MASTER_SOBTI Sarah

UNIVERSITE KASDI MERBAH, OUARGLA
FACULTE DES SCIENCES DE LA NATURE ET DE LA VIE
ET SCIENCES DE LA TERRE ET DE L’UNIVERS
DEPARTEMENT DES SCIENCES AGRONOMIQUES
Projet de Fin d’Etudes
En vue de l’obtention du diplôme de
MASTER Académique
Domaine : Sciences de la nature et de la vie
Filière : Biologie
Spécialité : Microbiologie appliquée
Présenté par : Melle SOBTI Sarah
Thème
Isolement des bactéries telluriques résistantes
aux effets de salinité
Soutenu publiquement le : /06/2013
Devant le jury :
OULD EL-HADJ Med Didi
HAMDI- AISSA Baelhadj
Mlle BOUDERHEM Amel
Mlle OUSTANI Mabrouka
(Professeur)
(Professeur)
(MAA)
(MAA)
Président
UKM Ouargla
Encadreurs
UKM Ouargla
Co-encadreurs UKM Ouargla
Examinatrice
UKM Ouargla
Année universitaire : 2012/2013
Dédicace Je dédie l’apanage de cet écrit : Aux plus chères à mon
cœur et lumière de mon âme, mes parents, que je profite pour
les remercier pour tout :
A mon unique sœur
A mon unique frère
Aux deux mes grandes familles :
A mes chères ami(e)s :
RAOUF,AMI BOUZID, SOUMIA, AFAF
NIDHAL, AMEL, MERIEM, DANIA, HOUDA ET MOUNIRA
A tous les étudiants de la promotion 2013 de la
Microbiologie Appliquée.
Tout d'abord nous remercions le bon
tout puissant de la bonne santé, la
volonté et la patience qu'il nous a donné tout le long de la période de nos études.
Nous exprimons nos profondes reconnaissances et gratitude à toutes les
personnes qui ont apporté leur aimable contribution à ce travail par leurs remarques,
leurs conseils, leurs encouragements et leurs compétences et en particulier :
Mr HAMDI-AISSA, mon encadreur, non seulement pour l’aide très
précieuse qu’il m’apporté, mais aussi pour son enthousiasme communicatif, sa patience
et sa totale disponibilité pour l’encadrement de ce travail.
M elle AMEL BOUDERHAM, Co- promoteur de ce travail, pour m’avoir
guidées et soutenues.
Mr Med Didi pour l'honneur qu'il nous a fait en président ce jury
Melle OUSTANI MABROUKA pour avoir accepté l'évaluation de ce mémoire et d'en
être l’examinatrice.
Nos remerciements vont également à Mr BR.RAOUF, Mme KASSI, Melle SALHI,
Mme AMINATA et Mr KARABI pour leurs aides, qu’ils nous ont apportées
Je remercie tous les travailleurs de laboratoire pédagogique de la faculté des
sciences de la nature et de la vie et des sciences de la terre et de l’univers sans
exception.
Enfin je remercie toutes les personnes qui ’m’ont aidé, de près ou de loin
SOMMAIRE
Table des matières
INTRODUCTION………………………………………………………………1
Partie UNE : étude bibliographique
Chapitre I :
I- La vie tellurique…………………………………………...............................3
I-1-La diversité microbienne de sol…………………………………………......3
I-2 les microorganismes du sol et les cycles biogéochimiques………………….5
2- les interactions plantes-communautés microbienne de rhizosphère………….8
2-1- la rhizosphère……………………………………………………………….8
2-2- La diversité de rhizobium............................................................................9
2-3- Etablissement des symbioses………………………………………………..9
2-4- La spécificité symbiotique………………………………………………….13
3- Effet de la salinité sur le comportement des isolats…………………………...14
Partie DEUX : Matériels et Méthodes
1-1 Choix du site expérimental………………………………………………….15
1-2 Matériel végétale……………………………………………………………16
1-3 Milieu d’étude ………………………………………………………………16
1.3.1 Milieu d’isolement…………………………………………………….16
1.3.2 Stérilisation…………………………………………………………….16
1-4 Méthodes
1.4.1 Technique de préparation et conservation des nodules…………………17
1.4.2 Isolement des souches de rizobia à partir des nodules………………….18
1.4.3 Tests de la tolérance de sel et d’effectivité……………………………...20
SOMMAIRE
1.4.4
Test de nodulation en pots……………………………………………….20
1.4.5 Stérilisation des graines…………………………………………………...21
1.4.6 Solution nutritive…………………………………………………….……21
1.4.7 Germination et inoculation………………………………………………….21
1.4.8 Paramètres à mesurer……………………………………………………....23
Partie Troisième: Résultats et discussion
Chapitre III: Résultats
I Caractéristiques morphologiques, culturaux et physiologiques des isolats
I .1 Résultats de l’isolement des bactéries à partir des nodules (1 ére étape)…24
I.1.1 Croissance sur YMA………………………………………………………….24
I.1.2 Croissance sur les différents milieux de cultures utilisés………………….....25
II Test de tolérance de sel (2éme étape)…………………………………………….30
III Test de nodulation et effet des isolats sur la luzerne ………………………….33
Chapitre IV : Discussion
Conclusion générale …………………………………………………………….38
ANNEXE…………………………………………………………………………..41
Référence bibliographique
LISTE DES TABLEAUX
N° de
Titre de TABLEAU
tableau
01
02
03
04
05
06
07
08
09
N°
page
Listes de quelques microorganismes utiles vivants dans le sol
Exemples d’association entre rhizobium et légumineuses
Tableau schématiques de quelques effets de l’environnement sur la physiologie des
nodules fixant l’azote
Testes d’efficacités des souches de rhizobiums sp sur la luzerne en condition salin
Critères et méthodes de calcul pour évaluer l’indice nodulaire
Résumé des caractères culturaux des 7 souches après l’observation à l’œil nu
Résumé des caractères morphologiques des 7 souches après microscope
Caractéristiques morphologiques nodulaire observés après l’inoculation des souches
sélectionnées dans les pots
Solution de Hoagland et Arnon (1938)
LISTE DES FIGURES
N° de
figure
01
02
03
04
05
06
07
08
09
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
Titre de figure
Schéma du cycle de carbone
Schéma du cycle d’azote
Schéma du phosphate
Section d’une racine montrent de la structure de la rhizosphère
Etablissement symbioses rhizobiennes
Les nodules fixateurs d’azote chez les plantes
Dialogue moléculaire entre la plante et la bactérie lors de la mise en place d’une
association symbiotique fixatrice de l’azote
Racine en coupe longitudinale montrent un nodule fonctionnaire
Schéma montrent nombreux bactéroides dans une cellule d’une nodosité
Coupe longitudinale schématique d’une nodosité de type indéterminé
Situation de site expérimental dans l’exploitation d’université Ouargla
Collecte des nodules
Rinçages des racines et nodules
Etape de stérilisation des nodules
Broyage des nodules jusqu’à l’obtention d’un aspect laiteux
Conservation des nodules
Exemple des souches rhizobiums sp a différent caractères morphologique
Exemple de rhizobium sp (bâtonnets Gram négative)
Aspect des colonies dans YEM+Rouge Congo
Aspect des colonies dans YEM+Bleu bromoythol
Cinétique de croissance des souches isolées pour différentes concentrations en NaCl.
Les deux formes que prends le nodule
N°
page
INTRODUCTION GENERALE
Dans
les
régions
arides
et
semi-arides,
notamment
autour de cuvette
d’Ouargla, la salinisation des sols constitue l’un des facteurs abiotiques majeurs
qui réduit le rendement agricole de plusieurs cultures (Daoud et Halitim, 1994).
L’importance des légumineuses dans l’agriculture est particulièrement liée à
leur capacité
l’environnement
à fixer
tels
l’azote dans leurs nodosités. Cependant, des facteurs de
que
la
salinité
peuvent avoir
un
effet négatif sur le
rhizobium, sur la légumineuse hôte ou sur leur relation symbiotique.
La tolérance des végétaux aux sels notamment la famille légumineuse joue un
rôle important dans le maintien de la productivité en agriculture, cette tolérance
représente un phénomène complexe qui implique des particularités morphologique et
développementales avec des mécanismes physiologique et biochimiques variés.
Les communautés microbiennes telluriques, qui jouent un rôle primordial dans
les cycles biogéochimiques du carbone, de l’azote et d’autres éléments, exercent
également des effets bénéfiques ou délétères sur la croissance et la santé des plantes.
Parmi les éléments qui peuvent contribuer à augmenter la production végétale et
le rendement chez les légumineuses, la mise à profit de la symbiose légumineuseRhizobium à travers l’apport d’inoculum. (Claude et al., 2008)
De nombreuses recherches ont été effectuées sur le problème de l’effet de
stress
salin
sur
les
caractères
phénotypiques
et
l’activité
biologique
des
microorganismes telluriques, en particulier la famille des Rhizobiaceae (Kassem et
al., 1984 ; N’deye Fatou Diaw, 1997 ; Berraho et al., 2003 ; Ibriz.M et al., 2004 ;
Fatma Lazrek, 2008 ; Tatiana, 2008 ; Mohamed-Rabie, 2011). C’est dans ce contexte
que s’inscrit notre travail de recherche qui a pour objectifs :
-
la caractérisation phénotypiques des souches de rhizobiums isolées dans le sol
de la rhizosphère de Medicago sativa (Alfalfa) dans la région de Ouargla (au
niveau de l’exploitation du l’université)
-
déterminer l’effet de la salinité sur la croissance des souches isolées à partir
de Medicago sativa
-
déterminer l’infectivité (aptitude à noduler) et l’efficience des souches testées.
Notre travail se structure en trois parties :
1
INTRODUCTION GENERALE
 Première partie :Synthèse bibliographique comporte trois chapitres :
Chapitre I : Description de la vie tellurique, afin de déterminer la diversité
microbienne de sol et leur rôle dans les cycles biogéochimiques.
Chapitre II : les interactions plantes-communautés microbiennes de la rhizosphère ;
afin d’avoir l’importance de la relation symbiotique entre plantes /Rhizobiums.
Chapitre III :Effet de la salinité sur le comportement des isolats, afin de déterminer :
-l’effet de stress salin sur la croissance des souches isolées (Rhizobium) ;
- l’infectivité (aptitude à noduler) et l’efficience des souches.
 Deuxième partie : nous présenterons les matériaux est les méthodologies de
travail.
 Troisième partie : sera consacrée à l’interprétation et la discussion des résultats
obtenus.
En fin une conclusion générale est établie pour ressortir l’apport de notre approche.
2
Chapitre I : SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE
1. La vie tellurique
Le réseau trophique du sol est fondamentalement la communauté des
organismes qui vivent dans le sol. Chaque champ agricole, forêt, prairie ou pâturage
possède son propre réseau trophique avec un ensemble unique d’organismes du sol.
Le sol est un milieu oligotrophe ,la plus part des microorganismes telluriques
(algues, protozoaires, champignons, bactéries)
processus
sont impliqués dans de nombreux
biogéochimiques (A.richaume et al., 2006). La communauté microbienne
tellurique, qui joue un rôle primordial dans les cycles biogéochimiques du carbone, de
l’azote et d’autres élément, exercent également des effets bénéfiques ou délétères sur
la croissance et la santé des plantes.
1.1.
La diversité microbienne de sol
Il existe une grande diversité des communautés microbiennes dans le sol tant
du point du vue de la diversité taxonomique que du point de vue des fonctions. En
effet, il est estimé, par exemple, qu’un gramme de sol contient environ 1010 à 1011
bactéries (Horner-Devine et al. 2003), dont 6000 à 50000 espèces de bactéries et
plus de 200 mètres d’hyphes de champignons (Curtis et al. 2002).
Les agents de la microflore du sol se divisent en quatre groupes : les algues,
les champignons, les bactéries filamenteuses ou actinomycètes et les bactéries
(Tableau 1).
Certains auteurs incluent également dans la microflore du sol les protozoaires et
les virus. (Claude et al., 2008)
1.1.1. Les algues n’existent qu’en surface de sol, car elle besoin le soleil pour
leur photosynthèse, leur activité est limitée pendant la période où le sol est
humide. Malgré leur faible nombre (cent mille gramme par de sol), elles
ont un rôle important comme source de matière organique et comme
fixatrice d’azote en symbiose avec des algues blues.
1.1.2. Les champignons forment un règne est à eux tous seuls, leur importance
est telle dans la fertilisation de sol. Ainsi, on peut avoir d’une à deux
tonnes de champignons par hectare de sol agricole. Ils représentent les
deux tiers de la biomasse microbienne du sol. Leurs rôles sont variés ;
3
Chapitre I : SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE
-leur rôle le plus déterminant vient du fait qu’ils sont les seuls organismes
sur la terre, à part quelques rares bactéries, à être capable de décomposer
la lignine des plantes (est la principale source d’humus dans le sol)
-Pour effectuer ce travail fondamental, les champignons ont besoin d’un
sol aéré, car tous les champignons, sauf ceux très particuliers du rumen de
bovins, ont besoins d’oxygéné pour vivre. C’est la raison pour laquelle la
végétation des marais, qui se décompose en absence d’air au fond de
l’eau, donne naissance à la tourbe et non à l’humus.
1.1.3. Les actinomycètes sont un peu intermédiaires entre les champignons et les
bactéries. De ces premiers, ils ont l’aspect filamenteux et la capacité de
sécréter d’antibiotiques ; des secondes, ils ont la possibilité d’effectuer de
très nombreuses réactions biochimiques. Leur nombre est d’un à cent
millions par gramme de terre, et leur poids total est d’environ une tonne
par hectare.
1.1.4. Les bactéries nous arrivons enfin au dernier groupe de microorganismes
du sol : les bactéries. C’est le groupe le plus nombreux et le plus varié,
puisque leur densité peut s’élever de dix millions à un milliard par gramme
de sol. Du fait de leur petite taille, leur poids reste inférieur à une tonne par
hectare de sol. Ce qui donne aux bactéries une place importante dans le
sol, c’est leur extraordinaire variabilité biochimique qui leur permet de
transformer toutes les substances du sol et de les faire entrer dans le monde
vivant. (Claude et al., 2008)
4
Chapitre I : SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE
Tableau1 : Liste de quelques micro-organis mes utiles vivants dans le sol
(http://symbiotech.over-blog.com/pages/Les_microorganismes_utiles-5459433.html)
Microorganismes
Leurs Rôle
groupe de bactéries appartenant à la flore du sol, qui
Actinomycètes
jouent un rôle important dans la décomposition des
matières organiques.
bactérie aérobie stricte et libre dans le sol qui fixe l’azote
Azotobacter
atmosphérique chez la plupart des végétaux et le
transforme en ammonium (20 à 40 kilos par hectare)
bactérie aérobie stricte et libre dans le sol. C’est une
bactérie rhizosphériquephytoprotectrice des racines
Pseudomonas spp
(PGPR). Elle crée un bio film adhésif et protecteur
(mucilage microbien). Elle a également la capacité de
solubiliser le fer.
bactérie aérobie stricte qui fixe l’azote atmosphérique en
association avec des plantes hôtes (légumineuses) et le
Rhizobium
transforme en ammonium (20 à 40 kilos par hectare).
est une association entre les racines des plantes et des
champignons. Elle existe chez 95% de toutes les plantes à
fleurs et à graines. Dans la nature, elle est essentielle à la
survie des deux partenaires. Chez la plante, elle augmente
sa capacité d'absorber les minéraux essentiels et sa
Mycorhizes (glomus
résistance aux maladies des racines. Et elle permet au
Intraradices et mosseae)
champignon de tirer les glucides directement de son
partenaire, sans la compétition des autres
microorganismes.
1.2.
Les microorganismes du sol et les cycles biogéochimiques
Afin de bien illustrer ces capacités biochimiques dans le monde microbien,
nous allons décrire les cycles de quelques éléments entrants dans la matière vivant.
5
Chapitre I : SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE
1.2.1. Cycle de carbone
Cet élément fondamental (figure 1) qui constitue près de la moitié des corps
vivants.
Figure 1 : Schéma du cycle de carbone.
Source : http://www2.ustboniface.ca/cusb/abernier/Biologie/Ecologie/pg3.htm.2007
1.2.2. Cycle d’azote
Le cycle montre le rôle des microorganismes dans la circulation de la matière
de terre dans le monde vivant (figure2).
6
Chapitre I : SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE
Figure 2 : Schéma du cycle de l’azote (http://microbiosol.fr.gd/Cycle-Azote.htm)
1.2.3. Cycle de phosphore
Le troisième cycle que nous décrirons est dominé par les champignons. Il
s’agit de celui du phosphore (figure 3).
Plante
Hu
humification par les
Mycorhize
champignons
RétrogradationMinéralisation
Argilo-humique
PO4 ion phosphate
microbienne
Humus
60%
Phosphate de la roche 40%
Figure 3 Schéma du cycle du phosphate (Claude et al, 2008)
Ces trois cycles biogéochimiques suffisent pour nous montrer le rôle clef joué par ces
microorganismes dans ces cycles. On comprend alors l’intérêt pour l’agriculture de
favoriser les cycles microbiens pour assurer une alimentation équilibrée à ses plantes.
7
Chapitre I : SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE
2. Les
interactions
plantes-communautés
microbiennes
de
la
rhizosphère
Les interactions
plante-communautés microbiennes de la rhizosphère pourront
être étudiées avec une vision plus globale intégrant tous les partenaires de
l’interaction avec leur diversité.
2.1.
La rhizosphère
Le terme rhizosphère a été décrit pour la première fois en 1904 par un
chercheur allemand Lorenz Hiltner, est le volume de sol entourant les racines et
influencé par les matériaux libérés par ces mêmes racines (figure 4). La surface des
racines des plantes, ce qu’on appelle le rhizoplane (Prescott, 2007).
Elle est caractérisée par une forte activité microbienne due au renouvellement
des composés organiques assimilables issus des exsudats racinaires, des mucilages et
des cellules épidermiques mortes. L’interaction plante-microorganismes dans la
rhizosphère est un processus clé qui joue un rôle primordial dans le recyclage du
carbone dans la rhizosphère et notamment dans la croissance et la santé des plantes.
(G. Govaert et al., 2010).
Figure 4 : Section d’une racine montrant la structure de la rhizosphère
(http://www.nature.com/scitable/knowledge/library/the-rhizosphere-roots-soil-and-67500617)
8
Chapitre I : SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE
2.2.
La diversité de rhizobium
Les Rhizobium sont des bactéries du sol, en forme de bâtonnets et non
sporulantes, appartenant à la famille des Rhizobiaceae (Jordan, 1962). Ces bactéries
présentent la capacité de former une symbiose avec des plantes de la famille des
légumineuses (pois, haricot, luzerne, etc.). En condition de carence en azote, les
Rhizobium induisent la formation de nodules au niveau des racines des légumineuses.
(Prescott, 2007). Ces nodules sont de véritables organes d’échange métabolique entre
les bactéries et les plantes. Cette symbiose va permettre aux bactéries de bénéficier
d’un micro habitat exceptionnellement favorable au niveau de l’hôte leur procurant un
apport en substrats carbonés issus de la photosynthèse. En se référant à la
classification de plusieurs auteurs, il y a différents genres de la famille des
Rhizobiaceae (Young 2001, Yong et al., 2003, Willems 2006).
Tableau 2 : Exemples d’associations entre rhizobia et légumineuses
(Sawada et al., 2003)
2.3.
Établissement des symbioses rhizobiennes
Le genre Rhizobium est un membre remarquable de la communauté de la
rhizosphére. Cette bactérie peut aussi établir une association symbiotique avec
légumineuses et fixer l’azote au bénéfice de la plante. Rhizobium infecte des
légumineuses spécifiques et y forment des nodules (figure 7). La symbiose entre les
9
Chapitre I : SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE
espèces Rhizobium et les plantes s’effectue avec un hôte spécifique tel que le cas de
Sinorhizobium meliloti et la luzerne. Ce processus de symbiose implique des
molécules secrétées par les plantes. Ces molécules s’appellent lectines et permettant la
reconnaissance de l’hôte et la fixation de l’espèce appropriée de Rhizobium sur des
sites spécifiques des radicules (Prescott, 1995). Ces lectines produites par les hôtes
permettent l’agglomération des Rhizobium (Prescott, 2007). De plus, les Rhizobium
libèrent des lipopolysaccharides qui pénètrent dans le poil absorbant et dirigent la
formation du filament infectieux. Lors du contact de la bactérie avec la racine, le poil
aura une forme de crosse et, par conséquent, la bactérie y pénètre et induit la
formation d’un filament infectieux par la plante qui s’allonge dans la radicule vers
la racine. Le Rhizobium se propage dans le filament infectieux et infecte les
cellules adjacentes de la racine qui subiront par la suite des divisions successives et
les nodules apparaissent. Les bactéries se multiplient dans les cellules infectées
et
se
développent en ramifications gonflées, nommées bactéroïdes, qui sont
responsables de réduire l’azote atmosphérique en ammoniaque. En plus, il y a la
production de leghémoglobine et de la noduline dans les bactéroïdes. La noduline
formée cause l’élargissement du cortex cellulaire tandis que la leghémoglobine est à
l’origine de la couleur rose chez les nodules et permet la régulation de
l’oxygène chez les bactéroïdes (Oldroyed et al., 2011 ; Prescott 2007).
10
Chapitre I : SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE
Figure 5 : établissement des symbioses rhizobiennes
source :http://permaculturetokyo.blogspot.com/2009/02/rhizobium-sy mbiosis-with-woody-plants.html
Figure 6 : Les nodules fixateurs d’azote chez les plantes
A-C. La symbiose fixatrice d’azote Rhizobium-Légumineuse, exemple de
Medicagosativa et son symbionte S. meliloti. A. Tige et fleur de M. sativa. B. Nodules
entiers. C. Section longitudinale d’un nodule.
11
Chapitre I : SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE
 La formation de nodules radiculaire par les rhizobiums :
Figure 7: Dialogue moléculaire entre la plante et la bactérie lors de la mise en place
d'une association symbiotique fixatrice de l'azote (Journet ; 2004).
Figure 8: Racine en coupe longitudinale montrant un nodule fonctionnel
Source : http://www.perrin33.com/ microbiologie/azote/entree-n_3.php
12
Chapitre I : SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE
Figure 9 : Schéma montrant nombreux bactéroïdes dans une cellule d'une nodosité
racinaire. Source :http://biosol.esitpa.org/liens/rhizo2003/nodulation.htm
Figure 10: Coupe longitudinale schématique d’une nodosité de type indéterminé (A)
et de type déterminé (B). I = zone méristématique, Il = zone d’infection, II-III = interzone, III = zone fixatrice d’azote. IV = zone de sénescence. Ce = cortex externe, E =
endoderme, Ci = cortex interne, FV = faisceau vasculaire, CF = cortex faisceau
TC =Tissu conducteur, CC= Cortex conducteur (M.G. Jean-François ; 1997)
2.4.
La spécificité symbiotique
L’une des caractéristiques majeures des associations rhizobium-légumineuse
est leur spécificité d’hôte. En effet, une espèce de rhizobium donnée n’est
capable,
en
général, d’établir une relation symbiotique efficace qu’avec un nombre
limité de partenaires végétaux (tableau 3). De même une espèce de légumineuse ne
peut être nodulée que par un certain nombre d’espèces de rhizobium.
(G.H.William, 2003).
Cette spécificité serait contrôlée par les lectines de l'hôte qui reconnaissent
certains glucides des capsules bactériennes. Les lipopolysaccahrides sont un des
13
Chapitre I : SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE
composés minoritaires de la membrane bactérienne externe qui jouent aussi un rôle
important dans la spécificité rhizobiums légumineuses (Prescott, 1997)
3. Effet de la salinité sur le comportement des isolats
Les principaux facteurs limitant l'activité biologique dans les sols sont le
déficit hydrique, la salinité, les températures élevées, les pH extrêmes et les carences
en éléments nutritionnels. Les interactions fréquentes entre ces différentes contraintes
affectent la croissance et la capacité de survie des micro-organismes dans les sols
arides. (E.Cacciari et al., 1998 ).
La salinisation des sols est le processus d'accumulation de sels à la surface
du sol et dans la zone racinaire, qui occasionne des effets nocifs sur les végétaux et le
sol; il s’ensuit une diminution des rendements et, à terme, une stérilisation du sol. La
salinisation se produit généralement lorsque la quantité d’eau perdue par le sol par
évapotranspiration dépasse celle provenant de l’infiltration des précipitations. Pour
cette raison, nous avons étudié
le facteur d salinité parmi ces facteurs abiotique.
(P.Sylvie van, 2009).
Afin
de
caractériser
les
différences
de
comportement
physiologiques
et
microbiologique des souches de rhizobiums isolées dans le sol de la rhizosphère de la
plante M.sativa,L.
Tableau 3: tableau schématique de quelques effets de l’enivrement sur la physiologie
des nodules fixant l’azote. (H.Zahran et al., 1998)
Facteurs
Effets
Températures
Sur la fixation de l’azote et /ou son assimilation
Diffusion des gaz
Stress hydrique
Effet direct sur les nodules incluant une
réduction de la porosité affectant l’assimilation
de l’oxygène.
Salinité
Réduction de l’activité de la nitrogénase.
L’inhibition de la synthèse leghémoglobine.
L’azote combine
Inhibition par les nitrites formes par la réduction
des nitrates dans les bacteroides.
14
Chapitre II: Matériel et Méthodes
1. Choix du site expérimental
Pour des raisons pratiques nous avons réalisé notre expérimentation au
niveau de l’exploitation agricole du département d’agronomie de l’université
d’Ouargla (ex. ITAS) (31° 57’ de latitude Nord et 5° 24’ de longitude Est) (figure 11).
Le site a été choisi en fonction de l'objectif de notre sujet, visant la présence
des plantes légumineuse, telle que Medicago sative et un sol salé. L'exploitation se
présente sous la forme d'un glacis d'une grande homogénéité topographique. Le sol
composé est à dominance texturale sableuse et sableu-limoneuse, avec une structure
particulaire, pH légèrement basique et une fore salinité (conductivité électrique
élevée) (DOUADI et SAHRAOUI, 1991 ; LAHMAR, 1992).
Figure 11 : situation du site expérimentale dans l’exploitation d’université d’Ouargla
(EX : I.T.A.S) (Google earth., 2013)
15 Chapitre II: Matériel et Méthodes
1.1.
Matériel végétal
Les souches utilisées dans ce travail sont isolées à partir des nodosités
prélevées sur des légumineuses, en particulier le Medicago sativa L. (la luzerne). Il
s’agit d’une plante vivace fourragère originaire d'Asie ; elle appartient à la famille des
papilionacées ou légumineuses, l'appelle encore alfalfa. Elle est tétraploïde (2n = 4x =
32). La luzerne est appréciée comme culture fourragère pour sa valeur nutritive et sa
grande aire d'adaptation, mais elle joue également un rôle important dans les
rotations, car elle améliore la structure du sol, l'enrichit en azote et facilite la lutte
contre les organismes nuisibles. (K.A.Lesins et al., 1979)
1.2.
Milieux d’étude
1.3.1. Milieu d’isolement
- Milieu YEM (Yeast Extract Mannitol)
Le milieu nutritif agar YEM est un milieu de culture solide, mis au point par
Vincent (1970). Ce milieu est utilisé pour isoler et conserver les souches de bactéries
fixatrices d’azote dans les nodules.
-Milieu YMB (Yeast Mannitol Broth):
Bouillon de culture qui possèdent la même fonction, mais ces milieux ne
contiennent pas d'agar-agar, ils sont donc totalement liquides.
La composition de chaque milieu est donnée en (annexe 1).
1.3.2. Stérilisation
Tous les milieux, dont le pH a été neutralisé par NaOH N et du HCl M
suivant le cas. Les milieux sont stérilisés à 121°C pendant 20 minutes dans un
autoclave. La verrerie est stérilisée à 180°C dans une étuve universelle pendant 30
minutes. Il est à noter que toutes les manipulations microbiologiques sont
effectuées
dans
des conditions stériles c'est-à-dire autour de la flamme du bec
Bunsen et sous hotte à flux laminaire.
16 Chapitre II: Matériel et Méthodes
1.4. Méthodes
1.4.1. Technique de préparation et de conservation des nodules
La récolte des nodules s’effectue selon les techniques préconisées par
Vincent (1970) et Somasegaran et Hoben (1985). Il s’agit de creuser environ 15cm
autour de la plante et 20cm dans le sol pour extraire la plante et son appareil
racinaire. Manuellement, on se débarrasse de la terre au niveau des racines sans
toutefois endommager les nodules. Les racines avec leurs nodules sont lavées
délicatement des restes de terre à l’eau de robinet. Les nodules peuvent être conservés
pendant plus d’un an au réfrigérateur à +4°C. Les nodosités d’une même plante
doivent être mises dans un même tube.
Figure12 : Collecte des nodules (Photo D.P. Beck, 1993)
Figure 13 : Rinçage des racines et nodules (Photo D.P. Beck, 1993)
17 Chapitre II: Matériel et Méthodes
1.4.2. Isolement des souches de rizobia à partir des nodules
1.4.2.1. Stérilisation des nodules
La technique classique d’isolement des souches de Rhizobium décrite par
Cleyet-Marel (1989) a été adoptée. Les nodules roses (la pigmentation rose révèle
la présence de la léghémoglobine), récupérés à partir des racines de la luzerne sont
stérilisés superficiellement par immersion dans l’éthanol à 95° durant 30 secondes,
puis dans une solution de chlorure mercurique HgCl2 à 0,1 % ou l’eau javel pendant
deux minutes pour éliminer le plus de bactéries possibles de la rhizosphère. Ensuite
sont rincés 10 fois à l’eau distillée stérile.
Figure 14: étapes de stérilisation les nodules
Il est à noter que toutes les manipulations microbiologiques sont
effectuées
dans
des conditions stériles c'est-à-dire autour de la flamme du bec
Bunsen et sous hotte à flux laminaire.
1.4.2.2. Technique d’isolement
On citer deux techniques pour isolé les rhizobia à partir les nodules :
a) Broyage des nodosités et ensemencement du broyat
Cinq à six nodosités sont broyées dans 1 ml d’eau physiologique stérile, il
faut bien écraser les nodules afin d’obtenir une suspension laiteuse.
Une dilution de 10 -1 du broyat obtenu est réalisée, en mettant dans un
tube 0,1 ml de broyat et 0,9 ml d’eau physiologique stérile. On dépose 0,5 ml de
la dilution précédente sur des boites de Pétri contenant le milieu Y.E.M. puis on étale
la goutte déposée.
18 Chapitre II: Matériel et Méthodes
Figure 15 : Broyage des nodules jusqu'à l’obtention d'un aspect laiteux
b) Piquer au centre des nodules
La deuxième technique consiste à casser les nodules en deux et à piquer le
centre du nodule à l'aide d'un filament de platine puis à ensemencer des boîtes de
pétri. La deuxième technique a l'avantage par rapport à la première de permettre une
purification beaucoup plus rapide et c'est la méthode qu'on a utilisée.
 La suspension obtenue, est étalée par épuisement sur boîte de Pétri contenant le
milieu YEM gélosé au Rouge Congo à la concentration finale de 0.025g/l. Notons
que le rouge Congo est utilisé afin d’éviter toute contamination par les bactéries
(Actinomycètes, Agrobacter, …). Les colonies apparaissent après 3 à 7 jours
d’incubation à 28°C dans des conditions aérobies. La pureté des souches
vérifiée
par
repiquage
successif
sur
milieu
YEM
gélosé
au
est
rouge
Congo.
 L’identification des souches de Rhizobium a été faite par un examen
macroscopique (caractères culturaux sur milieu YEM gélosé au rouge
Congo) et par une observation microscopique (coloration de Gram et
examen à l’état frais des cellules vivantes), et d’autres tests biochimiques.
1.4.2.3. Conservation des souches
La technique de conservation utilisée est celle décrite par Vincent (1970).
Le milieu YMA est tamponné avec 3 g /l de CaCo3 et réparti dans des tubes. Après
autoclavage à 120° C pendant 20 minutes, les tubes sont inclinés.
Après refroidissement, des stries de la souche à conserver sont effectuées sur
la surface de la gélose inclinée. La technique permet une conservation de 6 à
12 mois à 4° C (Vincent, 1970).
19 Chapitre II: Matériel et Méthodes
Figure 16: Conservation des nodules (Photo D.P. Beck, 1993)
NB : Sur chaque flacon sont mentionnées le nom de la plante, date et lieu de collecte,
et la date de conservation.
1.4.3. Tests de la tolérance de sel et d’effectivité
Le tests de tolérance au sel ont été réalisés sur 7 souches de rhizobium
sélectionnées, les cinétiques de croissance sont établies par la mesure de l'évolution
de la densité optique (spectrophotomètre à 600 nm) des cultures dans le milieu
YEM
liquide (Vincent, 1970), pour des concentrations salines allant de 0,8,12
et16g/1 de NaCl. Après 7 jours d'incubation à 28 °C sous agitation à 250 tr/min
(incubateur agitateur). La croissance bactérienne est comparée au témoin sans NaCl.
L'étude a été pour suivie par mesure périodique.
L'efficience est la capacité de réduire efficacement l'azote atmosphérique en
ammonium. Différentes techniques d'estimation de l'efficience sont disponibles.
La méthode qui nous avons été l’utilisé, elle est consisté à déterminer le
poids sec de la partie végétative des plantes inoculées par la souche à tester
comparativement au témoin non inoculé. L'effectivité des souches les plus tolérantes
au sel a été évaluée sur plante entière (5 plantes pour chaque souche et 2
répétitions par plante) .(vincent,1970)
1.4.4. Test de nodulation en pots
Tous les isolats doivent être testés et confirmés avant de les inoculer. Le test
de nodulation est la capacité et l’aptitude des isolats à former des nodules avec la
plante-hôte dans des conditions bactériologiquement contrôlées.
20 Chapitre II: Matériel et Méthodes
(Vincent., 1970, Beck et al., 1993). Ce test consiste en l’inoculation des graines de
la plante hôte Médicago sative L. avec les différents isolats obtenus.
1.4.5. Stérilisation des graines
Des graines de luzerne, ont été désinfectées en surface (alcool éthylique
95%, 2 min, hypochlorite de sodium NaCl à 5%, 10 min; cinq rinçages ont été
effectués avec de l’eau distillée stérile (Vincent, 1970).
1.4.6. Solution nutritive
La solution nutritive stérile (sans azote) est composée comme suit (mg/L
d’eau distillée) : 174 mg de K2HPO4, 136 mg KH2PO4, 5 mg de citrate de fer, 493 mg
MgSO4 .7H2O, 147 mg CaCl2.2H2O, et 1 ml de la solution de Hoagland (Annex 1).
1.4.7. Germination et inoculation
Des essais de culture ont été réalisés dans des pots de (15 cm de
diamètre) remplis d’un sole stérile. Les graines de luzerne désinfectées en surface
ont été semées et pré-germées durant 48 h, puis on a procédé à un éclaircissage de
façon à garder 5 plants/pot. Les différents traitements sont décrits au Tableau 4.
Tous les essais ont été conduits en 2 répétitions.
Les racines des plantes sont inoculées avec une dose de (10 8 bactéries/ml)
provenant d’une culture en phase exponentielle de croissance sur milieu YMB/plante.
Pour un volume de 5 ml/plante pour garder une certaine humidité et diminuer l’effet
des dilutions que peut causer l’arrosage, soit un volume de 50 ml/pot.
Un total de 28 pots a été utilisé. Après environ un mois, une coupe au stade
de 10% de floraison a été effectuée pour déterminer l’indice nodulaire et le
poids sec des racines.
Les pots ont été transférés dans une chambre de croissance (photopériode de
16 h, température de 25°C le jour et 15°C la nuit) pour une durée de 30 jours.
Les plantes ont été arrosées deux fois à 3 fois par semaine avec la solution nutritive
21 Chapitre II: Matériel et Méthodes
Tableau 4 : Tests d’efficacité des souches de rhizobium sp sur la luzerne en condition
salin
Volume de solution
Traitement
Microorganismes
Volume de
nutritive (ml) ajouté
bioinoculants (ml) pour compléter à 50
T0+YMB
T8+YMB
Rhz1
5
45
Rhz2
5
45
Rhz3
5
45
Rhz4
5
45
Rhz5
5
45
Rhz6
5
45
Rhz7
5
45
T12+YMB
T16+YMB
T0+YMB
T8+YMB
T12+YMB
T16+YMB
T0+YMB
T8+YMB
T12+YMB
T16+YMB
T0+YMB
T8+YMB
T12+YMB
T16+YMB
T0+YMB
T8+YMB
T12+YMB
T16+YMB
T0+YMB
T8+YMB
T12+YMB
T16+YMB
T0+YMB
T8+YMB
T12+YMB
T16+YMB
22 Chapitre II: Matériel et Méthodes
1.4.8. Paramètres à mesurer
Après 4 semaines de croissance, on a déterminé le nombre de nodules,
l’indice nodulaire et le poids sec du feuillage. L’indice nodulaire exprime la qualité
de symbiose entre la plante et les microorganismes, c’est une valeur qualitative
qui tient compte de la gosseur, du nombre et de la couleur des nodules. Elle se calcule
comme le montre le Tableau 5.
Tableau 5 : Critères et méthode de calcul pour évaluer l'indice nodulaire.
(Ben Rebah et al. 2001)
Valeur A
Grosseur des nodules
Gros 3
Moyen 2
Petit 1
Couleurs des nodules
Valeur B
Rose 2
Blanc 1
Nombres des nodules
Valeur C
Pas de nodule 0
Peu de nodules 2
Beaucoup 3
Sur racine principale P
Autres caractéristiques
Sur racine secondaire S
Sur les racines P et S
Forme Allongé A
Forme ronde R
En groupe (Grappe) G
Isolé I
Indice nodulaire
A×B×C ≤18 maximum
23 Chapitre III: Résultats
Dans ce chapitre, nous rapporterons les résultats des mesures et d’analyses notre
isolats les 3 étapes qui on a été effectués :

Etape 1ére : Dans le milieu de culture YMA (Yeast mannitol Agar)
Étudier les isolats selon :
-
Leurs
caractéristiques
phénotypiques,
(leurs
caractères
culturaux,
morphologiques, biochimiques…etc.) ;
-
Leurs vitesses de croissance (lente ou rapide) dans les milieux de culture
spécifique (YMA+ rouge Congo, YMA + Blue bromythol).

Etape 2ème : Le test de tolérance de NaCl :
Le test de tolérance de NaCl a été réalisé dans le milieu de culture YMA
gélosé et liquide YMB (YMA sans agar), selon les différentes concentrations de NaCl
(0, 8, 12,16 g/l). Nous avons mesuré la densité optique pour :
-
Evaluer leurs croissance selon le stress salin appliqué dans notre approche ;
-
Sélectionnée la meilleure souche tolérante au sel.

Etape 3éme : Le test de nodulation
Le test permet d’évaluer la capacité d’infectivité des isolats (aptitude de
nodulation) par l’estimation de l’indice nodulaire, et leurs efficience (la capacité de
fixation l’azote) par l’estimation de pois sec de la partie aérienne après la culture des
plantules (la luzerne).
Nous avons interprétés nos résultats obtenus pour chaque étape par des tableaux, et
des observations principales.
I Caractéristiques morphologiques, culturaux et physiologiques des isolats
Sur le nombre total des nodules récoltés à partir des racines de luzerne, nous
avons tenu compte de sept (7) isolats, qu’ils sont détectables à partir de (24h) après
des observations macroscopique et microscopique.
I .1 Résultats de l’isolement des bactéries à partir des nodules (1ére étape)
Des colonies bactériennes rappelant les rhizobiums sont obtenues. Après
le piqueur au niveau de centre des nodules à l’aide d’une anse platine stérile,
L’ensemencement est réalisé selon la technique des quatre cadrans de manière à avoir
des colonies isolées et donc faciles à caractériser. Les mêmes nodules sont
ensemencés sur :
24
Chapitre III: Résultats
a) YMA (Yeast mannitol Agar): (observation macroscopique, microscopique) ;
b) YMA+ rouge Congo, YMA+ Blue bromythol (72 heures d'incubation à 28° C).
La vitesse de croissance, les aspects des cultures sur milieux qui on a cité
précédemment, On a choisis les isolats du genre Rhizobium en se basant sur :
1-Le temps d’incubation (72 heures) ;
2-Forme des colonies (colonies muqueuses, bombées, circulaires et brillantes
aspect mielleux) ;
3-La température pour une croissance optimale de la croissance est de 28°C ;
4-Le pH Pour une croissance optimale est de 7,00 ;
5-La mobilité et la coloration de Gram (Gram négative). (Vincent., 1970).
I.1.1 Croissance sur YMA
Les aspects des cultures sur milieu YMA après l’observation macromicroscopique sont récapitulés dans le (tableau 6).
25
Chapitre III: Résultats
Tableau 6 : Résumé des caractères culturaux des sept (7) souches après observation à l’œil
nu
Souches
1
2
3
4
5
6
7
< 2mm
>2mm
<2mm
< 2mm
<2mm
< 2mm
>2mm
arrondie
arrondie,
arrondie,
arrondie,
Circul*
Circul,
Circul,
circulaire
circulaire,
Colonie
circulaire
plats
arrond*,
arrond
colonie
volumineuse
Caractéres
Diamètre de
colonie
Forme
Colonie
volumineuse
lisse
Surface
Lisse
Vol*
lisse
lisse
lisse
lisse
lisse
bombée
bombée
plats
bombée
bombée
humide
bombée
Hauteur
légèrement
bombée
visqu*
visqu
visqu
visqu
visqu*
visqu
Visuq*
Trans*
Trans
Trans
Semi
Trans*
Trans*
Trans
Semi trans
opaque
opaque
trans
blanche
blanche
beige et
blanche
blanche
blanche
blanche
brillante
brillante
lente
rapide
rapide
lente
rapide
Consistance
Caractères
optiques
Couleur
laiteuse
Croissance à
rapide
rapide
28°C
Viqu*= très visqueuse, trans*= très translucide, circul*=circulaire, arrond*=arrondie,
vol*=volumineuse.
26
Chapitre III: Résultats
Figure 17 : Exemples des souches rhizobium sp à différentes caractères
morphologiques
27
Chapitre III: Résultats
Tableau 7 : Résumé des caractères morphologiques des sept (07) souches après
microscopie (G ; ×100) :
Souches
1
2
3
4
5
6
7
mobilité
+
+
++
++
+
-
++
forme
bâtonnet bâtonnet
bâtonnet
bâtonnet
bâtonnet
bâtonnet
bâtonnet
courte
courte
courte
court
long
longue
courte
isolé
grappe
grappe
Isolé
isolé
isolé
grappe
Diamètre de
longue
longue
longue
_
_
courte
_
cellule
petite
petite
moyenne
Gram
négatif
négatif
négatif
Caractères
Mode de
regroupement
large
négatif
négatif
négatif
négatif
+ : mobile ; ++ : très mobile ; - : no déterminé
Regroupés
Isolées
(grappe)
Figure 18 : Exemples de rhizobium sp (bâtonnets Gram négatif) ; (G ;×100)
au microscope électronique.
28
Chapitre III: Résultats
I.1.2 Croissance sur les différents milieux de cultures utilisés
-
Sur milieu YMA + rouge Congo: les isolats absorbent peu ou pas le
rouge Congo restant ainsi rose à blanchâtre (Figure 19).
-
Sur milieu YMA + bleu de bromothymol (BTB): L’ensemble des isolats
acidifie le milieu (virage de l’indicateur de pH en moins de 24h).
(Figure 20)
Figure 19 : Aspect des colonies dans YEM+ rouge Congo
Figure 20 : Aspect des colonies dans YEM+BTB
29
Chapitre III: Résultats
II Test de tolérance de sel (2 éme étape)
La croissance des rhizobiums est évalué par l'apparition de colonies dans
les boîtes de Petri ou liquide renfermant des concentrations croissantes de NaCl :
0, 8, 12, 16 g/L, avec deux répétitions pour chaque traitement.
La mise en culture des souches étudiées sur le milieu YMA gélosé enrichi en
concentrations
Croissantes de NaCl montre que:
- La majorité des souches peuvent croître sur le milieu contenant 8 g/l de NaCl par
rapport à la souche témoins (sans NaCl).
-Au-delà de cette concentration, ainsi les souches peuvent se développer jusqu’à la
concentration 12 g/L.
- Une diminution remarquable au-delà de 12g/L, on a distingué seulement une souche
développée dans le milieu contenant 16g /L.
La même expérimentation, réalisée en milieu liquide, isole les mêmes souches
tolérantes. Les courbes de la figure 21 représentent la croissance des souches choisies
sur YMA liquide, à différentes concentrations de NaCl en fonction du temps.
30
Chapitre III: Résultats
1,4
Souche 3
Unité DO à 600 nm
1,2
1
Série1
0,8
Série2
0,6
Série3
0,4
Série4
0,2
Temps (h)
0
0
20
40
60
80
100
120
140
1,4
Souche 4
1,2
Unité DO à 600 nm
1
Série1
0,8
Série2
0,6
Série3
Série4
0,4
0,2
0
0
20
40
60
80
31
100
120
140
Temps (h)
Chapitre III: Résultats
1,2
Souche 5
Unité DO à 600 nm
1
0,8
Série1
Série2
0,6
Série3
Série4
0,4
0,2
Temps (h)
0
0
20
40
60
80
100
120
140
1,4
Souche 7
Unité DO à 600 nm
1,2
1
Série1
0,8
Série2
0,6
Série3
Série4
0,4
0,2
Temps (h)
0
0
20
40
60
80
100
120
140
Série 1= 0 g/L, Série 2= 12g/L, Série 3= 16g/L, Série 4= 8 g/L
Figure 21 : Cinétique de croissance des souches isolées pour différentes
concentrations en NaCl. Cultures réalisées en milieu YMA liquide et croissance
évaluée par mesure de la densité optique (DO) de la culture à 600 nm.
32
Chapitre III: Résultats
III Test de nodulation et effet des isolats sur la luzerne
Afin de vérifier les propriétés symbiotiques de nos isolats, c’est à dire la capacité à
noduler et à fixer l’azote, nous avons testé nos souches obtenus après leurs
caractérisations phénotypiques.
La détermination et le suivi de la croissance des isolats sur milieu YMB
(Vincent., 1970) nous a permet seulement de prendre les souches à une phase
exponentielle
de
croissance figure 21 pour pouvoir déterminer leurs aptitudes à
noduler les graines germées de la légumineuse.
Tableau 5 montre les caractéristiques morphologiques nodulaires observées après
l’inoculation des souches sélectionnées dans les pots :
Tableau 5 : Caractéristiques morphologique nodulaire observés après l’inoculation
des souches sélectionnées dans les pots
[NaCl]=
S2
Sans
sphérique
S3
S4
S5
Dans:
Seulement
Seulement
dans:
dans:
[8a,12b]
[8a,12b]
[8a,12b]
Sphérique
Sphérique
0
Sphérique
0
petit
Toutes [NaCl]
inoculation
Caractères
Forme
S1
Toutes [NaCl]
[8, 12,16]g/l
Témoin
Toutes [NaCl]
Inoculation
[8a,12b, 16c]
0
0
Cylindriquea
S6
S7
Seulement
dans:
Sphériqueb
Cylindriquec
Grosseur
petit
0
0
Moyenne
Petit*
Petit*
blanche
0
0
rose
blanche-
blanche-
rose
rose
4
2
A
Couleur
B
Nombre
3
0
0
8
C
rose
0
2
0
racine
P
Indice
0
0
P+R
P+R
P
0
P
0
0
12
2- 4
2-4
0
4
nodulaire
A*B*C
(cf matériels
et méthodes)
Petit*= Très petit, P= racine principale, R= racine secondaire
33
Chapitre III: Résultats
Figure 22 : Les deux formes que prend le nodule (Richter., 1993)
Après une période d’un mois, on remarque qu’en présence des concentrations de 0,
8 g/L de NaCl après l’inoculation des plantules par S3, S4, S5, S7, la partie aérienne
est bien développée avec des feuilles bien formées vertes ainsi que la partie racinaire.
et pour la concentration 12g/L, on peut noter que les résultats sont satisfaisants avec
peu de développement par rapport à ceux citer juste au-dessus.
Dans la concentration de 16g/L de NaCl, et avec S4, S5, S7, on note la mort des
plantules. Alors que dans la présence de la souche 3, les plantules présentent un
faible développement, suivi par une formation d’un nombre peu des nodules.
34
Chapitre IV: Discussion
Tout en suivant une démarche classique Vincent (1970, 1982) ; Somasegaran
et Hoben, (1994), relative
à l’identification
des
bactéries appartenant aux genres
Rhizobium ; nous avons procédé à un isolement et une caractérisation des bactéries
nodulant la légumineuse fourragère (Medecag sativa, L.)
A travers les résultats obtenus, notamment les caractères phénotypiques, on
constate
que
les
isolats
se
comportent
pratiquement
comme
des
rhizobia
(morphologie des colonies sur YMA, vitesse de croissance, test de nodulation,….).
En effet, les aspects morphologique et cultural des isolats sur les différents
milieux
de culture attribuent la majorité de nosisolats à des souches à croissance
rapide et une morphologie des colonies proche du genre Rhizobium tel que décrit
Vincent (1970, 1982), Jordan (1984), Somasegaran et Hoben (1994). Il en est de
même pour la croissance des isolats sur milieux spécifiques (absorption
du rouge
Congo), et une réaction acide rapide sur le milieu YMB.
Les résultats de tolérance au sel révèlent que nos isolats présentent différent
comportements. Il est à noter que Zahran et al., (2003); Vriezen et al.,(2006, 2007)
ont constaté que les rhizobiums sont généralement plus tolérants aux stress
comparativement à leurs plantes hôtes.
La gamme de tolérance au sel des rhizobiums est variable selon la souche et
le type de sel (El Sheikh et al., 1989). Khatteli (1994) a constaté que la tolérance aux
concentrations en NaCl supérieures à 1,5% (15g /L, 0,25M) est rare chez certains
Rhizobium.
L’analyse de la croissance des souches S4, S5 et S7 en milieu liquide en
présence de différentes concentrations NaCl montre que seule la concentration à
16g/L de NaCl a un effet inhibiteur sur la croissance de ces souches ; phénomène déjà
observé lors des cultures de souches bactériennes tolérantes au sel (Kassem et
al.,1985), qui montre que l’influence de NaCl sur légumineuse peut se manifester dès
leur gémination. Ainsi la germination de Medecag sativa, L. est inhibée par 1,5% de
NaCl (0,26 M/L).
La croissance est même plus importante lorsque le milieu est enrichi avec 8g/L
de NaCl, alors que des cinétiques de croissance identiques sont observées pour les
souches qui se développent en absence de sel ou en présence de 12 g/L de NaCl
(Fatou et al.,1998). Ces mêmes résultats sont constatés pour la cinétique de croissance
par S3, S4, S5 et S7.
35
Chapitre IV: Discussion
Des résultats rapportées par Steiborn et Rhoughley (1975) et Ibriz et al.,(1988),
montrent que la
tolérance aux fortes
concentrations de NaCl
semble
être
un
caractère adaptatif, comme il a été établi avec des souches de Sinorhizobium meliloti,
qui après un long séjour dans un milieu à forte concentration de NaCl, sont devenues
tolérantes à 3,5% de NaCl. Ce qui confirme la formation des nodules par la souche
S3.
D’après les résultats obtenus par (Zahran., 2001) et (Zahran et al., 1985), les
souches tolérantes et sensibles ont des évolutions respectives rapide et plus lente. En
symbiose, le rhizobium est plus résistant à la salinité que son partenaire végétal.
Ainsi, la salinité affecte l'initiation, le développement et le fonctionnement des
nodules, de même que la capacité photosynthétique des feuilles. Il s'avère que la
fixation symbiotique de l'azote est plus affectée par le sel que la croissance des
plantes (Rao et al., 2002). Selon Kaseem et al., (1985), il a été constaté que la
sensibilité de la nodulation à la salinité est très variable, elle peut être inhibée par des
petites quantités de NaCl, cette inhibition peut être due à la sensibilité de rhizobium
au sel, à la sensibilité de la plante-hôte et à celle de l’interaction rhizobium-plantehôte ; ce qui explique l’absence de nodulation pour les souches S1, S2 et S6.
Le test de nodulation en pots n’a pas été très précis puisque les témoins non
inoculés avec Rhizobium sont nodulés (Nadjib.M., 2011). Ceci traduit, que nos
résultats sont probablement dus à une contamination entre les pots, concernant
l’indice nodulaire, la récupération des nodules n’était pas facile; il y a eu une perte qui
a rendu les résultats moins précis en plus les témoins non inoculés ont été contaminés.
La nodulation atténuée par l’effet du sel continue à se produire dans des
fortes concentrations (16 g/l de NaCl) (Ibriz et al., 1988) ; ceci confirme la formation
d’un nombre un peu réduit des nodules par la souche 3.
Les résultats obtenus lors de nos travaux montrent la mort, après une
semaine, des plantules inoculées par les souches S1, S2 et S6 ; ce phénomène est dû
à l’insuffisance
en quantité de ces souches inoculées, ou à cause de la température
élevée (mois de juin : période de déroulement du test).
36
Chapitre IV: Discussion
Selon
Mezni et al., (2002),
qui stipule que les échecs des cultures de
légumineuses dans certaines régions sont souvent le résultat d'une insuffisance ou d'un
manque d'efficience des souches de rhizobium. Ce qui confirme bien notre approche.
En présence des souches S3, S4, S5 et S7, on observe la formation de
quelques nodules de couleur rose de taille moyennes à petites, ces nodules se situent
dans la partie supérieure des racines. La couleur rose des nodules est probablement
due à la présence d’un pigment, la Leghémoglobine ; l’apparition de ce pigment dans
le nodule coïncide avec le démarrage de fixation d’azote et sa dégradation correspond
à l’arrêt de la fixation. En plus le réisolement des souches bactériennes à partir de ces
nodules fait apparaître des colonies sur milieu YMA.
L'apparition de nodosités (infectivité) est suivie par la capacité de ces
nodules à fixer l'azote (effectivité) ; infectivité et effectivité sont estimées par l'état de
la plante (taille, couleur des feuilles) et parcomparaison avec des plantes témoins non
inoculées.
Jebara et col., (2000) ont montrés que l’association de Sinorhizobium avec
Medicago sativa donne une différence de réponse à la salinité (aussi bien au
niveau du nombre de nodules que du poids en matière sèche des parties
aériennes). Ceci appui en termes d’explication les différents résultats obtenus dans les
concentrations utilisées dans nos expériences
Nos résultats obtenus lors du test de nodulation
montrent un faible
développement des parties aériennes et racinaires dans une concentration de 16g/L de
NaCl avec la présence de souche 3. Ceci est confirmé par les travaux de Berraho et
al., (2003), qui ont montré que, les faibles rendement souvent obtenus ne seraient pas
limités uniquement par le potentiel fixateur d’azote de la symbiose mais pourraient
aussi être dus aux stress osmotiques prévalantes dans les zones salée. Aussi l’étude
réalisée par Mainassara et al., (2009), conduisant à terme à des baisses de rendement
et de qualité des productions, dû à la présence d’un excès de sel dans le sol, confirme
ce phénomène.
37
Conclusion générale
La salinité est une contrainte majeure qui affecte la croissance et le
développement des plantes surtout dans les régions arides et semi-arides qui
souffrent des problèmes de la salinisation des sols. Les effets dépressifs de la
salinité sur les légumineuse, en particulier la luzerne, affectent également la
nodulation, la fixation symbiotique d’azote ainsi que le métabolisme azoté.
Notre travail est basé sur trois objectifs principaux, le premier ayant pour but
d’isoler les souches de Rhizobium à partir des nodules de racines de la légumineuse
Medigaco sative au niveau de l’exploitation agricole dans la région d’Ouargla ; dans
cette phase nous avons procédé à un isolement et une caractérisation
phénotypique selon les techniques usuelles propres aux rhizobia dans des
conditions bactériologiquement contrôlées. Le second objectif présente une étude de
l’effet de stress salin sur nos isolats selon différentes concentration de NaCl afin de
déterminer la tolérance de ces isolats à la contrainte saline.
Le troisième objectif, et toujours par rapport au même facteur abiotique major, est
consacré à l’étude de l’influence du stress salin sur le spectre d’hôte de nos isolats en
testant leur infectivité et leur effectivité
sur la luzerne.
Les résultats ainsi obtenus, nous ont permis de constatés ce qui suit :
 Les aspects morphologique et cultural des isolats sur les différents milieux
de culture attribuent que la majorité de nos isolats ont une morphologie des
colonies proche du genre Rhizobium. La croissance sur milieu YMA- rouge
Congo montre que les souches absorbent peu du rouge Congo.
 En fonction de la vitesse de croissance sur le milieu YMA additionné
de bleu de Bromothymol, les isolats peuvent être séparés en deux
groupes : Rhizobium (Bactéries à croissance rapide) et Bradyrhizobium
(bactéries à croissance lente) (Vincent, 1970), or la majorité de nos souches
ont acidifié le milieu après seulement 24h d’incubation.
 Selon le test de tolérance à la salinité, on a constaté une variation de la
croissance des cultivars sous contrainte saline et on a distingué trois types
des isolats :
38
Conclusion générale
 Souche tolérante : la majorité des souches peuvent se développée en l’absence
de NaCl et dans une concentration 8g/L.
 Souche intermédiaire : un développement suffisant de nos isolats dans la
concentration 12g/L de NaCl.
 Souche sensible : Dans la concentration de 16g/L de NaCl ; on remarque une
inhibition pour la majorité des souches, mais il existe une souche qui présente
une tolérance dans cette concentration.
 Les interactions symbiotiques sont caractérisées chez les légumineuses en
particulier la luzerne, par la formation des nodules racinaires colonisés
par des bactéries fixatrices d’azote. Cette fixation est due à la capacité de la
luzerne à établir des symbioses avec des bactéries du genre Rhizobium
qui conduit à la formation de nodules au sein desquels les bactéries sont
capables d'assimiler l'azote de l'air.
Un test de nodulation sous l’effet de stress salin a été réalisé dans des conditions
bactériologiquement contrôlées, ce test montre qu’ il y’a une différence réponse
dans :
 La pénétration des inoculant dans les tissus racinaires da la luzerne pour
induire la formation des nodules, avec une certaine sensibilité des isolats
aux fortes concentrations de NaCl.
 La concentration de NaCl dans le milieu affecte aussi le nombre et la taille des
nodules formés.
 le degré d’infectivité varie non seulement en fonction de concentration de
NaCl, mais aussi en fonction de la souche inoculée.
La fixation de l’azote par la symbiose Rhizobium-Légumineuses présente un intérêt
économique et agronomique considérable, en limitant l'utilisation des engrais azotés
(nitrates) qui sont coûteux et polluants, et en augmentant le stock d’azote du sol pour
produire un bon compte des protéines alimentaires de qualité sanitaire.
Grâce à cette dernière raison, on peut améliorer notre approche étudiée sous
l’effet de la salinité pour atteindre plus de tolérance à l’effet de sel ; et améliorer
ainsi la capacité d’infectivité et d’efficience des isolats inoculées.
39
Conclusion générale
Cependant, cette étude est loin d’être finie. Dans l’avenir, nous envisagerons
d’entreprendre des travaux de recherches visant à l’application et à la
vulgarisation des techniques mises au point.
Nos travaux futurs seront axés sur:
L’étude de la compétitivité des souches introduites vis-à-vis d’autres
microorganismes du sol ;
La caractérisation moléculaire de nos isolats en comparaison à une souche de
référence donnée ;
La caractérisation phénotypique des isolats selon d’autres facteurs abiotiques
et biotiques
40
ANNEXE
ANNEXE 1
Les milieux de culture
Milieu: Yeast Mannitol Broth (YMB) (Vincent, 1970)
Mannitol
10.0g
K 2 HPO 4
0.5g
MgSO 4 7H 2 O
0.2g
NaCl
0.1g
Extrait de levure
0.5g
Eau distillée
1000ml
PH
6.8
Autoclavage
120° Pendant 20minutes
Milieu: Yeast Mannitol Agar (YMA) (Vincent, 1970)
YMB
1000ml
Agar
15g
PH
6.8
Autoclavage
120°C pendant 20minutes
Milieu: YMA+rouge Congo
YMB
1000ml
Solution stock de rouge Congo
10ml
Agar
15g
PH
6.8
Autoclavage
120° Pendant 20minutes
Après ajustement du pH on ajoute 10ml de rouge Congo (0.25g rouge Congo
dans 100ml d’eau distillée), puis on ajoute l’agar.
41
ANNEXE
Milieu : YMA+bleu de bromothymol
YMB
1000ml
Solution stock de bleu de bromothymol
5ml
Agar
15g
PH
6.8
Autoclavage
120°C pendant 20minutes
Après ajustement de pH on ajoute 5ml de bleu de bromothymol (0.5g BTB
dans 100ml d’éthanol), puis on ajoute l’agar.
ANNEXE 2
Composition de la solution nutritive
La solution nutritive stérile (sans azote) est composée comme suit (mg/L d’eau
distillée) : 174 mg de K 2 HPO 4 , 136 mg KH2 PO4 , 5 mg de citrate de fer, 493 mg
MgSO4 .7H2 O, 147 mg CaCl2 2H2 O et 1 ml de la solution de Hoagland
Tableau 9 : Solution de Hoagland et Arnon (1938)
Produit
Quantité
H3 BO 3
2.86 mg
MnCl2 4H2 O
1.81mg
ZnSO 4 7H2 O
0.22 mg
CuSO 4 5H2 O
0.008 mg
H2 MoO 4 H2 O (85%MoO 3 )
0.09 mg
CoCl2 6 H2 O
0.004 mg
H2 O
1000 ml
42
ANNEXE
ANNEXE 3 :
Résultats de la mesure de densité optique pour le test effet de la concentration de
NaCl
Souche 3
jours
J1
J2
J3
J4
J5
J6
[NaCl]
g/L
0
0.382
0.474
0.874
0.747
0.276
1.242
8
0.228
0.326
0.336
0.572
0.35
0.428
12
0.186
0.382
0.194
0.375
0.26
0.685
16
0.218
0.308
0.764
0.315
0.213
0.62
Souche 4
Jour
J1
J2
J3
J4
J5
J6
[NaCl] g/L
0
0.226
0.522
0.443
1.271
0.745
0.98
8
0.113
0.238
0.265
0.425
0.198
0.313
12
0.192
0.46
0.4
0.498
0.174
0.453
16
0.221
0.349
0.707
0.557
0.272
0.607
43
ANNEXE
Souche 5
Jour
J1
J2
J3
J4
J5
J6
[NaCl] g/L
0
0.462
0.57
0.629
0.892
0.609
1.131
8
0.14
0.23
0.289
0.379
0.28
0.384
12
0.273
0.448
0.241
0.498
0.264
0.526
16
0.43
0.333
0.774
0.388
0.403
0.927
Souche 7
Jour
J1
J2
J3
J4
J5
J6
[NaCl] g/L
0
0.48
0.457
0.578
0.813
0.202
1.15
8
0.077
0.372
0.579
0.579
0.352
0.388
12
0.8
0.249
0.348
0.217
0.241
1.241
16
0.297
0.406
0.71
0.342
0.46
1.052
44
ANNEXE
Souche 3 [NaCl : 8g/L]
Souche 4 [NaCl : 8g/L]
Souche 5 [NaCl : 12g/L]
Souche 3 [NaCl :16g/L]
La prés-germination les grains de la luzerne
(Incubation 48h dans la chambre de culture, température 28°)
45
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Isolement des bactéries telluriques résistantes aux effets de salinité
Résumé : Les bactéries du sol couramment appelées rhizobium sont d’une importance considérable en agriculture à cause de leur capacité à fixer l’azote atmosphérique en symbiose avec les plantes de la famille des légumineuses. Le présent travail a porté sur l’évaluation de la tolérance au stress salin de 7 souches isolées à partir des racine de Medicago sativa L., au niveau de l’exploitation agricole de l’université de Ouargla. Les essais ont été réalisés en milieu de culture YEM et en pots de végétation dans des conditions semi‐
contrôlées. Les résultats montrent que la caractérisation phénotypique des isolats a été étudiée par les méthodes classiques se comportent pratiquement comme des rhizobia, sous l’effet de des concentrations de NaCl (0, 8, 12, 16 g/L), on a noté une différence réponse dans la croissance des isolats en YEB mesurer à DOy=600nm. D’autre part, le test de nodulation révélé une capacité symbiotique diffère (infectivité et effectivité). Mots clés : Rhizobiums, symbiose, salinité, nodulation, sol, Medicago sativa L. :‫الملخص‬
.‫بكتيريا االرض عادة ماتسمئ ريزوبيوم لھا اھمية في الزراعة بسبب تثبيت النيتروجين الجوي عن طريق التعايش مع النباتات من البقول‬
.‫ الموجودة في المساخة الزراعية بجامعة ورقلة‬Médicago Sativa. L ‫ من الريزوبيوم المعزولة من جذور‬7 ‫في ھذا العمل تم عزل‬
.NaCl (0, 8, 12, 16 g/L) ‫ واظھر تخليل مميزاتھا في مختلف تركيز درجلة المولوحة‬, ‫تم فحص المظھر الفزيولوجي لريزوبيوم‬
‫ ومالحظة فعالية ھذه االخيرة في تجربة انتاج العقد الجذرية وتثبيت‬, ‫وتمكنا من مالحظة الفرق في التباين الفيزيولوجي بين انواع الريزوبيوم المعزولة‬
.‫النيتروجين الجوي‬
Medicago sativa L. ‫ العقد الجذرية االرص‬,‫ الملوحة‬,‫التعايش‬, ‫ ريزوبيوم‬:‫الكلمات المفتاحية‬
Abstract
The bacteria of the ground usually called rhizobium are of considerable importance agriculture of their capacity to
fix the atmospheric nitrogen in symbiosis with the plants of the family of legumes.
The present work concerned the evaluation of the tolerance in the salt stress of 7 stumps isolated from root of
Medicago sative. L., at the level of the exploitation agriculture of Ouargla. The essays were realized in the middle
of culture YEM and in jars of vegetation in semi-controlled conditions.
The results show that the phenotypic characterization of isolates was studied by the classic methods behave
practically as rhizobia, under the influence of concentrations of NaCl g/L (0, 8, 12, 16), we noted a difference
answer in the growth of isolates in YEB to measure to DOy=600nm. On the other hand, the test of nodulation
revealed a symbiotic capacity differs (infectivity and effectiveness).
Keywords: Rhizobiums, symbiotic, salinity, nodulation, , soil, Medicago sativa L.