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Visualization of the intracellular behavior of HIV in living cells Virus de l’immunodéficience humaine Règne : virus Groupe VI : ssRNA RT Famille : Retroviridae Sous-famille : Orthoretrovirinae Genre : Lentivirus Cycle du VIH Introduction Pour atteindre le pore nucléaire, traversée du cytoplasme Diffusion des particules est limitée : viscosité du cytoplasme Moyen de transport : le cytosquelette , not. les dynéines le long des microtubules. Objectif de l’étude : grâce à la fluorescence Caractérisation du trafic intracellulaire permettant de détecter des complexes d’origine virale Observation du mouvement du virion dans la cellule Observation des interactions du VIH avec les éléments cytoplasmiques Production virale Suivi du virus suivi de la GFP-Vpr (Vpr reste associée à l’ADN viral) Vpr : protéine accessoire du VIH CoTransfection de cellules 293 T avec pLAI- Yu (DNA proviral) peGFPC3 P Gènes proviraux pLAI- Yu P GFP Vpr peGFPC3 Collecte du surnageant contenant les virus Incorporation Vpr – GFP par interaction avec la région gag p6 pendant l’assemblement viral Exposition cellule cible (exprimant le CD4) avec surnageant Observation de la fluorescence Infection précoce Après 2h d’incubation + Ac anti-tubuline (rouge) Signaux dans toute la cellule Accumulation du signal GFP dans la région péri nucléaire, au niveau des MTOC Utilisation de la GFP : technique fiable? Surnageant des cellules transfectées Fixation des particules virales Ac anti p17MA (protéine de matrice) Ac anti p24CA (protéine de la capside) Co-fixation de GFP-Vpr avec p24 ou p17 (protéines gag) ds 50-80 % des cas (flèches). Ccl : Détection possible de plus de la ½ des virions grâce à la GFP. But : montrer que GFP-Vpr est incorporé dans les virions infectieux Cellules transfectées + DiD (colorant des membranes) Collecte du surnageant (virus) Fixation Co-localisation GFP-Vpr- DiD Ccl : GFP-Vpr co-localise avec les membranes cellulaires enveloppant le virion. Ac anti p24 Transfection de cellules par constructions plasmidiques Collecte virions Fractionnement sur gradient Précipitation TCA Ac anti GFP SDS PAGE Western Blot Lysat de cellules transfectées avec GFP Fractions Pas d’association non spécifique Co-purification Vpr-GFP avec p24CA = incorporation spécifique dans les particules virales Ccl : incorporation de la GFP-Vpr ds les virions intacts Le VIH utilise le cytosquelette pour se déplacer dans la cellule (1) Trajectoire du virus Infection cellules HeLa (CD4/CCR5) avec HIV (GFP-Vpr) Progression du VIH Mitochondries=structure cellulaire Mouvement de 5 particules Trajectoire curviligne vers le noyau. Le VIH utilise le cytosquelette pour se déplacer dans la cellule (2) Quantification du mvt des 5 particules : Migration nucléaire relative=b/(a+b) Mesure de la position des part.virales ttes les 5 min. Mouvements vers l’int et l’ext . Migration nucléaire significative. Le VIH utilise le cytosquelette pour se déplacer dans la cellule (3) Mvt dép. et indép. des microtubules Injection de rhodamine-tubuline à des cellules CD4 infectées par HIV (GFPVpr,DiD) Rouge : VIH-DiD Microtubules Suivi d’1 particule DiD(-) qui utilise le réseau de microtubules Suivi d’1 particule DiD(-) qui n’utilise pas le réseau de microtubules Le VIH utilise le cytosquelette pour se déplacer dans la cellule (4) Importance de la dynéine. Cellule n’ayant pas reçu d’Ac Injection d’Ac anti- dynéine + rhodamine-dextrane (marqueur d’injection=cellules bleues) à des cellules cibles Infection par VIH (GFP-Vpr, DiD) Observation des particules DiD(-) Cellules ayant reçu Ac anti-dynéine : accumulation des particules à la périphérie. Cellules n’ayant pas reçu l’Ac : accumulation près du noyau. Ccl : La dynéine permet le mvt des particules vers le noyau. Identification des complexes de reverse transcription cytoplasmiques (1) Flèches: MTOC Particules virales ayant incorporé les dUTP Injection Alexa 594- dUTP (rouges) à des cellules CD4 Infection par HIV (GFP-Vpr) Agrandissement des MTOC Microtubules : Ac anti- tubuline 2 complexes doublement étiquetés : RTC, associés aux microtubules. Identification des complexes de reverse transcription cytoplasmiques (2) Injection à des cell. CD4/CCR5 d’Ac antidynéine ou IgG contrôle Infection VIH (GFP-Vpr) 3 fois plus de RTC Diminution de la progression nucléaire Masquage des RTC par le signal de fluorescence nucléaire (accumulation près du noyau) Ccl : utilisation de la dynéine par les RTC le long des microtubules. Identification des complexes de reverse transcription cytoplasmiques (3) Injection d’Alexa-dUTP (rouge) dans des cellules CD4/CCR5 Région périnucléaire incorporation de dUTP Infection par VIH (GFP-Vpr) Ac anti-p24CA RTC p24 (-) RTC p24 (+) RTC p24(-) et p24(+) associés aux microtubules 67 % des RTC ont 1 quantité de p24CA similaire aux particules extracellulaires capside intacte pendant l’initiation de la RT dans le cytoplasme Particules p24 (+) et (-) asso aux microtubules asso avt la perte de la capside Analyses des RTC au microscope électronique RTC associés aux microtubules Injection de Alexa-dUTP dans des fibroblastes Infection VIH GFP-Vpr Gelsoline : déplétion de l’actine Ac anti-tubuline (bleu) EM RTC= cylindre de 100 nm sur 400 Diamètre= 100 nm Discussion 1) Utilisation d’une technique de fluorescence pour suivre la progression du VIH dans le cytoplasme Vpr empaqueté dans les virions Fusion GFP-Vpr : détection de ces virions et les complexes dérivés par La sédimentation de GFP-Vpr avec les protéines virales La colocalisation avec p17MA, p24CA et les membranes des virions L’association de l’activité reverse transcriptase Pour repérer les virus infectieux : particules ayant perdu leur mb marquée (fusion cellulaire) et celles ayant incorporé des desoxynucléotides Mouvement dépendant des microtubules + indépendant (actine?) Discussion 2) Rôle de la dynéine cytoplasmique dans la mobilité du HIV Utilisation du réseau de microtubles par les virions pour arriver au noyau. Association RTC-microtubules non spécifique d’une cellule : détection dans les cellules Hos, Hela et fibroblastes. Traitement au nocodazole= destruction du réseau de microtubules=inhibition de l’infection par le VIH. Autres études sur HSV et AD-2 = seulement baisse de l’efficacité de l’infection Entrée proche du noyau? Microtubules résistants au nocodazole? Mvt brownien? Discussion 3) Initiation de la reverse transcription 2 posibilités : Libération de la capside juste après la fusion avec la mb cellulaire. La capside reste intacte jusqu’à l’atteinte du pore nucléaire par le génome viral . Etudes structurales de la capside : présence de pores suffisamment larges pour faire rentrer des nucléotides. Association RTC- microtubules avant la perte de la capside.
