M I S E A U P O I N T Mutations compensatoires, ou comment l’évolution met des bâtons dans les roues des médecins ! V. Perrot* RÉSUMÉ. Nous traitons ici de l’évolution de la résistance aux agents antimicrobiens, en particulier de ce qui se passe une fois que la résistance est apparue dans une souche. Dans certains cas, le gène de résistance handicape le microbe quand l’antibiotique n’est plus présent dans l’environnement (c’est le “coût de la résistance”). C’est ce qu’espèrent les utilisateurs d’antibiotiques, mais cela n’arrive pas toujours. De plus, quand la résistance a effectivement un coût, un microbe résistant peut trouver le moyen de réduire ce “coût de la résistance”. Le microbe a trois possibilités : il peut redevenir sensible (ce qui n’est pas nécessairement aussi simple qu’il y paraît), le gène de résistance avec le moindre coût peut être sélectionné, ou des mutations secondaires qui réduisent le coût de la mutation initiale peuvent être sélectionnées. L’évolution de ces mutations secondaires, faciles à observer au laboratoire, permet l’apparition de microbes plus virulents, et parfois plus résistants. C’est le résultat le plus souvent observé au laboratoire, ce qui donne une indication de la capacité des bactéries à évoluer, même dans des conditions qui nous semblent difficiles. Ces résultats soulignent une fois de plus l’importance de l’utilisation raisonnable et prudente des antibiotiques. Mots-clés : Résistance aux antibiotiques - Évolution - Escherichia coli - Salmonella Typhimurium. L de microbes résistants aux agents utilisés ’ apparition pour les traiter est un problème connu de longue date par les médecins. Dès le début du traitement de la tuberculose par la streptomycine, l’apparition de bacilles tuberculeux résistants, autrement dit la sélection de mutants résistants chez des patients traités, a été la cause d’échecs thérapeutiques (1). Du point de vue de la biologie évolutive, l’apparition de microbes résistants n’a rien de surprenant. En effet, dès que la pression de sélection est suffisamment forte, des microbes résistants apparaissent tôt ou tard. Que deviennent les gènes de résistance une fois qu’ils sont apparus ? En simplifiant un peu les choses, il y a deux cas de figure. Dans le cas le plus favorable, on observe que le gène de résistance ne se maintient pas dans la population bactérienne : chaque fois qu’il apparaît (par mutation ou par transfert de gène ou de plasmide) dans la souche responsable d’infections ou de colonisations chez un patient sous antibiotiques, ce gène est rarement transmis à un autre patient. De plus, s’il est transmis, le gène de résistance est rarement sélectionné à nouveau par un traitement antibiotique. * Department of biology, Emory University, 1510 Clifton Road, Atlanta, GA 30322, États-Unis. [email protected] NB. Les travaux cités dans cet article ont fait l’objet d’une bourse n° AI40662 des National Institutes of Health, États-Unis, accordée à B.R. Levin. La Lettre de l’Infectiologue - Tome XV - n° 7 - septembre 2000 Dans l’autre cas de figure, on observe qu’une fois apparu, le gène de résistance augmente en fréquence dans la population générale des bactéries : il est transmis de patient à patient, et il est souvent sélectionné par un antibiotique. Quelles sont les caractéristiques du système qui déterminent le comportement de la souche résistante ? Il y a deux caractéristiques principales, qui concernent les deux protagonistes, le microbe résistant et les utilisateurs d’antibiotiques. Du côté du microbe, le coût biologique de la résistance détermine les chances de transmission de patient à patient (directement ou via l’environnement). Plus le coût de la résistance est fort (plus le microbe résistant est handicapé par le gène de résistance), plus il est difficile pour la souche résistante de se maintenir. Du côté des utilisateurs des antibiotiques, la fréquence des traitements aux antibiotiques détermine la fréquence avec laquelle le gène de résistance est sélectionné. De toute évidence, il y a interaction entre ces deux caractéristiques. Par exemple, un gène de résistance particulièrement coûteux du point de vue de la bactérie nécessitera des traitements antibiotiques plus fréquents pour augmenter en fréquence. D’un autre côté, un gène de résistance n’ayant pas de coût de résistance n’aura pas de difficulté à s’établir, même s’il ne se trouve en présence d’antibiotiques que très rarement. Dans ce qui suit, nous nous intéressons au coût biologique de la résistance, et à son évolution. 273 M I S E A U P O I N T COÛT BIOLOGIQUE DE LA RÉSISTANCE On pense en général que les microbes résistants sont désavantagés par rapport aux microbes sensibles quand l’antibiotique n’est pas présent dans l’environnement. En effet, les microbes doivent changer quelque chose dans leur physiologie (pompe pour excréter l’antibiotique, enzymes pour le dégrader) ou dans leur composition (modification de diverses cibles telles que l’ADN-gyrase, les protéines ribosomiques, les polysaccharides de l’enveloppe, etc.). Dans certains cas, le changement est optionnel et ne se manifeste qu’en présence de l’antibiotique (cas du changement de polysaccharides engendrant la résistance à la vancomycine) ; dans d’autres cas, il est constitutif (mutations de la cible des fluoroquinolones et des aminoglycosides, par exemple). De plus, les cibles des molécules antibiotiques sont suffisamment importantes pour causer la mort de l’organisme si elles sont attaquées. On s’attend donc à ce que toute modification de ces cibles soit néfaste pour l’organisme. La réalité des choses n’est pas toujours aussi simple. Le désavantage des bactéries résistantes par rapport aux bactéries sensibles en l’absence d’antibiotiques, ou “coût de la résistance”, peut se manifester de façon variée : les bactéries résistantes peuvent pousser moins vite, survivre moins longtemps en phase stationnaire ou dans l’environnement, ou être moins capables d’envahir un nouvel hôte, etc. Il est facile de mesurer certains aspects du coût de la résistance au laboratoire, pour deux raisons. D’une part, il est possible de contrôler les conditions de culture (in vitro et in vivo) ; d’autre part, il est possible de comparer une souche résistante isolée au laboratoire avec son ancêtre sensible immédiat, permettant de mesurer ainsi l’effet du seul gène de résistance. Une des façons de mesurer le coût de la résistance est de mettre en compétition la souche résistante et la souche sensible. De cette façon, si l’on cultive les bactéries en flacon, cette mesure du coût de la résistance prend en compte, entre autres, le temps que les bactéries mettent à sortir de la phase de latence, la vitesse à laquelle elles se multiplient (taux de croissance) et leur survie en phase stationnaire. De ces différents aspects du coût de la résistance, seul le taux de croissance est facile à mesurer isolément. De plus, par compétition, il est possible de mesurer de faibles coûts de résistance, parce que les deux souches sont soumises à des conditions de croissance identiques, réduisant ainsi les erreurs de mesure. De ces mesures au laboratoire, il ressort que les mutations de résistance ont souvent un coût, mais pas toujours. Chez Escherichia coli, certaines mutations de résistance chromosomique comme celle à la streptomycine (mutations ponctuelles dans le gène de la protéine ribosomique S12, rpsL) produisent un coût de résistance de 10 à 15 % par génération, alors que la résistance à l’acide nalidixique (mutations dans le gène de l’ADN gyrase) ne semble pas causer de coût dans les différents milieux de culture testés (2). Chez Salmonella Typhimurium injectée dans une souris, certaines résistances chromosomiques à la streptomycine produisent un coût, et d’autres non. Il en est de même pour la résistance à la rifampicine (mutations dans le 274 gène d’une sous-unité de l’ARN polymérase, rpoB) : certaines mutations ont un coût dans la souris mais pas in vitro, et d’autres ont un coût in vitro mais pas dans la souris (3). Ce dernier résultat montre deux aspects importants du coût de la résistance : pour la résistance à un antibiotique donné, le coût est en général différent pour certaines mutations, et pour une mutation donnée, le coût peut être différent dans divers environnements. Ce qui est décrit ici est une mesure très partielle du coût de la résistance, et ne prend pas en compte des aspects capitaux du mode de vie des bactéries pathogènes, comme la capacité à infecter un hôte ou à survivre dans l’environnement. Néanmoins, ces résultats montrent que le coût de la résistance n’est pas nécessairement présent chez les microbes résistants. ÉVOLUTION DU COÛT DE LA RÉSISTANCE Les microbes ont évolué face à leurs nouvelles conditions de vie (présence d’antibiotiques dans le milieu) en devenant résistants. Vont-ils s’en tenir à cela ? Il y a trois issues possibles pour les microbes une fois qu’ils ne sont plus en présence de l’antibiotique : se débarrasser du gène de résistance désormais coûteux (redevenir sensibles), chercher la solution la moins coûteuse (sélection de l’allèle le moins handicapant), ou améliorer la solution présente (sélection de mutations supplémentaires qui réduisent les effets néfastes du gène de résistance, ou mutations compensatoires). Ce dernier mécanisme sera développé en détail dans la suite de cet article. Le retour à la sensibilité des microbes résistants est la solution la plus favorable en ce qui nous concerne, mais ce n’est pas nécessairement la solution la plus probable. Dans le cas des mutations ponctuelles, la réversion nécessite un changement de paires de bases exact pour rétablir le codon d’origine (si ce n’est la séquence d’origine). D’autres mutations sont souvent plus probables (voir plus loin). Dans le cas de gènes de résistance portés par des éléments génétiques accessoires (plasmides, transposons), on s’attendrait à ce que la bactérie s’en débarrasse dès qu’ils ne sont plus utiles, mais il semble que ces éléments aient eux-mêmes développé des mécanismes qui les rendent difficiles à évincer (4, 5). S’il y a suffisamment d’échanges entre populations microbiennes, c’est-à-dire si les différents gènes de résistance à un antibiotique donné ont souvent l’occasion d’être en compétition les uns avec les autres, on s’attend à ce que le gène de résistance avec le coût le plus faible soit gagnant (sélectionné). En admettant que les souches de Mycobacterium tuberculosis aient en effet un taux de migration suffisant, ce peut être une façon d’interpréter les résultats de Heym et al. (6), qui montrent que la majorité des isolats de M. tuberculosis résistant à la streptomycine porte la mutation associée avec le plus faible coût (du moins quand le coût est mesuré au laboratoire chez E. coli et S. Typhimurium). Cette interprétation suppose aussi que les taux de mutation qui engendrent chacune des mutations soient similaires. La Lettre de l’Infectiologue - Tome XV - n° 7 - septembre 2000 M MUTATIONS COMPENSATOIRES De la même façon que les microbes sont capables d’évoluer en devenant résistants, ils sont capables d’évoluer pour devenir plus efficacement résistants. Les mutations compensatoires peuvent évoluer pour réduire le coût de la résistance ; elles peuvent aussi augmenter la capacité à résister (concentration minimale d’inhibition) [cf l’article de F. Clavel, page 279]. Au cours du maintien en culture des microbes, des mutations apparaissent au hasard. La sélection naturelle ne garde que les mutations qui ont un avantage, et, dans le contexte des bactéries résistantes, ce sont des mutations qui réduisent le coût de la résistance. Il est facile d’observer l’apparition de mutations compensatoires au laboratoire. Le dispositif expérimental de base est le suivant : des microbes (résistants) sont maintenus en culture pendant de nombreuses générations par passage en série. Après un certain temps, une souche est isolée et son coût de résistance est mesuré. Ce stratagème peut être utilisé pour toutes sortes de systèmes de résistance : mutations chromosomiques, plasmides, transposons, etc., et dans différents milieux de culture : souris, culture de tissu, culture en milieu liquide, etc. L’article de F. Clavel traite en détail du cas du VIH, où des mutations compensatoires pour la résistance aux inhibiteurs de protéinases ont été observées dans des souches isolées au cours d’expériences de laboratoire et à partir de patients. MUTATIONS COMPENSATOIRES CHEZ LES BACTÉRIES Quand on utilise ce dispositif dans sa forme la plus simple, c’est-à-dire un milieu de culture liquide in vitro et E. coli portant une résistance chromosomique à la streptomycine avec un coût important (voir plus haut), après 250 générations de culture, on obtient des bactéries aussi résistantes qu’au début, mais avec un coût de résistance nettement réduit, quoique non nul (2). La plupart des mutations compensatoires apparaissent dans les protéines ribosomiques S4 et S5 (gènes rpsD et rpsE). Comme les souches portant une mutation compensatoire ont toujours un coût de résistance, on se demande pourquoi on n’observe pas de retour à la sensibilité pendant l’expérience, et pourquoi des souches résistantes à la streptomycine maintenues en culture pendant dix mille générations sont toujours résistantes [souches de E. coli B de R. Lenski (7)]. En ce qui concerne l’évolution à court terme (250 générations), l’apparition de mutations compensatoires, de préférence à des mutations de réversion, est probablement due à la combinaison de deux facteurs. D’une part, une mutation compensatoire est plus probable qu’une mutation de réversion : seul un changement de paires de bases spécifique peut rétablir la séquence sensible, alors qu’au moins dix mutations différentes peuvent produire une compensation. D’autre part, il existe un goulot d’étranglement entre les passages qui permet la transmission de la souche la plus commune, mais pas nécessairement de celle avec le coût le plus faible (8). La Lettre de l’Infectiologue - Tome XV - n° 7 - septembre 2000 I S E A U P O I N T Une fois qu’une souche résistante porte une ou plusieurs mutations compensatoires, est-il possible qu’elle redevienne sensible ? Nous avons mesuré la valeur sélective de souches compensées rendues sensibles par transduction. Ces souches ont une valeur sélective nettement plus faible que celle des souches résistantes d’origine : une mutation de réversion à la sensibilité apparaissant dans une souche compensée est nettement désavantagée, et il lui serait quasiment impossible d’envahir la population (9). En d’autres termes, une fois une mutation de compensation fixée dans la population, cette population ne peut redevenir sensible que si elle est envahie par une souche sensible arrivant par migration. La souche utilisée par R. Lenski comme ancêtre de ses expériences d’évolution à long terme porte en effet une mutation compensatoire. Une autre série d’expériences compare l’évolution de souches résistantes de S. Typhimurium cultivées in vitro ou dans des souris. Dans le cas de la résistance à la streptomycine, l’évolution in vitro permet la sélection de mutations compensatoires dans rpsD et rpsE, de façon similaire à ce que l’on observe chez E. coli. Après évolution dans la souris, ce sont surtout des mutations dans le gène de résistance lui-même qui apparaissent, mutations qui changent le codon 42 du gène rpsL de ACA ou AAC (résistance à la streptomycine avec coût) en AGA (résistance à la streptomycine sans coût). Dans ce cas, le spectre des mutations compensatoires est différent dans la souris et in vitro (3). L’apparition de mutations compensatoires est également observée quand la résistance est portée par un plasmide. De plus, dans ce système, il est relativement facile de savoir si la compensation est portée par le plasmide, par le chromosome ou par les deux. Après évolution, le plasmide peut être transféré dans la souche hôte de départ (précieusement gardée au congélateur avant d’être infectée avec le plasmide au début de l’expérience). Si la compensation est en partie portée par le plasmide, le coût de résistance causé par le plasmide ayant évolué sera plus faible que le coût causé par le plasmide de départ. Après évolution, on peut aussi remplacer le plasmide par le plasmide de départ. Si la compensation est en partie portée par le chromosome, le coût causé par le plasmide de départ dans un hôte ayant évolué sera plus faible que le coût de résistance de départ. Dans le cas d’un gène de résistance à la tétracycline porté par un plasmide de clonage, les mutations de compensation se trouvent dans le chromosome (10). Une série d’expériences dans notre laboratoire montre que, dans le cas de plasmides de résistance comme RK2 ou R1 maintenus en culture dans E. coli in vitro, la compensation se trouve parfois dans le plasmide luimême (8). CONCLUSION Cet article ne contribue en rien à éclaircir le sombre tableau de la résistance aux antibiotiques. Au contraire, c’est un appel de plus à considérer très sérieusement la vaste capacité des microbes à évoluer et à surmonter les obstacles que nous pla275 M I S E A U P O I N T çons sur leur chemin. L’apparition de résistances à de nouveaux agents antimicrobiens est quasiment inévitable. Nous pouvons essayer de la retarder par différents moyens : utilisation minimale et judicieuse des antibiotiques, élaboration de nouveaux antibiotiques en prenant en compte les mécanismes possibles de résistance, par exemple. Même si nous arrivons à développer une nouvelle famille de molécules posant un problème particulièrement compliqué aux microbes, nous ne devons surtout pas nous reposer sur nos lauriers. Les bactéries sont capables d’inventer (ou de trouver) des mécanismes compliqués, si on leur en laisse le temps (voir la résistance à la vancomycine). Et ça n’est qu’un début. Une fois les bases de la résistance établies, tous les raffinements sont possibles, avec ou sans antibiotiques. De toute évidence, il faut limiter l’utilisation des antibiotiques, mais il ne faut pas s’attendre à ce que les bactéries résistantes disparaissent. Même si elles deviennent rares, un coup d’antibiotique peut les faire resurgir, plus résistantes que jamais. " R É F É R E N C E S B I B L I O G R A P H I Q U E S 3. Björkman J, Hughes D, Andersson DI. Virulence of antibiotic-resistant Salmonella typhimurium. Proc Natl Acad Sci USA 1998 ; 95 : 3949-53. 4. Gerdes K, Rasmussen PB, Molin S. Unique type of plasmid maintenance function : postsegregational killing of plasmid-free cells. Proc Natl Acad Sci USA 1986 ; 83 : 3116-20. 5. Summers DK. The biology of plasmids. Oxford : Oxford University Press, 1996. 6. Heym B, Honoré N, Truffot-Pernot C, Banerjee A, Schurra C, Jacobs WRJ, Van Embden JDA, Grosset JH, Cole ST. Implications of multidrug resistance for the future of short-course chemotherapy of tuberculosis : a molecular study. Lancet 1994 ; 344 : 293-8. 7. Lenski RE, Travisano M. Dynamics of adaptation and diversification : a 10,000generation experiment with bacterial populations. Proc Natl Acad Sci USA 1994 ; 91 : 6808-14. 8. Levin BR, Perrot V, Walker N. Compensatory mutations, antibiotic resistance and the population genetics of adaptive evolution in bacteria. Genetics 2000 ; 154 : 985-97. 9. Schrag SJ, Perrot V, Levin BR. Adaptation to the fitness costs of antibiotic resistance in Escherichia coli. Proc R Soc Lond (Biol) 1997 ; 264 : 1287-91. 1. Dubos R, Dubos J. The white plague. Boston : Little, Brown and Company, 1952. 2. Schrag SJ, Perrot V. Reducing antibiotic resistance. Nature 1996 ; 381 : 120-1. 10. Bouma JE, Lenski RE. Evolution of a bacteria/plasmid association. Nature 1988 ; 335 : 351-2. F ormation M édicale C ontinue M C ? I. Les bactéries résistantes sont-elles toujours désavantagées par rapport aux bactéries sensibles en l’absence d’antibiotique ? ? II. Les microbes résistants sont-ils capables d’évoluer en redevenant sensibles ? ? III. Les bactéries résistantes sont-elles capables d’évoluer en restant résistantes et en devenant plus efficaces (virulentes) ? a. toujours b. ça dépend des cas c. jamais a. oui, c’est ce qu’on observe le plus souvent au laboratoire b. oui, c’est ce qu’on observe souvent chez les patients c. oui, mais ce n’est pas le résultat le plus fréquent a. oui, c’est ce qu’on observe le plus souvent au laboratoire b. oui, mais ce n’est pas le résultat le plus fréquent c. c’est ce que disent les expériences de laboratoire, mais Voir réponses page 310 Les articles publiés dans “La Lettre de l’Infectiologue” le sont sous la seule responsabilité de leurs auteurs. Tous droits de reproduction, d'adaptation et de traduction par tous procédés réservés pour tous pays. © octobre 1985 - EDIMARK S.A. Imprimé en France - Differdange S.A. - 95110 Sannois - Dépôt légal 3 e trimestre 2000 276 La Lettre de l’Infectiologue - Tome XV - n° 7 - septembre 2000