Cellules souches mésenchymateuses et thérapie
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Cellules souches mésenchymateuses et thérapie cellulaire du cartilage DU Médecine Régénératrice – Montpellier – 26/11/2015 Marie Maumus IRMB - Inserm U1183, Equipe 1, Montpellier, France Médecine régénératrice La médecine régénératrice est une stratégie thérapeutique visant à réparer, renouveler, restaurer ou régénérer des cellules, un tissu ou un organe malade grâce à des cellules souches qui vont se différencier ou qui vont induire une réponse adaptative de l’organisme. Maladies autoimmunes Maladies cardiovasculaires Cellules souches Maladies neurodégénératrices Peau Pancréas Hématologie Foie Rétine - Cornée Médecine régénératrice Réparer Renouveler Restaurer Régénérer Cancers Maladies musculaires Maladies Ostéo-articulaires La base de cette médecine est la thérapie cellulaire → intérêt des cellules souches. Qu’est-ce qu’une cellule souche? Une cellule souche est une cellule indifférenciée. Son auto-renouvellement qui est la capacité pour une cellule de proliférer indéfiniment tout en maintenant un état indifférencié. Ses potentialités de différenciation qui sont les capacités pour une cellule de se différencier en un ou plusieurs types de cellules matures. Spécialisation Potentialités totipotence pluripotence multipotence unipotence progéniteur Capacités d’auto-renouvellement cellule différenciée Les différents types de cellules souches 2 grands types de cellules souches L’œuf fécondé = zygote Cellules totipotentes Embryon Annexes extra-embryonnaires Cellules souches embryonniques (ES) Pluripotentes Cellules souches pluripotentes induites (iPS) Les cellules souches adultes - Cellules rares, localisées dans certains organes - Cellules multi- ou uni-potentes Thérapie cellulaire Renouvellement tissulaire Renouvellement tissulaire en conditions physiologiques En situation physiologique: - Un corps humain perd plus de 20 milliards de cellules par jour Fuchs E, 2009 - Certains organes se renouvellent peu ou pas - D’autres sont en renouvellement constant Épiderme - Poil/cheveux Cerveau Barker N, 2008 Cellules souches de l’épiderme et du follicule pileux Cœur Épithélium intestinal Watt FM, 2002 Cellules souches intestinales Reins Cellules sanguines – Moelle osseuse Orkin SH and Zon LI, 2008 Cellules souches hématopoïétiques Et le cartilage articulaire ??? Le cartilage articulaire - structure Fin des os longs Aspect morphologique du cartilage Cellularité Chondrocytes: cellules matures, différenciées, capacité limitée de proliférer (cellules quiescentes) Aggrecan Collagène type II Fibronectine Zone superficielle (5-10%) Link Zone moyenne (40-60%) Intégrine Comp Chondrocyte Protéoglycans Hyaluronane Zone profonde (30-40%) Zone calcifiée (5-10%) Os souschondral Collagène Différents types de lésions du cartilage Défauts focaux Essentiellement post-traumatiques - 20% de toutes les procédures arthroscopiques (genou: 5-10% de patients jeunes et plus de 60% de patients vieux) Zones larges Associées avec les maladies rhumastismales - Arthrite rhumatoïde: 0,3% de la population totale - Arthrose: 35% des femmes et 20% des hommes au dessus de 65 ans Peu ou pas de réparation tissulaire par les chondrocytes et/ou les cellules souches endogènes → intérêt de l’utilisation des cellules souches mésenchymateuses en médecine régénératrice du cartilage ! Caractéristiques des MSCs Différentes sources Propriétés Les cellules souches mésenchymateuses = MSC Caractéristiques CD45 CD105 CD90 Counts Counts CD73 HLA-DR Counts Counts Counts Counts CD13 CD106 Counts Counts CD14 CD11b Counts CD34 CD31 Counts - Immunophénotype Counts - Adhérentes au plastique - CD73+, CD90+, CD105+, (CD13+) - CD11b-, CD14-, CD19-, CD34-, CD45-, HLA-DR-, (CD31-, CD106-) - Capacités de différenciation en adipocytes, ostéoblastes et chondrocytes Myocyte Cardiomyocyte Adipocyte Ostéoblaste Chondrocyte Neurone Cellule endothéliale Hépatocyte Cellule produisant de l’insuline Fonctions paracrines des MSC Anti-fibrotic effects MMP-2, MMP-9, TIMP-1, TIMP-2, HGF, bFGF, Ang-1, KGF Anti-apoptotic effects VEGF, HGF, IGF-1, TGF-β, bFGF, GM-CSF, IL-6 Anti-bacterial effects Hematopoietic stem cell supportive effects TPO, SCF, TGFβ, M-CSF, LIF, Ang-1, SDF-1 Neuroprotective effects BDNF, NGF, GDNF, galectin-1 Angiogenic effects VEGF-A, VEGF-D, HGF, Ang-1, bFGF, IGF-1, PDGF, PIGF, IL6, EPO, MCP-1 LL37 MSC Chemoattractive effects SDF-1, HGF, LIF, IGF, G-CSF, M-CSF, VEGF, CCL-2, -3, -4, -5, -6, -20, CXCL2,-3, -5,-8,-10 -11 Proliferative effects Immunomodulation KGF, FGF-2, VEGF, IGF, PDGF, HGF IDO, PGE2, TGF-β, TSG-6, HGF, LIF, NO, HO-1, HLA-G, IL-6 Les cellules souches mésenchymateuses = Localisation des MSC Les MSCs sont facilement isolables et peuvent être produits en grandes quantités in vitro et de facon GMP Tissus adultes Tissus fétaux Kobolak J et al, Methods, 2015 Les cellules souches mésenchymateuses = Localisation des ASC in vivo Immunohistochimie sur TA humain Lectine/CD34/Noyau Péricytes? CD140b/CD34 /Noyau NG2/CD34/Noyau Lectine: marqueur des cellules endothéliales Localisation stromale et périvasculaire des ASC CD140b (PDGF-R): marqueur des péricytes NG2 (chondroitin sulfate proteoglycan) : marqueur des péricytes Les ASC périvasculaires différentes des péricytes. sont Différentes sources de MSC Tissus adultes Tissus fétaux (BM-MSC, ASC) (A-MSC, C-MSC, UC-MSC, WJ-MSC) - Grandes quantités - Peu invasif - Utilisation autologue - Déjà utilisées dans de nombreux essais cliniques - Grandes quantités - Pas invasif - Fort taux de prolifération - Faible sénéscence - Utilisation allogénique - Différenciation A/O/C - Cellules immunomodulatrices - Plus de potentiels de différenciation (lignages neuronal, pancreatique) - Cellules immunomodulatrices Applications cliniques des MSC en rhumatologie Capacités de différenciation MSC Fonctions trophiques Formation TGFβ d’osteophytes BMP MSC Chondrocyte Fonctions immunorégulatrices Synovial Synoviocytes Fibroblaste IL1b, IL8, TNF, PGE2, NO Dégradation du cartilage MMP ADAMTS Différenciation en chondrocytes sur biomatériaux Ingénierie tissulaire: Réparation des défauts focaux Chondrocyte Chondroprotection et stimulation de la réparation endogène Application à l’arthrose Contrer l’inflammation Thérapies cellulaires anti-inflammatoire Application à la polyarthrite rhumatoïde Médecine régénératrice des défauts focaux du cartilage Capacités de différenciation MSC Fonctions trophiques Formation TGFβ d’osteophytes BMP MSC Chondrocyte Fonctions immunorégulatrices Synovial Synoviocytes Fibroblaste IL1b, IL8, TNF, PGE2, NO Dégradation du cartilage MMP ADAMTS Différenciation en chondrocytes sur biomatériaux Ingénierie tissulaire: Réparation des défauts focaux Chondrocyte Chondroprotection et stimulation de la réparation endogène Application à l’arthrose Contrer l’inflammation Thérapies cellulaires anti-inflammatoire Application à la polyarthrite rhumatoïde Traitements pour les défauts focaux Microfracture Mosaicplastie ou Greffes osteochondrales ACI: autologous chondrocyte implantation MACI: matrix-induced chondrocyte implantation Traitements pour les défauts focaux Résultats: ACI = microfracture > mosaicplaty Mais quelques limitations Limité aux petits défauts Formation d’osteophytes et fibrocartilage dans la lésions Mortalité au site donneur Hypertrophie Du périoste Faible intégration Mortalité au site donneur - Nouvelles approches pour l’ingénierie tissulaire - Nouvelles sources cellulaires MSCs pour le traitement des défauts focaux Faisabilité de l’implantation de BM-MSC authologues pour les maladies orthopédiques - 1998: premier essai clinique utilisant les BM-MSCs dans 2 reports de cas (Wakitani S et al, 2004) Amélioration importante des symptômes cliniques (douleur, marche…) mais fibrocartilage - 2002: 24 patients avec OA du genou ont reçu des BM-MSCs dans des éponges de collagène sous un lambeau de périoste Pas d’amélioration significative comparé au groupe collagène/périoste. Wakitani et al, Osteoarthr. Cart. 2002 Meilleur score arthrospique et histologique dans le groupe traité avec les MSC avec un grand contenu en cartilage hyalin dans les biopsies 10 mois après l’implantation. Intérêt de l’utilisation des MSCs pour la réparation du cartilage ! MSCs pour le traitement des défauts focaux Efficacité des BM-MSCs comparée à l’implantation des chondrocytes autologues? - MSCs sont aussi efficaces que les Col I chondrocytes pour la réparation (n=36) - amélioration de la qualité de vie des patients et de leurs activités dans la vie courante et sportives - formation de cartilage hyalin (1an) Col X - l’implantation des chondrocyte est meilleure pour les patients <45 ans et pas de différences en rapport avec l’age pour le groupe MSC Col II PG Nejadnik et al, Am J. Sports Med, 2010 Les MSCs peuvent être utilisées comme une alternative aux chondrocytes pour la réparation du cartilage - couts réduits, - une opération en moins, - minimiser la morbidité au niveau du site donneur MSCs pour le traitement des défauts focaux Sécurité des MSC en thérapie? “If the cells are harvested for therapy well before the cultures reach senescence, there is a very low probability of malignant transformation and tumor formation in patients” (Prockop et al, Cytotherapy september 2010) - Sécurité des implantation de BM-MSC autologues pour les maladies orthopédiques? - 2005-2009: 10 ± 7 mois de suivi pour 227 patients traités pour différentes conditions orthopédiques. (Centeno et al, Curr Stem Cell Res Ther 2010) Pas de tumeur au site d’implantation - 1998-2009: 5 mois à 11 ans de suivi de 41 patients ayant reçu une transplantation de BM-MSC (Wakitani et al, J Tissue Eng Regen Med 2010) Pas de tumeur ni d’infection enregistré MSCs pour l’ingénierie du cartilage Combinaison optimale des 3 composants indispensables: Mesenchymal Stem Cell Signaux inducteurs Biomatériaux (synthétique or naturel) (facteurs de croissance) H2 O H2 O MSCs pour l’ingénierie du cartilage Cumulative release (µg/ml) PAMs (Pharmacological active microcarriers) pour la libération prolongée de TGF-b3 pour la différenciation de MSC h1 d1 d7 4 3 2 released functional 1 0 0 4 8 12 16 24 Day 32 d21 d21 Aggrecan Collagen II Implantation sous-cutanée des TGF-β3-PAMs in vivo d20 Collagen II Aggrecan Bouffi et al, Biomaterials, 2010 PAMs pour l’ingénierie du cartilage H2 O Optimisation du relargage du TGFβ3 Protein:additive polymer ratio Cumulated release of TGFβ3 (%) H2O 80 P188 1:20 PLGA-P188-PLGA 70 60 50 X3 40 30 P188 1:10 PLGA-P188-PLGA P188 1:10 PLGA 20 10 0 0 10 20 30 40 Total protein Bioactive protein Time (days) Augmentation significative du relargage: 3 X TGFβ3 bioactif PLGA PAMs PLGA-P188-PLGA 50 µm PAMs PAMs pour l’ingénierie du cartilage H2O H2 O A E A. B 50 µm PLGA MS Adhésion et meilleure prolifération -8.1 ± 1.6 PLGA PAMs +15.4 ± 0.3 PLGA-P188-PLGA MS - 8.1 ± 2.3 PLGA-P188-PLGA PAMs D Zeta potential (mV) -8.1 ± 1.6 PLGA PAMs +15.4 ± 0.3 PLGA-P188-PLGA MS - 8.1 ± 2.3 PLGA-P188-PLGA PAMs +7.9 ± 0.8 48h 7days 100µm 25µm F Cell number (%) IF anti-FN ** 600 500 400 300 48h 100µm 25µm Day 7 7days * 25µm 24h 25µm Adhérence à 4h Survie à 24h Prolifération à 7 jours 7days 200 100 0 Cells 100µm 50 µm F E PLGA MS MAB D 48h 24h +7.9 ± 0.8 100µm 50 µm CB B. Zeta potential (mV) PLGA PAMs PLGA-P188-PLGA PAMs PAMs pour l’ingénierie du cartilage H2O H2 O Différenciation in vitro (jour 21) Fold increase 100000 Collagen II ** Aggrecan 2500 80000 2000 60000 1500 Collagen X ** ** 60000 50000 40000 PLGA PAMs 30000 40000 1000 20000 500 10000 0 0 0 D0 TGF-β3 New TGF-β3 PLGA PAMs New PAMs PAMs TGFβ3-PLGA PAMs New PAMs 20000 D0 TGF-β3 New TGF-β3 PLGA PAMs New PAMs PAMs PLGA-P188-PLGA PAMs D0 TGFβ3-PLGA-P188-PLGA PAMs TGF-β3 New TGF-β3 PLGA PAMs New PAMs PAMs Augmentation de la formation de matrice avec la nouvelle formulation Morille et al., J. Control Release, 2013 PAMs pour l’ingénierie du cartilage H2O H2 O Formation de cartilage in vivo Injection intraarticular de collagenase d0 d2 Injection PAM/MSC TGFβ3 d10 d42 Sacrifice Histological scoring 3D imaging of cartilage PAMs pour l’ingénierie du cartilage H2O H2 O Imagerie 3D du cartilage (CLSM) Evaluation quantitative de la structure 3D du cartilage grâce à la propiété d’autofluorescence du tissu (le volume 3D est recontruit à partir de l’empilement des images 2D) CLSM Echantillon CLSM CLSM CLSM 1er scan (coupe) Tibial plateaux CLSM 3ème scan (coupe) Lateral plateau Median plateau Stok K. and Müller R. Microscopy research and technique 2009 PAMs pour l’ingénierie du cartilage H2 O Imagerie 3D du cartilage (CLSM) * * Les paramêtres du cartilage indiquent une meilleure intégrité tissulaire. PAM collagenase Tibial plateau lateral median PAM/TGFβ3 H2O Morille M et al. En Préparation Médecine régénératrice des maladies auto-inflammatoires: application à l’arthrite Capacités de différenciation MSC Fonctions trophiques Formation TGFβ d’osteophytes BMP MSC Chondrocyte Fonctions immunorégulatrices Synovial Synoviocytes Fibroblaste IL1b, IL8, TNF, PGE2, NO Dégradation du cartilage MMP ADAMTS Différenciation en chondrocytes sur biomatériaux Ingénierie tissulaire: Réparation des défauts focaux Chondrocyte Chondroprotection et stimulation de la réparation endogène Application à l’arthrose Contrer l’inflammation Thérapies cellulaires anti-inflammatoire Application à la polyarthrite rhumatoïde Effet immunosuppresseur des MSC 140 Proliferation (% ± SD) Relative proliferative response (% ± SD) 120 80 40 0 120 100 80 60 40 20 0 1:1 1:10 1:100 0:1 allo MSC MSC:responder ratio MSC + transwell Djouad et al., Blood 2003 L’effet immunosuppresseur des MSC est dosedépendant et passe par des facteurs solubles. Facteurs solubles impliqués dans l’effet immunosuppresseur des MSCs Inhibition de la prolifération et des fonctions cytotoxiques Inhibition de la prolifération et différenciation des cellules sécrétrices d’anticorps Inhibition de la prolifération & fonction des CD8 cytotoxic Prolifération et fonction iNOS IDO Inhibition de la différenciation et de la maturation Fonction de présentation des Ag diminuée Djouad et al, Nat Rev Rheum 2009 Effets immunosuppresseurs des MSCs Tyndall A et al, Immunology letters, 2015 Intérêt de l’utilisation des MSC dans les maladies autoimmunes Destruction des tissus Prolifération et activation des lymphocytes T CD8 et Lymphocytes B Inflammation tissulaire - douleur Destruction tissu-specifique - chondrocytes dans la RA - cellules pancreatiques β dans le diabetes - cellules rénales dans le lupus Perte de tolérance Activation des lymphocytes T CD4 (© 2001 Terese Winslow) Différents traitements: - anti-inflammatoire (methotrexate) - agents immunosuppresseurs (steroids) - biotherapies (anti-TNF,…) Mais: résistance, pas d’amélioration La polyarthrite rhumatoïde = PR L’arthrite: maladie inflammatoire chronique, auto-immune, d’origine multifactorielle (génétique et/ou environnementale), caractérisée par une destruction progressive des articulations Traitement médicaux: - anti-douleurs: soulager les douleurs inflammatoires (paracétamol, anti-inflammatoires non stéroïdiens (AINS) ou encore corticoïdes) - immunosuppresseurs: réduisent la réponse - Implication de nombreux types cellulaires (macrophages, lymphocytes B et T, chondrocytes, ostéoclastes et synoviocytes) contribuant à la destruction articulaire. - Activation du système immunitaire, réponses inflammatoires aberrantes, perte de la tolérance avec production d’auto-antigènes immunitaire locale responsable de l’inflammation (méthotrexate: traitement de référence) - biothérapies: immunosuppresseurs spécifiques (anticorps ou protéines qui inhibent de manière spécifique une protéine de l’immunité): anti-TNFα (etanercept, infliximab, adalimumab) …Mais: résistance, pas d’amélioration Intéret de la thérapie cellulaire utilisant les MSCs pour diminuer l’inflammation. Effet des MSC dans une modèle préclinique d’arthrite modèle préclinique d’arthrite = CIA (Collagen Induced Arthritis) MSC MSC ** Paw swwelling (mm) 0,4 ** ** 0,3 Control 106 C3-Luc / d0 4x106 C3-Luc / d0 106 C3-Luc / d21 4x106 C3-Luc / D21 0,2 0,1 0 20 25 30 35 40 45 50 Day after immunization Djouad et al., Arthr. Rheum 2005 Effet des MSC dans une modèle préclinique d’arthrite Effet d’une injection de MSC syngenique à distance de l’immunisation ou du boost 0.6 d18 0.5 0.4 d18+d32 Control 0.3 0.2 0.1 d18+d24 ** * 0 21 26 31 36 41 Day following arthritis induction Paw swelling increase (mm) Paw swelling increase (mm) 0.7 Control 0.7 allogeneic MSC 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 * * * * 0 18 21 24 27 30 33 36 39 42 Day after arthritis induction Il y a une fenètre spécifique d’injection des MSC qui est indépendante de la souche des souris. Effet des MSC dans une modèle préclinique d’arthrite Effet des MSC déficientes pour iNOS ou IL-6 dans le modèle d’arthrite (CIA) 0.4 % proliferation 0.5 * 80 Control wt MSC IL6-/- MSC iNOS-/- MSC 60 * 40 * 20 0 0.3 ConA wt iNOS-/- IL-6-/- C57BL/6 MSC 0.2 0.1 * * * 0 19 21 23 25 27 29 31 Days after arthritis induction 105 103 10 102 10 Bouffi et al., PLoSONE 2010 102 104 IL-6 (ng/ml) 103 106 PGE2 (pg/ml) Paw swelling increase (mm) 100 ConA wt iNOS-/- IL-6-/- 1 C57BL/6 MSC La sécrétion dépendante de l’IL6 inhibe l’inflammation locale dans la CIA. Effet des ASC dans une modèle préclinique d’arthrite Gonzales et al., Arthr. Rheum. 2009 La tolérance médiée par hASC passe par la génération de lymphocytes T régulateurs. Effet des ASC dans une modèle préclinique d’arthrite Effet des ASC sur la perte osseuse dans le modèle d’arthrite (CIA) Ctrl CIA CIA+ASCs Garimella MG et al., J Immunol. 2015 Les ASC protègent contre la perte osseuse péri-articulaire et systémique en inhibant l’ostéoclastogenèse. Effet des UC-MSC dans une modèle préclinique d’arthrite Liu et al., Arthr. Res. Ther. 2010 Xenogeneic human UC-MSCs are efficient in reducing the arthritic symptoms Médecine régénératrice pour les maladies dégénératrices: application à l’arthrose Capacités de différenciation MSC Fonctions trophiques Formation TGFβ d’osteophytes BMP MSC Chondrocyte Fonctions immunorégulatrices Synovial Synoviocytes Fibroblaste IL1b, IL8, TNF, PGE2, NO Dégradation du cartilage MMP ADAMTS Différenciation en chondrocytes sur biomatériaux Ingénierie tissulaire: Réparation des défauts focaux Chondrocyte Chondroprotection et stimulation de la réparation endogène Application à l’arthrose Contrer l’inflammation Thérapies cellulaires anti-inflammatoire Application à la polyarthrite rhumatoïde Arthrose (Osteoarthritis = OA) Arthrose (OA): maladie chronique caractérisée par une destruction lente du cartilage articulaire menant à une invalidité et à une perte de fonction. 16% personnes > 65 ans, affecte environ 4 millions de français Besoins médicaux non satisfaits: -Absence de traitement efficace. Chondrocyte & Synovial inflammation Cartilage degenerescence apoptosis fibrosis hypertrophy - Les traitements symptomatiques les plus efficaces sont les AINS qui améliorent <50% du score WOMAC - Nécessité de traitements plus sûrs: les AINS traditionnels donnent des complications gastro-intestinales importantes et les inhibiteurs COX-2 augmentent les risques cardiovasculaires Osteophyte formation Intéret de la thérapie cellulaire utilisant les MSCs pour la protection du cartilage et sa régénération. Chondroprotection – données préliminaires Données pré-cliniques: • OA chez la chèvre • Résection du ACL + menistectomie • Injection IA de 107 GFP+ BM-MSC + HA à 6 semaines Recueil des données à 6 et 20 semaines Murphy et al., Arthr Rheum 2003 • Régénération des ménisques pour 4/6 chèvres (moins fibrillation, moins perte PG, meilleure intégrité du cartilage) • Peu de MSC GFP+ dans le cartilage 6 weeks La majorité des effets de l’injection des BM-MSC injection n’est pas due à l’intégration des cellules mais à leur activité trophique (stimulation des précurseurs endogènes) Chondroprotection – méchanismes d’action Effets sur la prolifération des chondrocytes 2 or 7 days Assays *** % proliferation ASC ratio 1:8 Chondrocytes DMEM/ Ascorbic acid/ Proline/ Sodium pyruvate *** 250 0.4 µm transwell membrane 200 150 100 Pas d’effet sur la proliferation des chondrocyte 50 0 Chondro Chondro 10% FCS +ASC Chondro+ASC Counts Chondrocytes Annexin V Camptothecin-induced apoptosis % of annexin V + chondrocytes Effets sur l’apoptose des chondrocytes 40 30 20 10 * 0 Chondro Chondro + ASC Effet antiapoptotic des ASCs Chondroprotection – méchanismes d’action Effets sur le phenotype des chondrocyte 3 3 Gene expression (fold change) Gene expression (fold change) SC Abdo ASC * 2 1 * 0 Sox9 ** *** MMP13 AP *** Col I Col III 3 Gene expression (fold change) 3 Gene expression (fold change) 1 0 Agg Col IIB Link BM-MSC 2 2 1 0 2 1 ** ** ** 0 Agg Col IIB Link Sox9 MMP13 Col X Col I Col III Effets antifibrotique et antihypertrophique des ASC et MSC Chondroprotection – méchanismes d’action Quantification of secreted factors 800 1000 500 50 600 400 200 50 25 ND 0 Ch ASC Coalone alone culture 20 10 TSP-1 TSP-1 concentration (pg/mL) 75 30 Ch ASC Coalone alone culture 100 ** 80 60 40 20 0 Ch ASC Coalone alone culture TGF-b 1 concentration (pg/mL) IL-1RA 100 40 Ch ASC Coalone alone culture Ch ASC Coalone alone culture TIMP-2 0 0 0 IL-1RA concentration (pg/mL) TIMP-1 TIMP-2 concentration (ng/mL) MMP-1 TIMP-1 concentration (ng/mL) MMP1 concentration (ng/mL) 1500 600 TGF-β1 * *** ** 400 200 0 ND Ch ASC Coalone alone culture No secretion of TNF-α, IL-1β and MMP-9 Chondroprotection – méchanismes d’action Quantification of HGF secretion HGF mRNA quantification 200 150 100 50 0 * 0.05 ND HGF expression (2 - CT ) HGF concentration (pg/mL) HGF protein quantification 0.04 0.03 0.02 0.01 0.00 Ch ASC Coalone alone culture Ch Ch ASC ASC -co -co Induction of HGF secretion by ASCs in co-culture Chondroprotection – méchanismes d’action MMP13 1.0 ** 0.5 ** *** 0.0 1.0 * *** *** * 0.5 Col3 1.5 1.0 0.5 * *** 0.0 0.0 Chondrocytes + ASC HGF-Ab Isotype control rhHGF (50ng/mL) - 1.0 2.0 1.5 0.5 AP 1.5 0.0 Col1 2.0 Col I expression ** Alkaline phosphatase 1.5 Col III expression MMP13 expression Co-culture with a neutralizing anti-HGF antibody + + - + + + - + + + - + + Chondrocytes + ASC HGF-Ab Isotype control rhHGF (50ng/mL) - + + - + + + - + + + - + + Réversion de l’effet anti-fibrotic des ASC en utilisant un anticorps anti-HGF Maumus M et al., Stem cell research, 2013. Chondroprotection – méchanismes d’action Effets sur le phenotype inflammatoire des chondrocytes et synoviocytes Chondrocyte inflammation Synoviocyte inflammation Manferdini C et al., A&R, 2013 Manferdini C et al, Osteoarthritis Cartilage. 2015 Effet anti-inflammatoire des ASCs sur les chondrocytes et synoviocytes Role des ASCs dans des modèles animaux d’arthrose Modèle murin Modèle lapin Protège contre la destruction du cartilage Protège contre la destruction du cartilage 4% RSA Diminue la formation d’ostéophyte 2.106 ASC Diminue l’inflammation de la synoviale 4% RSA 2.106 ASC Effets thérapeutiques des ASC dans des modèles d’arthrose chez la souris et le lapin. ter Huurne M et al., Arthritis Rheum., 2012 Nov. Desando et al. Arthritis Research & Therapy, 2013 Effets pléiotropiques dans des modèles de maladie dégénératives Immunomodulateur (IDO, iNOs, PGE2, TSG-6,…) Anti-fibrotique Osteophyte formation Synovial Fibroblaste TGFβ BMP IL1b, IL8, TNF, PGE2, ROS NO MMP ADAMTS Chondrocyte Degradation Protecteur TIMP-1, -2 Anti-apoptotique (HGF, Sfrp1) Inflammation ADIPOA = ADIPose stem cells-based therapy for OA Objectif scientifique: Sureté d’une injection IA d’ASC autologues à des patients avec une arthrose sévère du genou. Design de l’étude: Etude bicentrique ouverte de phase I Buts primaires: Sureté et tolérance de l’injection d’ASC Buts secondaires: Evaluation fonctionnelle et globale (WOMAC, VAS, examen physique) Critères d’inclusion: Hommes et femmes (agés de 50 à 75 ans) avec une arthrose modérée/sévère du genou Critères d’exclusion: Maladie ou traitement affectant le métabolisme de l’os ou du cartilage Nombre de patients: 18 patients (6/dose) Doses: 2 – 10 – 50 x106 ASC IA Temps d’évaluation: semaine 2-4-8-12 (bi-annuel/5 ans) ADIPOA, essai clinique 18 Patients (end-stage knee OA) Intraarticular injection of ASCs Harvest of ASCs Knee joint replacement 2.106 n = 6 10 .106 n = 6 50 .106 n = 6 Adverse Events (AE, SAE) monitoring > 6w 2 w 0w 1w 4w 12 w Primary endpoint: Safety and tolerability Secondary Endpoints: efficacy - Patient global assessment, ROM, laboratory investigations WOMAC-, KOOS- VAS- SF36- score Immunomonitoring - X-ray/MRI (dGEMRIC-MRI) - Synovia Analysis 60 w Procédure clinique – injection des cellules souches ADIPOA, essai clinique - Résultats Diminution de la douleur et amélioration de la fonction. Pas de pose de prothèse (11/12 patients) Augmentation du contenu en PG et épaisseur du cartilage (3/6 patients) ADIPOA, essai clinique - Résultats CD25hCD127loFoxP3+ in CD4+ CD14++CD16- classical monocytes ** P= 0.0054 10 * P= 0.0151 8 6 4 2 11/26/2015 0 0 7 30 Days 90 Controls Augmentation des lymphocytes T régulateurs Diminution des monocytes inflammatoires Pers YM et al., Stem Cells Translational Medicine, en révision. ADIPOA 2 Objectif scientifique: Efficacité d’une injection IA d’ASC autologues à des patients avec une arthrose sévère du genou. Design de l’étude: Etude multicentrique à l’aveugle de phase II (10 centres) Buts : Efficacité de l’injection d’ASC comparée à un placebo Critères d’inclusion: Hommes et femmes (agés de 50 à 75 ans) avec une arthrose modérée/sévère du genou Critères d’exclusion: Maladie ou traitement affectant le métabolisme de l’os ou du cartilage Nombre de patients: 150 patients (50/dose) Doses: 2 – 10 x106 ASC IA ou placebo http://adipoa2.eu/ Remerciements Inserm U1183 – Equipe 1 Montpellier Biologie de la cellule souche mésenchymateuse et thérapies du cartilage Christian Jorgensen Danièle Noël Karine Toupet Marie Maumus Maxime Ruiz Claire Bony Stella Cosenza Guillaume Fonteneau Alexandre Maria Philippe Guilpain Yves-Marie Pers Stromalab, Toulouse Louis Casteilla Philippe Bourin Roxane Blattes Yannick Jeanson Julie-Anne Peyrafite Sanofi-Aventis, Montpellier Gautier Roussignol Isabelle Bentz Régis Steinberg Géraldine Penarier Laboratorio di Immunoreumatologia e Rigenerazione Tissutale, Bologna, Italy Andrea Facchini Gina Lisignoli Cristina Manferdini A. Piacentini Elena Gabusi Les différents types de cellules souches Cellules souches totipotentes Cellules souches multipotentes Cellules souches embryonniques Pluripotentes (ES) Cellules souches pluripotentes induites (iPS) Cellules spécialisées
