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Projet Génie Biologique Troisième Année Nouvelles stratégies pour faire face à la résistance des bactéries aux antibiotiques Laurent Guillaud Fabienne Le Bouteiller Céline Martineau Hélène Mauboussin Alain Medawar Jian-Chun Sun Romain Viaux-Cambuzat 27 janvier 2005 Chef de projet : Fabienne Degroote 1 Introduction Introduction Nouvelles stratégies pour faire face à la résistance des bactéries aux antibiotiques Un problème d’actualité Recherche Aspects 27 janvier 2005 de solutions techniques industriels et perspectives 2 Introduction Introduction Objectifs de la soutenance Apporter une vision complémentaire Mettre en évidence les enjeux Sommaire Evaluation d’un agent anti-microbien Un exemple: les peptides anti-microbiens Développement et Mise en application dans la société moderne 27 janvier 2005 3 Plan Introduction I. II. III. Évaluation d’un agent anti-microbien 1. Différents critères pris en compte 2. Comparatif des stratégies Peptides anti-microbiens 1. Types et Modes d’action 2. Origines et Motivations 3. Exemples d’organismes 4. Techniques rapides d’identification microbienne Mise en application et rôle de l’État 1. Entomed 2. Rôle de l’État dans l’aide aux entreprises innovantes 3. Influence de l’État sur la population Conclusion 27 janvier 2005 4 Évaluation d’un agent anti-microbien 27 janvier 2005 5 Évaluation d’un agent anti-microbien Différents critères pris en compte 27 janvier 2005 6 Évaluation d’un agent anti-microbien Émergence de la résistance Adaptation de la bactérie (rôle de la pression de sélection, du mode d’action, de la largeur du spectre) Enrayée par Arrêt de prescription lors de l’apparition 27 janvier 2005 Limitation de prescription de produits à large spectre Hygiène 7 Évaluation d’un agent anti-microbien Largeur du spectre d’action Définition Ne prend pas en compte la résistance 4 classes pour les espèces bactériennes Espèces habituellement sensibles Espèces modérément sensibles Espèces inconstamment sensibles Espèces résistantes 27 janvier 2005 8 Évaluation d’un agent anti-microbien Effet Définition Bactériostatique : Concentration Minimale Inhibitrice 27 janvier 2005 Bactéricide : Concentration Minimale Bactéricide Antipathogénique 9 Évaluation d’un agent anti-microbien Obtention Recherche & Développement : - Cribler l’agent anti-microbien - Modifications Production 27 janvier 2005 10 Évaluation d’un agent anti-microbien Immunogénicité / Toxicité Risque d’allergie Utilisation de molécules de défense Toxicité potentielle chez l’homme Ex: mélittine (abeille), pardaxine (poisson) 27 janvier 2005 11 Évaluation d’un agent anti-microbien Comparatif des stratégies 27 janvier 2005 12 Évaluation d’un agent anti-microbien Évaluation d’un agent anti-microbien CRITERE Bactériophages Résistance Oui : mode d’action, infections chroniques Spectre Etroit Effet Bactéricide, mais population résiduelle Obtention Facile, production peu coûteuse Immunogénicité Oui (potentiellement) 27 janvier 2005 13 Évaluation d’un agent anti-microbien Évaluation d’un agent anti-microbien CRITERE Peptides antimicrobiens Résistance Peu probable Spectre Variable Effet Bactéricide, mais population résiduelle Obtention Démarche relativement longue Immunogénicité Toxicité dans certains cas 27 janvier 2005 14 Évaluation d’un agent anti-microbien Évaluation d’un agent anti-microbien CRITERE Sérothérapie Résistance Non Spectre Culture cellulaire: étroit Extraction sur l’homme : variable Effet Bactéricide Obtention Réalisation complexe à grande échelle Immunogénicité Non, mais problèmes liés à la transfusion 27 janvier 2005 15 Évaluation d’un agent anti-microbien Évaluation d’un agent anti-microbien CRITERE Motifs CpG Résistance Non : stimulation du système immunitaire Spectre Large Effet Indirectement bactéricide Obtention Simple Immunogénicité Problèmes liés aux médicaments ADN 27 janvier 2005 16 Évaluation d’un agent anti-microbien Évaluation d’un agent anti-microbien CRITERE Inhibition du Quorum Sensing Résistance Peu probable Spectre Étroit Effet Antipathogénique Obtention Difficile, mais mécanismes proches Immunogénicité Non 27 janvier 2005 17 Évaluation d’un agent anti-microbien Évaluation d’un agent anti-microbien Solution Bactériophages Peptides anti-microbiens Sérothérapie Motifs CpG Inhibition QS Résistance Oui Non Non Non Non Spectre Variable Variable Variable Large Étroit Effet Bactéricide Bactéricide Bactéricide Indirectement Bactéricde Antipathogénique Obtention Facile Difficile Difficile Facile Difficile Immunogénicité Oui variable Non Oui Non Critère Évaluation d’un agent anti-microbien Bilan Grande diversité des solutions envisagées Chaque solution est un bon candidat Nécessité de recherches : Validation Mise 27 janvier 2005 du produit dans le cas considéré en place d’une action planifiée et raisonnée 19 Peptides Anti-microbiens 27 janvier 2005 20 Peptides Anti-microbiens Types et Modes d’action 27 janvier 2005 21 Peptides anti-microbiens Généralités Petites molécules endogènes Effet anti-microbien à spectre étroit Altération de la membrane bactérienne 27 janvier 2005 22 Peptides anti-microbiens Mode d’action général Attraction électrostatique - - - + + - + + + Perturbation de la membrane Insertion bioénergétique et interaction 27 janvier 2005 23 Peptides anti-microbiens 3 catégories Peptides anti-microbiens anioniques Peptides anti-microbiens cationiques Peptides fragments de protéine 27 janvier 2005 24 Peptides anti-microbiens Peptides anioniques Dans les tissus pulmonaires, le foie et l’intestin grêle de bovins et d’ovins Complexés à du zinc, leur efficacité augmente Mode d’action inconnu Théorie : Zn+ Zn+ Zn+ 27 janvier 2005 Zn+ Ribo nucléase Bactérie Mort 25 Peptides anti-microbiens Peptides cationiques Composition très variable Classés en 3 catégories : Linéaires avec hélice Linéaires riches en Proline Avec cystéines stabilisantes Grand nombre d ’Arginine et de Lysine Domaine C-terminal variable : cationique anti-microbien 27 janvier 2005 26 Peptides anti-microbiens Peptides cationiques Peptides linéaires avec hélice Amphiphiles Perméabilisation de la membrane Exemple : Cécropine P1 (intestin de porc) Activité anti-bactérienne très rapide Contre les bactéries Gram négatif Interaction avec phospholipides membrannaires Déstabilisation de la membrane 27 janvier 2005 27 Peptides anti-microbiens Peptides cationiques Peptides linéaires riches en Proline Contiennent Exemple un grand nombre d ’Arg, Gly et Trp : PR-39 (intestin de porc) Contre les bactéries Gram négatif PR-39 Mort PR-39 Salmonella cholerasuis Inhibe la NADPH oxydase des neutrophiles Toxique pour l’homme 27 janvier 2005 28 Peptides anti-microbiens Peptides cationiques Peptides avec cystéine stabilisante Ponts disulfure Exemple : - défensines Feuillets stables Neutrophiles de certains mammifères Stockées dans granulocytes Contre les bactéries Gram négatif, Gram positif et virus - défensines de volailles > 90% efficaces contre E.coli et Listéria monocytogenes 27 janvier 2005 29 Peptides anti-microbiens Peptides fragments de protéines Domaines anti-microbiens résidant dans des protéines Produits d’une digestion enzymatique naturelle Peptide antimicrobien Exemple : Lactoferricine 27 janvier 2005 Dégradation partielle de Lactoferrine Contre bactéries de la lumière gastro-intestinale 30 Peptides anti-microbiens Potentiel thérapeutique Bons résultats in vitro Pourraient être efficaces in vivo 2 études avec des moutons présentant une pneumonie aïgue par Mannheimia hæmolytica Diminution de [bactéries] Réduction de l’inflammation Traitements et prévention d’infections pulmonaires Besoins d’études plus poussées pour confirmation 27 janvier 2005 31 Peptides anti-microbiens Les recherches futures Séquençage futur de génomes d’animaux nouveaux peptides antimicrobiens Exemple : ß-défensines découvertes chez l’homme et la souris Animaux transgéniques sources de peptides anti-microbiens Lactoferrine de vache transgénique Commercialisée au Japon : Alicament 27 janvier 2005 32 Peptides anti-microbiens Bilan Peptides anti-microbiens : Traitements des infections Possibilité d’augmenter leur production chez les animaux Utilisation de virus contenant un gène de peptide antimicrobien Co-administration avec des vaccins 27 janvier 2005 33 Peptides Anti-microbiens Origine et motivations 27 janvier 2005 34 Peptides anti-microbiens Origine Système immunitaire inné Système immunitaire adaptatif Récepteurs spécifiques invariants Contre motifs structuraux microbiens (LPS,…) Récepteurs de la super-famille des IgG Contre tout corps du non soi Rapidité de réponse de la voie innée Performance des peptides anti-microbiens dans la réponse immunitaire 27 janvier 2005 35 Peptides anti-microbiens Motivations : Étude phylogénique Compréhension des mécanismes biologiques fondamentaux Bonnes perspectives d’application thérapeutique Présents chez tous les métazoaires et certains organismes unicellulaires Microorganismes Plantes Animaux Invertébrés Vertébrés 27 janvier 2005 Peptides Anti-microbiens 36 Peptides Anti-microbiens Exemples d’organismes 27 janvier 2005 37 Peptides anti-microbiens Exemple 1: Les bactéries Entérobactéries Microcines 27 janvier 2005 - Klebsiella pneumoniæ E492 Actif contre Gram - 38 Peptides anti-microbiens Exemple 2: Les poissons Plie rouge Saumon Pleurocidine Hépcidine Perspectives : -Transgénèse chez les poissons 27 janvier 2005 -Renforcement de l’état larvaire 39 Peptides anti-microbiens Exemple 3: Les annélides Sangsue 4 peptides Synthèse et stockage : cellules graisseuses Actifs contre les Gram + Originalité : Stimulation par infection microbienne 27 janvier 2005 40 Peptides anti-microbiens Exemple 4: Les mammifères Porc Synthèse et stockage : Leucocytes, cellules épithéliales + 12 peptides Spectre variable Perspective : -Transgénèse dans la luzerne : β-défensine 27 janvier 2005 -Agent thérapeutique naturel pour le bétail 41 Peptides anti-microbiens Exemple 5: Les amphibiens Batraciens anoures Synthèse et stockage : Glandes granuleuses Pré-prodermaseptines Spectre variable Perspectives : -Dermaseptines B et S : non toxiques pour l’homme 27 janvier 2005 -Synthèse chimique 42 Peptides anti-microbiens Exemple 6: Les insectes Drosophile 7 peptides Synthèse et Stockage : Corps gras Spectres spécifiques Perspectives : -Applications sur les insectes utiles ou nuisibles 27 janvier 2005 -Applications thérapeutiques 43 Peptides anti-microbiens Bilan des exemples Sources multiples de peptides Étude des êtres vivants Découverte de peptides à haut potentiel thérapeutique 27 janvier 2005 44 Peptides Anti-microbiens Techniques rapides d’identification microbienne 27 janvier 2005 45 Peptides anti-microbiens Protocole de traitement Prélèvement Malade Identification du germe Prescription Choix du peptide anti-microbien 27 janvier 2005 46 Peptides anti-microbiens Caractéristiques recherchées Rapide Simple Identification Fiable 27 janvier 2005 Automatisée 47 Peptides anti-microbiens Techniques rapides d’identification microbienne Tests d’hybridation moléculaire PCR quantitative Cytométrie de flux 27 janvier 2005 48 Peptides anti-microbiens Tests d’hybridation moléculaire Principe: hybridation ADN/ADN ou ARN/ADN révélation du signal de l’hybride formé LUMIprobe 24® (Europrobe / Euralam) Spécificité Rapidité < 24h 27 janvier 2005 Sonde ADN / ARNr germe ciblé Simplicité d’utilisation 49 Peptides anti-microbiens PCR quantitative Principe: amplification de l’ADN avec amorces choisies analyse quantitative GeneSystem® (GeneSystems) GeneDisc Cycler GeneExtract Extracteur d’ADN bactérien 27 janvier 2005 Automate GeneDisc 50 Peptides anti-microbiens PCR quantitative Rapide (3 à 24h) Standardisée Simple Traçabilité des résultats 27 janvier 2005 51 Peptides anti-microbiens Cytométrie de flux Principe Échantillon Marqueurs Signal Laser Propriétés de la cellule analysée 27 janvier 2005 52 Peptides anti-microbiens Cytométrie de flux Rapidité Sensibilité Fiabilité Multiparamétrique Automatisé << 24h Quantitative reproductibilité 30 000 cellules/s traçabilité 27 janvier 2005 53 Peptides anti-microbiens Bilan Limité à l’agroalimentaire Peu d’espèces identifiables Coût + Utilisation en routine Utilisation en analyse clinique envisageable 27 janvier 2005 54 Mise en application et rôle de l’État 27 janvier 2005 55 Mise en application et rôle de l’État Entomed 27 janvier 2005 56 Mise en application et rôle de l’État Présentation Entreprise de Biotechnologie Créée en 1999 R&D et Production Peptides anti-microbiens Dérivés de la réponse immunitaire d’insectes Mutagenèse dirigée 27 janvier 2005 57 Mise en application et rôle de l’État Subventions Ministère délégué à la Recherche ANVAR Création 27 janvier 2005 Activité 58 Mise en application et rôle de l’État Problèmes rencontrés Utilisation spécifique à une espèce Marché visé restreint Coûts de production élevés Produit Rentable ? 27 janvier 2005 59 Mise en application et rôle de l’État Choix stratégiques En Interne Pas de production de peptides Production de molécules plus rentables 27 janvier 2005 En Externe Recherche de partenaires pour la production de peptides 60 Mise en application et rôle de l’État Rôle de l’État dans l’aide aux entreprises innovantes 27 janvier 2005 61 Mise en application et rôle de l’État Création d’entreprises innovantes ANVAR 40 % de l’activité Future Entreprise Concours National Bourse de Faisabilité Bourse de Création-développement 27 janvier 2005 62 Mise en application et rôle de l’État Accompagnement personnalisé Expertise 27 janvier 2005 Recherche de partenaires Promotion de l’innovation 63 Mise en application et rôle de l’État Différentes aides de l’ANVAR Avances remboursables 66 % Subventions 28 % Bons de Souscription d’Actions 6% 27 janvier 2005 64 Mise en application et rôle de l’État Politique en faveur de l’innovation Société Capital Risque Unipersonnelle Création d’un statut « jeune entreprise innovante » Co-financement des incubateurs publics Fonds spécialisés dans la création d’entreprises 27 janvier 2005 65 Mise en application et rôle de l’État Influence de l’État sur la population 27 janvier 2005 66 Mise en application et rôle de l’État Les antibiotiques, des médicaments pas comme les autres Automédication Un médicament efficace contre tout ? 27 janvier 2005 Mauvais usage des antibiotiques Une pression de la part des patients sur leur médecin Respect de l’ordonnance non nécessaire 67 Mise en application et rôle de l’État Une meilleure information Auprès des médecins Tables rondes Questionnaires Auprès des patients « Les antibiotiques c’est pas automatique » Mise à disposition de dépliants dans les cabinets médicaux Sites Internet médicaux grand public "maladie infectieuse courante = antibiotiques" 27 janvier 2005 68 Mise en application et rôle de l’État Les solutions mises en oeuvre Étude « regards croisés » d’IPSOS « Propositions pour un plan national pour préserver l’efficacité des antibiotiques 2001-2005 » Programme de gestion du risque de l’Assurance maladie Test de diagnostique rapide de l’angine Test de gastroentérite virale : Vikia® 27 janvier 2005 69 Mise en application et rôle de l’État Une baisse encourageante 27 janvier 2005 70 Conclusion Conclusion Plusieurs alternatives Peptides anti-microbiens Techniques d’indentification rapides Productions envisagées Nécessité d’implication Problème de rentabilité 27 janvier 2005 71 Conclusion Conclusion Utilisation Aides Développement État Demande Public Sensibilisation 27 janvier 2005 72
