Transfert d`un phénotype d`un organisme à un autre
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Transfert d’un phénotype d’un organisme à un autre Introduction On veut introduire un plasmide contenant la séquence d’ADN codant pour la protéine GFP dans des bactéries pour qu’elles acquièrent les caractéristiques de fluorescence de la GFP. Extraction et modification du plasmide Extraction du plasmide de la bactérie 1 : ADN Génomique Insertion des gènes codant pour la fluorescence (GFP) et pour la résistance à la kanamycine 2 : Plasmides GFP On le plasmide contenant une part Onextrait insère dans le plasmides la séquence de l’ADN de la bactérie. Il est utilisé d’ADN codant pour la protéine GFP et celle comme car ilà est codantoutil pourgénétique la résistance la Kanamycine. facilement manipulable. La kanamycine sera ajoutée au milieu de culture des bactéries afin de tuer toutes celle qui n’ont pas intégré le plasmide et ne sont donc pas résistantes à celle-ci Gène de résistance à la Kanamycine Obtention de bactéries compétentes Ajout des plasmides Bactéries contenant le On rajoute ensuite du milieu LB puis on fait incuber plasmide modifié Bain Marie les bactéries à 37° pendant 30 minutes afin de les laisser proliférer. CaCl2 Bactéries 42° Le CaCl2 crée des pores dans la paroi des bactéries afin d’y laisser pénétrer les plasmides. On crée un choc thermique pour refermer les pores de la paroi Etalement des bactéries On étale les bactéries obtenues précédemment sur un milieu LB contenant de la kanamycine. La kanamycine détruira toutes les bactéries n’ayant pas le plasmide résistant à l’antibiotique et donc pas la GFP. Cela permet donc de ne sélectionner que les bactéries ayant intégré le plasmide contenant l’ADN qui code pour la GFP. Milieu LB Bactéries Témoin Contenant Ampiciline Contenant Kanamycine Contenant le plasmide codant pour la GFP et résistante à la kanamycine. Sans plasmide et résistante à la kanamycine. Contenant un plasmide non modifié On laisse incuber les bactéries durant la nuit. Les Ces bactéries résultats qui nesont se concordent sont pasbactéries avec les résultats que le attendus, plasmide ilsà peuvent bien été provenir intégré par d’une les L’ampiciline Les L’ampiciline bactéries aadétruit se détruit toutes développées les développées bactéries les comme carprouvent elles on carl’attendait, ne elles possédaient ne possèdent elle aucune sont pas bien résistance de résistantes résistance à un àà la cet bactéries résistance car naturelle celles-cià ont l’antibiotique résisté à l’antibiotique. ou d’un antibiotique défaillant, voire d’une erreur de antibiotique. kanamycine. antibiotique. manipulation. Récupération des plasmides Pour s’assurer de la présence des plasmides contenant l’ADN codant pour la GFP, on tente de les récupérer à l’intérieur des bactéries. On lyse les bactéries de façon à récupérer les plasmides. Puis, après plusieurs réactions enzymatiques, on récupère la section du plasmide codant pour la GFP. Action des enzymes… … qui isolent la section d’ADN codant pour la GFP. Afin de vérifier que la section d’ADN récupérée est bien celle codant pour la GFP, on coule ensuite un gel d’agarose dans lequel on compare la migration des plasmides avec celle d’un marqueur sous une lampe UV. Bande correspon dante au plasmide Marqueur Bande correspon dante à la section codant pour la GFP Réalisé par : - HELICK Julien -TANI Emilie - GRARD Jérôme - BOTZANOWSKI Thomas - CERAULO Hugo
