'azote fixé par hectare par rapport à Rudy). Cette variété peut être recommandée en association
avec les souches de Rhizobium ISRA 554 et rSRA 353 pour l'inoculation du haricot.
Dans l'optique d'un transfert des résultats d'inoculation en milieu paysan dans la zone des
Niayes il était indispensable d'étudier l'effet de certains facteurs liés au sol et aux semences
employés par les paysans.
La quantité de phosphore minimale nécessaire pour une bonne nodulation et fixation d'azote
étudié chez la variété Nérina. Dans cette étude nous avons montré que le phosphore apporté à 36
ou 48 kg de P20/ha chez la variété Nérina inoculée avec la souche de Rhizobium ISRA 353
augmentait le poids sec des nodules de 17% ainsi que le pourcentage d'azote provenant de la
fixation (15%) dans les parties aériennes. Les apports de phosphore à 12,36 et 48 kg de P20/ha
ont aussi amélioré les quantités d'azote fixé de 63% par rapport au témoin sans phosphore. Donc
pour une bonne nodulation et une fixation d'azote efficiente dans un sol pauvre en phosphore un
amendement en phosphore est nécessaire.
Ensuite, la diversité génotypique des souches de Rhizobium à induire la nodulation du haricot
en présence de nitrate étudiée chez six souches de Rhizobium (ISRA 355, rSRA 350, rSRA 554,
ISRA 699, ISRA 700 et CrAT 899) a montré que la souche de Rhizobium rSRA 353 nodulait
mieux que les autres souches en présence de 2,5 mM de nitrate que rSRA 554. Donc ISRA 353
83
Conclusion
est plus recommandée pour l'inoculation du haricot dans la zone des Niayes où les sols sont
riches en nitrate.
"
"
Par ailleurs, pour éviter ou limiter l'incidence des fongicides appliqués aux semences sur la
nodulation et la fixation d'azote chez le haricot, les résultats obtenus sur la sensibilité des
souches ISRA 353 et ISRA 554 testées sur des semences enrobées de Oichlofenthion-Thiram
(OCT) ont montré que la souche de Rhizobium ISRA 353 est sensible au OCT mais que la souche
ISRA 554 est résistante au OCT. Ainsi, la souche de Rhizobium ISRA 554 a été plus infective
que ISRA 353 avec une bi-omasse nodulaire trois fois plus importante et une production de
biomasse des parties aériennes et des gousses deux fois plus importante. L'inoculation des
semences de haricot enrobée de OCT avec ces souche n'est pas recommandée surtout dans le cas
de ISRA 353.
L'association des souches ISRA 353 et ISRA 554 avec la souche de Pseudomonas fluorescens
6F 16 et/ou la souche de champignon mycorhizien Glomus aggregatum a montré, qu'avec ISRA
353 Pseudomonas fluorescens 6F 16 n'avait d'effet ni sur la croissance ni sur la nodulation de la
variété Nérina et que la quantité d'azote fixé avait significativement baissée de -31 %. Par contre
avec G. aggregatum la variété Nérina inoculée avec ISRA 353 produisait plus de biomasse
(24%), Il fois plus de nodules ont été formés par rapport au Rhizobium seul. Les teneur et
quantité de phosphore ont été plus élevées respectivement de 40% et 81 %. Aussi, l'association de
la souche ISRA 554 avec P. fluorescens 6F 16 et/ou G. aggregatum n'avait pas d'effet sur la
biomasse de cette variété. Et comme avec ISRA 353, G. aggregatum a amélioré la production de
nodules de 4 fois et 5 fois, les teneur et quantité de phosphore de +44% et +62%. L'association
des souches de rhizobium avec P. fluorescens 6F16 n'a pas d'effet bénéfique chez la variété
Nérina contrairement à celle de Glollms aggregatum.
Ces deux souches avec des sensibilités différentes au nitrate (ISRA 554 plus sensible que
ISRA 353) et au fongicide (ISRA 353 plus sensible au OCT que ISRA 554) ont été utilisées pour
inoculer la variété Nérina dans les essais multilocaux mis en place dans la zone des Niayes.
Au cours des essais, nous avons montré que l'inoculation de la variété Nérina améliore le
rendement en gousses quelle que soit la localité. Mais, par rapport à l'amendement azoté des
paysans dans chaque localité, les résultats obtenus ont été divergents. Toutefois, dans les localités
de Gorom 1 et Sangalcam où une évolution des rendements entre 1999 (rendements identiques) et
84
Il
./
Conclusion
2000 (rendements supérieurs avec l'inoculation) a été observée, l'utilisation de ces inoculums
"-
offre des perspectives de substitution à la pratique paysanne.
Ces résultats divergents sur la réponse du haricot en fonction des sols nous avaient amenés à
étudier la compétitivité de ces souches dans certaines localités de la zones de Niayes où
l'inoculation nous a été proposée par les groupements de paysans. Les résultats obtenus après
l'étude réalisée avec la technique de la PCRlRFLP appliquée aux rOdUle~\montrent que ces
souches n'ont pas été très
com~étitives dans ces_~oca~tés.
'
1
l
__
'
i
85
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95
ANNEXES
.. /
Annexes
Composition des milieux de culture
"'-
1) Milieu YMA (Vincent, 1970)
Mannitol
KH 2 P04
Glutamate de soduim
NaCI
Extrait de levure (Difco)
Agar (Difco)
MgS0 4 ,7H 2 0
CaCl z
FeCI),6H20
Eau distillée qsp
10,00 g/I
0,50 g/I
0,50 g/I
0,05 g/I
1,00 g/I
20,00 g/I
0,20 g/l
4,00 mg/l
4,00 mg/I
1000 ml
Ajuster le pH à 6,8; l'addition de l'agar se fait après ajustement du pH.
Stériliser à 120° C durant 20 mn.
2) Milieu Jensen (Vincent, 1970)
KH 2P0 4
MgS0 4 ,7H20
NaCI
CaHP0 4
FeCI),6Hp
Agar
Solution d'oligoéléments de Jensen*
Eau distillée qsp
0,20 g/I
0,20 g/I
0,20 g/I
0,25 g/I
0,04 g/I
20,00 g/I
1,00 mlll
1000 ml
*Solution d'oligoéléments de Jensen:
MnS0 4,4H 20
CuS04 ,5H 20
ZnS04,7H20
Na 2M0 4,H20
Eau distillée qsp
2,03 g/I
0,08 g/I
0,22 g/I
0,09 g/I
1000 ml
Ajuster le pH à 6,8; l'addition de l'agar se fait après ajustement du pH.
Stériliser à 120° C durant 20 mn.
3) Milieu pour Pseudomotlas fluorescents (King et al, 1954)
Protéose peptone n03
Glycérol
K 1HP04
MgS0 4 ,7H10
Agar
Eau distillée qsp
20,0 g
10,0 ml
1,5 g
1,5 g
20,0 g
1000 ml
96
...
Annexes
4) Solution nutritive utilisée en hydroponie (Drevon et al., 1988).
Macro éléments (mM)
"
0,25'KH 2P04
3,30
CaCl 2
1,25
K 2S04
2,05
MgS0 4 ,7H 20
Oligo-éléments (J.lM)
H]BO]
MnS0 4 ,H 20
ZnS0 4 ,7H 20
CuS0 4,5H 20
NaMo0 4,2H20
FeEDHA (mg 1-')
(Sequestrène CIBA-GEIGY Solurapide Fe 100 SG, à 50% de Fe
EDHA dont 3% de Fe)
4,00
6,60
l,55
l,55
0,10
16,00
5) Milieu Trypsic Soy Broth à 0,3% (Meyer & Linderman, 1986)
Trypsie soy broth
Agar
Eau distillée qsp
Ajuster le pH à 7; l'addition de 1'agar se fait après ajustement du pH.
Stériliser à 120° C durant 20 mn
3g
20 g
1000 ml
6) Milieux pour extraction et amplification d'ADN
Tampon Tris-Borate (TBE)
Tris-Base
Na2EDTA
Acide Borique
89,0 mM
2,5 mM
89,0 mM
Tampon Tris
Tris-Hel
EDTA
Ajuster le pH à 9
10,0 mM
l,OmM
Acétate de sodium 3M
NaAc
Hpqsp
Bromure d'éthidium (BET)
BET
Hp
A conserver à 4oC
408,1 g
1000 ml
10 mg
1 ml
97
li