Developpement d`une Thérapie optogénétique dans le cadre des

DEVELOPPEMENT D’UNE THERAPIE
OPTOGENETIQUE DANS LE CADRE
DES RETINITES PIGMENTAIRES
Encadrement : Laurence Nieto et Rémy Poupot
Camille GRASMUCK
Mélissa HANIQUE
Victor TRAMON
Yannick VIEU
Remerciements
Nous souhaitons remercier tout d’abord Laurence Nieto pour l’aide précieuse qu’elle nous a
apportée, pour sa bienveillance en toutes circonstances. Nous la remercions également pour la
confiance qu’elle nous a témoignée tout au long du projet malgré l’exotisme de notre sujet.
Nous remercions Rémy Poupot pour son attention et sa sympathie.
Enfin, nous remercions tous les acteurs de notre année de master, pour cet apprentissage
agréablement intensif.
« Comment un parachutiste aveugle sait-il qu'il va toucher le sol ?
Quand il y a du mou dans la laisse du chien. »
Résumé
La rétinite pigmentaire regroupe un ensemble de maladies progressives et génétiques
qui amène à une perte de la vision incurable et touchent deux millions de personnes à travers la
monde. Cette pathologie induit une dégénérescence précoce des photorécepteurs de la rétine et
de l'épithélium pigmentaire. Les cônes sont les cellules photoréceptrices permettant la vision
diurne. En cas de rétinite pigmentaire, ils sont très vite dégénérés. La dégénérescence
commence par les segments externes. Cette structure particulière est responsable de la
transduction du signal lumineux en signal chimique.
Dans le but de progresser dans la thérapie des rétinites pigmentaires, Busskamp et ses
collaborateurs ont montré que l’expression du cluster de microARNs 183/96/182 est suffisant
pour le maintien des segments externes lorsque la machinerie de maturation de l’ensemble des
microARNs est absente. Cependant, le modèle étudié ici n’est pas représentatif d’une
pathologie existante chez l’Homme. Ainsi, le projet c’est tourné vers une autre perspective
appelée la thérapie optogénétique.
Table des matières
Glossaire .................................................................................................................................... 1
Introduction .............................................................................................................................. 2
La rétine .................................................................................................................................. 3
La rétinite pigmentaire ............................................................................................................ 4
MicroARNs et photorécepteurs .............................................................................................. 5
Présentation de la publication (Busskamp et al., 2014) ........................................................ 7
La perte des microARNs dans les connes adultes conduit à la perte des segments externes . 7
Les miR-182 et 183 sont suffisants pour le maintien des segments externes ......................... 8
Le cluster mir-182/96/183 induit la formation de courts segments externes de cônes et une
photoréponse in vitro ............................................................................................................ 10
Projet de recherche................................................................................................................. 12
I.
Choix des modèles et purification des cellules ganglionnaires ..................................... 12
II. Identification d’un promoteur spécifique des cellules ganglionnaires .......................... 13
1) Transcriptome des cellules .......................................................................................... 13
2) Vérification de la spécificité du gène.......................................................................... 13
3) Définition du promoteur ............................................................................................. 14
III. Construction du système de transduction ...................................................................... 15
1) Transduction d’un photo-senseur dans la rétine par AAVs ....................................... 15
2) Production des AAVs ................................................................................................. 16
IV. Validation du système .................................................................................................... 17
1) Test de localisation du photo-senseur ......................................................................... 17
2) Tests fonctionnels ...................................................................................................... 18
Perspectives ............................................................................................................................. 20
Bibliographie........................................................................................................................... 21
Glossaire
AAV : Adéno-associated Virus
miR : MicroARNs
RP : Rétinite Pigmentaire
KO : Knock Out
ChR2 : Channelrhodopsine-2
NpHR : Natronomonas Pharaonis Halorhodopsine
WT : wild type / sauvage
DGCR8 : DiGeorge syndrome critical region 8
C-DGCR-KO : Knock out de DGCR8 cône spécifique
P30, P60, … : Postnatal day / Nombre de jour après naissance
Sh-miR : Short hairpin microRNA
ES : Embryonnic Stem Cells
CNG : Cyclic nucleotide-gated
FRT-seq : Flowcell Reverse Transcription Sequencing
eGFP : enhanced Green Fluorescent Protein
eYFP : enhanced Yellow Fluorescent Protein
ITR : Inverted Terminal Repeat
PEI : Polyéthylènimine
Tet : Tetracycline
CG : Copie de génome
PEV : Potentiels évoqués visuels
1
Figure 1 : Schéma d’une coupe transversale de
rétine humaine.
La couche externe, la sclérotique, est une enveloppe de
protection. Elle donne à l'œil sa couleur blanche et sa
rigidité.
La Choroïde est en continuité avec le corps ciliaire et
l'iris, qui se situent à l'avant de l'œil. Elle absorbe les
rayons lumineux inutiles pour la vision, elle est très
riche en vaisseaux sanguins afin de nourrir les
photorécepteurs de la rétine.
La rétine est une membrane recouvrant le fond de l’œil.
C’est la couche sensible à la lumière grâce aux cellules
photoréceptrices.
La cornée est une membrane solide et transparente au
travers de laquelle la lumière entre à l'intérieur de l'œil.
La cornée est privée de vaisseaux sanguins, elle est
donc nourrie par un liquide fluide comme l'eau :
l'humeur aqueuse. La cornée est la principale lentille
de l'œil, elle assure environ 80% de la réfraction.
Le cristallin est une lentille auxiliaire molle.
Figure 2 : Organisation de la rétine.
(A) Coupe de rétine schématisée et détaillée en bas. La
lumière arrive et traverse l’ensemble des couches
cellulaires jusqu’à atteindre les segments externes
des photorécepteurs (bâtonnets et cônes). Suite à
l’interprétation du signal par les photorécepteurs,
celui-ci passe par les cellules bipolaires. A ce
niveau les amacrines et les cellules horizontales
permettent
la
transmission
latérale
des
informations. Pour finir, les cellules ganglionnaires
transmettent le signal vers le nerf optique.
(B) Schéma des photorécepteurs : cônes et bâtonnets.
Ils sont constitués d’une partie axonales permettant
de transmettre le signal. Avant ça, le segment
externe interprète les photons lumineux et les
transmets à la terminaison axonique via le segment
interne.
B
A
Introduction
La rétine
La rétine est l’organe responsable de la sensibilité à la lumière au sein de l’œil (cf. figure 1).
Elle couvre 75% de la face interne du globe oculaire et est intercalée entre l’humeur vitrée et
l’épithélium pigmentaire sous-choroïdal. Elle est composée de nombreux types cellulaires en
couches permettant l’interprétation du signal lumineux et la transmission au nerf optique. Celuici envoie alors le signal vers le cerveau. Curieusement, la lumière doit traverser successivement
les différentes couches cellulaires de la rétine avant d’atteindre les photorécepteurs.
Les photorécepteurs sont les cellules de la rétine sensibles aux signaux lumineux. Il en existe
deux types : les cônes et les bâtonnets (cf. figure 2) (Larhammar et al., 2009). Ces cellules
interprètent l’arrivée des photons en les transformant en signaux électrochimiques. Les
bâtonnets sont les cellules responsables de l’interprétation du signal lumineux crépusculaire et
nocturne en noir et blanc. Elles sont donc très sensibles à l’intensité de la lumière. En
contrepartie, les cônes sont les cellules rétiniennes permettant l’interprétation du signal
lumineux diurne et en couleur. Les cônes font aujourd’hui l’objet de nombreuses études du fait
de leur large implication dans les pathologies liées à la vision, comme la dégénérescence
maculaire liée à l’âge ou les rétinites pigmentaires (Busskamp et al., 2014). Les photorécepteurs
sont constitués d’un segment externe sensible aux photons, d’un segment interne relié au
segment externe par un cil connecteur et enfin d’une terminaison axonique (cf. figure 2B). Le
segment externe est constitué d’un empilement de disques membranaires renouvelés en
permanence. C’est à ce niveau que la réaction de ces cellules à l’énergie lumineuse a lieu. Elle
est due à la présence de protéines membranaires appelées opsines qui se localisent
exclusivement au niveau des segments externes. Cette famille de protéines est photosensible
grâce à la liaison avec un chromophore.
En aval de cette couche cellulaire, une succession de cellules gliales et neuronales permettent
la transduction du signal vers le nerf optique (cf. figure 2A). Parmi ces cellules indispensables
à la vision, les neurones bipolaires, cellules horizontales et amacrines s’organisent dans une
couche de cellules. Pour finir, les cellules ganglionnaires ON/OFF sont les dernières cellules
rétiniennes transductrices du signal avant le nerf optique. Les cellules ON se dépolarisent et les
cellules OFF s’hyperpolarisent lorsque les photorécepteurs sont exposés à la lumière.
2
Hyperpigmentation de la rétine
Rétine saine
Amincissement des vaisseaux
Rétinite Pigmentaire
Figure 3. Diagnostic d’une rétinite pigmentaire par fond d’œil.
A gauche, un fond d’œil sain. A droite, un fond d’œil de rétine atteinte de rétinite pigmentaire.
Les vaisseaux sanguins sont nettement amincis et la rétine est marquée par des taches
d’hyperpigmentation.
Leur position dans la transduction du signal en fait une cible potentielle intéressante pour les
thérapies dans le cadre de dégénérescences de la rétine. En effet, dans le cadre des différentes
rétinites pigmentaires, les cellules rétiniennes dégénérées peuvent être multiples et variées.
Ainsi, le ciblage des cellules ganglionnaires garanti une réponse quelles que soient les
dégénérescences cellulaires en amont de la transmission du signal.
La rétinite pigmentaire
La rétinite pigmentaire (RP) regroupe un ensemble de maladies progressives et génétiques qui
amènent à une perte de la vision incurable et touchent deux millions de personnes à travers la
monde (Busskamp et al., 2011). Elle atteint donc une personne sur quatre mille et représente la
cause la plus fréquente de cécité pour les personnes d'âge intermédiaire dans les pays
développés. Cette pathologie induit une dégénérescence précoce des photorécepteurs de la
rétine et de l'épithélium pigmentaire entraînant ainsi comme premier symptôme, la perte de la
vision nocturne suivie d'un rétrécissement du champ visuel pour finir par une perte de la vision
centrale.
Un diagnostic précoce est possible par électrorétinogramme, on peut ainsi observer chez les
personnes atteintes de rétinite pigmentaire un retard de la réponse au stimulus lumineux et une
baisse de l'amplitude de cette réponse. De plus, ces effets sont proportionnels à la gravité de la
maladie. Le diagnostic tardif se réalise par fond d'œil sur lequel on peut détecter une
hyperpigmentation de la rétine et un amincissement des vaisseaux sanguins (cf. figure 3). Dans
30% des cas les patients présentent des syndromes associés dont le plus courant est la surdité
dans le syndrome d'Usher. Actuellement il n'existe pas de traitement curatif.
Pour les différentes RP, des mutations dans plus de 44 gènes ont pu être identifiées et encore
50% des cas de RP n’ont pas encore été décrits (Farrar et al., 2002). Les RP sont donc
représentées dans la population par de trop nombreuses mutations génétiques pour envisager
une quelconque thérapie génique (Smith et al., 2009). A ce jour, les gènes mutés identifiés sont
essentiellement impliqués dans les premières étapes de transduction du signal lumineux dans la
rétine et plus spécifiquement dans les bâtonnets. La mort de ces derniers est étroitement liée à
la dégénérescence des segments externes photosensibles des cônes (Sancho-Pelluz et al., 2008).
C’est pour cela que Busskamp et ces associés ont cherché à régénérer les segments externes de
cônes qui sont la partie essentielle pour l’interprétation des signaux lumineux (cf. figure 2)
3
MicroARNs
Figure 4. Voie de maturation des microARNs au
sein des cellules.
La première étape de transcription d’un intron ou un
gène permet de donner un pri-miARN. Celui-ci est
pris en charge par le complexe Drosha/DGCR8 pour
donner un pré-miARN. Enfin, DICER effectue la
maturation terminale du pré-miARN en miARN
duplex donnant ainsi un miARN.
Gène
Exon
miARN
Exon
Transcription
Pri-miARN
m7G
AAA
DROSHA/DGCR8
Pré-miARN
DICER
miARN duplex
miARN
(Busskamp et al., 2014). En effet, les segments externes des cônes sont indispensables pour la
vision et ils sont dégénérés dès les stades précoces de RP. C’est au niveau de ces segments que
les protéines photoréceptrices de type opsines jouent le rôle d’interprétation des photons.
MicroARNs et photorécepteurs
Dans une publication récente, l’équipe de Busskamp a voulu étudier les voies moléculaires qui
contrôlent la maintenance des segments externes chez les adultes sains (Busskamp et al., 2014).
Les microRNAs (miRs) sont connus pour avoir un rôle essentiel dans le développement
fonctionnel des cônes. Ce sont des répresseurs post-transcriptionnels de l’expression des gènes.
Leur biogénèse se produit en deux étapes (cf. figure 4). Les premiers ARN transcrits, les primiRNAs, sont clivés en pré-miRNAs par le complexe Drosha/DGCR8, puis sont ensuite pris
en charge par Dicer pour devenir des miRNAs matures (Krol et al., 2010). Ainsi, Busskamp et
ses collaborateurs ont montré que le disfonctionnement de DGCR8 peut causer la perte des
miRNAs dans les photorécepteurs et en conséquence la perte des segments externes des
photorécepteurs chez la souris (Busskamp et al., 2014). Ceci entraine alors une perte
significative de la réponse des cellules à la lumière. Par la suite, grâce à la réexpression des
miR-182 et miR-183 spécifiques des cellules sensorielles, ils ont pu montrer qu’il y avait
maintien des segments externes de cônes. Dans le contexte d’une culture de cellules souches
dérivées en cellules rétiniennes, ces miRNAs sont nécessaires et suffisants à la formation de
segments internes, de cils connecteurs et de courts segments externes. Cette publication que
nous présenterons par la suite, a servi de support à l’établissement du projet.
Malheureusement, l’ensemble des recherches effectuées sur les rétinites pigmentaires a montré
que l’utilisation des miRNAs pour rétablir la fonctionnalité des cônes dégénérés n’est pas un
projet envisageable. En effet, ces miRs pourraient être utilisés en guise de prévention à la perte
des segments externes mais ne permettent pas encore d’envisager un rôle thérapeutique posttraumatique. Les travaux de recherches de Busskamp et ses associés sont faits sur un Knock
Out (KO) de DGCR8 qui ne correspond à aucune pathologie connue à ce jour. De surcroît, les
rétinites pigmentaires entraînent une dégénérescence de la rétine à un stade plus ou moins
avancé et parfois la mort des cellules photoréceptrices dans leur totalité (Busskamp and Roska,
2011).
4
Optogénétique
Une alternative réside dans l'application d'une nouvelle technologie, l'optogénétique. Cet outil
a été mis en place suite à la découverte de la Channelrhodopsine-2 (ChR2) microbienne. Cette
opsine est capable de dépolariser les cellules des tissus mammifères suite à une exposition à la
lumière et ceci sans cofacteurs additionnels habituellement indispensables.
Cette découverte a mené au développement d’un grand nombre de photo-senseurs
« optogénétiques » du même type. Ainsi, cette stratégie consiste en l'expression de cette
molécule ectopique, appelée photo-senseur, pour l’induction d’un changement de potentiel
membranaire des cellules cibles suite à un stimulus lumineux. Il s'agit donc de cibler des cellules
et d’en faire des cellules photoréceptrices artificielles.
Ainsi, la transmission du signal
électrique jusqu'au nerf optique est restaurée.
Une étude récente d'optogénétique se base sur l'utilisation ChR2 (Chlamydomonas reinhardtii),
canal ionique activable par la lumière bleue et NpHR (Natronomonas pharaonis), pompe à
chlore activable par la lumière jaune et entraînant une hyperpolarisation membranaire
(Busskamp et al., 2010). Ces deux protéines peuvent être insérées soit de manière indifférenciée
dans les cellules de la rétine, soit en ciblant l'expression de ChR2 dans les cellules
ganglionnaires ON et NpHR dans les OFF afin de restaurer une réaction physiologique. Mais
ils peuvent également être exprimés dans les cellules bipolaires (ON/OFF) les cônes voir les
cellules amacrines (Busskamp et al., 2011). Ces dernières activent et inhibent les cellules ON
et OFF et ne nécessitent donc pas une expression différentielle des deux protéines. Il existe trois
types de protéines photo-senseurs : des pompes entraînant une hyperpolarisation, des canaux
entraînant une dépolarisation ou des récepteurs couplés aux protéines G activant un canal.
Cette approche de supplémentation génique est une stratégie conceptuellement simple et
attrayante si, comme c’est le cas pour les RP, la maladie est due à une perte de fonction.
Dernièrement, Maguire a montré les progrès dans la thérapie génique pour une pathologie au
niveau de l’épithélium pigmentaire de la rétine (Maguire et al., 2008). Leur étude a non
seulement offert un espoir pour les patients atteints de cette maladie, mais aussi a entraîné la
confiance générale dans les stratégies de thérapies géniques pour les maladies rétiniennes en
démontrant la sécurité et l’efficacité des Adeno-associated virus (AAVs). Les AAVs permettent
une expression stable et à long terme (Kwong et al., 2014).
5
De surcroît, ils permettent le ciblage d’un type cellulaire via l’utilisation d’un promoteur
spécifique ou l’adaptation du sérotype de la capside. Ainsi, dans le cadre de l’optogénétique,
l’apport d’un photo-senseur par AAVs dans la rétine peut restaurer artificiellement une activité
rétinienne proche de celle trouvée dans une rétine normale (Busskamp et al., 2011).
En somme, l’optogénétique via l’utilisation des AAVs représente une stratégie attrayante dans
le cadre de l’étude des RP. En premier lieu, la dégénérescence des cellules de la rétine dans le
cadre des RP est difficile à prédire. C’est pourquoi, la stratégie d’optogénétique via les AAVs
pourrait servir pour le ciblage des cellules ganglionnaires qui sont comme précédemment
évoqué, les dernières cellules responsables de la transmission du signal au nerf optique. Ainsi,
l’efficacité de l’optogénétique dans ces cellules ne dépendra pas de l’état de dégénérescence
des cellules en amont comme les photorécepteurs ou les cellules bipolaires. Le projet exposé
ici est issu de cette réflexion et de nombreuses recherches suite à la lecture des travaux de
Busskamp et ses collaborateurs (2014). Ainsi, avant de décrire le projet, nous résumerons cette
publication.
6
Figure 5 : Les cônes de souris C-DGCR-KO à P60 perdent leurs segments externes et leurs fonctions
(A) Western Blot quantitatif révélé avec un anticorps anti-DGCR8 sur des cônes de souris Wild Type (WT) ou Knock Out (KO) C-DGCR8-KO
à P30 (n=3). Le témoin de charge utilisé est la tubuline avec son anticorps associé (anticorps Anti-tubuline).
(B) Mesure RT-qPCR de miRNAs matures d’intérêts (n=3) dans des cônes à P30.
(C) Electrorétinogramme photopique (reflétant principalement l’activité des cônes) de rétines WT ou KO à P30 stimulées avec de la lumière
aux intensités indiquées. Comme contrôle un électrorétinogramme scotopique est montré en haut (reflétant principalement l’activité des
bâtonnets).
(D) Western Blot quantitatif révélé avec un anticorps anti-DGCR8 sur des cônes de souris Wild Type (WT) ou Knock Out (KO) C-DGCR8-KO
à P60 (n=3). Le témoin de charge utilisé est la tubuline avec son anticorps associé.
(E) Mesure RT-qPCR de miRNAs matures sélectionnés (n=3) dans des cônes à P60.
(F) Electrorétinogramme photopique (reflétant principalement l’activité des cônes) de rétines WT ou KO à P60 stimulées avec de la lumière
aux intensités indiquées. Comme contrôle un électrorétinogramme scotopique est montré en haut (reflétant principalement l’activité des
bâtonnets).
Présentation de la publication (Busskamp et al., 2014)
Le disfonctionnement des segments externes des cônes est le premier signe de dégénérescence
de la rétine. Dans cet article, l’importance des microARNs miR182 et 183 a été étudiée. Il a été
démontré que ces deux miRNAs sont nécessaires et suffisants pour la formation du segment
interne, du cil connectant et d’un court segment externe dans les cellules ES dérivés en rétine
in vitro. Les résultats ont aussi permis de montrer que les voies de régulations gérées par les
miR182 et 183 sont nécessaires pour le maintien des segments externes in vivo et de leur
fonction in vitro.
La perte des microARNs dans les cônes adultes conduit à la perte des segments externes
Afin d’étudier le rôle des miRNAs dans la viabilité des cônes adultes, les auteurs ont
génétiquement interrompu la machinerie Drosha/DGCR8 permettant la formation des miRNAs.
Pour cela ils ont croisé des souris dans lequelles DGCR8 est floxé (encadré par des sites LoxP)
avec des souris exprimant spécifiquement la Cre-recombinase dans les cônes (D4-Cre
hétérozygotes). La lignée résultante de ce croisement, KnockOut DGCR8 cône spécifique (CDGCR-KO) est obtenue après recombinaison homologue dans l’exon 3 floxé du gène cible,
provoquant un décalage du cadre de lecture et la production d’une protéine tronquée. Dans les
différentes expériences, ils ont utilisé des vecteurs viraux conditionnels (AAVs) pour effectuer
l’infection des cônes C-DGCR-KO ou WT.
Trente jours après la naissance des souris (P30), la rétine est totalement développée. A ce stade,
le western blot quantitatif anti DGCR8 révèle une diminution de plus de 50% de la protéine
dans les cônes C-DGCR-KO (cf. figure 5A). A P60 (60 jours après la naissance), la production
de DGCR8 chez le C-DGCR-KO est quasiment nulle (18% du WT) (cf. figure 5I). De surcroît,
le niveau de microARNs matures diminu seulement de 20-25% pour le cluster de
miR183/96/182 à P30 (cf. figure 5B) alors qu’à P60 ces miRs sont quasiment absents (cf. figure
5J). Il semble donc que le KO de DGCR8 est totalement effectif à P60.
Pour étudier l’influence du KO, le nombre de cellules coniques a été estimé (résultats non
montrés). Celui-ci ne varie pas entre les rétines de souris WT et C-DGRC-KO. Les auteurs ont
aussi montré que l’opsine n’est plus présente dans les cônes C-DGCR-KO (résultats non
montrés). Donc, l’opsine est nécessaire pour la photoréponse des cônes.
7
Figure 6 : Rétrécissement des segments externes de cônes de souris C-DGCR-KO entre P30 et P90
(A) Quantification de la surface d’une coupe transversale de SI (Segment Interne), CC (Cil Connecteur), et SE (Segment Externe) de
cône P60 WT (blanc) et P60 KO (noir).
(B) Vue de côté de cônes à P30, P40, P50, et P60 C-DGCR8-KO.
(C) Quantification de la longueur du SE (Segment Externe) à P30, P40, P50, et P60 sur des cônes WT et KO. Barre d’erreur : erreur
standard à la moyenne.
Figure 7 : La réintroduction des miR-182 et 183 sont suffisants
pour le maintien des segments externes de cônes
(A) Expression conditionnelle d’une cassette DGCR8 AAV
conduite par un promoteur CMV. En présence de Crerecombinase, la séquence d’ADN encadrée par deux sites
différents loxP (triangles noir et gris) est inversée, permettant
l’expression de DGCR8. WPRE : woodchuck hepatitis virus
post transcriptional regulatory element.
(B) Quantification de l’immunomarquage des opsines OPN dans
des cônes WT, KO, et KO rescue (complémenté) à P90.
La
fonctionnalité
des
cônes
est
alors
testée
in
vivo
par
électrorétinographie.
L’électrorétinographie consiste à mesurer la réponse à la lumière des cellules rétiniennes. Le
scotopic flash permet de mesurer la réponse à la lumière des bâtonnets. Le flash photopique
permet de mesurer la réponse des cônes. A P30, l’électrorétinographie ne révèle pas de
différence entre la réponse au stimulus lumineux des rétines WT et C-DGCR-KO (cf. figure
5C). En revanche, la réponse à P60 est fortement diminuée dans les cônes de rétine C-DGCRKO (cf. figure 5F).
Pour révéler les changements morphologiques des cônes à P60, des biopsies 3D de rétines de
souris P30 et P60 C-DGCR-KO sont analysées par microscopie électronique (SBEM :
technique de microscopie à haute résolution 3D). Les cônes des C-DGCR-KO P60 ont perdu
leurs segments externes. Le diamètre du segment interne est plus large que dans les souris WT
(cf. figure 6A). Le corps cellulaire du cône et l’organisation nucléaire sont intactes et
n’apparaissent pas être différents du WT (données non montrées). La morphologie des cônes à
P30 dans les souris C-DGCR-KO et la morphologie des bâtonnets à P30 ainsi qu’à P60 de
souris C-DGCR-KO apparaissent normaux (données non montrées). Pour déterminer le temps
qu’il faut pour perdre le segment externe, ils ont reconstruit en 3D la rétine externe tous les 10
jours entre P30 et P60. Les segments externes des cônes P30 C-DGCR-KO ont une longueur
similaire au WT, mais à chacun des points de temps suivant ils raccourcissent de façon linéaire
jusqu’à devenir indétectables à P60 (cf. figure 6B et 6C). Cela indique que DGCR8 est
nécessaire au maintien des segments externes des cônes dans la souris adulte.
Ensuite, DGCR8 est réintroduit dans des cônes P45 (rescue) C-DGCR-KO via un AAV (cf.
figure 7A). La séquence WPRE rajoutée en 3’ permet d’augmenter la stabilité de l’ARN
messager. A P90, le niveau d’opsine dans les cônes est alors significativement plus haut dans
les rétines C-DGCR-KO infectées par AAV que dans les rétines contrôles non infectées (cf.
figure 7B). Donc, la réexpression de DGCR8 est suffisante pour ré-initier l’expression de
l’opsine.
Les miR-182 et 183 sont suffisants pour le maintien des segments externes
Les auteurs ont précédemment mis en évidence que l’absence des miRNAs induit la perte
progressive des segments externes des cônes. Selon eux, si cette perte est due à l’absence de
miRNA matures, alors la réexpression des miRNA les plus pertinents (soit les plus exprimés)
8
Figure 8 : La réintroduction des miR-182 et 183 est suffisant pour le maintien des segments externes de cônes
(A) Profil d’expression des miRNAs matures dans les cônes des souris Wild Type à P60 (séquençage haut débit)
(B) Cassettes d’expression de sh-miR du vecteur viral adéno-associé (AAV) sous l’influence du promoteur CMV. En présence de Cre, le segment d’ADN
flanqué de sites loxP est inversé, réprimant le répresseur Tet (TetR) et activant l’expression de la GFP. En absence de TetR les sh-miRs sont exprimés
via le promoteur H1-TetO2.
(C) Observation par microscopie confocale du sauvetage des segments externes des cônes (souris C-DGCR8-KO), et de l’expression d’opsine par les
sh-miR-183/182. Marquage GFP des cônes infectés (Jaune) ; Opsine (vert) ; Marquage spécifique des cônes par tdTomato (magenta). La ligne en
pointillé indique la localisation des segments externes.
(D) Quantification des opsines (OPN) suite à l’immunomarquage effectué en (C) (foci).
(E) Observation par microscopie confocale des cônes de souris C-DGCR8-KO à P90. La réexpression de miR-182/183 à P60 ne permet pas la
restauration des segments externes 30 jours après. Marquage GFP des cônes infectés (Jaune) ; Opsine (vert) ; Marquage des cônes par tdTomato
(magenta).
dans les cônes C-DGCR-KO permettrait de prévenir ce problème. L’expression des miRNAs
dans les cônes « adultes » chez les souris wild type (soit à 60 jours postnatals) a été révélée par
séquençage haut débit. Les auteurs ont estimé que les miRNAs les plus exprimés seraient
probablement ceux impliqués dans la maintenance des segments externes des cônes (cf. figure
8A). Le profil d’expression des miRNAs est très inégal. Le miR-182 est le plus abondant et
représente à lui seul 64 % d’abondance par rapport à la population totale de miRNAs. Sachant
que miR-183, miR-182 et miR-96 (abondance < 1%) sont issus du même transcrit primaire
(cluster miR-183/96/182), les auteurs ont choisi de ré-exprimer miR-182 et miR-183 dans les
cônes C-DGCR-KO, d’autant plus que ces deux miRNAs ont des séquences apparentées.
Afin de s’affranchir du mécanisme de maturation des pri-miRNAs en pré-miRNAs assuré par
le complexe Drosha/DGCR8 (absent dans la lignée C-DGCR-KO), les auteurs ont généré des
ARNs mimétiques des miRNAs matures (sh-miRs) ; ces sh-miRs subissent uniquement la
dernière étape de maturation opérée par DICER, qui génère des miRs matures à partir de prémiRNAs. L’expression des miRs dans les cônes C-DGCR-KO est réalisée à 30 jours postnatals
(P30) par infection avec des vecteurs viraux adéno-associé (AAVs) (cf. figure 8A). A ce stade,
les segments externes des cônes sont encore présents comme montré précédemment.
A P65, 35 jours après l’infection, la structure des cônes est analysée par immunomarquage sur
sections rétiniennes : miR-182/183 empêche la perte des segments externes des cônes ainsi que
des opsines (cf. figure 8C). Après avoir vérifié par RT-qPCR que l’expression des sh-miRs
182/183 n’a pas d’influence sur l’expression des autres miRNAs présents dans les cônes
(résultats non montrés), les auteurs ont pu conclure que la présence des miR-182/183 est
suffisante pour le maintien de segments externes (cf. figure 8D).
Cependant, les auteurs ont voulu examiner si la réexpression de miR-182/183 dans les cônes
C-DGCR-KO permettrait de reformer les segments externes. Le même protocole d’infection
via AAVs est réalisé à P60, c’est-à-dire après la perte des segments externes. L’inspection des
rétines à P90 via immunomarquage indique que les segments externes n’ont pas été restaurés
(cf. figure 8E).
En somme, les miR-182/183 sont suffisant pour le maintien des segments externes de cône dans
les souris C-DGCR-KO mais ne permettent pas de les restaurer après leur dégénérescence.
9
Figure 9 : Les microARNs du cluster miR-183/96/182 sont nécessaires et suffisants pour la formation de la structure distale des
photorécepteurs dans les cellules ES dérivées en rétine.
(A) Nombre de copies de miRNAs par cellule analysés à différents temps de culture in vitro des cellules ES dérivées. Cette mesure est réalisée
en RT-qPCR (n=3). Les échantillons représentés en jaune sont infectés au jour 7 (d7) de culture par des AAVs surrexprimant le cluster miR182/96/183.
(B) Les cellules ES différenciées en cellules rétinales sont fixées et analysées en microscopie confocale à différents temps de culture. Les cellules
ES dérivées sont infectées avec des AAVs exprimant la GFP et les miR-182/96/183. Le contrôle est fait avec une infection de la culture au
jour 7 avec des AAVs exprimant la GFP. Les immunomarquages de la Rhodopsine (rouge) et de la GFP (jaune) sont montrés. Les noyaux
cellulaires sont marqués par Hoechst (blanc). Barre d’échelle, 20µm.
(C) De la même manière que précédemment, les cellules en culture sont observées. Les cellules sont infectées au jour 15 par des AAVs exprimant
le « triple-sponge » miR-182/96/183 et la GFP sous la dépendance d’un promoteur cône spécifique : le promoteur Rho.
Le cluster MiR-182/96/183 induit la formation de courts segments externes de cônes et
une photoréponse in vitro
Le cluster d’expression des miR-183/96/182 est nécessaire au maintien de la viabilité des cônes
de souris. Mais il reste encore à identifier et comprendre les effets de l’expression du cluster de
microARNs miR-183/96/182 au sein des cônes. Pour cela l’équipe a mis en place un modèle in
vitro de cellules ES de souris dérivées en cellules rétinales. Grâce à ce modèle, l’équipe a pu
étudier la progression des quantités de microARNs grâce à des RT-PCR quantitatives. En
parallèle, ils ont voulu observer l’évolution de la structure des cônes grâce à la microscopie à
fluorescence. La protéine Rhodopsine est notamment utilisée pour observer les segments
coniques formés. En effet, cette protéine est localisée naturellement dans le segment externe.
Les cellules ES dérivées en cellules rétinales sont étudiées en culture 3D. Dans ce contexte,
elles ne possèdent pas de segments. C’est donc un contexte propice à l’étude de la formation de
segments. C’est une rétine reconstituée in vitro. En effet, au bout de 25 jours de culture (d25),
L’analyse en RT-qPCR révèle une faible expression des miR183 et 182. Quant au miR96, il
n’est pas exprimé au 25ème jour (cf. figure 9A). A ce stade, la structure segmentaire n’est pas
visible en microcopie (cf. figure 9B). En revanche, au 35ème jour de développement des cellules
(d35), le segment interne est présent et l’expression des miR182 et 183 est haute. Toutefois, les
segments externes restent absents (cf. figure 9B).
Ainsi, l’équipe a pu étudier le lien de cause à effet entre l’expression du cluster miR-183/96/182
et la formation de la structure segmentaire interne. Une infection de la culture cellulaire est faite
au 7ème jour de culture avec des AAVs exprimant le cluster miR-183/96/182. Suite à cette
infection, les miRs du cluster sont fortement accumulés au 25ème jour et les segments internes
sont alors observés (cf. figure 9B en jaune). Ainsi, la surexpression de ce cluster de microARNs
entraîne le développement précoce du segment interne.
Mais il est nécessaire de confirmer que l’expression du cluster est nécessaire pour la formation
du segment interne. Pour cela, une construction « triple-sponge » spécifique des miR183/96/182 est apportée dans la culture cellulaire. Ainsi, l’activité des trois miRs étudiés est
bloquée in vivo et in vitro (Krol et al., 2010b). Suite à l’apport du « triple-sponge », la structure
des photorécepteurs est absente (cf. figure 9C). Ainsi, l’expression du cluster étudié est
nécessaire et suffisante pour la formation d’un début de structure de photorécepteur à partir de
10
Figure 10 : Le cluster miR-183/96/182 induit la formation de court segments externes et une réponse à la lumière dans
les cellules ES dérivées en culture rétinienne.
(A) Microscopie électronique de la structure distale au jour 25 d’une cellule ES dérivée en cône par infection au jour 7 avec
un AAV exprimant pri-miR-183/96/182.
(B) Quantification d’une réponse hyperpolarisante d’un pseudo photorécepteur en réponse à une stimulation lumineuse.
cellules ES dérivées en cônes.
Suite à ces résultats, les auteurs cherchent l’influence de l’expression de ce cluster sur la
formation de segments externes sur leur modèle cellulaire. Pour répondre à cette interrogation,
une reconstitution par microscopie électronique est faite pour pouvoir observer la morphologie
des cellules. Cette reconstitution est faite à partir de cellules en culture depuis 25 jours et en
présence des microARNs miR183, 96 et 182 (infection au 7ème jour de culture avec des AAVs
exprimant pri-miR-183/96/182). Ainsi, des structures de segments internes avec des
mitochondries et de longs cils connectants ont été mis en évidence (cf. figure 10A). De plus,
dans la partie supérieure de ce cil, il est observé un empilement de disques membranaires
caractéristiques du segment externe des cônes. Cet empilement pourrait être suffisant pour
obtenir une réponse au stimulus lumineux.
Afin de caractériser cette structure abortive de segments externes, la réponse des cellules à la
stimulation lumineuse est étudiée. En effet, celle-ci est strictement dépendante de la présence
du segment externe. Ainsi, pour évaluer la photoréponse, une mesure de l’hyperpolarisation des
cellules est faite. La photoréponse des cellules est effective contrairement aux cellules contrôles
non-infectées (cf. figure 10B).
Grâce à cette étude in vitro, les auteurs ont pu constater que l’expression du cluster miR183/96/182 induit la formation d’un court segment externe dans les cellules ES dérivées en
cellules rétinales. Ceci est confirmé par une réponse au stimulus lumineux identique à celle des
photorécepteurs normaux chez les vertébrés.
Grâce au modèle in vivo de souris KO (C-DGCR-KO), les auteurs ont démontré l'importance
des miR-182 et miR-183 pour le maintien des cônes dans la rétine de souris. En effet, en leur
absence les segments externes des cônes sont progressivement raccourcis et leur réexpression
prévient ce défaut. De plus, le cluster miR-183/96/182 s'est révélé nécessaire et suffisant pour
la formation des segments internes, du cil connecteur et de segments externes courts, dans des
cellules ES dérivées en rétine. Ce résultat est prometteur pour les applications thérapeutiques.
Les pathologies rétiniennes dans lesquelles on observe une dégénérescence progressive des
segments externes, pourraient effectivement être abordées par une stratégie de réexpression de
ce cluster de microARNs.
11
Souris WT
(C57BL/6J)
Souris RP (GCNA
-/-
-/-
Biopsies de Rétines
Rétine humaine WT et RP
Purification des cellules ganglionnaires
Transcriptome des cellules ganglionnaires de souris WT et
d’humain WT
RT-PCR sur tous les types cellulaire de la rétine (amacrines, horizontales, cônes,
bâtonnets, bipolaires) avec amorces du gène cible + UNIPROT
Vérification de l’expression spécifique du gène dans les cellules ganglionnaires
Travail in-silico et expériences de gène rapporteur
Design du promoteur
Transfection AAV-eYFP ou AAV-photosenseur-eYFP sur rétines de souris WT ou
RP et sur rétines humaines WT ou RP
Vérification que localisation du photosenseur au niveau des cellules
ganglionnaires
Transfection AAV-vide ou AAV-photosenseur dans souris WT ou RP et dans rétines
humaines WT ou RP
+
Tests fonctionnels
Vérification de la restauration de la réponse à la lumière des cellules rétiniennes
Plan générale de la stratégie d’optogénétique dans le cadre d’une rétinite pigmentaire
Projet de recherche
Les cellules ganglionnaires sont les cellules les plus en aval dans la transduction du
signal lumineux, vers le nerf optique qui transmet l'information au cerveau supérieur. Nous
cherchons donc à exprimer spécifiquement notre photo-senseur dans ces cellules. Pour cela
nous devons rechercher un promoteur spécifique des cellules ganglionnaires, en analysant leur
transcriptome. Cette étude nécessite donc la purification de ces cellules à partir d'une biopsie
de rétine (cf. plan).
I.
Choix des modèles et purification des cellules ganglionnaires
Dans le but d'obtenir des cellules ganglionnaires de rétine, nous partirons de trois types
de donneurs. Tout d'abord, nous commanderons des souris wild-type C57BL/6J (Claes et al.,
2004). Mais aussi des souris porteuses d'une rétinite pigmentaire, soit la souche CNGA3-/- Rho/-
(Claes et al., 2004). La mutation Rho-/- (Rhodopsine knockout) entraîne la dégénérescence
des photorécepteurs. Ce résultat est cohérent puisque la rhodopsine est nécessaire au maintien
des segments externes des photorécepteurs. La mutation CNGA3-/-correspond à l'extinction du
gène codant pour la sous unité A3 d'un canal à cation spécifique des cônes (CNG = Cyclic
nucleotide-gated) qui créé une hyperpolarisation des cellules. La perte de CNGA3-/- induit la
dégénérescence des photorécepteurs ainsi que la disparition de leur photoréponse. Cette souche
est donc un bon modèle de rétinite pigmentaire de par l'absence totale de photoréponse. Mais
aussi car elle a l'avantage de conserver une organisation structurale normale de la rétine. Un
autre avantage est la dégénérescence progressive des photorécepteurs, débutant à quatre
semaines après la naissance pour enfin être totale à trois mois.
Pour finir, nous aurons besoin de prélèvements humains issus de donneurs, fournis par
la CorneaBank Amstersdam. La rétine doit être mise en culture moins de 36 heures après la
mort du patient (Busskamp et al., 2010). À partir de ces donneurs nous réaliserons une biopsie
de rétine selon le protocole classique du journal Nature publishing group (Powner et al., 2012)
mais sans les étapes de fixation de la rétine.
12
À partir des biopsies de rétines, nous pourrons isoler du tissu les cellules ganglionnaires
qui nous intéressent grâce à une stratégie de purification utilisant deux anticorps. Cette
technique a été découverte par Barbara A. Barres en 1988 (Barres et al., 1988). Nous suivrons
le "Nature protocols" (Winzeler and Wang, 2013).
II.
Identification d'un promoteur spécifique des cellules ganglionnaires
1) Transcriptome des cellules
Grâce à l'étude transcriptomique nous souhaitons trouver un promoteur spécifique des
cellules ganglionnaires. Ce promoteur nous permettra de réaliser une expression du photosenseur uniquement dans ces cellules. Afin d'éviter tout biais lié à la rétinite pigmentaire ce
travail sera réalisé sur des cellules wild-type (C57BL/6J), en parallèle sur l'humain et la souris.
Pour commencer il faut extraire les ARN par le TRIzol® Reagent (Life Technologies)
selon la procédure conseillée. Sachant que la purification de cellules ganglionnaires à partir
d’une rétine donne environ 15 000 cellules, que l’extraction d’ARN possède un rendement
d’environ 8-15µg et que l’Illumina nécessite environ 250ng. Nous utiliserons les deux rétines
d’une souris pour faire le transcriptome. Notons aussi que ce transcriptome est réalisé en
triplicate. Ensuite, un enrichissement en ARNm est réalisé via des billes magnétiques
fonctionnalisées par des oligodT (dynabeads®Oligo (dT)25-61002 chez Life Technologies)
pour éviter d'amplifier les ARNr (ribosomiques). Les ARN seront ensuite envoyés à l'entreprise
Illumina afin de réaliser un séquençage haut débit FRT-Seq (Flowcell Reverse Transcription
Sequencing) (Mamanova and Turner, 2011). Le FRT-Seq permet de s'affranchir des biais de
PCR en réalisant la réverse transcription directement sur la puce à partir d'ARN non amplifiés
liés aux adaptateurs. Le traitement des données se fera via le programme DAVID. La fonction
des cellules ganglionnaires est la transduction du signal photoélectrique. Nous analyserons donc
en priorité les gènes impliqués dans la photoréponse (canaux, pompes, transducine,...) afin de
voir si un ou plusieurs d'entre eux sont largement surexprimés par rapport aux autres gènes.
2) Vérification de la spécificité du gène
À partir des gènes sélectionnés, nous désignerons des amorces afin de voir lesquelles
sont spécifiques des cellules ganglionnaires par RT-PCR. Cette analyse se fera sur les ARNm
(ARN messagers) des autres types cellulaires de la rétine à savoir : les cellules bipolaires, les
13
Tableau 1 : Logiciels utilisés pour l'analyse in-silico et informations apportées
Figure 11 : Carte du vecteur pGL2-Basis (Proméga).
Le pGL2 basic permet l'insertion d'un promoteur à tester, en amont de la luciférase dans le site de multi clonage (MCS en bleu de +1 à
+123). La luciférase est alors sous le contrôle du promoteur et son niveau d'expression dépend de la force et de la régulation du promoteur.
pBR322 origin est une origine de réplication procaryote, elle permet de faire la production de plasmide chez Escherichia coli. Ampicillin
correspond au gène de résistance à l'ampicilline, il est utile pour sélectionner les bactéries transformées pendant l'amplification du plasmide
en bactéries. Les primers EBV_rev et LucNrev sont des séquences à partir desquelles nous pouvons designer des amorces pour le
séquençage du promoteur inséré, pour vérifier notre construction. (Proméga - pGL2-Basic Vector)
cellules amacrines, les cellules horizontales, les cônes et les bâtonnets. Le résultat attendu est
une absence d'amplification si le gène est bien spécifique de ces cellules.
L'inconvénient de cette expérience réside dans l'obligation de travailler sur l'ensemble
des ARNm de tous les types cellulaires hormis les ganglionnaires. En effet nous ne pouvons
pas isoler chaque type cellulaire. Nous nous contenterons donc de séparer les cellules
ganglionnaires des autres cellules de la rétine. Si jamais la RT-PCR donnait une amplification,
nous retournerions aux données du transcriptome afin de sélectionner d'autres gènes d'intérêt.
La dernière étape de contrôle du gène d'intérêt consistera à aller voir son profil
d'expression sous le contrôle de son promoteur sur le site UNIPROT.
3) Définition du promoteur
Une fois le gène spécifique des cellules ganglionnaires identifié, nous ferons des
analyses bio-informatiques afin de retrouver le promoteur qui contrôle sont expression. À partir
de la séquence complète du promoteur, nous chercherons quelles sont les régions qui permettent
la meilleure expression du gène. Pour cela nous réaliserons tout d'abord un travail in-silico (cf.
tableau 1) puis des tests de gènes rapporteurs luciférase. L'étude in-silico commence par la
localisation des îlots CpG afin de les exclure puisqu'ils régulent généralement de manière
négative l'expression des gènes une fois méthylés. La recherche de séquences consensus permet
d'identifier des boîtes conservées pouvant être nécessaires à la transcription. Il est donc
nécessaire de les conserver. De même, il faut identifier les motifs similaires des facteurs de
transcription et en repérer les sites de fixations indispensables à la transcription (Casco-Robles
et al., 2014).
À la suite de ces analyses bioinformatiques, nous commanderons différentes
constructions contenants certaines séquences consensus identifiées. Nous testerons ces
constructions expérience de gène rapporteur. Les tests de gène rapporteur dans les cellules
ganglionnaires, serons réalisés par insertion des différents promoteurs dans le vecteur pGL2
(Proméga - pGL2-Basic Vector - cf. figure 11) selon le protocole recommandé. La
normalisation sera réalisée avec le vecteur phRG-TK (Proméga - phRG-TK Vector) qui permet
l'expression de la Renillia Luciferase, en cotransfectant les cellules ganglionnaires.
14
Figure 12 : Carte du vecteur pGL2-Control (Proméga).
Le pGL2 contrôle permet de vérifier l'efficacité de la transfection , en amont de la luciférase il y a un promoteur fort SV40. La luciférase est alors sous le
contrôle du promoteur et son niveau d'expression est fort et visualisable, donc la détection de luciférase sera tributaire de l'infection cellulaire. pBR322 origin
est une origine de réplication procaryote, elle permet de faire la production de plasmide chez Escherichia coli. Ampicillin correspond au gène de résistance à
l'ampicilline, il est utile pour sélectionner les bactéries transformées pendant l'amplification du plasmide en bactéries. (Proméga - pGL2-Control Vector)
Figure 13 : Illustration du ciblage cellule spécifique d’un AAV par injection
intraocculaire.
Selon le mode de délivrance, les particules virales peuvent cibler les cellules de
l'épithélium pigmentaire (RPE), les photorécepteurs (PR), les cellules de Müller,
les cellules ganglionnaires (GC), les cellules endothéliales de la cornée (CE), les
cellules de l'épithélium de l'iris (IR). Sue les quatre images de coupe de rétine
cellues marquées à l'iodure de propidium), nous pouvons observer quelles
cellules sont ciblées (en vert) en fonction du type de capside utilisée et du mode
d'injection : en haut à gauche, un adeno virus en injection intravitréenne cible
les cellules de Müller; en bas à gauche, un AAV2/2 en injection intravitréenne
cible les cellules de Müller et les cellules ganglionnaires; en haut à droite, un
adéno virus, un lentivirus ou un AAV2/1 en injection subrétinal ciblent les
cellules de l'épithélium pigmentaire; en bas à droite, un AAV2/2, un AAV2/5 en
injection subrétinale, ciblent les photorécepteurs et les cellules de l'épithélium
pigmentaire. (Bennett, 2003)
Le contrôle négatif en vecteur pGL2-Basic vide sera également cotransfecté avec le phRG-TK
ainsi que le contrôle positif avec le vecteur pGL2-Control (Proméga - pGL2-Control Vector –
cf. figure 12). Avant les transformations dans les cellules ganglionnaires, nous réaliserons les
étapes de production de plasmides chez Escherichia coli ainsi qu'une vérification des séquences
promotrices insérées par séquençage via les amorces contenues dans pGL2 autour du site
multiple de clonage. Une fois que nous avons les niveaux d'expression de chaque construction,
nous en choisirons un optimum pour la suite de nos travaux.
III.
Construction du système de transfection
Grâce au promoteur, nous pourrons tenter d'exprimer le photo-senseur eNpHR
spécifiquement dans les cellules ganglionnaires via AAVs (Adéno-associated virus). Cette
stratégie d'optogénétique pourrait permettre la restauration de la réponse à la lumière de la rétine
et ainsi rendre la vue dans le cas de rétinite pigmentaire.
1) Transduction d’un photo-senseur dans la rétine par AAVs
Les virus adéno-associés sont des vecteurs qui permettent une expression stable et à
long terme de gènes. Ils peuvent cibler différents types de cellules en fonction du sérotype de
capside et l'utilisation d'un promoteur spécifique peut induire une expression contrôlée du
transgène. L’œil est une cible idéale pour le transfert de gènes médié par les vecteurs viraux :
c’est un organe petit et compartimenté qui nécessite donc une petite quantité de vecteur
(Lebherz et al., 2008).
Les AAVs sont des vecteurs viraux issues des parvovirus humains, dont 96% des
éléments viraux ont été éliminés (Grieger et al., 2006). Ils n’induisent donc aucune réponse
immunitaire à médiation cellulaire dans l’œil ou ailleurs dans le corps (Bennett, 2003). Les
protéines de la capside des AAVs sont responsables de leur tropisme et donc de leur efficacité
à transduire un type cellulaire spécifique. Les virus adéno-associés de sérotype 2 (AAV2)
ciblent efficacement les cellules de Müller (cellules gliales de la rétine) (cf. figure 13), et
particulièrement les cellules ganglionnaires après injection par voie intravitréenne (Bennett,
2003).
15
Figure 14 : Microscopie à fluorescence d’une coupe de rétine afin de visualiser le ciblage spécifique de différents AAVs.
Cryocoupes de rétine 6 mois après injection d'AAV (adéno-associated virus) avec marquage fluorescent des cellules infectées par l'AAV
et marquage des noyaux au DAPI. L'AAV2/1 (en haut à gauche) cible les cellules de l'épithélium pigmentaire (RPE); L'AAV2/2 (en
haut au milieu) ne cible aucun type cellulaire; L'AAV2/5 (en haut à droite) cible les photorécepteurs (RP) dans la couche externe (onl :
outer nuclear layer) ainsi que les cellules de l'épithélium pigmentaire; L'AAV2/5 (en bas à gauche) cible les RPE et les photorécepteurs;
L'AAV2/8 (en bas au milieu) cible les cellules ganglionnaires et les photorécepteurs; L'AAV2/9 (en bas à droite) cible les RPE.
(Lebherz et al., 2008)
Tableau 2 : Spécificité cellulaire des différents types d’AAVs 6 mois après injection.
Les capsides 1,2,5,7,8,9 correspondent respectivement aux AAV2/2, AAV2/3, AAV2/5, AAV2/7,
AAV2/8, AAV2/9. Les RPE sont les cellules de l'épithélium pigmentaire, les PRs sont les
photorécepteurs, la colonne Muller correspond aux cellules de Müller et les GLC sont les cellules
ganglionnaires. (Lebherz et al., 2008)
Pour améliorer la spécificité du transfert de gène vis-à-vis du sous-type cellulaire
rétinien, une stratégie de pseudotypage d’AAV peut être mise en place. Le tropisme viral de
l’AAV2 peut être orienté de façon plus spécifique vers les cellules ganglionnaires de la rétine,
tout en conservant les avantages d’une expression stable et à long terme du transgène. Tel que
décrit dans la publication Lebherz et al., 2008, il s’agit de produire un AAV hybride en
empaquetant le génome de l’AAV2 dans une capside d’AAV de sérotype 8 (AAV2/8). Les
auteurs ont pu mettre en évidence qu’une injection intravitréenne d’AAV2/8 portant une
cassette codant pour le transgène eGFP chez des souris C57BL/6 adultes (deux mois), permet
d’obtenir un signal d’expression de l’eGFP au niveau des cellules ganglionnaires rétiniennes
(cf. figure 14 et tableau 2). L’efficacité de transduction du transgène eGFP est rapide
(fluorescence détectable dès 5 jours après l’injection) et stable sur une durée supérieure à 6
mois. L’utilisation de l’AAV2/8 semble donc être un outil approprié pour le transfert d’un
photo-senseur dans les cellules ganglionnaires de la rétine chez des modèles murins de rétinite
pigmentaire (Cnga3–/–; Rho–/–). L’avantage d’expérimenter sur les maladies cécitantes, est
qu’elles sont bilatéralement symétriques : il est donc possible d’effectuer des expériences de
transduction contrôlées en utilisant un œil comme « œil expérimental » et l’œil controlatéral
comme « œil contrôle » (Lebherz et al., 2008).
2) Production des AAVs
La production des AAVs sera effectuée comme décrit précédemment (Busskamp et al.,
2014) par triple transfection de cellules HEK293T en utilisant des polymères cationiques
polyéthylènimine-linéaire (PEI). Le plasmide pITR contient la cassette transgène (gène
« contrôle » eYFP ou gène codant pour le photo-senseur eNpHR fusionné à l’eYFP) sous
contrôle du promoteur spécifique des cellules ganglionnaires de la rétine et encadrée par les
séquences « inverted terminal repeat » (ITR). Le plasmide AAV-helper code les protéines Rep
spécifiques du sérotype 2, et les protéines Cap du sérotype 8 (Rep et Cap sont des protéines de
réplication et des protéines structurales de la capside virale, respectivement). Le plasmide
helper adénoviral pHGTI-Adeno1 héberge les gènes adénoviraux qui codent pour les protéines
E1A, E1B, E4 et E2A requises pour les fonctions auxiliaires (Grieger et al., 2006). Les AAVs
seront purifiés en utilisant un gradient discontinu de l'iodixanol (Sigma, Optiprep). L’ADN
encapsidé
sera
quantifié
par
RT-qPCR
TaqMan
(amorce
sens
:
GGCTGTTGGGCACTGACAA ; amorce antisens : CCAAGGAAAGGACGATGATTTC ;
sonde : TCCGTGGTGTTGTCG) après dénaturation des particules d'AAV en utilisant la
16
ProtéinaseK, et les titres seront calculés en tant que copies de génome (cg) par ml.
IV.
Validation du système
1) Tests de localisation du photo-senseur
Dans notre stratégie d'optogénétique nous avons choisi d'exprimer eNpHR, pompe à
chlore activable par la lumière jaune. Elle entraînera une hyperpolarisation membranaire
(Busskamp et al., 2010) spécifiquement dans les cellules ganglionnaires grâce au promoteur.
En effet, des expériences d'optogénétique réalisées avec ce photo-senseur ont démontrées sont
efficacité à restaurer la réponse à la lumière dans des modèles de rétinites (Busskamp et al.,
2014).
Nos expériences de transduction seront réalisées dans deux lignées murines différentes:
C57BL/6J comme lignée wild type (WT) et Cnga3–/–; Rho–/– comme lignée modèle de rétinite
pigmentaire (Claes et al., 2004). Elles seront aussi réalisées sur rétine humaine (wild-type et
rétinite pigmentaire) en culture. Les injections d’AAVs seront réalisées à P60 (souris adultes).
Le vecteur AAV2/8 sera utilisé pour transduire soit le transgène codant pour le photo-senseur
fusionné à l’eYFP sous contrôle du promoteur spécifique des cellules ganglionnaires ; soit le
transgène « contrôle » codant pour l’eYFP seul. L’eYFP présent dans les deux cassettes
d’expression est nécessaire pour valider par mesure de fluorescence, que l’expression des
transgènes est bien localisée au niveau des cellules ganglionnaires. Pour chaque groupe de
souris (C57BL/6J n = 3 ; Cnga3–/–; Rho–/– n = 3), les animaux recevront une injection du
transgène « photo-senseur/eYFP » dans un œil, et une injection du transgène contrôle « eYFP »
dans l’œil controlatéral. L’administration des AAV2/8 est réalisée par injection intravitréenne
(2 μl/œil, soit une dose de 1 × 1010 cg/œil, n = 3/groupe) (Lebherz et al., 2008) chez les animaux
préalablement anesthésiés par 3% d’isoflurane (Busskamp et al., 2010). Les souris seront
ensuite sacrifiées et les yeux énucléés pour les étapes d’histologie décrites par Lebherz et al.
2008. Comme mentionné précédemment (Lebherz et al., 2008), le sérotype 8 a une efficacité
de transduction rapide (expression maximale du transgène 5 jours après l’injection). La
détection de l’eYFP par fluorescence pourra donc être réalisée peu de temps après les injections.
Les mêmes mesures seront égalements réalisées en triplicate sans aucune injection sur WT
(n=3) et sur modèle de rétinite (n=3).
17
Figure 15 : Représentation du patch clamp sur cellules entière
(Whole-cell patch clamp).
L'électrode est placée sur la cellule, puis une aspiration est
appliquée pour rompre la membrane au niveau de l’ouverture de
l’électrode. Cela permet de créer un accès à l'espace intracellulaire
afin de mesurer la totalité des courants cellulaires.
2) Tests fonctionnels
Des tests fonctionnels de PEV (potentiels évoqués visuels) chez la souris et de patch
clamp sur cellules ganglionnaires, nous permettrons de voir si la fonction de la rétine est
recouvrée. Ceci permettrait de valider cette stratégie d'optogénétique. Pour cela, les animaux
(C57BL/6 n = 3 ; Cnga3–/–; Rho–/– n = 3) recevront une injection intravitréenne d’AAV2/8
contenant : le gène codant pour notre photo-senseur sous le contrôle du promoteur spécifique ;
aucun transgène (vecteur vide dans l’œil controlatéral), ou ne recevront aucune injection dans
un œil et le vecteur vide dans l’autre. Ces tests fonctionnels seront également réalisés sur des
rétines humaines (WT et modèle de rétinite pigmentaire) en culture pour les mêmes injections
(pas d'injection, vecteur vide, vecteur avec photo-senseur).
Enregistrement ex vivo de la réponse des cellules ganglionnaires par patch clamp
Les tests fonctionnels par patch clamp seront réalisés sur les souris C57BL/6 (n = 3) et
Cnga3–/–; Rho–/– (n = 3) : Les animaux recevront une injection intravitréenne d’AAV2/8
contenant le transgène « photo-senseur/eYFP » dans un œil, et une injection contrôle (transgène
« eYFP ») dans l’œil controlatéral. Dans les deux cas, l’eYFP est nécessaire pour détecter les
régions au sein de la rétine où il y a eu transduction par les AAVs. En effet, le signal eYFP sera
détecté via microscopie « 2-photon » : L’excitation du fluorophore sera réalisée par un pulse
laser réglé sur 920 nm (Mai Tai HP two-photon laser / Spectra Physics), où l’absorption
simultanée de deux photons infrarouges par l’eYFP est assez énergétique pour amener celui-ci
à l’état excité. L’enregistrement du signal eYFP se fera via une caméra CCD (Diagnostic
Instruments).
Tel que décrit par Busskamp et al. 2014, les rétines de souris transduites par AAVs seront
montées sur un morceau de papier-filtre (MF-membrane, Millipore) avec les cellules
ganglionnaire vers le haut, puis placées dans un milieu Ringer (en mM: 110 NaCl, 2.5 KCl, 1
CaCl2, 1.6 MgCl2, 10 D-glucose, 22 NaHCO3) à 36°C et enrichi à 5% CO2 ; 95% O2. Après
détection des cellules ganglionnaires infectées par les AAVs (signal eYFP), les enregistrements
patch clamp seront réalisés sur cellule entière (Whole-cell patch clamp) à l’aide d’un
amplificateur Axon Multiclamp 700B, et d’électrodes en verre de borosilicate (BF100-50-10,
Sutter Instruments). La résistance d'étanchéité des électrodes patch devra être de l’ordre de 7 –
9 MΩ. Lors de l’enregistrement, la stimulation des cellules ganglionnaires sera réalisée par une
18
lumière plein champ (cf. figure 15).
Enregistrement in vivo des potentiels évoqués visuels (PEV)
Le potentiel évoqué visuel (PEV) est la réponse électrique du cortex qui est provoquée
par une stimulation visuelle. Des souris (C57BL/6 n = 3 ; Cnga3–/–; Rho–/– n = 3) recevront
une injection intravitréenne d’AAV2/8 à P60 contenant : le photo-senseur dans un œil et le
vecteur vide dans l’œil controlatéral (modèle RP); aucun transgène dans un œil et le vecteur
vide dans l’œil controlatéral (modèle WT). On mesurera le PEV sur les souris 10 jours après la
transfection soit à P70. Les souris sont anesthésiées par des injections sous-cutanées de 8%
d’hydrate de chloral. Des gouttes d’atropine (1%) et d’Oculotec (Novartis) sont déposées sur
l’œil pour dilater et protéger la pupille. Après localisation du cortex visuel primaire (V1), les
électrodes d’enregistrements d’irridium-platine (taille 0.0035, California Fine Wire Company)
sont insérées en sous-cutané en regard du cortex visuel occipital. Deux électrodes sur le nez et
la queue ont servi respectivement de référence et de masse (Depeyre et al., 2006). Les réponses
sont d’abord mesurées à différentes profondeurs corticales, et la profondeur avec la réponse
maximum est choisie pour faire les enregistrements. Des stimuli de 500 ms sont délivrés dans
l’œil controlatéral toute les 3 secondes, 30 fois, en utilisant un câble optique attaché à une source
lumineuse (EXFO XI120PC-XL, 120W, Photonic Solutions). La distance du câble optique à
l’œil est de 1cm. L’intensité de la lumière est à la surface de l’œil de 1016 photons cm-2 s-1.
(Busskamp et al., 2014)(Busskamp et al., 2014).
Ainsi, les tests fonctionnels in vivo et ex vivo permettrons d’observer l’efficacité de la
thérapie optogénétique développée tout au long de ce projet. En revanche, de nombreuses
vérifications seront nécessaires et de nombreuses perspectives se dessineront.
19
Conclusion et Perspectives
La rétinite pigmentaire touche près de deux millions de personnes dans le monde, ceci en fait
la première cause de cécité hors pathologies liées à l'âge. Cependant, les thérapies géniques
classiques ne sont pas envisageables au vue des multiples gènes impliqués.
Une alternative nous permettrai de contourner cette complexité phénotypique, il s'agit de la
stratégie d'optogénétique décrite par Busskamp (Busskamp et al., 2011). L'optogénétique
consiste à apporter une molécule ectopique appelée photo-senseur, afin qu'il soit exprimé dans
les cellules de la rétine et ainsi qu'il restaure la photo-réaction des cellules.
Notre projet a donc pour but d'exprimer eNpHR (Natronomonas pharaonis HaloRhodopsin) de
manière ciblée dans les cellules ganglionnaires. Le ciblage est possible grâce à l'utilisation
d'AAVs (Adéno-associated virus) présentant un sérotype de capside 8 (AAV2/8) et une cassette
d'expression sous le contrôle d'un promoteur spécifique des cellules ganglionnaires.
Cependant, eNpHR est une pompe à chlores, il entraîne donc une hyperpolarisation des cellules.
Or nous savons qu'il existe deux types de cellules ganglionnaires, les ON qui se dépolarisent
quand l'intensité lumineuse augmente, et les OFF qui s'hyperpolarisent lorsqu'elle diminue. La
réponse des cellules à la lumière n'est donc pas complètement physiologique.
Dans la suite des travaux, il serait donc intéressant d'utiliser un autre photo-senseur afin de
complémenter l'action d'eNpHR. Nous connaissons par exemple ChR2 (Channelrhodopsine-2),
canal ionique qui permet la dépolarisation des cellules (Busskamp et al., 2011).
Pour cela, il nous faudrait donc séparer les cellules ganglionnaires ON des OFF par FACS en
utilisant leur différence morphologique. Puis l'identification d'un promoteur spécifique pour
chacun des deux types cellulaires, permettra l'expression ciblée de ChR2 dans les cellules ON
et de eNpHR dans les cellules OFF.
20
Bibliographie
Barres, B.A., Silverstein, B.E., Corey, D.P., and Chun, L.L. (1988). Immunological,
morphological, and electrophysiological variation among retinal ganglion cells purified by
panning. Neuron 1, 791–803.
Bennett, J. (2003). Immune response following intraocular delivery of recombinant viral
vectors. Gene Ther. 10, 977–982.
Busskamp, V., and Roska, B. (2011). Optogenetic approaches to restoring visual function in
retinitis pigmentosa. Curr. Opin. Neurobiol. 21, 942–946.
Busskamp, V., Duebel, J., Balya, D., Fradot, M., Viney, T.J., Siegert, S., Groner, A.C.,
Cabuy, E., Forster, V., Seeliger, M., et al. (2010). Genetic reactivation of cone photoreceptors
restores visual responses in retinitis pigmentosa. Science 329, 413–417.
Busskamp, V., Picaud, S., Sahel, J.A., and Roska, B. (2011). Optogenetic therapy for retinitis
pigmentosa. 19, 169–175.
Busskamp, V., Krol, J., Nelidova, D., Daum, J., Szikra, T., Tsuda, B., Jüttner, J., Farrow, K.,
Scherf, B.G., Alvarez, C.P.P., et al. (2014). miRNAs 182 and 183 are necessary to maintain
adult cone photoreceptor outer segments and visual function. Neuron 83, 586–600.
Casco-Robles, M.M., Miura, T., and Chiba, C. (2014). The newt (Cynops pyrrhogaster)
RPE65 promoter: molecular cloning, characterization and functional analysis. Transgenic
Res.
Claes, E., Seeliger, M., Michalakis, S., Biel, M., Humphries, P., and Haverkamp, S. (2004).
Morphological characterization of the retina of the CNGA3(-/-)Rho(-/-) mutant mouse lacking
functional cones and rods. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 45, 2039–2048.
Depeyre, C., Chen-Kuo-Chang, M., Payet, O., Cornille, K., Muller, A., Lenaers, G., Hamel,
C., Arné, J.L., and Arndt, C. (2006). [A murine model of transitory optic neuropathy based on
small interference RNA-induced OPA1 silencing in vivo (gene mutation associated with
Kjer’s disease)]. J. Fr. Ophtalmol. 29, 875–880.
Farrar, G.J., Kenna, P.F., and Humphries, P. (2002). On the genetics of retinitis pigmentosa
and on mutation-independent approaches to therapeutic intervention. EMBO J. 21, 857–864.
Grieger, J.C., Choi, V.W., and Samulski, R.J. (2006). Production and characterization of
adeno-associated viral vectors. Nat. Protoc. 1, 1412–1428.
Krol, J., Loedige, I., and Filipowicz, W. (2010). The widespread regulation of microRNA
biogenesis, function and decay. Nat. Rev. Genet. 11, 597–610.
Kwong, J.M.K., Gu, L., Nassiri, N., Bekerman, V., Kumar-Singh, R., Rhee, K.D., Yang, X.J., Hauswirth, W.W., Caprioli, J., and Piri, N. (2014). AAV-mediated and pharmacological
induction of Hsp70 expression stimulates survival of retinal ganglion cells following axonal
injury. Gene Ther.
21
Larhammar, D., Nordström, K., and Larsson, T.A. (2009). Evolution of vertebrate rod and
cone phototransduction genes. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 364, 2867–2880.
Lebherz, C., Maguire, A., Tang, W., Bennett, J., and Wilson, J.M. (2008). Novel AAV
serotypes for improved ocular gene transfer. J. Gene Med. 10, 375–382.
Maguire, A.M., Simonelli, F., Pierce, E.A., Pugh, E.N., Mingozzi, F., Bennicelli, J., Banfi, S.,
Marshall, K.A., Testa, F., Surace, E.M., et al. (2008). Safety and efficacy of gene transfer for
Leber’s congenital amaurosis. N. Engl. J. Med. 358, 2240–2248.
Mamanova, L., and Turner, D.J. (2011). Low-bias, strand-specific transcriptome Illumina
sequencing by on-flowcell reverse transcription (FRT-seq). Nat. Protoc. 6, 1736–1747.
Powner, M.B., Vevis, K., McKenzie, J.A.G., Gandhi, P., Jadeja, S., and Fruttiger, M. (2012).
Visualization of gene expression in whole mouse retina by in situ hybridization. Nat. Protoc.
7, 1086–1096.
Sancho-Pelluz, J., Arango-Gonzalez, B., Kustermann, S., Romero, F.J., van Veen, T.,
Zrenner, E., Ekström, P., and Paquet-Durand, F. (2008). Photoreceptor cell death mechanisms
in inherited retinal degeneration. Mol. Neurobiol. 38, 253–269.
Smith, A.J., Bainbridge, J.W., and Ali, R.R. (2009). Prospects for retinal gene replacement
therapy. Trends Genet. 25, 156–165.
Winzeler, A., and Wang, J.T. (2013). Purification and culture of retinal ganglion cells from
rodents. Cold Spring Harb. Protoc. 2013, 643–652.
22