Bacs on Beads Hôpital Robert Debré
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DIAGNOSTIC PRENATAL RAPIDE PAR LA TECHNIQUE DES BACs-on-BEADS (BoBs): UTILISATION EN ROUTINE Unité fonctionnelle de Cytogénétique Hôpital Robert Debré (AP-HP) Paris Principe de la CGH array Marquage des ADN Analyse des rapports de fluorescence Cy3/Cy5 par un logiciel adapté ADN ADN patient témoin *Cy5 *Cy3 Lavage Puce 2500 clones (BAC) Cohybridation Lecture par scanner WolfHirschhorn WilliamsBeuren LangerGiedion MillerDieker 13 DiGeorge Prader-Willi / Angelman Cri du Chat 21 18 SmithMagenis X Y Quelle technologie utilise Prenatal BoBs? Prenatal BoBs ACs n ead BACs on Beads utilise le couplage de sondes d’ADN générées à partir de chromosomes bactériens artificiels (BACs) sélectionnés et amplifiés par PCR, sur les billes Luminex codées par fluorescence. 5 sondes BACs-on-Beads indépendantes sont inclus es pour les chromosomes 13, 18, 21, X et Y et 4 à 8 sondes sont incluses pour chaque région. J1 Marquage de l’ADN à la Biotine Random Primer Solution Biotin-dNTP Mix Polymerase Sample Diluent Biotine Purification de l’ADN Kit de purification Purelink INVITROGEN Colonne avec filtre Biotine Hybridation de l’ADN sur les billes Dénaturation 5 mn à 85°C Hybridation à 52°C à 1200 rpm 16 à 20H Sonde fixée sur les micro billes Biotine J2 Lavages Wash Buffer 1 Elimination de l’ADN non hybridé Filtre 0,45 µm en µplaque ADN marqué non-hybridé Révélation du signal Phycoérythrine Streptavidine Reporter Concentrate Reporter Diluent 37°C 1200 rpm Biotine Lavages Wash Buffer 2 Filtre 0,45 µm en µplaque Streptavidine non couplée Lectures des billes Lecture d’une plaque complète = 2h Lectures des billes Le laser vert identifie le signal de la phycoérythrine sur l’ADN Le laser rouge identifie le signal de la bille Profil féminin normal Profil masculin anormal Notre expérience à Robert Debré BACs on Beads utilise le couplage de sondes d’ADN générées à partir de chromosomes bactériens artificiels (BACs) sélectionnés et amplifiés par PCR, sur les billes Luminex codées par fluorescence. 5 sondes BACs-on-Beads indépendantes sont inclus es pour les chromosomes 13, 18, 21, X et Y et 4 à 8 sondes sont incluses pour chaque région. Nos résultats De avril 2011 à juillet 2012 Intérêts – Rendu de résultats rapide – Seulement ? ng d’ADN nécessaire soit 2mL de LA ou 1 petite villosité – Comparaison avec des références mâles et femelles – Jusqu’à 44 patients par plaque – Jusqu’à 100 sondes par puits dont 4 à 8 sondes par région étudiée – Screening plus large (dont contrôles sur quelques autosomes) Exemple d’une découverte d’une tétrasomie 12p chez un fœtus Exemple d’une découverte d’une délétion 7q11 (Sd de Williams) chez un fœtus présentant un RCIU à 34SA Inconvénients – Non détection des translocations équilibrées ? – Difficulté d’interprétation des triploïdies – Technique très manuelle – Technique coûteuse ? – Certaines microdel étudiées inutiles ? Exemple d’une triploïdie chez un fœtus
