Réponses induites par les virus chez les poissons téléostéens: de la

Réponses induites par les virus
chez les poissons téléostéens:
de la sécrétion d'interféron aux
modifications des répertoires
immunitaires
Pierre Boudinot, Abdenour Benmansour
Nécessité et diversité des
systèmes de défense chez les
métazoaires
Diversité des métazoaires et des agents
pathogènes
 Diversité des stratégies de défense

(plasticité évolutive, diversité de
reconnaissance, ressources génétiques,
plan d’organisation, écologie)
Le système immunitaire des
Vertébrés: un système de défense
conservé
Unité évolutive des acteurs de la réponse
spécifique de l’Ag chez les Vertébrés:
(lymphocytes, TCR, Ig, RAG, MHC,
Cytokines)

-> idée d’un système immunitaire conservé,
apparu chez les ancêtres des Vertébrés avec le
système de réarrangements V(D)J et décliné dans
les différentes classes selon les contraintes et
aléas de leurs évolutions respectives Etude de la réponse à un pathogène
viral des Salmonidés, le VSHV



Le Virus de la septicémie hémorragique virale: un
novirhabdovirus
Virus responsable d’une maladie à déclaration
obligatoire, à impact économique significatif
Virus bien connu,
séquencé,
réactifs
disponibles
Caractérisation de la réponse innée
antivirale de la truite arc-en-ciel
Approche:
identification des transcrits induits ou réprimés
Stratégie:
méthodes différentielles « globales »
• mRNA differential display
• Suppression Subtraction Hybridization
• EST based micro arrays (10000 seq)
Vig1 : un gène modèle •Transcrit identifié par DD-PCR
•Gène induit par les glycoprotéines virales
et par les IFN de type I
•Protéine de 348 aa, cytoplasmique,
motif MoaA (famille SAM)
•Séquence très conservée des poissons à l’homme,
•Induction restreinte aux DC chez la souris
•Activité antivirale de la protéine homologue humaine
(« Viperin »)
Viperin (Virus Inhibitory Protein, Endoplasmic Reticulumassociated, INterferon-inducible )
K.-C. Chin and P. Cresswell Inaugural Article: Viperin (cig5), an IFN-inducible
antiviral protein directly induced by human cytomegalovirus PNAS,
December 18, 2001; 98(26): 15125 - 15130.


Protéine induite par les IFN et la gB du HCMV
L’expression stable en fibroblastes inhibe la
réplication du HCMV, et la production de gB,
pp28, and pp65, protéines structurales
essentielles
Banques SSH
BANQUE 1
leucocytes +/- VSHV
• 20 transcrits viro-induits
• 11 gènes caractérisés
BANQUE 2 et 3
fibroblastes +/- VNHI ou polyIC
• 100 transcrits viro-induits environ
• dont 40 gènes connus
La réponse des leucocytes est
dominée par les gènes induits par l’IFN
Clone
Similarité la plus élevée
Espèce
probabilité, % d’homologie
x/y acides aminés
ubiquitin-like protein
retinoic acid- and interferon-inducible
protein (58kD)
transmembrane protein 7
28kD interferon alpha responsive protein
Transmembrane protein
Carassius auratus
Homo sapiens
2e-39, 55 % 86/156
3e-34, 31 % 106/335
Homo sapiens
Mus musculus
Mus musculus
4e-22, 35% 58/164
2e-17, 30% 50/163
5e-44, 41% 99/238
LFCA-1 protein
platelet basic protein
galectin like protein
Lampetra fluviatilis
Sus scrofa
Oncorhynchus mykiss
1e-11, 36% 33/90
8e-12, 47% 36/76
4e-63, 47 % 122/259
Homo sapiens
Mus musculus
7e-37, 40% 75/183
2e-42, 85% 82/96
Homo sapiens
Homo sapiens
2e-59, 45% 124/273
8e-85, 47% 164/348
Interferon responsive genes
A29
B6
B17
B126
Chemo-attractants
A14 (CXC1)
B68 (CXC2)
A83
Subcellular compartments
B32
B51
TRIM like protein
coatomer
Nucleic acid binding protein
B12
B203
Unamed protein product
KIAA1769 protein
Filtres « haute densité » d’ESTs
de truite arc-en-ciel
• FISH-AGENAE :
• séquençage d’une banque multi-tissus
d’ESTs de truite
• production de micro membranes
« génériques » à 10 000 séquences
• Double objectif de leur utilisation:
• validation croisée des résultats de SSH
• identification de nouveaux transcrits viro
induits (en cours)
Partie 1:
conclusions
1. L’interféron orchestre la réponse non spécifique
viro-induite des leucocytes de truite arc-en-ciel
2. Le système interféron des poissons fait appel à
de nombreux gènes très conservés chez les
vertébrés, mais aussi à des gènes clairement
divergents.
3. Intérêts de la caractérisation fonctionnelle des
gènes viro induits de poissons.
Approche « globale » et systématique
•
Tentative d’inventaire systématique dans différents
contextes, grâce à des méthodes « globales »
•
Etudes fonctionnelles semi-systématiques par
profil complémentaire d’expression
•
Identification et étude fonctionnelle des
gènes homologues chez le zebrafish
chaque fois que c’est pertinent
•
Réalisation d’un filtre dédié « réponse antivirale »
chez la truite
Approche «gène candidat » sur des gènes
d’intérêt particulier: exemple de TRIM_B32
• B32 appartient à la famille TRIM
BLAST:
tripartite motif protein TRIM5 isoform alpha; [Homo sapiens]
Score = 66.2 bits (160), Expect = 4e-10, Identities = 44/135 (32%), Positives = 75/135 (55%), Gaps = 10/135 (7%)
• Famille des TRIM:
o très nbx membres
o 3 motifs + région variable
o différents membres ont une
activité antivirale comme TRIM5a ,
et pml
TRIM_B32 , gène induit par le vSHV :
quelles fonctions ?
-> la réplication des rhabdovirus utilise cette famille de protéines.
( présence de corps cellulaires denses dans les cellules infectées par
les rhabdovirus )
-> cette protéine participe du système de défense. TRIM 19 ou PML
semble influer sur la réplication du VSV et du virus de la rage.
Premiers résultats :
-> 3 transcrits
chez la truite
-> extraordinaire diversité de gènes homologues très similaires
chez le zebrafish
Etude de la réponse cellulaire spécifique
anti-VSHV de la truite arc-en-ciel
Les poissons ont ils des lymphocytes T
classiques?
•Gènes du TCR α et β chez différentes espèces
•Diversité du TCR par réarrangements V(D)J
•MHC polymorphe , classe I et II
•CD8, système d’apprêtage des peptides
•Cellules T impliquées dans des réponses
allogéniques in vitro
•Rejet de greffes d’écailles
Le répertoire TCRβ comme clé de la
biologie des lymphocytes T
• Répertoire disponible : réponses publique
« when an antigen
confronts
the immune
system,
et privées
contre
le vSHV
•
•
it impinges upon a repertoire of available
lymphocytes(...)We must distinguish between
the potential potentiel
repertoire :ofnouveaux
specificities
Répertoire
Vb et
that could arise given the genetic constitution
réponse anti vSHV
of the zygote from which the animal develops,
and the available repertoire embodied in the cells
that can respond
to antigens at aanatomique
given moment :
Diversité
« géographique »
in the life of the animal »
diversité des lELs et réponse
Nils antivirale
Jerne, 1974
Immunoscope
Vβ
CDR3
Cβ
run-off Cβ
Vβ4-Cβ
run-off Jβ
Vβ4-Jβ5
Vβ4-Jβ1
Premier modèle d’étude :
infection avec un vSHV atténué
• Température: 16°C
• Injection intramusculaire de 5 105 puis 10 106 pfu
J1= injection#1
J21= injection#2
J36= étude du répertoire
• Etude du répertoire splénique
• Utilisation de clones hétérozygotes de truite
(gynogenèses croisées)
Des réponses T publiques et privées
Des expansions drastiques de
jonctions Vβ4Jβ1
Truite#3
AA
Truite#1
/ CDR3 / nb de cl.
AASSGDSY
AA / CDR3 / nb de cl.
AASSGDSY SEA 8 10
AASIFRAY
SEA
8
1
AASSSY
AVNRGH
AAKTGIY
AASISSY
AASIRQGGY
AARIGQGRY
AVTRQGGSY
AARIIGQGAD
SEA
SEA
SEA
SEA
SEA
SEA
SEA
SEA
6
6
7
7
9
9
9
10
1
1
1
1
1
1
1
1
AASIGTY
AVRQGRY
AASSGNSY
AASMEGAKSY
AASTGNPPPY
AASILGGLSY
AASILIEGVRDR
SEA
SEA
SEA
SEA
SEA
SEA
SEA
SEA
8 13
7
7
7
10
10
10
13
1
1
1
1
1
1
1
Quelle est la cible de la réponse
T anti vSHV?
Second modèle : vaccination ADN / G vSHV
• G_VHSV clonée dans PcDNA1
• 3 injections 50µg pl. ( 1, 7, 14)
100% séroconversion et
protection
=>
Profils immunoscope (V4J1) après vaccinatio
ADN anti g-vSHV
pcDNA-gVHSV
Trout #1
Trout #2
pcDNA
pcDNA-nVHSV
Trout #3
day21
6 789
Trout #4
6 789
Trout #5
67 89
Trout #6
day52
6 789
8aa
6aa
6 78 9
67 8 9
6 78 9
Tableau synthétique des jonctions Vβ4Jβ1
amplifiées en réponse à la G du vSHV
Rainbow trout Clone EQ#2 V4-J1 junction
Nb / total
Attenuated virus (1, 27)
Analysis day 41 and 47
AASSGDSY
10/12;13/13
pCDNA1_gVHS (1, 7, 14)
Analysis day 52
AASSGDSY
AASNRDSY
AASPGQGN
7/17;0/11
0/17;2/11
0/17;3/11
pCDNA1_gVHS (1, 7, 14)
Challenge day 110
Analysis day 125
AASTGDSY
AVGTGDSY
AARDRGPY
AAMTGDSY
6/14;0/12
0/14;5/12
3/14;0/12
0/14;3/12
AASSGDSY
Recombinant virus
rvIHN_gVHS (1, 27)
Rainbow
Analysis
daytrout
50 Fish farm V4-J1 junction
Attenuated virus 25_111
Challenge day
27
Recombinant
virus
rvIHN_gIHN
Analysis day(1,4027)
Analysis day 50
AARDRGPY
AASIEGRR
AASGGISY
6/8;0/3
Nb / total
6/14
3/14
3/4;0/3
La truite arc en ciel possède des IELs
Blood
IELs
Anti-µ Ab
Le répertoire des IELs est polyclonal
et extrêmement divers, contrairement à celui
Des IELs humaines et murines
Vβ4-Jβ2.1
(from Regnault et al.
Vβ8.1-Jβ2.2 J Exp Med
180 1345 1994)
Vβ13-Jβ1.2
Etude des mécanismes d’activation T chez les poissons :
co-stimulation et signaux (I)
• Clonage de CD28 et CTLA4 chez la truite
• Régions extracellulaires conservées, régions
intracytoplasmiques divergentes:
• CD28 est retrouvé chez toutes les espèces de poissons
étudiées, pas CTLA4; pas d’ICOS chez les poissons
• profil d’expression tissulaire et temporel typiques
•Gènes situés sur deux chromosomes différents
tCTLA4 est il l’homologue fonctionnel de CTLA4 ?
Etude des mécanismes d’activation T
chez les poissons :
co-stimulation et signaux (II)
• Obtention de clones Jurkat exprimant des
récepteurs chimériques hCD28/ tCD28 ou tCTLA4
•Premiers résultats:
le récepteur chimère hCD28/t CD28
induit la P de erk
⇒ poursuite de la caractérisation du signal transduit
via ces récepteurs (tB7, différentes voies, ..)
Collaboration: John Hansen, Seattle USGS,
Ruth Philips ,Vancouver
Béatrice Riteau, INRA VIM
Frédérique Michel, IP
Conclusions
• le répertoire T splénique est polyclonal
• le virus induit des réponses publiques et privées
• la réponse publique est dirigée contre la G ,
cible de la réponse Ac protectrice
• la réponse publique elle-même est diverse et complexe
• six nouveaux segments Vβ fonctionnels
• les IELs de truite présentent un répertoire divers,
au lieu de celui, oligoclonal des mammifères et les IELs
répondent comme les splénocytes à une
infection virale systémique
• la truite possède des costimulateurs de la famille CD28/CTLA4
Quel est l’intérêt général de ces approches
d’immunologie comparée?
Les poissons peuvent-ils aider à comprendre
les mécanismes évolutifs des systèmes de défense?
Contraintes évolutives = contraintes internes (génome, programme de
développement)
= contraintes externes (environnement physique)
= pressions de sélection
Systèmes de défense des vertébrés = bien connus chez différents Mam.
éléments de base conservés
Poissons téléostéens = alternative évolutive (et non « primitive »)
• 4 génomes complets
• physiologie poïkilotherme
• milieu aquatique
• importante radiation adaptative
Opportunité unique pour observer un répertoire de variations sur ce
thème dans un contexte radicalement différent, et de tirer des
enseignements généraux de la comparaison avec les mammifères
Equipe immunité et infections
des Poissons, VIM, IN
Abdenour Benmansour
Jean-François Bernardet
Stefan Chilmonzchic
Eric Duchaud
Pierre de Kinkelin
Christian Michel
Danièle Monge
Anne-Françoise Monnier
Brigitte Kérouault
Collaborations
Bénédicte Loriot
Corinne Thory
Adrien Six, Alexis Collette et Pierre André Cazenave , Institut pasteur
Monique Cantonnet
Catherine Bouchenot
Sabine Riffault et Bernard Charley, VIM
Mar Blanco
Caroline O’Farrell
Samia Salhi
Nikta Vaghefi
Samira Boubekeur
Pascale Massin
David Bernard
Guillaume Vignon
Bertrand Collet, Aberdeen
Georges Lutfalla, Montpellier
Marie-Paule Lefranc, Montpellier
Jean Pierre Levrault et Philippe Herbomel
Institut Pasteur
John Hansen, Seattle
Frédérique Michel, Institut Pasteur
Béatrice Riteau, VIM
Louis du Pasquier, Bâ
Bâle