Projet de thèse : Biosynthèse et Régulation de l`Expression de

Projet de thèse :
Biosynthèse et Régulation de l’Expression des cyclolipopeptides de Pseudoalteromonas hCg-6
Acronyme : BREx6
Établissements porteurs du projet : Université de Bretagne Occidentale
Université de Bretagne Sud
Ecole Doctorale : ED SML
Financement CDE (50% UBO et 50% UBS)
Directeur de thèse :
Alexis Bazire (LBCM, UBS)
Co-encadrant
Benjamin Brillet (LBCM
(LBCM, UBO)
Résumé du projet :
Lee foisonnement de bactéries multi
multi-résistantes aux antibiotiques entraine des impasses
thérapeutiques acculant les
es praticiens hospitaliers à ressusciter d’anciens antibiotiques tels que la
colistine. Nous avons caractérisé une famille originale de cyclolipopeptides (CLP) produite par une
bactérie marine du genre Pseudoalteromonas (Brevet WO2014187993). Ces CLP exercent une
activité bactéricide puissante sur les bactéries à Gram négatif. Ils diffèrent par la nature de la chaine
hydrocarbonée liée à un cycle peptidique identique. Ce dernier contient 7 résidus d’acides aminés
dont 5 exotiques, l’acide diaminobutyrique (Dab), la déhydrobutyrine (Dhb) et 3 acides  hydroxy
diaminobutyrique ( HO-Dab) uniquement décris dans les CLP de Pseudoalteromonas.
Pseudoalteromonas Un système
putatif de biosynthèse des CLP a été identifié
identifié, par analyse bioinformatique, incluant
inclu
deux mégaenzymes de type Non Ribosomal Peptide Synthetase (NRPS) et des protéines impliquées dans la voie
de biosynthèse des monomères exotiques, le transport membranaire ou la régulation de la
production. Less objectifs de ce proje
projet sont de (i) valider et conduire la dissection moléculaire des 2
NRPS impliquées dans la biosynthèse des CLP, (ii) caractériser les
es enzymes responsables de la
biosynthèse des  HO-Dab, (iii) élucider des
es mécanismes de régulation de la production températuredépendante de CLP et enfin (iv) établir la prévalence de ces résidus exotiques dans les métabolomes
des bactéries marines. Ce projet comporte à la fois un intérêt fondamental (biosynthèse de peptides
non ribosomiaux et d’acides aminés exotique
exotiques)) et des potentialités d’applications importantes
(nouveaux antibiotiques et monomères non-usuels).
Contexte du projet
La souche Pseudoalteromonas hCg-6 a été isolée d’hémolymphe de
d l’huitre creuse,
Crassostrea gigas, pour des activité
activités antibactériennes. Elle produit une nouvelle famille de
cyclolipopeptides (CLPs) présentant des activités antibactériennes puissantes (Brevet
WO2014187993). Ces CLPs présentent une structure originale composée d’un cycle peptidique
cationique contenant 5 résidus exotiques lié à une chaine hydrocarbonnée variant en longueur,
hydroxylation
roxylation et insaturation en position 3’ (Figure 1). La caractérisation du mécanisme d’action a
montré qu’ils agissent par perméabilisation membranaire après interaction avec le
lipopolysaccharide (LPS)) de la membrane externe des bactéries sensibles et aboutissent
outissent à la lyse des
bactéries cibles.
Figure 1:: Structure chimique des cyclolipopeptides (CLP) de
Pseudoalteromonas hCg-6
1
Nous avons réalisé le séquençage du génome de la souche h
hCg-6. Un groupe de gènes,
appelé Cluster 5, a été identifié dans le chromosome 1 de la souche hCg6
6 à l’aide de la plateforme
1,2
anti-SMASH . Il contient 36 Coding DNA Sequences (CDS) dont deux codant potentiellement des
Non Ribosomal Peptide Synthetases (NRPS) (Figure 2).
Figure 2 : Structure du
cluster 5 identifié
comme impliqué dans
la biosynthèse des
CLPs (A) et structure
des 2 NRPS (B).
L’analyse bioinformatique2 des 2 NRPS putatives montre que (i) la séquence de
l’heptapeptide est Dab1-Thr2-Dab
Dab3-Leu4-Arg5-X6-X7, (ii) les acides aminés incorporés sont de
configuration (L),
), (iii) le premier domaine d’adénylation présente une séquence caractéristique dite
start qui indique la liaison d’un acide gras et (iv) le domaine de condensation du module 3 présente
une séquence « modified AA » qui suggère la déshydratation de la TThr2 en Dhb2. Les HO-Dab ne
sont pas prédites en position 6 et 7 car non recensées dans les bases de données. Le module 7
assurerait la cyclisation de l’heptapeptide. Par conséquent, les prédictions sont en adéquation avec la
structure des CLP.
Les CDS situées en amont et en aval des 2 NRPS ont été également analysées pour définir
les enzymes impliquées dans la biosynthèse des monomères exotiques composant les CLPs. Les
analyses bioinformatiques montrent que :
- la Dhb proviendrait de la deshydratation d’une (L)-thréonine
thréonine par le module 3 de la NRPS 1,
- les
es CDS a2042 et a2045 situées en amont des NRPS dans le cluster de gènes n°5 codent des
protéines présentant des homologies de séquences importantes avec les enzymes impliquées dans la
biosynthèse de Dab (Figure 3).
- les CDS a2043 et a2044 montrent des homologies de séquences avec des hydroxylases.
Figure 3 : CDS a2042 – a2045 dans
le cluster 5.
La recherche de synténie avec les CDS a2043, a2044 et a2045 dans la base de données
MAGE a révélé l’existence d’un système homologue chez Photorhabdus luminescens NBA II. Une
analyse plus approfondie du cluster de CDS de Photorhabdus luminescens NBA II a montré la
présence d’un système NRPS associé qui génèrerait d’après nos analyses un tripeptide : Lys1- HODab2-Ala3. Ces résultats renforcent l’hypothèse d’une implication de la CDS a2043 dans
l’hydroxylation de la Dab préalable à son incorporation dans llaa chaîne peptidique.
2
Projet de thèse :
Le projet de thèse « Biosynthèse et Régulation de l’Expression des CLP de
Pseudoalteromonas hCg-6 » (BREx6) est consacré à l’analyse des CDS du cluster 5. Il est focalisé sur
l’analyse fonctionnelle des CDS impliquées dans la biosynthèse des CLPs et sa régulation. Il est
articulé en 3 étapes indépendantes qui pourront être menées simultanément.
- (i) dissection moléculaire des 2 NRPS impliquées dans la biosynthèse des CLP :
La dissection fonctionnelle du système NRPS impliqué dans la production des CLP sera
menée par différentes approches moléculaires (CRISPR-Cas9, par exemple). L'identification
fonctionnelle des différents modules sera alors établie, en suivant une stratégie d’expression en
système hétérologue et mesure de l’hydrolyse d’ATP consécutive à l’activation du monomère. Cette
approche combine des techniques de biologie moléculaire, d’enzymologie et de biochimie
analytique. Elle constitue les bases d’un programme d’ingénierie moléculaire des CLP.
- (ii) caractérisation des enzymes responsables de la biosynthèse des  HO-Dab,
Nous proposons de valider les activités Dab-hydroxylases de la protéine codée par la CDS
a2043. La stratégie préconisée va consister à produire cette hydroxylase putative chez E. coli.
Différentes étiquettes seront ajoutées afin de faciliter la purification et la manipulation de la protéine
recombinante. Les conditions d’activité (pH et température optimale) et les paramètres cinétiques
(Km, Vmax) seront définis de manière à sélectionner la construction la plus efficace. L’activité
enzymatique d’hydroxylation de la Dab sera vérifiée par LC-MS.
Cette validation ouvrira des perspectives d’écologies chimiques. En effet, nous
rechercherons des CDS homologues dans les génomes des souches bactériennes disponibles dans les
différentes bases de données telles que GOLD, MBGD… qui cumulent plus ~80 000 génomes. Cette
exploration génomique nous permettra d’accéder à (i) la prévalence des NRPS incorporant des -OHDab et (ii) la chimio-diversité structurale des peptides non ribosomiaux contenant des -OH-Dab.
Disposant alors des monomères exotiques -OH-Dab, la synthèse chimique de ces peptides sera
menée pour explorer et illustrer leur diversité fonctionnelle.
- (iii) élucidation des mécanismes de régulation de la production température-dépendante de CLP :
Les conditions de culture de la souche hCg-6, notamment la température, influencent la
production de CLP. En effet, bien que le taux de croissance optimal de la souche soit observé entre
25 et 30°C, la production de CLP optimale est constatée à 12°C. Des analyses génomiques seront
donc menées pour identifier le(s) système(s) de régulation mis en jeux.
Ce projet ambitieux comporte à la fois un intérêt fondamental (études des peptides nonribosomiaux, de leur voie de biosynthèse et de régulation et écologie chimique de bactéries
marines), mais également un important potentiel biotechnologique à différent niveaux :
(i)
renouvellement des antibiotiques en médecine humaine ou vétérinaire : le
phénomène de multi-résistance aux antimicrobiens chez les bactéries menace la santé publique.
(prévision de 10 millions de morts/an en 2050). Le développement de nouveaux antibiotiques est
devenu vital. Les CLP de Pseudoalteromonas sont des lipopeptides, une classe de composés utilisée
en antibiothérapie humaine depuis de nombreuses années (colistine) ou très récemment
(Daptomycine).
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(ii)
production enzymatique d’un nouveau monomère pour la synthèse peptidique en
phase solide : la production maîtrisée de nouveaux monomères exotiques tels que la  HO-Dab
comporte un fort potentiel d’application en synthèse peptidique en phase solide. En effet, le marché
florissant des peptides est annoncé à 25.8 milliard $ en 2018 alors qu’il était de 11 milliard $ en 2011.
(iii)
exploration métabolomique dirigée : l’utilisation des outils moléculaires définis
dans ce projet (domaine d’adénylation  HO-Dab et - hydroxylase) va permettre d’accéder à une
nouvelle chimiodiversité et d’explorer les activités biologiques de ces peptides non ribosomiaux
exotiques.
Ces travaux ont été initiés à travers un stage de M2 (financement Stage transverse et
thématique 2017, IUEM), un programme blanc de Biotechnologies (IUEM 2017) et une collaboration
a été établie avec le Dr Y. Li (UMR CNRS-MNHN, Paris). Compte-tenu de l’importance du programme
du projet BREx6, il est probable que nous soyons amenés à privilégier les étapes progressant le plus
rapidement.
Profil du candidat (compétences scientifiques et techniques requises) :
Le candidat devra posséder une formation de niveau M2 ou équivalent en Biochimie,
Biologie moléculaire, Microbiologie ou Biotechnologie. Le bon déroulement du projet implique que le
candidat devra posséder des compétences techniques à la fois en microbiologie (techniques
culturales principalement), en biochimie (techniques de purification de peptides (HPLC notamment)
et d’extraction de biomolécules) et Biologie Moléculaire (PCR, Clonage, ….).
En supplément, le projet impliquant un travail en collaboration avec d’autres sites et unités de
recherche, des qualités d’adaptation, d’autonomie, d’organisation, d’initiative, de curiosité
scientifique, d’esprit de synthèse et de communication à l’oral comme à l’écrit sont recherchées.
Positionnement et environnement scientifique dans le contexte régional, et le cas échéant, national
et international :
Le positionnement du LBCMubo est à l’interface des peptides antimicrobiens et des
bactéries marines. L’environnement scientifique académique et industriel en microbiologie marine
est particulièrement riche dans la région Bretagne. En revanche, peu d’équipes étudient les
lipopeptides antimicrobiens en Bretagne et en France. Nous participons à différentes réseaux dédiés
aux peptides antimicrobiens (GDR CNRS 3625 « Multifonction des Peptides Antimicrobiens », Groupe
Français des Peptides et Protéines, Société françaises des Peptides antimicrobiens et European
Peptide Society). Ce projet est mené en étroite concertation avec la SATT Ouest Valorisation.
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CV Alexis BAZIRE
Maître de conférences CNU64 à l’Université de Bretagne Sud depuis 2007.
2005 : Doctorat à l’Université de Bretagne Sud sur la régulation et la production des
rhamnolipides chez P. aeruginosa.
2005-2006 : ATER à l’Université de Bretagne Sud sur l’implication du facteur sigma AlgU dans
la formation des biofilms de P. aeruginosa.
2006-2007 : Post-doctorat à l’Université Technique du Danemark sur les transferts de
plasmides au sein des biofilms.
2015 : Habilitation à diriger des recherches.
6 encadrements de thèses (4 soutenues et 2 en cours) dont 2 en collaboration avec des
laboratoires de l’IUEM -(LEMAR, LM2E).
4 supervisions de post-doctorants dont 2 ATER, 6 encadrements de MASTER 2.
Prime d’excellence scientifique 2011-2015 et Prime d’encadrement doctoral et de
recherche 2016-2020.
Directeur des études de L3 Biotechnologies (UBS)
Responsable du cycle préparatoire aux études de médecine (UBS)
Membre élu au conseil de l’UFR sciences de l’UBS et au conseil du département SET.
24 articles dans des journaux internationaux de rang A avec comité de lecture dont les 5
derniers :
1. Rodrigues S., Paillard C., Le Pennec G., Dufour A., Bazire A. Vibrio tapetis, the Causative Agent of
Brown Ring Disease, Forms Biofilms with Spherical Components. 2015. Frontiers in Microbiology 6,
1384 (IF 4)
2. Rosay T., Bazire A., Diaz S., Clamens T., Blier A.S., Mijouin L., Hoffmann B., Sergent J.A.,
Bouffartigues E., Boireau W., Vieillard J., Hulen C., Dufour A., Harmer N.J., Feuilloley M.G.J.,
Lesouhaitier O. 2015. Pseudomonas aeruginosa expresses a functional human natriuretic peptide
receptor ortholog: involvement in biofilm formation. mBio 6, e01033-15 (IF 6.786)
3. Doghri I., Rodrigues S., Bazire A., Dufour A., Akbar D., et al. 2015. Marine bacteria from the French
Atlantic coast displaying high forming-biofilm abilities and different biofilm 3D architectures. BMC
Microbiology, 15, 231 (IF 3.1)
4. Rodrigues S., Paillard C., Dufour A., Bazire A. 2015. Antibiofilm activity of the marine bacterium
Pseudoalteromonas sp. 3J6 against Vibrio tapetis, the causative agent of Brown Ring Disease.
Probiotics and Antimicrobial Proteins 7, 45-51
5. Bazire A. and Dufour A. 2014. The Pseudomonas aeruginosa rhlG and rhlAB genes are inversely
regulated and RhlG is not required for rhamnolipid synthesis. BMC Microbiology 14,160 (IF 3.10)
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