Technologie de l`ADN Recombinant CHMI 4226 F

Boiningénierie de l’ADN
CHMI 3216 E
Semaine du 14 Septembre 2007
Boîte à outils, 2ième partie.
Plasmides, clonage d’ADN 101
E.R. Gauthier, Ph.D.
CHMI 3216 F – A2009
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Plasmides
• Plasmides:
– Molécules d’ADN circulaires extrachromosomales
– Caractéristiques de base:
• Origine de réplication: permet au plasmide de se répliquer
de manière autonome;
• Gène de résistance à un antibiotique: permet la sélection
de bactéries possédant le plasmide;
• Site de clonage multiple (multiple cloning site -MCS): une
petite région du plasmide crée en laboratoire et contenant un
certain nombre de sites de coupure uniques pour des
enzymes de restrictions.
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Plasmides – origine de réplication
•
Origine de réplication (Ori): courte séquence d’ADN permettant à l’ADN
polymérase bactérienne de lier et initier la réplication du plasmide;
•
Il existe plusieurs types d’Ori. ColE1 celui rencontré le plus souvent;
•
Certaines Ori permettent au plasmide de se répliquer fréquemment
(plasmides à nombre de copies élevées – jusqu’à 100 copies par
bactérie); d’autres Ori ne permettent qu’un taux relativement faible
d’initiation de la réplication (plasmides à nombre de copies faible–
seulement quelques copies de plasmide par bactérie);
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Plasmides – gènes de sélection
• Gènes codant des protéines permettant la résistance bactérienne à
un antibiotique particulier;
• Gènes le plus souvent rencontrés:
– Ampr: résistance à l’ampicilline
– Kanr: résistance à la kanamycine
– Tetr: résistance à la tétracycline
• Les bactéries possédant un plasmide ayant le gène Ampr seront
capable de survivre lorsque cultivées dans un milieu de culture
contenant de l’ampicilline;
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Plasmides – sites de clonage
multiples
• MCS: une région limitée du plasmide crée artificiellement
et qui possède plusieurs sites de coupure uniques pour
un ensemble d’enzymes de restriction;
• Les sites de restriction retrouvés dans le MCS ne sont
pas retrouvés ailleurs dans le plasmide en question.
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Plasmides – autres caractéristiques
• Promoteurs pour les ARN polymérases virales Sp6, T7 or T3
– Permet de faire des expériences de transcription in-vitro;
• Origine de réplication du phage F1:
– Permet la préparation de plasmides simple-brin;
• Gènes codant pour des ARNt suppresseurs
• Gènes indicateurs (reporter genes):
– Permettent l’identification rapide et simple de colonies bactériennes
possédant des propriétés particulières;
– P.ex..: Lac z (code la b-galactosidase);
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Plasmides – Gène de sélection
SupF
• SupF:
– ARNt suppresseur
– Insère l’ acide aminé Glu
au codon stop UAA;
– Permet la survie de
bactéries possédant un
épisome (plasmide naturel)
P3: l’épisome P3 possède
les gènes de résistance
Ampr et Tetr interrompus
parle codon stop UAA.
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Plasmides – pBR322
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Plasmides - pBluescript
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Plasmides – vecteurs navette
• Les vecteurs navette
peuvent être utilisés
dans au moins deux
organismes vivants
différents:
–
–
–
–
–
Bactéries (obligatoire)
Levures
Insectes
Plantes
Mammifères
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Plasmides – Vecteurs navette
• Vecteur navette pour
bactérie/levures;
• Leu2:
– Gène de sélection pur la
croissance chez la levure;
– Code pour un gène
permettant la synthèse de
l’acide aminé Leu dans des
cellules de levures
incapables de produire la
Leu par elles-mêmes
(auxotrophe);
– Les levures possédant ce
vecteur pourront croître
dans un milieu de culture
ne contenant pas la Leu.
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Clonage d’ADN
• Pourquoi cloner l’ADN?
– Obtenir de grandes quantités
– Caractériser les propriétés spécifiques à un ADN
particulier:
• Séquence
• Mutagenèse
– Pour exprimer une protéine spécifique in vitro ou
dans une organisme vivant:
• P. ex: production d’insuline recombinante: mieux que
l’insuline purifiée du sang, qui peut être contaminée par des
virus (hépatite, HIV) ou autres belles petites choses (prions);
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Clonage d’ADN – Étapes de base
• 1. Coupe l’ADN d’intérêt et le plasmide avec un enzyme de
restriction approprié;
• 2. Mélange les deux ensemble et soude les bouts libres avec l’ADN
ligase (ligation)
• 3. Insère l’ADN/plasmide (plasmide recombinant) dans des
bactéries (transformation)
– Requiert l’utilisation de bactéries compétentes.
• 4. Sélection des bactéries résistante à un antibiotique et recherche
des bactéries possédant le fragment inséré dans le plasmide.
• 5. Confirmation du clonage
– Digestion par enzyme(s) de restriction
– Séquençage
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Clonage d’ADN – Étapes de base
Étape 1
Étape
2
Étape 3
Étape
4
http://www.accessexcellence.org/RC/VL/GG/plasmid.html
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Clonage d’ADN
• Traitement du vecteur à la phosphatase alcaline:
– Permet de réduire le bruit de fond (background) de bactéries possédant
le plasmide n’ayant pas incorporé le fragment d’intérêt.
• Des bouts francs peuvent être utilisés pour le clonage (un rapport
fragment d’DNA/plasmide devra être plus élevé: 10/1 au lieu de 3/1)
• Les bouts de l’ADN d’intérêt peuvent être modifiés par la Klenow
afin d’accommoder les sites de restriction disponibles sur le vecteur
(et vice-versa).
• L’utilisation d’adaptateurs et linkers peut faciliter grandement le
clonage.
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Adaptateurs et linkers
Adaptateurs
Linkers
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Devoir #2
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