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Etude des interactions entre le chitosane et
diverses souches bactériennes en milieux
aqueux.
DEA « Chimie et Microbiologie de l ’Eau »
Laurence Giraud
Encadrant : Yves Andres
Maître assistant, HDR
PLAN DE LA PRESENTATION
•
•
•
•
Introduction
 Généralités sur la chitine et le chitosane
 Généralités sur les bactéries
 Cinétiques de mortalité
Matériels et Méthodes
 Caractérisation des matériaux
 Etude de la survie des bactéries dans divers milieux
 Approche mécanistique
Résultats et Discussion
 Spectres IR-TF et Titrages acido-basiques
 Courbes de survie des bactéries dans divers milieux
 Approche mecanistique
Conclusion et Perspectives
INTRODUCTION
•
Dispersion des micro-organismes résistants par les installations traitant
l ’eau (Gerba et al., 2003)
 Aeromonas Hydrophila (E.P.A.)
 103-104 UFC/mL dans eaux de surface
 102-103 UFC/mL dans les réseaux de distribution
• Toxicité des produits de désinfection actuels (Chlore, dioxyde de chlore, ozone)
 Exemple : le dioxyde de chlore est capable de se combiner à la matière organique du
milieu et de former des composés aromatiques chlorés nocifs
• Afin de pallier à ces problèmes techniques de mises en œuvre, utilisation du chitosane
pour le traitement des eaux.
 L ’E.P.A. a déjà approuvé l ’usage du chitosane dans l ’eau (jusqu ’à 10 mg/L)
• But de l ’étude : Etudier les interactions et les effets entre le polymère et les souches
bactériennes : deux Gram-négatives, Escherichia coli et Pseudomonas aeruginosa, et deux Grampositives, Staphylococcus saprophyticus et Enterococcus faecalis
INTRODUCTION
Généralités sur la chitine et le chitosane
Structures moléculaires de la chitine (a) et du chitosane (b).
CH3
C
CH2OH
O
CH2OH
NH
O
O
HO
O
HO
O
O
HO
CH 2OH
NH
C
O
O
O
NH
(a)
C
CH3
CH3
CH2OH
O
CH2OH
NH2
O
HO
NH2
O
O
O
HO
O
O
CH2OH
(b)
O
HO
NH2
INTRODUCTION
Généralités sur la chitine et le chitosane
Propriétés et caractérisation
• Analyses physiques du chitosane
 polymère très peu poreux
• Analyse infra-rouge
Chitosane
Chitine
Bande amide 1 ou
déformation N-H des
amines
1633
1655-1626
Bande amide 2 ou
déformation des amines
protonées
1590
1561
Bande amide 3 ou
étirement C-N des amines
1300
1320
Nombres d’onde caractéristiques (cm-1) des principales vibrations amines et amides des polymères.
 A1655 
 A1655
 1
*100  *
(Harish Prashanth et al., 2002) ; DA = 
 *115 (Khor, 2001)
A
3450
A
3450
1,33




DA = 
• Comportement acido-basique du chitosane
% NH2 =   V2  V1 *M  *161 (Broussignac, 1968 ; cité par Saucedo, 1993)
m


INTRODUCTION
Généralités sur les bactéries
La paroi bactérienne
Acide lipoteichoïque
Acide teichoïque
Porines
Lipopolysaccharide
Membrane
externe
Pedptidoglycane
Espace
périplasmique
Protéines
Membrane
celluaire
Protéines transmembranaires
Lipides
Gram négative
Gram positive
Comparaison des enveloppes des bactéries Gram-positives
et Gram-négatives (Maier et al., 2000).
INTRODUCTION
Cinétiques de mortalité
Le modèle de Chik-Watson (Montgomery, 1985)
ln
N
N0
K
t
N
  = -Kt
 N0 
= nombre de micro-organismes présents au temps t,
= nombre de micro-organimes présents au temps 0,
= constante caractéristique du type de désinfectant,
des micro-organismes et de l’aspect de la qualité de l’eau
du système (min-1),
= temps (min).
MATERIELS ET METHODES
Caractérisation du matériel utilisé
• Analyse infra-rouge
Caractérisation des matériaux par spectroscopie IR-TF (pastillage de l ’échantillon)
• Titrages acido-basiques des polymères
Dissolution des polymères dans de l ’acide chlorhydrique 0.1M et dosage par la soude
Etude de la survie des micro-organismes dans divers milieux
• Dans l ’eau déminéralisée
• Dans une suspension de chitosane déacétylé à 80 %
• Influence du degré de déacétylation du chitosane
• Influence de la concentration en chitosane déacétylé à 80 %
Etude mécanistique
• Intégrité des couches pariétales
• Libération de protons
• Libération d ’ions potassium
• Force ionique
MATERIELS ET METHODES
Etude de la survie des micro-organismes dans divers milieux
dilution en cascade
24h,T° optimale
~72 h, 20°C
100 µL
L
préculture
culture
récupération culot suspension culot
par centrifugation
dans 800 mL d'ED
conservation des bactéries
à 4°C durant la nuit
numération des colonies présentes
dans le culot récolté
numération des
colonies au temps t
défini
ensemencement réacteurs (2 duplicats par milieux) : eau déminéralisée,
suspension de chitine, suspension de chitosane déacétylé à 60 %
et suspension de chitosane déacétylé à 80 %
Protocole de numération des colonies
RESULTATS ET DISCUSSIONS
1
0,9
0,8
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
3,8
3,3
Chitin
2,8
ee
2,3
Abs
Abs
Caractérisation des matériaux par spectroscopie IR-TF et titrimétrie des polymères
Analyses des spectres infra-rouge
1,8
1,3
Chitosane
0,8
3613 3312 3011 2710 2409 2108 1807 1506 1205 904 603 302
1
cm-1
Spectres infra-rouge de la chitine et du chitosane (déacétylé à 80 %).
Chitine (Aldrich)
Chitosane (France Chitine)
Chitosane (cette étude)
(Harish Prashanth et al. 2002)
% d'acétylation
% de déacétylation
43
57
21
79
29
71
(Khor 2001)
% d'acétylation
% de déacétylation
65
35
38
62
44
56
Détermination du degré d’acétylation (+/- 5 %) à partir de l’analyse des spectres
infra-rouge (les résultas représentent les valeurs moyennes des duplicats).
RESULTATS ET DISCUSSIONS
Caractérisation des matériaux par spectroscopie IR-TF et titrimétrie des polymères
Analyses des titrages acido-basiques
14,00
70,00
12,00
60,00
50,00
10,00
pH
30,00
6,00
20,00
4,00
dpH/dV
40,00
8,00
10,00
2,00
0,00
0,00
-10,00
0
7
15
17
19
23
26
29
37
45
volume de NaO H 0.2M ve rsé (mL)
Titrage acido-basique du chitosane (France Chitine).
Comparaison des taux de déacétylation des polymères selon la méthode d ’analyse
Chitosane 80
Chitosane 60
Chitine
Titrimètrie
Spectro IR (Khor, 2001)
% déacétylation
pKa
n (NH2)(mmole) / g polymère
62
64,6
6,3 +/- 0,1
4
56
12,5
5,92 +/- 0,1
0,8
35
7
7,31 +/- 0,1
0,4
Comparaison des taux de fonctions aminées (%) du chitosane et de la chitine
selon la méthode d’analyse utilisée.
RESULTATS ET DISCUSSIONS
Etude de la survie des MO dans divers milieux
1,0E+06
1,0E+05
Exemple de courbe de survie obtenue
pour les quatre souches de bactéries :
E. coli (), P. aeruginosa (), E.
faecalis (), et S. saprophyticus (),
dans l’eau déminéralisée en présence
de chitosane (80 %).
UFC/mL
1,0E+04
1,0E+03
1,0E+02
1,0E+01
1,0E+00
0
100
200
300
te mps (min)
Eau Déminéralisée
E. coli
P. aeruginosa
E. faecalis.
S. saprophyticus (ds NaCl)
-6,00E-04
-12,00E-04
-25,00E-04
-16,00E-04
400
500
Eau déminéralisée additionnée de polymères
Chitosane (80%)
Chitosane (60%)
Chitine
-227,00E-04
-905,00E-04
6,00E-04
-132,00E-04
9,00E-04
-367,00E-04
1,00E-04
-281,00E-04
-50,00E-04
3,00E-04
Constantes de mortalité (minute–1) des bactéries dans quatre milieux : eau déminéralisée, suspension
contenant du chitosane déacétylé à 80 % et déacétylé à 60 % et suspension contenant de la chitine.
RESULATS ET DISCUSSIONS
Etude de la survie des MO dans divers milieux
Influence de la concentration en chitosane
chitosane (mg/mL)
0,00
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
K (min -1 )
-0,01
-0,02
-0,03
-0,04
-0,05
-0,06
Courbe représentant les constantes de mortalité de E. coli selon
la concentration en chitosane déacétylé à 80 %.
RESULTATS ET DISCUSSIONS
Approche mécanistique
Intégrité des couches pariétales
CODi
0,83
1,51
12,84
Eau déminéralisée
Chitosane 80%
Chitine
CODf
2,39
2,96
13,18
Concentrations en Carbone Organique Dissout dans trois milieux différents avec E. coli (mg.L-1).
Libération des ions potassium
potassium (mg/L)
K (min -1 )
-0,02
-0,03
-0,04
0,10
0,20
0,30
0,20
potassium (mg/L)
0,00
0,00
-0,01
0,25
0,15
0,10
0,05
-0,05
-0,06
0,00
0
-0,07
0,2
0,4
0,6
0,8
chitosane (mg/mL)
1
Courbes représentant les constantes de mortalité de Escherichia coli selon la quantité de K+ rejetés (a) et la
quantité en ions potassium libérés dans le milieu pour différentes concentrations en polymère (b).
RESULTATS ET DISCUSIONS
Approche mécanistique
Influence de la présence d ’ions dans le milieu
L ’eau de source permet de voir un effet possible de la présence d ’ions dans le milieu sur la
mortalité de E. coli
Anions
Calcium
Magnésium
Sodium
Potassium
62,27
14,3
10,52
1,02
Cations
Bicarbonates
219
Sulfates
29,8
Chlorures
37,4
Composition ionique de l’eau de source Sainte-Aude (mg.L-1).
Eau de Source
E. coli
-6,00E-04
Eau de source additionnée de polymères
Chitosane (80%) Chitosane (60%)
Chitine
-17,00E-04
-29,00E-04
-8,00E-04
Constantes de mortalité (minute–1) des bactéries dans quatre milieux : eau de source, suspension contenant
du chitosane déacétylé à 80 % et déacétylé à 60 % et suspension contenant de la chitine.
CONCLUSION ET PERSPECTIVES
•
Effet antibactérien du chitosane
• Action différente sur les quatre souches de bactéries, mais pas de comparaison notable
entre mortalité des Gram-négatives et mortalité des Gram-positives
• Rôle majeur des fonctions NH2 du chitosane dans la diminution de la population
bactérienne
• Interaction probable entre les fonctions amines libres du chitosane et des groupements
fonctionnels des bactéries
• Les cellules ne se lysent apparemment pas
• Possibilité de réutiliser le polymère après réalisation d ’une première cinétique de
mortalité
• D ’autres études nécessaires à la caractérisation de la mortalité des cellules
• Utilisation du polymère dans le traitement des eaux