Ecole - Département de Physique

Détection optique de biomolécules uniques
Maxime Dahan
Laboratoire Kastler Brossel
Département de physique
Ecole normale supérieure
Présentation générale
• Microscopie de fluorescence
• description simple d’un système fluorescent
• sondes fluorescentes : colorants, GFP, nanocristaux
•Détecter une molécule unique
• Rapport signal sur bruit, bruit de photon,…
• Approches expérimentales
•Applications en biophysique
• Résolution vs localisation : mouvement de la myosin V,
microscopie ultrarésolution
• « Motility assays »: myosine/actine, kinesine/microtubule,
protéine/ADN
• Mesure en polarisation: dynamique rotationelle de F1-ATPase
• Relation Conformation/Dynamique : approche par transfert
d’énergie de Forster et par transfert électronique – étude du
répliement des protéines
• Suivi de molécules uniques en cellules vivantes : diffusion
membranaire, expression genique
Motivations :
« aller au-delà des valeurs moyennes »
• fluctuations statistiques :
En analysant molécule par molécule, on peut identifier et
analyser les inhomogénéités dans l’échantillon
Motivations (2) :
pour analyser des processus stochastiques
• fluctuations dynamiques :
k
k
En mesurant l’état d’une molécule au cours du temps, on
peut déterminer les constantes cinétiques qui gouvernent
son évolution, même si on est à l’équilibre
k
k
Nombre d'évenements
t
120
120
100
100
80
80
1
60
40
1
60
k
40
20
k
20
0
0
0
5
10
15
20
0
5
durée
Mesure d’ensemble :
10
durée
k
pV 
k  k
15
20
(cf. JFA – cours n°2)
Historique
Canaux ioniques
Neher et Sackmann (1976) [Prix Nobel 1991]
Mesures optiques
• détection optique d’une molécule unique
– mesure à basse température (1989)
– mesure à température ambiante (1992-1994)
•premières expériences sur des biomolécules in vitro :
– activité enzymatique d’une cholestérol oxydase (1998)
– conformation de petites molécules d’ADN et ARN (1999)
– activité d’une exonucléase (1999)
• premières expériences in vivo:
– suivi de l’entrée d’un adéno-virus (2001)
– diffusion latérale de canaux calciques (2001)
– organisation membranaire de récepteurs dans des amibes
Dictyostelium discoideum (2001)
Microscopie de fluorescence
Fluorescence
Lorsqu’ils sont dans un niveau excité, certains
systèmes (atomes, molécules, cristaux,…) peuvent se
désexciter en émettant des photons.
excitation
La longueur d’onde d’émission est (souvent) plus grande que plus celle
d’absorption et il est possible de sélectionner spectralement la
lumière émise → microscopie de fluorescence
Microscopie de fluorescence
Il s’agit donc d’une détection sur fond noir
Voir des biomolécules en fluorescence
• En général, les molécules biologiques (protéines, acides
nucléiques,…) ne sont pas fluorescentes dans le visible (quelques
exceptions: flavines, NADH, GFP,…). Certains acides aminés ont
néanmoins des propriétés de fluorescence dans l’UV (tryptophane).
• On attache spécifiquement des marqueurs fluorescents :
 couplage covalent (liaison chimique)
 marquage d’affinité: on utilise une molécule fluorescente
qui vient s’attacher spécifiquement (anticorps, toxines,…)
 clonage d’une protéine fluorescente
Modèle d’un système fluorescent
à deux niveaux
Description d’un système fluorescent à 2 niveaux
|e>
k exc
k des
La molécule peut se désexciter de
deux manières différentes : en
émettant un photon ou non
radiativement.
|g>
kdes  kr  knr
kr 
1
 est la section efficace d’absorption
T fluo
kexc  

hc
Tfluo est la durée de vie radiative
I
 est le coefficient d’extinction  (cm 2 ) 
2303
NA
Taux de fluorescence G
dPe
  k des Pe  k exc Pg
dt
Pe  Pg  1
Solution à l’état stationnaire:
I Is
G  kr Pe 
T fluo 1  I I s
1
I s  knr  kr 
hc

(intensité de saturation )
Fluorescence (a.u.)
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
0
1
2
Intensité
3
4
Cas limites
A faible intensité, régime linéaire :
Pour I  I s , G  Q
Fluorescence (a.u.)
0,8
0,6
Q
0,4
0,2
kr
k r  k nr

hc
I
Efficacité quantique
radiative
probabilité qu’un photon absorbé soit réémis
0,0
0
1
2
3
4
Intensité
A forte intensité, régime saturée :
Pour I  I s , G  kdes 
1
T fluo
Pour gagner en signal sur bruit, on essaie toujours d’avoir I << Is
Etude résolue en temps
Si on excite avec un laser pulsé (à la fréquence 1/Trep):
signal (a.u.)
1
Si on connaît :
1

k r  k nr
0,1
e  ( k nr  k r ) t
0,01
0
20
40
time (ns)
60
kr
Q
k r  k nr
80
On peut déterminer kr et knr
Marqueurs fluorescents:
molécules, protéines, nanocristaux
Fluorophores organiques
Diagramme de Jablonski
système à trois niveaux
On prend en compte l’état triplet
hc k fl  k ISC
Is 
 1  k ISC kT
Green fluorescent protein
Découverte en 1961 dans la méduse Aequorea Victoria, clonée en 1992
Absorption
Fluorescence
Autres mutants/ Autres couleurs :
R. Tsien, FEBS Lett. 2005
Aussi, des mutants:
• photoactivables,
• dont l’émission change dans le temps
• sensibles au calcium
• indicateurs de la phosphorylation
…
Nanocristaux semiconducteurs
ZnS
2-5 nm
CdSe
Nanoparticules composées de 100 à
100000 atomes of CdSe recouverts par
une coquille de ZnS
Des boites quantiques de quelques nanomètres
Quels sont les niveaux d’énergie des électrons ?
Une particule dans une boite à 1 D :
Fonctions propres:
n(x) 2 sin( nx)
L
L
V(x)
Energies propres:
0
L
En 2²m² Ln²²
(en fait la boite est tridimensionnelle…)
Emission et absorption ajustable avec la
taille des nanoparticules
L
(AU)
L
2
1,8
1,6
1,4
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
absorption
5.0 nm
CdSe
2.2 nm
CdSe
350
450
550
650
Wavelength (nm)
Plus les particules sont petites, plus l’emission est décalée vers
les courtes longueurs d’onde (grandes énergies)
Semiconductor Quantum Dots
Spécificités spectrales et photophysique des
nanocristaux par rapport à des émetteurs organiques
Nanocristal
Colorant
taille
Longueur d’onde
Excitation
• emission etroite (quasi-atomique)
• absorption large (solide)
• photostabilité
Détection de molécules
fluorescentes uniques
Problème de détection:
quel est le rapport signal sur bruit ?
•
Signal S de fluorescence (d’une seule molécule)
•
Bruit B de variance de moyenne mB et de variance B:
S
B
 1
Sources de bruit
•Fluctuations intrinsèques (bruit de photon / shot noise)
•Signal optique parasite (autofluorescence, lumière
diffusée,…)
proportionnel à l’intensité lumineuse I
•Bruit électronique (courant d’obscurité, bruit de
lecture,…)
indépendant de l’intensité lumineuse
Btotal  B photon B par Belec
les processus sont indépendan ts :

2
total

2
photon

2
par

2
elec
Bruit de Photon
et Processus de Poisson
On considère un flux où des particules (des photons) arrivent avec un
taux k sur un détecteur (une photodiode). On fait l’hypothèse que ce
qui se passe entre t et (t+dt) est indépendant de ce qui se passe
entre 0 et t (processus de Markov).
Prob( N (t , t  dt )  0)  1  kdt  o(dt )
Prob( N (t , t  dt )  1)  kdt  o(dt )
Prob( N (t , t  dt )  1)  o(dt )
Quel est la distribution du temps d’attente du premier evènement ?
Quelle est la probabilité P qu’on ne détecte rien entre 0 et t ?
(t )  e
 kt
Quelle est la probabilité de détecter n photons durant le temps t ?
P ( N  n)  e
 kt
kt 
n
n!
(distribution de Poisson)
Distribution de Poisson
n


kt
P (n  N )  e kt
n!
n   nP (n)  
Valeur moyenne :
Variance :
  n  n
2

2
n


kt
ne  kt
 n  kt
n!
 kt
Bruit d’origine lumineuse
• Bruit de photons des molécules (non saturées):
S  It
 S2  It
• Bruit dû à la lumière parasite :
N par  It
 2par  It
Sources de bruit électronique
Lumière
incidente
lecture
Crée des
photolélectrons
Nombre de
coups
• Courant d’obscurité : du à l’apparition de Nobs photoélectrons
à cause du bruit thermique (proportionnel au temps)
N obs  a 2 t
2
 obs
 N obs  a 2 t
• Bruit noir de lecture : dû au convertisseur analogue-digital
2
 lec
 b2
Rapport signal sur bruit
S
B
kIt

kIt  It  a 2 t  b 2
Fluorescence des molécules
Signal parasite (diffusé)
Bruit électronique
0,8
0,7
Cas limite du « shot noise »:
Signal (u.a.)
0,6
0,5
0,4
S
0,3
B
0,2
0,1
0,0
0
10
20
30
Intensité I
40
50
60
 kIt
Identifier un fluorophore unique
Fluorescence (u.a.)
Pour un fluorophore : photodestruction instantanée
(molécule de Cy3)
35
30
25
20
15
10
5
0
0
2
4
6
8
10
temps (s)
Possibilité de réduire le photobleaching avec des « oxygen scavengers »
Scintillement d’un nanocristal unique
Tableau comparatif
Taille
Photostabilité
Absorption
Stoechiometry
Cy3
1 nm
~5s
 = 105
++
GFP
2-4 nm
~ 10-100 ms
 = 104
+++
QD
10-30
nm
> 20 mn
 = 106
+/++
Bille
latex
100 nm
1 µm
∞
Diffusion
Contraste de phase
-
Approches expérimentales
Champ proche
Betzig (1992,1994)
Microscopie de champ lointain :
microscopie confocale
Mesure en diffusion
Chaque molécule qui traverse par diffusion
le volume de focalisation émet des photons
Veff = 1x1x1 µm3 = 1 fl
Détection de molécules uniques si :
C < 1 nM
Temps de diffusion:
40
35
t ~ L²/4D ~ 0.1-1 ms
30
Nbe de couts en 0.2 ms
(FCS: C = 5-10 nM)
25
20
Analyse des corrélations temporelles: FCS
15
10
5
0
0
500
1000
1500
temps (ms)
2000
2500
3000
Nie and Zare, Science (1994)
Microscopie en balayage
Laser
On déplace le point de focalisation sur
l’échantillon.
Objectif
Trou de filtrage
Photodiode, PM
Inconvénient : le temps
passé sur la molécule
est bref
Np
Nm
Taille de l’image : Np*Np pixels - Taille de la molécule : Nm*Nm pixels
Fraction du temps passée à exciter la molécule : F = (Nm/Np)²
Exemple : taille d’un pixel : 200 nm, Np = 100, Nm = 4, soit F = 0,16 %
Si durée totale de l’image : 100 ms (10 µs/pixel), cela correspond à 160 µs.
Microscopie en épifluorescence
On éclaire l’échantillon avec une
lumière collimatée. Pour cela,
on focalise la lumière dans le
plan focal arrière de l’objectif.
Lampe UV
ou
Laser
CCD Camera
Problème
Dans un échantillon épais, on collecte la lumière de tous les plans de l’échantillon
Excitation
Détection
profondeur
champ
Objet dans le
plan focal
Objet au
dessus du plan
focal
Objet en
dessous du
plan focal
Comment se débarasser de la lumière provenant des plans hors focus ?
Microscopie en onde évanescente
I ( z )  I 0e
z
1 4

d

d
Angle critique :
n1  1.5
et n2  1.0   c  41.8

41.8
50
60
65
n1  1.5
 c  arcsin( n2 / n1 )
et n2  1.33   c  62.5

62.5
65
70
75
d

84,4 nm
57,6 nm
51,8 nm
(  600 nm)
n12 sin 2 1  n22
d

170 nm
100 nm
83 nm
Il faut que l’objectif ait une
ouverture numérique supérieure à n2
 max  arcsin( NA / n1 )
pour NA  1.4 et n1  1.5
 max  69
Vérification expérimentale
Sarkar, Atom et al. (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101, 12882-12886
Détection de molécules uniques
dans structures nanofabriquées
Science 299, 682 (2002)
Veff = 20x50x50 nm3
= 5.10-20 litres
Détection de molécules uniques si : C < 30 µM
Permet de suivre l’activité enzymatique
(ex. séquencage de l’ADN en molécules uniques)