Synthèse Bibliographique en Biologie et Biotechnologie Master 2 Biologie Gestion Université de Rennes 1 UFR sciences de la vie et de l’environnement Les cellules souches cancéreuses : Une cible thérapeutique ? Remise du rapport : 16 Janvier 2013 Auteur : Julie Agaësse Tutrice : Stéphanie Le Bras - chercheur de l’Institut de Génétique et de Développement de Rennes - Remerciements Je tiens à remercier Stéphanie Le Bras - enseignante-chercheuse à l’Institut de Génétique et Développement de Rennes UMR6061 et Université de Rennes 1 - de m’avoir accordé sa confiance et de s’être tenue disponible pour me conseiller et me guider. Les responsables du diplôme : « Le tuteur a pour rôle de conseiller l’étudiant, l’orienter dans ses recherches bibliographiques, l’aider à comprendre les articles, en faire une synthèse de manière logique et rigoureuse. Il ne peut vérifier toutes les citations et interprétations de l’étudiant. Il ne peut donc s’engager vis-à-vis d’éventuelles erreurs ». Master Biologie Gestion - SBBB - Julie Agaësse Les cellules souches cancéreuses : une cible thérapeutique ? 2 Les cellules souches cancéreuses : une cible thérapeutique ? J. Agaësse Master Biologie-Gestion, UFR SVE Sciences de la vie et de l’environnement, Université de Rennes 1, Campus de Beaulieu, Bâtiment 13, 263 avenue Général Leclerc, 35042 Rennes cedex, France. Résumé Au cours de cette dernière décennie, s’est confirmée l’hypothèse de l’existence d’une sous-population de cellules aux caractéristiques proches des cellules souches, capables de s’autorenouveler, de proliférer et de se différencier afin de maintenir les tumeurs . Ces cellules qualifiées de cellules souches cancéreuses, réfractaires aux chimio et radiothérapies, permettent ainsi la croissance de la masse tumorale. Le microenvironnement semble jouer un rôle déterminant dans le maintien de leurs propriétés. Des marqueurs associés au phénotype de ces cellules souches cancéreuses ont été identifiés dans un grand nombre de cancers. Dans cette revue, nous discuterons du rôle important des voies de signalisation dans le maintien de l’homéostasie cellulaire et de leur dysfonctionnement dans les cellules souches cancéreuses. Ainsi, nous évoquerons les stratégies de traitements et les futures thérapies. Mots clés : cellules souches cancéreuses, niche, marqueurs, voies de signalisation, thérapie. Sommaire Résumé ................................................................................................................................................... 3 Lexique.................................................................................................................................................... 4 Introduction ............................................................................................................................................ 5 I. Les Cellules Souches....................................................................................................................... 6 II. Les Types Cellulaires impliqués dans le Cancer ............................................................................ 8 1. Les Cellules Cancéreuses « non-souches » (non-CSCs) ............................................................. 8 2. Les Cellules Souches Cancéreuses (CSCs) ................................................................................. 8 III. a) Définition du Modèle des Cellules Souches Cancéreuses .................................................... 8 b) Les Interactions avec leur Microenvironnement................................................................. 10 c) Les Métastases ...................................................................................................................... 12 Les Propriétés des CSCs dans les Tumeurs .............................................................................. 14 1. Les Résistances aux Thérapies Actuelles ................................................................................. 14 2. Le Modèle des Souris Nude ...................................................................................................... 15 3. Les Marqueurs des Cellules Souches Cancéreuses.................................................................. 16 4. Les Voies de Signalisation ......................................................................................................... 19 5. Des Approches Thérapeutiques ...............................................................................................27 IV. Quelques Limites ...................................................................................................................... 30 Conclusion ............................................................................................................................................. 31 Références Bibliographiques ..................................................................................................................32 Master Biologie Gestion - SBBB - Julie Agaësse Les cellules souches cancéreuses : une cible thérapeutique ? 3 Lexique ABCG2 : ATP-binding cassette sub-family G member 2 ALDH : Aldéhyde déshydrogénase APC : Adenomatous polyposis coli ATP : Adénosine tri-phosphate ADN : Acide désoxyribonucléique ARN : Acide ribonucléique ARNm : Acide ribonucléique messager BCRP1 : Breast cancer resistance protein 1 BMI1 : B cell-specific Moloney murine leukemia virus integration site 1 COX-2 : Cyclooxygènase 2 CSCs : Cellules souches cancéreuses Dkk1 : Dickkopf1 EMT : Transition épiyhélio-mésenchymateuse IGF2 : Insulin growth factor 2 iNOS : Inducible nitric oxide synthase JAK2 : Jenus kinase 2 Mesd : Mesoderm development NCID : Notch intra-cellular domain NOD / SCID : Non obese diabetic severe combined immunodeficient NOD/SCID IL2 γnull : Absences de lymphocytes T, lymphocytes B et de Natural Killers PTCH : Patched PTEN : Phosphatidylinositol-3-kinase-phophatase RAS : Rat sarcoma SDF-1 : Stromal-derived factor-1 SMO : Smoothened SNC : Système nerveux central TGFβ3 : Transforming growth factor β3 VEGF : Vascular endothelial growth factor Master Biologie Gestion - SBBB - Julie Agaësse Les cellules souches cancéreuses : une cible thérapeutique ? 4 Introduction En 2011, 365 500 nouveaux cas de cancers ont été diagnostiqués en France, chez 207 000 hommes et 158 500 femmes (Hoog-Labouret et Merlet, 2012). Le taux de survie est lié à la localisation du cancer et à son stade de développement au moment de sa détection (MazeauWoynar et al, 2010). Ainsi, il existe plusieurs cancers tels que les cancers du cerveau, du côlon, de l’estomac, du foie, du pancréas, des poumons, du sein, les leucémies ; ils engendrent des pronostics plus ou moins favorables. Chirlaque et al ont étudié 9 types de cancers chez 57 622 patients espagnols diagnostiqués entre 1995 et 1999 et suivis jusqu’au 31 décembre 2004. Au terme des cinq années, le taux de survie le plus élevé, estimé à 95%, a été observé chez des sujets atteints du cancer du testicule ; tandis que le plus faible, évalué à 10%, a été mis en évidence chez des malades atteints du cancer du poumon (Chirlaque et al, 2010). D’importants progrès ont été réalisés pour traiter les cancers, toutefois la rechute de la maladie est souvent observée. En effet, en 2007, approximativement 30% des patients atteints du cancer de la prostate rechutaient après l’arrêt du traitement (Bibikova et al, 2007). En conséquence, la période de rémission au cours de laquelle toutes les cellules cancéreuses ont été éradiquées, doit faire l’objet d’une surveillance médicale. Il est considéré qu’à partir de 5 ans sans rechute, les estimations du taux de survie sont fiables quant à la probabilité de guérison des cancers (Mazeau-Woynar et al, 2010). Les thérapies actuelles ciblent efficacement les cellules cancéreuses en division jusqu’à la disparition de la masse tumorale. Cependant, une sous-population cellulaire en phase de quiescence, a la faculté de donner naissance à une nouvelle masse maligne, soit au même endroit, soit à distance, par prolifération métastasique (Hanahan et Weingerg, 2000). En dépit de la destruction des cellules cancéreuses, cette sous-population est responsable de la récidive de la maladie. L’expression de molécules spécifiques permet de l’isoler. Ces cellules, dites cellules souches cancéreuses, sont identifiées par leur capacité à donner de nouvelles tumeurs quand elles sont xénogreffées dans des souris immunodéprimées. Elles sont capables de se régénérer et jouent un rôle crucial dans les mécanismes de chimio et radio-résistances aux thérapies. La compréhension des processus de résistances de ces cellules est donc primordiale (Alison et al, 2010). Cette synthèse bibliographique est un état des lieux des connaissances actuelles des cellules souches cancéreuses et des opportunités thérapeutiques qu’elles représentent. Dans ce rapport, les cellules souches cancéreuses et leur microenvironnement seront définis. Puis, les mécanismes permettant leur identification seront décrits. Enfin, ce rapport s’achèvera par les nouvelles cibles thérapeutiques et les traitements futurs. Master Biologie Gestion - SBBB - Julie Agaësse Les cellules souches cancéreuses : une cible thérapeutique ? 5 I. Les Cellules Souches Les Caractéristiques Une cellule souche est une cellule indifférenciée ayant un potentiel de différenciation en au moins un type cellulaire. Elle se caractérise par sa capacité à s’autorenouveler. Ainsi, elle a la faculté de proliférer indéfiniment, tout en se maintenant dans un état indifférencié et en conservant les potentialités des cellules souches. Lorsqu’elles prolifèrent, elles subissent, soit une division symétrique pour donner naissance à deux cellules filles identiques, soit une division asymétrique afin de générer simultanément une cellule fille identique à elle-même ainsi qu’une cellule fille différenciée. Les cellules souches se distinguent par leur potentialité de différenciation : les cellules souches totipotentes : cellules pouvant donner tous les types cellulaires embryonnaires et extra-embryonnaires, soit un organisme dans son intégralité. Une cellule souche totipotente est une cellule issue des premières divisions du zygote en blastomères jusqu'au 4ème jour. les cellules souches pluripotentes : cellules descendant des cellules souches totipotentes, ayant le potentiel, à partir du blastocyste, de donner les trois feuillets embryonnaires formant tout l’organisme excepté les tissus extra-embryonnaires du placenta. Elles sont également appelées cellules souches embryonnaires. Ces cellules sont issues d’un embryon de 5 à 7 jours. les cellules souches multipotentes : cellules pouvant se différencier en un nombre limité de types cellulaires, généralement constituant un tissu entier. Elles sont présentes dans les organismes adultes. les cellules souches unipotentes : cellules ayant la capacité de s’autorenouveler et de se différencier en un seul type cellulaire spécialisé. Enfin, les cellules souches peuvent se distinguer selon leur origine : elles peuvent être embryonnaires, adultes ou induites à la pluripotence à des fins thérapeutiques (Maumus, 2009). Le microenvironnement La niche est le microenvironnement dans lequel les cellules souches résident. Ces niches sont composées de cellules adjacentes de soutien, d’une matrice extra-cellulaire et/ ou de facteurs requis pour l’autorenouvellement cellulaire, leur permettant ainsi de se maintenir dans un état indifférencié (Fuchs et al, 2004). Au cours de la division asymétrique, une cellule fille sort de la niche et s’engage dans une voie de différenciation spécifique afin de pouvoir proliférer et se Master Biologie Gestion - SBBB - Julie Agaësse Les cellules souches cancéreuses : une cible thérapeutique ? 6 différencier (Maumus, 2009). Enfin, il existe plusieurs types de microenvironnements tels que les niches stromales et épithéliales pouvant être permanentes ou transitoires. Master Biologie Gestion - SBBB - Julie Agaësse Les cellules souches cancéreuses : une cible thérapeutique ? 7 II. Les Types Cellulaires impliqués dans le Cancer Les cellules impliquées dans le cancer sont de natures hétérogènes. Dans la masse tumorale coexistent des cellules cancéreuses et non-cancéreuses. Les cellules non-cancéreuses comprennent des cellules inflammatoires, des fibroblastes et des cellules immatures du myéloïde (Alison et al, 2010). Une sous-population de cellules malignes aux propriétés semblables aux cellules souches, appelées cellules souches cancéreuses, prolifèrent et se différencient au sein de la tumeur en cellules cancéreuses. 1. Les Cellules Cancéreuses « non-souches » (non-CSCs) Dans les cellules saines, des facteurs de croissance ainsi que des signaux antiprolifératifs agissent afin de maintenir une quiescence cellulaire et l'homéostasie des tissus. Contrairement aux cellules normales, les cellules cancéreuses ont la particularité d’échapper au contrôle de division cellulaire et se multiplient de façon anarchique. Ces cellules ont la capacité de passer d'un stade de quiescence à un stade de prolifération active, malgré l’absence de facteurs de croissance. De plus, ces cellules sont résistantes à l'apoptose. Enfin, ces cellules ont la faculté de migrer vers d’autres tissus pour induire une nouvelle tumeur sur un autre site (Hanahan et Weingerg, 2000). 2. Les Cellules Souches Cancéreuses (CSCs) L’hypothèse de l’existence de cellules souches cancéreuses a été suggérée, la première fois dans les années 1970, au cours de recherches sur la leucémie. Cette sous-population de cellules néoplasiques aurait la capacité de s’autorenouveler, de proliférer et de se différencier (Bonnet et Dick, 1997). Ces cellules souches cancéreuses ont par la suite été détectées dans les tumeurs mammaires puis dans beaucoup d’autres tumeurs solides. a) Définition du Modèle des Cellules Souches Cancéreuses Les CSCs 1 partagent plusieurs caractéristiques avec les cellules souches normales (Ákos et al, 2012). En effet, elles ont la capacité de s’autorenouveler de façon illimitée et de se différencier. Les CSCs ont la faculté de se diviser de façon asymétrique pour donner naissance à une nouvelle 1 CSCs : Cellules souches cancéreuses Master Biologie Gestion - SBBB - Julie Agaësse Les cellules souches cancéreuses : une cible thérapeutique ? 8 cellule souche cancéreuse identique à la cellule mère et de générer des progéniteurs cellulaires, qui eux-mêmes, seront à l’origine des lignées cellulaires différenciées. Les cellules filles vont ensuite proliférer et former la masse tumorale (Clarke et al, 2006). Le modèle des cellules souches cancéreuses est un modèle organisé hiérarchiquement en cellules différenciées et indifférenciées (Figure 1). Ces dernières, situées au sommet de la hiérarchie, conduisent à la progression de la maladie. Les cellules différenciées, quant à elles, ont une plus faible aptitude à induire la progression de la tumeur (Dick, 2008 ; Reya et al, 2001 ; Shackleton et al, 2009). Figure 1 : Représentation schématique du modèle hiérarchique des cellules souches cancéreuses (Clarke et al, 2006 ; Magee et al, 2012 ; Vermeulen et al, 2012). Cependant, tous les cancers ne suivraient pas le modèle hiérarchique des cellules souches cancéreuses. En effet, les CSCs pourraient se développer sans nécessairement provenir du sommet de la hiérarchie, autrement dit, d’une cellule souche cancéreuse. Elles résulteraient d’une cellule différenciée ayant subi une modification génétique ou épigénétique (Ákos et al, 2012). Les cellules différenciées pourraient réintégrer un phénotype de CSCs incluant la capacité à induire de nouvelles tumeurs (Vermeulen et al, 2012) (Figure 2). Figure 2 : Représentation schématique de la transformation maligne des cellules souches et des cellules différenciées en CSCs (Magee et al, 2012 ; Siddique et Saleem, 2012 ; Vermeulen et al, 2012). Master Biologie Gestion - SBBB - Julie Agaësse Les cellules souches cancéreuses : une cible thérapeutique ? 9 Les CSCs ont été définies comme une sous-population de cellules tumorales capables de propager la malignité primaire quand elles sont transplantées, habituellement en petit nombre, dans des souris immunodéprimées (Bonnet et Dick, 1997 ; Alison et al, 2010). La tumeur greffée reprend la complexité et l’hétérogénéité de la tumeur primaire du patient (Grotenhuis et al, 2012). Ainsi, les cellules différenciées et indifférenciées contribuent à la diversité des tumeurs malignes (Vermeulen et al, 2012). b) Les Interactions avec leur Microenvironnement Les CSCs se situent dans un microenvironnement cellulaire complexe, appelé « niche ». Cette niche est vascularisée et composée de cellules stromales telles que des myofibroblastes, des cellules immunitaires, des cellules mésenchymateuses, des molécules de la matrice extra-cellulaire ainsi que des cellules nerveuses. Le stroma a un rôle mécanique de soutien ainsi qu’un rôle métabolique pour la nutrition et les échanges entre le sang et le parenchyme. Le microenvironnement joue un rôle essentiel dans la régulation du comportement des cellules souches cancéreuses (Alison et al, 2010). En effet, la niche est nécessaire au maintien de l’identité de la cellule souche cancéreuse et donc à sa capacité d’autorenouvellement (Clarke et al, 2006). Le facteur VEGF 2 sécrété par les cellules endothéliales de la niche est impliqué dans l’expansion de la tumeur (Goossens et al, 2011). De plus, des études ont montré que le microenvironnement jouxtant les vaisseaux sanguins est propice aux plus hauts taux de prolifération cellulaire tumorale (Calabrese et al, 2007). Les cellules stromales du microenvironnement déterminent les propriétés des CSCs. Ainsi, les cellules souches du gliome ont la capacité de se différencier en lignées cellulaires endothéliales pour constituer ensuite la niche tumorale (Ricci-Vitiani et al, 2010 ; Wang et al, 2010). Le microenvironnement et les instabilités génétiques et épigénétiques influencent également l’hétérogénéité de cette sous-population de cellules souches cancéreuses. La plupart des tumeurs solides se développent à partir de cellules souches normales ayant subi des mutations successives. Progressivement, au cours de l’expansion clonale, les cellules souches acquièrent des mutations jusqu’à ce que le phénotype malin émerge. Puis, lors de la progression du cancer, la pression sélective (nutrition, oxygène, défenses immunitaires, thérapies) sera à l’origine de nouveaux clones qui résulteront d’altérations génétiques et épigénétiques (Clarke et al, 2006). Ce fait a notamment été observé dans le cas de la leucémie myéloïde aiguë (LMA). Un sous clone ayant subi une mutation, probablement due à la chimiothérapie, a conduit à l’expansion clonale 2 VEGF : Vascular endothelial growth factor Master Biologie Gestion - SBBB - Julie Agaësse Les cellules souches cancéreuses : une cible thérapeutique ? 10 puis à la rechute de la maladie (Ding et al, 2012). Les modifications génétiques étant irréversibles et aléatoires, les cellules tumorigènes ne peuvent pas rétablir l’hétérogénéité de la tumeur primaire. Dans le cas où le degré d’hétérogénéité serait faible, les CSCs pourraient redonner celle de la tumeur dont elles dérivent. Cependant, ces sources d’hétérogénéité compliquent le modèle des CSCs et signifient que, d’un patient à l’autre, le phénotype des CSCs ne sera pas forcément le même. D’où, l’importance de tester les CSCs avec des marqueurs et ainsi visualiser l’hétérogénéité chez les patients (Magee et al, 2012). Enfin, dans la masse tumorale, un équilibre dynamique, dû à la régulation par le microenvironnement, existerait entre les CSCs et les cellules cancéreuses différenciées (non-CSCs) (Li et Neaves, 2006 ; Moore et Lemischka, 2006). En effet, la niche de CSCs contrôle le nombre de cellules et leur prolifération. Ainsi, les CSCs et les non-CSCs seraient mutuellement échangeables. Les cellules différenciées peuvent se dédifférencier, pour retrouver les caractéristiques des cellules souches cancéreuses, grâce à des signaux provenant de leur environnement et des cellules stromales (Figure 3). Cette restauration des CSCs pourrait être la conséquence des rechutes après l’interruption des traitements. Figure 3 : Représentation schématique du modèle dynamique des cellules souches (Clarke et al, 2006 ; Li et Neaves, 2006 ; Moore et Lemischka, 2006 ; Vermeulen et al, 2012). Dans la grande majorité des cancers, la principale cause de décès est due aux métastases qui sont formées puis détachées de la tumeur primaire. Ces métastases vont coloniser des sites distants, après un long passage dans les vaisseaux sanguins et lymphatiques (Grotenhuis et al, 2012). Master Biologie Gestion - SBBB - Julie Agaësse Les cellules souches cancéreuses : une cible thérapeutique ? 11 c) Les Métastases Au cours de la transition épithélio-mésenchymateuse (EMT), les cellules tumorales se désolidarisent de la tumeur primaire, par la perte des propriétés d’adhésion cellulaire et par l’acquisition des caractéristiques de mobilité. Il s’agit d’un processus par lequel les contacts cellulaires E-cadhérine dépendant entre cellules épithéliales diminuent, les cellules épithéliales deviennent alors mobiles. Ces cellules mobiles transmettent la tumeur primaire à différents sites, via un processus inverse appelé transition mésenchymo-épithéliale (Thiery et al, 2009). Les facteurs de transcription TWIST et SNAIL induisent la répression de l’expression du gène de l’Ecadhérine. Dans les cellules épithéliales cancéreuses du sein, la régulation à la hausse des facteurs de transcription TWIST et SNAIL induit l’EMT. Il est donc possible que les cellules épithéliales cancéreuses du sein (CD44+/CD24-) acquièrent un phénotype de CSC au cours de l’EMT. ZEB est une autre famille de facteurs de transcription contrôlant l’EMT. La diminution du facteur de transcription ZEB1 réduit la clonogénicité et la tumorigénicité dans les cellules cancéreuses du pancréas. Il est suggéré que ZEB1 ne promeut pas seulement l’EMT, il maintiendrait aussi l’identité des cellules souches en bloquant la transcription des mi RNA200 (Alison et al, 2010). Les microARN constituent une classe de petits ARN 3 non codants d’environ 20 nucléotides. Ils contrôlent de nombreux processus physiologiques tels que la différenciation et la prolifération cellulaires ainsi que l’apoptose (Ogier-Denis et al, 2007). Ils induisent la répression de la transcription ou le clivage de l'ARN messager cible. Les microARN 200 sont des inhibiteurs qui ciblent les facteurs de transcription des gènes SOX2 et KLF4, essentiels au maintien de la pluripotence et de l’autorenouvellement des cellules souches (Alison et al, 2010). L’expression anormale de ces microARN les conduit à fonctionner comme des gènes suppresseurs tumeur ou des oncogènes (Ogier-Denis et al, 2007). Dans les cellules cancéreuses ovariennes, la transfection de SNAIL et SNAIL 2 (aussi appelé SLUG) conduit à la dérépression des gènes de souchitude incluant Nanog et KLF4. Cette introduction de SNAIL et SNAIL 2 induit une croissance de la population de CSCs (CD44+/CD117+) devenant 4 à 5 fois plus grande qu’initialement. Ces cellules deviennent donc plus résistantes aux chimio et radiothérapies. Les ARNm 4 des protéines SNAIL, TWIST et ZEB 1 sont traduits par YB-1. Cette dernière est une protéine multifonctionnelle, exprimée principalement dans le cytoplasme. Elle régule la traduction de facteurs de transcription coordonnés à l’EMT. 3 4 ARN : Acide ribonucléique ARNm : Acide ribonucléique messager Master Biologie Gestion - SBBB - Julie Agaësse Les cellules souches cancéreuses : une cible thérapeutique ? 12 CXCR4 est un récepteur membranaire couplé aux protéines G de la famille des chimiokines. Son ligand SDF-15 ou CXCL12 est sécrété en grande quantité par les niches hématopoïétiques ainsi que par les cellules du foie et des poumons. Ce récepteur est très souvent exprimé dans les cellules cancéreuses et notamment dans les CSCs. In vitro, son inhibition empêche l’invasion tumorale. Des travaux ont montré que les CSCs-CD133+ du pancréas, exprimant le récepteur CXCR4, forment des métastases à l’inverse de celles qui en sont démunies. De même, les CSCsALDH+ du sein, sur-exprimant le récepteur CXCR1 activé via l’interleukine 8, permettent l’invasion métastasique (Alison et al, 2010). La capacité intrinsèque des CSCs à subir l’EMT pourrait fournir l’explication de la variation de fréquence des CSCs entre les différentes malignités, et peut- être même entre les patients (Quintana et al, 2008). L’EMT dans les carcinomes semble être associé à l’acquisition du phénotype des CSCs (Alison et al, 2011). Néanmoins, il serait intéressant de savoir avec certitude, si uniquement les cellules souches cancéreuses sont capables d’acquérir des modifications génétiques qui confèrent un potentiel métastasique, ou si les cellules non-tumorigènes peuvent, elles aussi, acquérir des modifications génétiques qui confèrent les deux potentiels tumorigène et métastasique (Magee et al, 2012). Pour répondre à cette question, des études ont été réalisées. Dans le cancer mamellaire de la souris, elles montrent que les CSCs sont les seules populations cellulaires capables de former des métastases (Malanchi et al, 2011). Cette fonction des CSCs dépend de l’induction de l’expression du gène codant pour la protéine POSTN (ou Périostine) via la transformation du facteur de croissance TGF-β3, dans le stroma de l’hôte6. POSTN agit positivement sur la voie de signalisation Wnt des CSCs. La perte de cette protéine, ou l’inhibition du facteur TGF-β3, provoque l’arrêt de la formation métastasique (Ákos et al, 2012). Face au nombre important de rechutes et de décès dus au cancer, il est intéressant de comprendre les limites des thérapies actuelles et d’appréhender les cibles et opportunités thérapeutiques de demain. Ainsi, identifier les cellules souches cancéreuses et comprendre leurs propriétés biologiques conduisant à la croissance de la masse tumorale et à la rechute de la maladie est un véritable enjeu pour améliorer la survie des patients. 5 6 SDF-1 : Stromal-derived factor-1 TGFβ3 : Transforming growth factor β3 Master Biologie Gestion - SBBB - Julie Agaësse Les cellules souches cancéreuses : une cible thérapeutique ? 13 III. Les Propriétés des CSCs dans les Tumeurs 1. Les Résistances aux Thérapies Actuelles Actuellement, les traitements néoadjuvants ciblent le potentiel prolifératif de la tumeur, en tuant rapidement les cellules en division. Ces médicaments anti-cancéreux provoquent donc un rétrécissement de la tumeur. Cependant, les CSCs ont un avantage de survie en n’étant pas affectées, ce qui peut expliquer la rechute de la maladie. En effet, les CSCs possèderaient un niveau élevé d’expression des pompes à efflux ; ces dernières sont spécialisées dans le transport de certaines substances chimiques dont les traitements anti-cancéreux. Elles appartiennent à la vaste superfamille des transporteurs ABC. Ces CSCs seraient également résistantes à la mort cellulaire grâce à des mécanismes anti-apoptotiques. Les dommages de l’ADN 7 seraient reconnus et réparés par une « DNA repair » activée. Elles auraient également la particularité de pouvoir réaliser des cycles cellulaires lents. Plus récemment, des études ont montré que les cellules souches cancéreuses du sein peuvent entrer dans un état de quiescence sous l’effet d’un inhibiteur de la farnesyl transférase. Cet inhibiteur empêche une maturation correcte de la protéine RAS 8 (Chaterjee et al, 2011). 60% des cancers du côlon sont dus à une activation anormale de cette protéine (Lièvre et Puig, 2010). La molécule RAS normale induit la division cellulaire lorsqu’un facteur de croissance se présente en surface cellulaire. Puis, à l’arrêt du traitement, les cellules peuvent de nouveau entrer dans le cycle cellulaire (Ákos et al, 2012). L’oncogène, issu d’une translocation entre les chromosomes 9 et 22, code pour la protéine de fusion BCR-ABL. Celle-ci est responsable de la leucémie myéloïde chronique (LMC). L’activité tyrosine kinase constitutive de la protéine chimérique BCR-ABL est à l’origine de la transformation de cellules souches hématopoïétiques dans la LMC. Les sous-populations de cellules souches cancéreuses causant la LMC BCR-ABL+ ont la faculté de survivre, malgré la présence d’un inhibiteur de la tyrosine kinase, la dasatinib, et l’absence de facteur de croissance (Hamilton et al, 2012). Ces CSCs se trouvent dans un état de quiescence, elles ne peuvent plus proliférer mais restent viables. Les CSCs peuvent réaliser un lent cycle cellulaire, elles échappent ainsi aux agents chimiothérapeutiques conventionnels. L’ajout de facteurs de croissance et le retrait de l’inhibiteur leur permettent de retourner dans le cycle cellulaire afin qu’elles puissent proliférer (Ákos et al, 2012). En outre, des mécanismes génétiques peuvent également être la cause de résistance aux traitements thérapeutiques. L’administration d’imatinib, aux patients atteints de la LMC, prévient la rechute de la maladie, jusqu’à ce que les cellules initiatrices de celle-ci acquièrent une 7 8 ADN : Acide désoxyribonucléique RAS : Rat sarcoma Master Biologie Gestion - SBBB - Julie Agaësse Les cellules souches cancéreuses : une cible thérapeutique ? 14 amplification de l’expression de la protéine de fusion BCR-ABL, conférant une résistance au traitement (Magee et al, 2012). Afin de comprendre les mécanismes de tumorigenèse, pour ensuite guérir les patients du cancer, des manipulations expérimentales sont nécessaires in vitro et in vivo. Le modèle de la souris Nude, dans laquelle est greffée la tumeur humaine, sert de support vivant pour confirmer les résultats obtenus in vitro. Ces souris permettent, également, de découvrir les marqueurs des cellules humaines et de comprendre les mécanismes biologiques. 2. Le Modèle des Souris Nude Afin d’analyser in vivo le développement des cellules souches cancéreuses humaines, la souris Nude est fréquemment utilisée en tant qu’animal hôte. Les souris NOD/SCID 9 ont la particularité d’être immunodéprimées et diabétiques. Elles sont démunies des cellules de l’immunité spécifique (lymphocytes T et lymphocytes B matures). Les cellules de l’immunité innée présentent, quant à elles, des anomalies (les natural killers (NK) ou cellules tueuses naturelles et l’interféron gamma (INF) produit par ces dernières). La transplantation de cellules cancéreuses dans une souris normale présente quelques inconvénients. En effet, les tissus de la souris diffèrent de ceux de l’homme, en termes d’architecture et de cellules stromales. Parfois, les facteurs de croissance et les molécules d’adhésion ne se lient pas aux récepteurs humains. Les cellules immunitaires sont des éléments importants du microenvironnement, elles peuvent favoriser ou au contraire entraver la croissance de la tumeur. De plus, de grandes différences existent dans la régulation de ces cellules entre les autologues et la greffe xénogénique. Les cellules humaines transplantées infèrent une augmentation de la réponse immunitaire xénogénique entraînant leur mort, pour la plupart, avant qu’elles aient eu la capacité de proliférer. Donc, cela implique que les cellules cancéreuses humaines doivent être transplantées dans des souris immunodéprimées, appelées souris Nude. La préservation d’une légère activité immunitaire rendrait les caractéristiques de ces souris plus proches de celles des patients. Cependant, les greffes xénogéniques ne peuvent pas modéliser les réponses immunitaires produites chez le patient. Il est donc préférable d’utiliser des souris hautement immunodéprimées, telles que les souris NOD/SCIDγIL2 9 null10 . Dans ces souris, la NOD / SCID : Non obese diabetic severe combined immunodeficient NOD/SCID IL2 γnull : absences de lymphocytes T, lymphocytes B et de Natural Killers 10 Master Biologie Gestion - SBBB - Julie Agaësse Les cellules souches cancéreuses : une cible thérapeutique ? 15 fréquence de cellules tumorigènes augmente de façon significative (Ishizawa et al, 2010 ; Kennedy et al, 2007 ; Quintana et al, 2008). Des cellules de mélanome ont été transplantées dans des souris NOD/SCID et NOD/SCID IL2 γnull. Selon les études réalisées, il a été estimé qu’une seule cellule CSCs sur un million provoque la malignité dans les souris présentant une activité NK, tandis qu’une sur quatre donne naissance à une tumeur chez les souris les plus immunodéprimées (sans activité NK). La fréquence de CSCs résulte donc des caractéristiques immunitaires de la souris hôte. L’efficacité de la xénogreffe dépend également de la présence de Matrigel. En effet, en utilisant cette membrane basale dans une souris immunodéficiente, la quantité de cellules de mélanome nécessaire à l'initiation de la tumeur est plus faible. Cette méthode assure des conditions optimales au développement malin (Quintana et al, 2008). Cependant, ce modèle privilégie l’importance du potentiel de formation de la tumeur mais ne prend pas en considération l’environnement dans lequel elle s’est formée (Magee et al, 2012). Ces souris Nude sont des modèles d’étude permettant l’analyse du développement in vivo de tumeurs humaines greffées. Les CSCs humaines dans l’hôte peuvent être identifiées et isolées grâce à des marqueurs de surfaces présents dans la masse tumorale. 3. Les Marqueurs des Cellules Souches Cancéreuses Les marqueurs CD, SP et ALDH Les cellules souches cancéreuses sont identifiables et quantifiables grâce à deux types distincts de marqueurs tumoraux. En effet, les marqueurs sécrétés permettent d’estimer le nombre de CSCs, tandis que les marqueurs de surface (Tableaux 1) révèlent l’identité de ces dernières. Le secretome correspond à l’ensemble des protéines sécrétées retrouvées dans le milieu conditionné de cellules en culture. Les protéines sécrétées jouent un rôle crucial dans de nombreux processus physiologiques et pathologiques. Une cellule tumorale présente des modifications, de son activité et de son métabolisme, responsables de la variation de la sécrétion de certaines protéines (Cheneau, 2009 ; Makridakis et Vlahou, 2010). Les marqueurs tumoraux correspondent à la substance sécrétée par la tumeur et déversée dans le sang. Ils sont détectés dans les liquides biologiques et dosés grâce à des méthodes analytiques de biochimie. Dans la tumeur, cette substance se trouve soit augmentée, soit absente par rapport à un tissu apparenté sain. Afin d’identifier la présence de cellules souches cancéreuses, la concentration sanguine Master Biologie Gestion - SBBB - Julie Agaësse Les cellules souches cancéreuses : une cible thérapeutique ? 16 anormale de cette substance est évaluée. La concentration de ces marqueurs est généralement corrélée au nombre de cellules souches cancéreuses (Makridakis et Vlahou, 2010). Les marqueurs de surface CD sont des glycoprotéines membranaires et certains d’entre eux, tels CD133, CD44, CD24 et ALDH1, sont fréquemment isolés dans les tumeurs solides, ainsi que CD34 dans les leucémies (Ákos et al, 2012). Aucun des marqueurs n’est retrouvé exclusivement dans les CSCs. Ces marqueurs sont donc présents dans les cellules cancéreuses et les cellules normales. Par exemple, le marqueur CD133 se trouve à la fois, dans les cellules souches normales et cancéreuses du cerveau, ainsi que dans beaucoup d’autres tissus. Cette remarque est également valable pour bien d’autres marqueurs tels que CD44, Sca1 et Thy1 (Clarke et al, 2006). La fraction SP, ou Side Population, est une population cellulaire permettant également d’identifier les CSCs. Ces cellules ont la capacité d’exclure la sonde fluorescente Hoeschst 33342 se liant aux régions A-T du petit sillon de l’ADN. La sortie de Hoeschst est permise par les transporteurs ABC grâce à leur mécanisme de pompe à efflux (Wu et Alman, 2008). Cependant, ce phénotype peut se retrouver dans des tissus ne contenant pas de CSCs. La toxicité de ce colorant, pour les cellules, pourrait également induire de mauvaises interprétations des résultats. Il est donc préférable de procéder à l’identification des CSCs à l’aide des marqueurs de surface, puis dans un second temps, vérifier que la sous-population cancéreuse est contenue dans la fraction SP. L’aldéhyde déshydrogénase est un autre marqueur permettant l’isolement des CSCs mammaires, mais est aussi rencontré dans les tumeurs du côlon, du foie et de la prostate (Clarke et al, 2006). Une concentration élevée de l’ALDH11 est largement utilisée pour sélectionner les CSCs dans les lignées cellulaires cancéreuses du sein. Cependant, le phénotype CD44+/CD24- est le plus fréquent dans ce cancer. Dans les leucémies LMA, les CSCs sont généralement identifiées par la surexpression du phénotype CD34+/CD38-, mais peuvent l’être également par un niveau élevé de l’activité ALDH (Charafe-Jauffret et al, 2009 ; Honeth et al, 2008 ; Bonnet et Dick, 1997). Pour un même cancer, il peut exister plusieurs phénotypes différents des CSCs, rendant ainsi l’isolement de ces cellules plus complexe. Dans le glioblastome, la population cellulaire au phénotype CD133+ a été enrichie à la suite de radiations thérapeutiques. De plus, le taux de cellules CD133+ à entrer en apoptose à l’issue d’un traitement chimiothérapeutique est plus faible que celui des cellules CD133-. De même, les souspopulations cellulaires CD133+ du pancréas sont résistantes aux agents chimiothérapeutiques (Grotenhuis et al, 2012). Dans des conditions d’hypoxie, les CSCs-CD44+ ainsi que le transporteur ABCG2 12 de la prostate et les CSCs-CD133+ du pancréas sont sur-exprimés conduisant à l’augmentation de la clonogénéicité (Ákos et al, 2012). 11 12 ALDH : Aldéhyde déshydrogénase ABCG2 : ATP-binding cassette sub-family G member 2 Master Biologie Gestion - SBBB - Julie Agaësse Les cellules souches cancéreuses : une cible thérapeutique ? 17 Tableau 1 : Les marqueurs de surface des cellules souches cancéreuses identifiés dans les tumeurs humaines (Ákos et al, 2012 ; Alison et al, 2011 ; Grotenhuis et al, 2012). Type de tumeur Marqueurs des CSCs Cerveau CD133+; SP, intégrine α6 CD133+; CD133+/ CD133-; CD44+; EpCAM-/ CD44-/ Côlon CD166-; CD44+/ALDH1; ALDH1; EpCAM+/ ALDH1+ Endomètre CD133+ Estomac CD44+/ CD24+ Foie CD133+ ; CD44+/ CD90+; ALDH/ CD133+; GEP; SP Leucémies (LMA, LMC) Mélanome CD34+/ CD38-; ALDH+ ABCB5 Ovaires CD133+; CD44+/ CD117+; CD44+/ MyD88; SP Pancréas CD44+/ CD24+/ EpCAM+ ; CD133+; c-met Poumon CD133+; SP; CD133+/ ASCL1/ ALDH1 Prostate CD133+/ CD44+/ α2β1; CD44+; CD44+/ CD24-; ALDH1 Rein CD105+ Sein CD44+/ CD24-/ ALDH+; ALDH+; CD90+ Tête et cou CD44+; SP; CD44+/ ALDH1+ Thyroïde SP ABCB5 : ATP-binding cassette sub-family B member 5 ; ALDH : aldéhyde déshydrogénase ; ASCL1 : achaete-scute complex homologue 1 ; EpCAM : molécule d’adhésion épithéliale ; GEP : granulin-epithelin precursor ; CD133 (prominine 1), CD34, CD38, CD44, CD105, CD117 (c-kit) : Glycoprotéines transmembranaires ; CD90 (Thy1), CD166 : immunoglobulines ; α2β1 : intégrine α2β1 ; MyD88 : myeloid differentiation primary response gene (88) ; SP : side population Les transporteurs ABC Les transporteurs ABC forment une grande famille de protéines transmembranaires qui utilisent l’énergie de l’hydrolyse de l’ATP 13 pour le passage unidirectionnel de substances biologiques à travers la membrane, tels les produits issus du métabolisme et les médicaments. Les transporteurs ABCB1 et ABCG2 sont impliqués dans la résistance aux traitements anticancéreux ainsi que dans le processus de chimiorésistance. Ces deux molécules empêchent la circulation des principes actifs des médicaments à travers la barrière hémato-encéphalique. En effet, les cellules CD133+ isolées dans les tumeurs cérébrales surexpriment les gènes de la 13 ATP : Adénosine tri-phosphate Master Biologie Gestion - SBBB - Julie Agaësse Les cellules souches cancéreuses : une cible thérapeutique ? 18 protéine BCRP-114, autrement dit d’ABCG2, dans l’efflux des médicaments et contribuent ainsi à leur capacité de résistance. Une forte activité d’ABCG2 favorise la chimiorésistance dans plusieurs tumeurs humaines, à savoir, les cancers du foie, du sein et les leucémies myéloïdes chroniques (Balabanov et al, 2011 ; Liu et al, 2006). Ces cellules sont résistantes aux agents chimiothérapeutiques tels que la témozolomide, la carboplatine, le paclitaxel et l’esctoposide. Un autre transporteur, ABCB5, régulé par la GEP, induit la chimiorésistance des CSCs du foie (Cheung et al, 2011). Les transporteurs ABC, l’aldéhyde déshydrogénase, l’hypoxie confèrent aux cellules souches cancéreuses, la caractéristique d’être résistantes aux traitements chimio et radio-thérapeutiques. Le dysfonctionnement de voies de signalisation semble également jouer un rôle important dans la tumorigenèse. 4. Les Voies de Signalisation Les voies de signalisation permettent la régulation de l’homéostasie cellulaire et sont impliquées dans les mécanismes de maintien et de différenciation des cellules souches. Les signaux de transduction de plusieurs voies de signalisation sont suractivés dans les CSCs (Ákos et al, 2012 ; Vermeulen et al, 2012). Dans le cadre de cette synthèse bibliographique, nous limiterons notre étude aux principales voies de régulation impliquées dans les mécanismes de chimio et radiorésistance des CSCs à savoir : Hedgehog, TGF-β, Wnt, STAT & NF-ƘB et Notch. Voie de régulation Sonic Hedgehog La voie de signalisation Hedgehog a initialement été mise en évidence chez la drosophile. La protéine Hedgehog est impliquée dans la polarisation des segments lors du développement embryonnaire. Elle régule la prolifération, la migration et la différenciation cellulaires de nombreuses espèces. Cette voie de signalisation est initiée par l’un de ses trois ligands Sonic Hedgehoh (SHh), Desert Hedgehoh (DHh) ou Indian Hedgehoh (IHh), se fixant au récepteur PTCH 15. En l'absence de ligand, le récepteur membranaire inhibe la protéine SMO 16. La liaison du ligand au récepteur PTCH lève cette inhibition, conduisant ainsi à l'activation des facteurs de transcription Gli1, Gli2 et Gli3. Gli1 agit comme un activateur transcriptionnel à l’inverse de Gli3 qui 14 BCRP1 : Breast cancer resistance protein 1 PTCH : Patched 16 SMO : Smoothened 15 Master Biologie Gestion - SBBB - Julie Agaësse Les cellules souches cancéreuses : une cible thérapeutique ? 19 agit comme un répresseur transcriptionnel. Quant à Gli2, il peut activer ou réprimer un gène en fonction des modifications post-transcriptionnelles et post-traductionnelles. Cette voie de signalisation induit la sécrétion de facteurs de croissance cellulaire tels l’IGF2 17 et le VEGF. La dérégulation de cette voie de signalisation est propice à la croissance des CSCs. Des études ont montré qu’elle est impliquée dans beaucoup de tumeurs humaines incluant le glioblastome, les cancers mammaire et pancréatique et la LMC. Des travaux ont mis en évidence que l’inhibition de la voie par le dysfonctionnement de SMO inhibe l’expression de la protéine de fusion BCR-ABL exprimée dans les LCM. Des antagonistes de la protéine SMO tels que la cyclopamine et 5E1 inhibent l’autorenouvellement cellulaire en induisant la différenciation terminale des cellules. Le signal Hedgehog active la voie PI3k/ Akt impliquée dans la biologie des CSCs (Figures 5a et 5b), et particulièrement dans le cycle cellulaire et la survie (Merchant et al, 2010). L’augmentation de la phosphorylation de l’Akt permet la stabilisation de la β-caténine et son accumulation nucléaire. Cette protéine va ainsi se fixer sur la séquence enhancer (TCF/ LEF) de l’oncogène c-myc et du gène de la cycline D1. Myc est un facteur de transcription activateur de deux protéines kinases du cycle cellulaire Cdk2 et Cdk4. Il les active indirectement grâce à son action inhibitrice sur l’expression des protéines p27 et p21. La protéine myc a donc un rôle central dans la prolifération cellulaire (Figure 4). En conséquence, l’activation de cette voie favorise la croissance de la tumeur (Lee et al, 2009 ; Bouchard et al, 1999 ; Larsson, 2011). pRB Suppresseurs de tumeurs p53 p21 Inhibiteurs nucléaires de Cyclines p27 Akt : protéine kinase B Cdk2/ Cdk4 : Cycline dépendante kinase de types 2 et 4. Activation 1 Inhibition Figure 4 : Répression des voies de l’apoptose et de la sénescence par l’oncogène myc (Bouchard et al, 1999 ; Larsson, 2011; Lee et al, 2009). 17 IGF2 : Insulin growth factor 2 Master Biologie Gestion - SBBB - Julie Agaësse Les cellules souches cancéreuses : une cible thérapeutique ? 20 Le facteur BMI1 18, activé par Hedgehog, joue un rôle crucial dans le développement des cancers. Il contrôle l’autorenouvellement et la différenciation cellulaire des progéniteurs et des cellules souches, par la régulation de protéines suppresseurs de tumeurs, telles que p16INK4a et p14ARF. Son activité télomérasique prévient contre les mécanismes de sénescence et d’immortalisation. Cette protéine est suractivée et co-exprimée avec les marqueurs CD133 et CD44 dans les CSCs (Siddique et Saleem, 2012). L’expression aberrante de BMI1 induit la suppression des suppresseurs de tumeurs. La protéine BMI1 provoque l’EMT en inhibant la phosphatase suppresseur de tumeur PTEN 19 (Song et al, 2009). En effet, la protéine PTEN catalyse la déphosphorylation du PIP3 en PIP2 conduisant à l’inactivation de la voie Akt. Une fois la protéine BMI1 fixée au gène pten, une cascade de signalisation se met en place. La voie PI3k/ Akt est donc activée et elle-même active l’expression de la protéine SNAIL, qui à son tour, inhibe l’expression de l’E-cadhérine (Figures 5a et 5b). Plusieurs autres molécules sont également dérégulées au cours de la transition épithéliale mésenchymateuse telles que l’E-cadhérine, la N-cadhérine, la vimentine, la tenascine, le facteur NF-ƘB, SLUG, TWIST, SNAIL, la β-caténine et CXCR4. Afin de déclencher l’EMT, les CSCs-CD133+ du sein sur-expriment les protéines SLUG, inhibitrices de l’E-cadhérine, et BMI1. De même, TWIST bloque les protéines inductrices de sénescence p16 et p21 et coopère avec les protéines RAS et BMI1. Enfin, la surexpression de la protéine BMI1 dans les CSCs-CD44+/CD24+ du pancréas provoque une résistance au traitement gemcitabine (Yin et al, 2011). En effet, suite à l’ajout de cette molécule, les cellules sensibles à la chimiothérapie deviennent résistantes. D’autres études ont révélé que sur 297 sujets atteints du glioblastome, 93.9% avaient un niveau d’expression élevé de la protéine BMI1. Cette protéine serait donc associée à la progression et à la chimiorésistance des CSCs chez les cancéreux. Un signal anormal Hedgehog induit la croissance tumorale par la prolifération et la chimiorésistance des CSCs aux thérapies actuelles (Siddique et Saleem, 2012). Voie de régulation du facteur de croissance TGF-β Les membres de la famille TGF-β sont essentiels auéveloppement d embryonnaire, à la prolifération et à la différenciation cellulaires ainsi qu’à la migration. Il est composé de trois isoformes : TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3. La transduction du signal se fait par l’intermédiaire des récepteurs de types I et II. Les récepteurs de type III présentent le TGF-β à ceux de type II et sont ainsi capables de phosphoryler les récepteurs de type I. Les protéines SMAD sont divisées en trois groupes : R-SMAD (SMAD1, 2, 3, 5, 8), Co-SMAD (SDAD4) et I-SMAD (SMAD6, 7). Le récepteur de type I permet la phosphorylation de R-SMAD, ce mécanisme mettant en jeu plusieurs molécules. 18 19 BMI1 : B cell-specific Moloney murine leukemia virus integration site 1 PTEN : Phosphatidylinositol-3-kinase-phophatase Master Biologie Gestion - SBBB - Julie Agaësse Les cellules souches cancéreuses : une cible thérapeutique ? 21 Un hétérocomplexe se constitue entre R-SMAD, Co-SMAD et SMAD4 et s’accumule dans le noyau afin de transactiver les gènes cibles du facteur. Les I-SMAD ont un rôle inhibiteur sur la voie de signalisation. Lors de la tumorigenèse, le facteur de croissance active les inhibiteurs p21, p15, p27, p57 empêchant ainsi la différenciation cellulaire. Le microenvironnement ainsi que le stade de progression du cancer peuvent induire le rôle du TGF-β de suppresseur à activateur de la tumeur. Cette voie de signalisation est suractivée lors de la progression de la tumeur par le déclenchement de l’EMT. Les facteurs SNAIL, SLUG, TWIST, ZEB1 et ZEB2 vont activer TGF-β à travers plusieurs mécanismes. SNAIL et SLUG s’associent avec SMAD3 et 4 en inhibant les complexes de jonctions cellulaires tels que l’E-cadhérine, l’occludine et la claudine. Dans le cancer du pancréas, le traitement au TGF-β provoque une augmentation de la fréquence des CSCs CD44+/ CD24 - (Perrot et al, 2012). Voie de régulation Wnt La voie de signalisation Wnt a été découverte chez la drosophile et est impliquée dans plusieurs événements au cours de l’embryogénèse. La stimulation de cette voie active la β-caténine par la liaison du ligand Wnt au récepteur Frizzled. Ce récepteur est activé par la fixation des co-récepteurs LRP5 et LRP6. En présence de ligands, la β-caténine est stabilisée puis transloquée dans le noyau où elle transactive les facteurs des transcriptions TCF/LEF permettant ainsi la différenciation et la prolifération cellulaires (mécanisme expliqué dans la voie de signalisation Hedgehog). En l’absence de ligand, la βcaténine est dégradée par un complexe multi-protéique, puis après ubiquitination par le protéasome (Liu et al, 2010). Cette dégradation est initiée par un complexe multi-protéique incluant le suppresseur de tumeur APC 20, la kinase GSK3β ainsi que l’axine/conductine (Behrens et al, 1998 ; Ikeda et al, 1998 ; Rubinfeld et al, 1996). La voie de signalisation Wnt joue un rôle important dans l’autorenouvellement des cellules souches du sein. Une activation anormale de la voie contribue au développement de tumeurs mammaires. Des études ont montré que la surexpression de la protéine LRP6 augmente la prolifération cellulaire et la tumorigenèse (Liu et al, 2010). 20 APC : Adenomatous polyposis coli Master Biologie Gestion - SBBB - Julie Agaësse Les cellules souches cancéreuses : une cible thérapeutique ? 22 Voies de régulation STAT & NF-ƘB La famille de facteurs de transcription STAT comprend STAT1, 2, 3, 4, 5A, 5B et 6. STAT3 est impliqué dans la prolifération et la survie cellulaires. Ce facteur de transcription est activé par la fixation de cytokines telles que l’interleukine-6 mais également par la liaison de facteurs de croissance à savoir, l’EGF, le PDGF ou encore l’HGF (Boccaccio et al, 1998; Yu et al, 2009). Il interagit avec différents cofacteurs (EGFR) pour activer ses gènes cibles tels que c-myc, la cycline D1 et BCL-XL. L’inhibition de l’oncogène c-src conduit à l’inactivation du facteur de transcription par l’EGFR (Gao et al, 2007 ; Bowman et al, 2001 ; Ren et Schaefer, 2002). STAT3 a notamment la capacité de se lier à des protéines du cycle cellulaire, Prb et p21, permettant ainsi son arrêt (Barré et al, 2005 ; Vigneron et al, 2006). A contrario, STAT3 active également la voie de l’Akt (Park et al, 2005) (expliquée précédemment), et induit cette fois la survie cellulaire. L’activation de la βcaténine favorise l’augmentation de l’expression de STAT3. Le facteur de transcription est donc impliqué dans la stimulation de la voie Wnt (Figure 5b). De même, il intervient dans la transcription de gènes de réparation de l’ADN comme l’endonucléase EMe1, et une fois encore, améliore la survie cellulaire (Vigneron et al, 2008). Dans le cancer du sein, l’activation de la voie STAT3/ JAK2 21/ IL-6 permet le maintien des cellules souches cancéreuses CD44+/CD24-, tandis que l’inhibition de STAT3 réduit la fréquence des CSCs-ALDH+ pancréatiques (Alison et al, 2012). NF-ƘB est l’un des facteurs de transcription des plus complexes en étant constitué de cinq sous-unités (p50, p52, RelA, RelB, c-Rel). Les protéines kinases IKK α, IKKβ et IKKγ/NEMO , appartenant à la famille d’inhibiteurs IKK, permettent son activation. Le NF-ƘB est séquestré par son inhibiteur IkB sous forme inactive dans le cytoplasme. Sous l’effet de signaux cellulaires et majoritairement par IKKβ, IKB est phosphorylé, puis ubiquitinylé et dégradé par le protéasome. L’hétéro-dimère NF-ƘB libéré migre dans le noyau (Ling et Kumar, 2012). Des travaux récents ont montré que le facteur de transcription peut induire une diminution de l’expression de la protéine PTEN, ce facteur serait donc responsable de la résistance à l’apoptose (Figures 5a et 5b). De plus, il agit avec la protéine p53, connue pour être un facteur suppresseur de tumeur, en régulant à la baisse son taux d’expression (Dolcet et al, 2005). La surexpression de NF-ƘB initie la transcription de l’IL-6, connue pour être un activateur de survie cellulaire, résistante aux traitements induisant l’apoptose (Ling et Kumar, 2012). NF-ƘB joue un rôle clé dans la prolifération cellulaire et l’invasion tumorale. En effet, il induit l’activation de plusieurs gènes : ceux des cyclines D1, D2, D3, E et de c-myc promouvant ainsi le cycle cellulaire, ceux des molécules d’adhésion ICAM-1 et Esélectine ainsi que ceux des métallo-protéases impliquées dans l’invasion cellulaire. Il promeut 21 JAK2 : Jenus kinase 2 Master Biologie Gestion - SBBB - Julie Agaësse Les cellules souches cancéreuses : une cible thérapeutique ? 23 également l’activation du facteur VEGF et l’expression des protéines COX-2 22 et iNOS 23, retrouvées dans un grand nombre de tumeurs. Dans des cancers humains, des onco-protéines virales (Epstein-Barr virus, EBV nuclear antigen-2) interagissent avec le complexe d’inhibiteurs pour activer le facteur NF-ƘB. La protéine oncogénique de fusion BCR-ABL, présente chez les patients atteints de LCM, pourrait activer NF- ƘB ; l’inhibition de ce facteur bloquerait le développement de la tumeur. Le récepteur à la tyrosine kinase HER2, appartenant à la famille des EGFR, a la capacité d’activer NF-ƘB grâce à une cascade de signalisation (activation des voies Ras/ Raf/ Mark et PI3k/ Akt) ; l’Akt phosphoryle et active IKK qui dégrade Iҡ B (Dolcet et al, 2005 ; Kane et al, 1999). La sur-activation du gène HER2 est corrélée à la progression de la maladie et à un mauvais pronostic des malades. Enfin, l’inhibiteur IKB-α est défaillant dans les cancers du sein, du côlon, de l’ovaire, du pancréas, de la prostate et dans le mélanome. Ce facteur est très largement impliqué dans l’initiation, la prolifération, l’angiogenèse et les métastases des CSCs du sein (Ling et Kumar, 2012). Voie de régulation Notch La mutation Notch a été mise en évidence chez la drosophile au début du XXe siècle. La perte totale des fonctions de Notch entraînait un phénotype embryonnaire létal, caractérisé par une surproduction de neurones (Poulson, 1940). Le gène notch joue un rôle clé dans le développement de différents types cellulaires et tissulaires incluant les neurones et le SNC 24. Le signal Notch régule l’autorenouvellement et la différenciation des cellules souches neurales normales et des CSCs (Fan et al, 2010). Durant le développement normal, l’activité du signal Notch des cellules exprimant le ligand diminue, tandis que celle des cellules exprimant le récepteur Notch augmente. Généralement, les cellules responsables de l’envoi du signal subissent une différenciation. Au contraire, les cellules recevant le signal restent dans un état indifférencié. Ce phénomène est appelé spécification latérale. Le signal Notch est initié par la liaison d’un ligand transmembranaire au récepteur Notch d’une cellule adjacente. Cette liaison entraîne la libération de l’γ-sécrétase. Cette enzyme, responsable du clivage protéolytique du récepteur Notch, produit le fragment cytosolique NICD 25 (Zhu et al, 2011). Ainsi, le NCID est transloqué dans le noyau où il interagit avec le facteur transcriptionnel CBF1 qui active, à son tour, les gènes hes et hey (Figures 5a). Chez les vertébrés, il existe au moins 4 récepteurs Notch, 5 ligands (JAG1, JAG 2, DLL1, DLL3, DLL4) et des molécules effectrices telles que HES1-6 ; HEY1 ; 2L. 22 COX-2 : Cyclooxygènase 2 iNOS : Inducible nitric oxide synthase 24 SNC : Système nerveux central 25 NCID : Notch intra-cellular domain 23 Master Biologie Gestion - SBBB - Julie Agaësse Les cellules souches cancéreuses : une cible thérapeutique ? 24 Le dysfonctionnement de la voie de signalisation Notch induit la croissance cellulaire par l’augmentation de la prolifération cellulaire et l’inhibition de l’apoptose. L’activation du gène cible hes-1 bloque l’expression de l’inhibiteur nucléaire, p27, provoquant l’arrêt du cycle (Murata et al, 2005). Le signal Notch est activement exprimé dans les CSCs du médulloblastome et du glioblastome. Les chimiothérapies et radiothérapies conventionnelles agissent efficacement contre les cellules différenciées mais n’ont pas d’effet sur les CSCs (Fan et al, 2010). Dans les cellules souches cancéreuses, la dérégulation des voies de signalisation Hedgehog, TGF-β, PI3k/Akt, Wnt, STAT3, NF-ƘB, Notch et leurs interactions induit l’invasion tumorale par le déclenchement de la transition épiyhélio-mésenchymateuse, l’activation du cycle cellulaire et le blocage de l’apoptose. Les protéines impliquées dans ces différentes voies de signalisation sont donc à l’origine de la croissance tumorale par la prolifération et l’autorenouvellement des CSCs induisant ainsi la récurrence tumorale et la chimiorésistance aux thérapies actuelles (Figures 5a et 5b). Ces voies de signalisation, associées aux CSCs, sont de nouvelles cibles thérapeutiques et font, pour quelques-unes d’entre elles, l’objet d’essais cliniques. (Vermeulen et al, 2012). Master Biologie Gestion - SBBB - Julie Agaësse Les cellules souches cancéreuses : une cible thérapeutique ? 25 Activation Inhibition Figure 4a : Représentation schématique des principales voies de régulation impliquées dans les mécanismes de chimiorésistance des CSCs (Alison et al, 2010 ; Fan et al, 2010 ; Merchant et al, 2010 ; Park et al, 2005 ; Perrot et al, 2012 ; Siddique et Saleem, 2012; Song et al, 2009). Activation Inhibition Figure 4b : Schématisation de la régulation entre les voies Hedgehog & TGF-β, Wnt et STAT3 et NF-ƘB impliquées dans les mécanismes de récurrence et de chimiorésistance du cancer (Alison et al, 2010 ; Fan et al, 2010 ; Merchant et al, 2010 ; Park et al, 2005 ; Perrot et al, 2012 ; Siddique et Saleem, 2012; Song et al, 2009). Master Biologie Gestion - SBBB - Julie Agaësse Les cellules souches cancéreuses : une cible thérapeutique ? 26 5. Des Approches Thérapeutiques La compréhension des dysfonctionnements des voies de régulation permet l’exploration de nouvelles approches thérapeutiques. Les cellules différenciées ont le potentiel de réintégrer les caractéristiques des CSCs, elles ont donc également besoin d’être ciblées. Les voies Hedgehoh et TGF-β L’inhibition de l’activité de la voie de signalisation Hedgehog par la cyclopamine (alcaloïde stéroïdien isolé à partir de la plante Veratrum californicum appartenant à la famille des liliacées) ou des ARN interférents, appelés ARNsi, dirigés contre les protéines SMO, Gli1 et Gli2, réduit la prolifération cellulaire, empêche l’invasion métastasique et induit l’apoptose. D'origine extérieure ou endogène à la cellule, ces ARN double brin d’une vingtaine de nucléotides sont impliqués dans le contrôle de la mobilité des transposons. Complémentaires de la séquence de l'ARNm cible, ils induisent la répression de la transcription par modification de la chromatine ou le clivage de l'ARNm cible. Gli1 est inhibée par les antagonistes du signal Hedgehog, GANT-58 et GANT-61, tandis que la protéine SMO l’est par GDC-0449. Les traitements inhibant le signal Hedgehog bloqueraient l’EMT et cibleraient le développement des métastases, bien qu’elles soient difficilement atteignables du fait de leur mobilité (Merchant et al, 2010). Il se pourrait qu’en l’absence de ligand Hedgehog, ce soit le facteur TGF-β qui active la voie. Plusieurs inhibiteurs ont été développés tels que SD093 et LY580279 induisant l’arrêt de l’EMT et de la migration des CSCs pancréatiques, ou encore FANG™, dirigé contre la convertase furine, enzyme responsable de l’activation du TGF- β. Bien d’autres inhibiteurs existent et sont actuellement à l’essai (Perrot et al, 2013). La voie Wnt Liu et al ont mis en évidence que la surexpression de la protéine LRP6 induit le cancer du sein. L’inhibition de ce co-récepteur par la Mesd, 26 une protéine chaperonne, bloque la progression de la tumeur (Lin et al, 2011 ; Liu et al, 2010). De même, l’inhibiteur DKK1 27 se lie à basse densité au corécepteur LRP6 empêchant ainsi la formation du complexe frizzled-Wnt-LRP6 (Liu et al, 2010 ; Alison et al, 2010). La salinomycine, quant à elle, bloque la phosphorylation du récepteur LRP6 et 26 27 Mesd : Mesoderm development Dkk1 : Dickkopf1 Master Biologie Gestion - SBBB - Julie Agaësse Les cellules souches cancéreuses : une cible thérapeutique ? 27 induit sa dégradation (Alison et al, 2012). La petite molécule XAV939 est un inhibiteur de l’enzyme tankyrase, responsable de la dégradation de l’axine, induisant ainsi la destruction de la β -caténine (Figure 6) (Alison et al, 2010 ; Peterson, 2009). Inhibition Figure 6 : Schéma de la dégradation de β la -caténine par l’action de XAV939 (Alison et al, 2010 ; Peterson, 2009). Les voies STAT et NF-ƘB Le lupéol est un tri-terpène, présent dans les fruits et légumes, inhibant l’autorenouvellement des CSCs hépatocytaires. En activant PTEN, il induit une baisse de la régulation de l’Akt et d’ABCG2. Ainsi, l’inhibition de la voie Akt diminue le nombre de CSCs. Le ciblage de la voie PI3k/Akt sensibilise donc les CSCs en induisant une diminution de leur fréquence (Lee et al, 2011). La salinomycine est un antibiotique qui induit la différenciation épithéliale terminale. Il inhibe la croissance des cellules cancéreuses, empêche la migration cellulaire et ne présente pas de toxicité pour les cellules épithéliales. Dans le cancer de la prostate, la salinomycine permet de réduire l’expression de l’ALDH, de myc et de NF-ƘB ainsi que la fraction de CSCs-CD44+, tandis que la galiellalactone bloque l’activité transcriptionnelle de STAT3 (Ketola et al, 2012). L’anthracycline et la butéine sont également des traitements inhibant la voie du NF-ƘB (Vermeulen et al, 2012 ; Alison et al, 2010). Master Biologie Gestion - SBBB - Julie Agaësse Les cellules souches cancéreuses : une cible thérapeutique ? 28 La voie Notch Afin de diminuer le niveau d’activité Notch des CSCs du gliome, la γ-sécrétase est inhibée par une sulfonamide, le GSI-18 ([11-endo]-N-(5, 6,7, 8, 9, 10- hexahydro-6,9-methanobenzo[9][8] annulen-11-yl)-thiophene-2 sulfonamide)). Puis, s’en suit une diminution des CSCs, prolongeant la survie des souris porteuses de xénogreffes intracrâniennes. Cette inhibition a permis de réduire la prolifération cellulaire et de provoquer l’apoptose. Cette voie de signalisation représente donc une cible possible pour les cellules du gliome. (Zhu et al, 2012 ; Fan et al, 2010). Les ARNsi dirigés contre le récepteur Notch-1 diminuent la tumorigénéicité du glioblastome. Dans le cancer du côlon, l’anticorps anti-DLL4 associé à l’irinotecan induit la réduction du nombre de CSCs et, de surcroît, la diminution de la clonogénéicité et de la tumorigénéicité (Wang J et al, 2011 ; Hoey et al, 2009). Les transporteurs ABC L’axitinib inhibe l’expression des protéines VEGFR-1, 2, 3, PDGFR et c-KIT TKS. De plus, il induit une sensibilité aux traitements en augmentant la concentration intracellulaire des médicaments tels que le topotecan et le mitoxantrone, par blocage du transporteur ABCG2. Cependant, ce traitement ne modifie pas l’expression d’ABCG2, seule la fonction d’efflux est inhibée par la fixation de l’axitinib (Wang F et al, 2012). L’inhibition des transporteurs ABC est une proposition attractive, même s’il ne faut pas omettre que les transporteurs ABC ne sont pas les seuls responsables de la résistance aux traitements anti-cancéreux. En conséquence, les CSCs sont identifiées par des anticorps dirigés contre leurs marqueurs. Le bloquage des voies de signalisation et des transporteurs ABC permet d’inhiber l’autorenouvellement et d’induire la différenciation terminale des CSCs. Ce ciblage des CSCs permet de renverser la résistance innée des CSCs aux chimio et radio-thérapies. Plusieurs traitements prometteurs sont actuellement en phase d’essais tels que, par exemple, le GDC-0449 en phase II dans les tests cliniques des cancers, pancréatique, gastrique, colorectal, ovarien, sein, poumon, gliome ; le FANG™ actuellement en phase II dans les tests cliniques du cancer du côlon ; l’Itraconazole en phase 0, I et II dans les tests cliniques des cancers du sein, de la leucémie myéloïde aigüe et du poumon ( Merchant et Matsui, 2010 ; Perrot et al, 2012). Master Biologie Gestion - SBBB - Julie Agaësse Les cellules souches cancéreuses : une cible thérapeutique ? 29 IV. Quelques Limites Le ciblage Une première remarque peut être émise au sujet des marqueurs. En effet, contrairement aux espoirs fondés quant à la spécificité de ces marqueurs, il s’est avéré que ces derniers ne sont pas exclusifs aux CSCs. La grande majorité des cellules associées à ces marqueurs ne sont pas des cellules souches. Ils ne sont donc pas suffisants pour cibler spécifiquement les cellules souches cancéreuses. Ainsi, afin de contrer cette faiblesse, il serait souhaitable d’isoler des gènes d’inactivation ou d’activation des cellules souches. Une deuxième remarque peut être soulignée concernant la difficulté de cibler spécifiquement les CSCs sans détruire les cellules souches normales. Une troisième remarque concerne cette fois la difficulté de ciblage des cellules tumorales circulantes, transmettant la tumeur primaire à différents sites, du fait de leur mobilité. Le modèle animal Le modèle de la souris ne tient pas compte des macro et microenvironnements fournis par la greffe. En effet, les conditions environnementales varient, la réponse immunitaire chez l’animal hôte n’est pas la même ; le modèle de la souris s’éloigne de celui humain. La xénotransplantation évalue le potentiel des cellules tumorales à former la tumeur mais ne permet pas d’étudier le devenir de ces cellules dans la tumeur dans laquelle elles sont nées. Il serait intéressant de pouvoir établir des comparaisons pour rendre compte des potentiels des cellules transplantées et in situ. Une alternative serait la culture cellulaire in vitro. La toxicité Différentes approches permettent d’éradiquer les CSCs des cancers ; néanmoins, le risque de toxicité in vivo subsiste. De plus, le placement de cellules souches en culture peut drastiquement altérer les marqueurs d’expression, rendant ainsi des résultats inexploitables ou faussés. Master Biologie Gestion - SBBB - Julie Agaësse Les cellules souches cancéreuses : une cible thérapeutique ? 30 Conclusion Les CSCs, contrairement aux cellules souches normales, peuvent se diviser de façon illimitée avec une vitesse de prolifération très faible. Elles sont identifiables grâce à différents marqueurs de CSCs dont le plus référencé est CD133. Elles sont également radio et chimiorésistantes aux principes actifs des médicaments, ces derniers ciblant principalement les cellules cancéreuses « non souches », en raison notamment d’une réparation efficace de l’ADN, de la surexpression des pompes d’efflux et de l’action de molécules anti-apoptotiques. La niche et le fonctionnement anormal des voies de signalisation leur permettent de se maintenir, de s’autorenouveler, de proliférer et d’échapper à l’apoptose. Le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques permettant d’éradiquer spécifiquement les CSCs et leur niche, en épargnant les cellules souches normales, est par conséquent une piste de recherche prometteuse. La dédifférenciation des cellules cancéreuses et le lien entre l’EMT et les CSCs devraient impliquer préférentiellement des agents thérapeutiques ciblant à la fois les CSCs et les non-CSCs. Bien qu’un certain nombre de molécules conférant les propriétés de résistance aux traitements soient aujourd’hui connues, il en reste bien d’autres encore à découvrir. Master Biologie Gestion - SBBB - Julie Agaësse Les cellules souches cancéreuses : une cible thérapeutique ? 31 Références Bibliographiques Supports papiers Ákos F, György V, János S. The hitchhikers guide to cancer stem cell theory: Markers, pathways and therapy. Cytometry Part A, 2012, 83A, n°1, 62-71. Alison M, Lim S.M.L, Nicholson L. Problems for therapy ? Journal of Pathology, 2010, 223, n°2, 147-161. Alison M, Lin W.R, Lim S.M.L, Nicholson L.J. Cancer stem cells : In the line of fire. Cancer Treatment reviews, 2012, 38, n°6, 589-598. Balabanov S, Gontarewicz A, Keller G, Raddrizzani L, Braig M, Bosotti R, Moll J, Jost E, Barett C, Rohe I, Bokemeyer C, Holyoake T.L, Brümmendorf T.H. 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