La cellule cancéreuse et son microenvironnement Dr Guedj Nathalie, MCU-PH Hôpital beaujon Généralités : cancer • Du au dérèglement de la division de quelques unes des milliards de cellules qui constituent les êtres pluricellulaires • Shématiquement on distingue 3 étapes dans la genèse du cancer : – Initiation : correspond à une lésion rapide et irréversible du DNA après exposition à un carcinogène – Promotion : correspond à une exposition prolongée, répétée ou continue, à une substance qui entretient et stabilise la lésion initiée – Progression : correspond à l’acquisition des propriétés de multiplication non contrôlée, l’acquisition de l’indépendance, la perte de la différenciation, l’invasion locale et métastatique • les deux premières sont connues uniquement par les modèles expérimentaux et l’étude de l’épidémiologie des tumeurs humaines Propriétes des cellules cancéreuses • Invasion du tissu adjacent • Extension locale • Métastases à distance -Cellules cancéreuses -Tissu de soutien Tissu de soutien • Matrice extra-cellulaire : – Glycoprotéines – Cytokines • Facteurs de croissance • Fibroblastes et myofibroblastes • Cellules endothéliales Plusieurs modes d’invasion : « Classifying collective cancer cell invasion » • Variabilité morphologique des tumeurs • Le comportement des cellules cancéreuses – Suggèrent : • Les cellules tumorales peuvent employer différents modes d’invasion cellulaires et moléculaires Friedl and al, Nature Cell Biology, 2012 Catégories de l’invasion collective • Migration « single-cell » : capacité de la cellule à migrer et à interragir avec la MEC (modification du cytosquelette+++) • « Multicellular streaming » : rapidité de migration par l’intermédiaire de chemokine ou facteurs de croissance (EGF). Le cytosquelette de chaque cellule agit indépendamment et réalise une force de traction sur la matrice avec adhésion intercellulaire transitoire • Migration et invasion cellulaire collective : maintien de la cohésion cellulaire lors de la migration. Rôle du cytosquelette (protrusion, et contractilité) des cellules, ensemble. Importance des molécules d’adhésion cellulaire++ • Autres types de migration multicellulaire : – Processus expansif • Passif • Changement de positionnement des cellules : prolifération cellulaire et re-positionnement des cellules filles • Expansion du front d’invasion Transition épithéliomésenchymateuse : TEM TEM : Généralités • Processus physiologique au cours de l’embryogenèse ou de la cicatrisation tissulaire Réversible Sabbah et al, Drug Resistance updates,2008 Migration des cellules TEM : cancérogenèse • Réactivation de la TEM dans les processus métastatiques (acquisition de propriétés invasives et migratoires) Thierry JP et al, Nature Review,2006 TEM : inducteurs multiples Biomarqueurs de la TEM et Cancers humains Induction du phénomène de TEM est responsable des chimiorésistances (Ghoul et al, Cancer Research, 2009) Avancées thérapeutiques Pourquoi vouloir étudier la TEM dans les CCs intrahépatiques ? Généralités : CCs intrahépatiques (IH) Cc périphérique • 2ème cancer primitif du foie (10 à 15%) • Tumeurs malignes développées au dépend de la cellule épithéliale biliaire – CCs intrahépatiques se divisent en : Cc hilaire TEM et CCIH : arguments cliniques • Tumeurs à caractère hautement invasif et métastatique • Survie< 5% à 5 ans – Diagnostic tardif (métastatique) – Faible chimiosensibilité TEM et CCIH : arguments morphologiques • CCs périphériques : – Nodules satellites – stroma tumoral très abondant – Emboles tumoraux endovasculaires • CCs hilaires – Cellules tumorales indépendantes – Engainements périnerveux – Lymphophiles+++ TEM et CCIH : arguments phénotypiques Lyse du tissu tumoral Analyse du phénotype de 52 CCs hilaires, 59 CCs periphériques, 12 HCCs, 11 CCs VBEH et 6 CHC Extraction des proteines totales Marquage des proteines par un fluorophore différent Incubation avec la puce à anticorps 11 Tissue MicroArray (40 marqueurs étudiés) 3 paires de CCs sur Protein Array (>100 AC étudiés) Surexpression du VEGF A dans les CCIH 80 70 p = 0.02 CC périphérique 60 50 40 VEGF A- 30 VEGF A + 20 10 0 Hilaire Périphérique Acquisition d’un phénotype mésenchymateux • CCs périphériques 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 CK 8 + - vimentine CK8 vimentine E-cadherin cytoplasmique CK8 et vimentine Molecular markers expression in percentage (mean ± DS) Presence of vascular invasion Absence of vascular invasion p (n=42) (n=13) CK8 63 ± 37 80 ± 31 Presence of lymph node metastasis (n=15) Absence of lymph node metastasis (n=31) CK19 86 ± 28 98 ± 12 <0.001 Ep-Cam 4±7 23 ± 29 0.043 0.06 Expression « de Novo » de la Filamine A sur Tissue MicroArray et Protein Array 100 p<0.001 80 60 40 20 0 hilaire filamine - périphérique filamine + Filamine A : facteur pronostique Fonctions de survie Filamin>m=1 1,0 0 1 0-censuré 1-censuré Survie cumulée 0,8 0,6 0,4 0,2 Survie actuarielle des patients opérés pour un CC périphérique (n=57) 0,0 0,00 10,00 20,00 30,00 survie limitée à 40 mois 40,00 Filamine A : protéine du cytosquelette qui se fixe à filaments d’actine et qui participent aux modifications de conformation de la cellule Puces à anticorps et identification de la filamine A • Filamine A : – Protéine d’échafaudage – Protéine liant les filaments non musculaire lisse d’actine – Rôle dans la régulation dynamique de la morphologie et de la motilité cellulaire – Implication dans la dissémination métastatique de cellules tumorales malignes (régulation de récepteurs de facteur de croissance) Filamine A Zhou et al, Trends in Cell Biology, 2010 Rôle de la Filamine A dans la carcinogenèse biliaire • Expression de « novo » de la Filamine A dans les CC-IH • Facteur pronostique • Filamine A participe à l’agressivité et à la progression tumorale des CC-IH • Perspectives de recherche: – Mécanismes? – Rôle du VEGF? 2ème etape : etude sur un modèle cellulaire de CC humains du rôle de VEGF A et Filamine A VEGF A ? Filamine A? Phénotype épithélial Phénotype mésenchymateux Etude du rôle de la filamine A dans une lignée cellulaire de CC • Moduler l’expression de la filamine A par si RNA – Etudier les effets sur la dispersion des cellules, l’expression des molécules des jonctions cellulaires, migration et invasion des cellules SKCha1 Fil 280 kd 42 kd 21 kd Filamine A VEGF VEGFR2 VEGFR1 VEGFC VEGFB VEGFA FLNA MzCha2 MzCha1 A1 A2 SK T1 ACTA2 PDGFRB épithélial) TGFB1 • Valider l’hypothèse que la filamine A participe à la progression tumorale • MzChA1 (phénotype 5,0 4,5 4,0 3,5 3,0 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 0,0 Caractérisation 3 lignées d’un point de vue morphologique et phénotypique • Morphologique – Microscopie optique : aspect des cellules, polarité des cellules, espace intercellulaire, • Phénotypique – Immunofluorescence : localisation E-cadhérine, B-caténine, ZO-1 B-cat E-cadh Yang et al, Cancer Res 2006 VEGF (ng/µl) 15 25 50 • MzChA1 • Etudier la régulation de l’expression des transcrits et protéique de la filamine A sous l’effet du VEGF • Etudier la régulation de la voie de signalisation du VEGF et de son récepteur dans les cellules invalidées pour la filamine A contrôle Etude de la régulation de la filamine A par le VEGF Filamine A IKKα F L MN/IK K 3,50 2,94 3,00 3,09 2,50 2,00 2,11 1,70 F L MN/IK K 1,50 1,00 0,50 0,00 c ontrôle 15ng/µl 25ng/µl 50ng/µl