Catalyse Enzymatique

CATALYSE ENZYMATIQUE
EFFETS DE pH
La plupart des enzymes sont actifs dans une gamme de pH restreinte,
typiquement entre pH 5 à 9. Le pH influence l'activité d'un enzyme à plusieurs
niveaux :
1) par la liaison du substrat à l'enzyme
2) de l'activité catalytique
3) de l'ionisation de substrat
4) de la stabilité structurale
La vitesse initiale de beaucoup d'enzymes démontre en fonction de pH un
profil ressemblant à une cloche.
- exemple : la cinétique d’aldolase de muscle de lapin
Vmax (units/mg)
18
Vmax
16
14
12
Curve 1
10
8
6
6
8
10
pH
Ces courbes reflètent l'ionisation d'un certain nombre de groupements
d’acides aminés au site actif de l'enzyme et suggèrent que certains états d'ionisation
sont essentiels pour l'expression de l'activité catalytique. Le modèle suivant est
capable d'expliquer une telle dépendance d'activité sur le pH.
E-
ES-
KE2
KES2
EH + S
k-1
KE1
EH2+
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k1
k2
ESH
E + P
KES1
ESH2+
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Dans ce modèle simple, seulement EH et ESH possède de la compétence
catalytique. Implicite dans ce modèle, il est assumé que l'échange des protons se fait
sur le régime de l'équilibre rapide. Ceci est raisonnable vu que la constante de
deuxième ordre pour l'échange d'un proton est rapide  109 M-1.s-1. L'échange rapide
parmi les populations fait en sorte que les espèces EH et ESH sont réduites par des
facteurs, f1 et f2, dépendant de leur constante d'ionisation ou pKa. Les facteurs f1 et f2
ont la forme suivante :
f 1=
[ H+ ]
K E1
+ 1 + K E2
;
[ H+ ]
f 2=
[ H+ ]
K ES1
+ 1 + K ES2
[ H+ ]
L'équation de Michaelis-Menten pour ce schéma possède la même forme
suivante :
vi =
V MAX , app [S ]
K M, app + [S ]
où VMAX,app et KM,app sont des constantes michaeliennes ‘apparentes’ et
réfèrent seulement aux formes actives de l'enzyme. Cette relation ressemble à celle
obtenue de l’inhibition mixte vu que les constantes sont définis par
VMAX,app = VMAX / f2 et KM,app = KM (f1/f2).
L'analyse de la relation log VMAX,app vs pH fournie les valeurs de KES1 et KES2
correspondantes à l’état lié - tandis que la relation de log (VMAX,app / KM,app) vs pH
informe sur les valeurs de KE1 et KE2, celles de l’enzyme et substrat libre. Ceci
implique la détermination des paramètres VMAX,app et KM,app à des pH différents.
Les pKa (log KEi ou log KESi) déterminés à l’aide des logiciels donnent des
indices importants sur l'identité des acides aminés au site actif.
Par exemple, pKa ≈ 4 suggère un résidu Asp ou Glu essentiel pour l'activité de
l'enzyme. Des valeurs pKa ≈ 6 ou ≈ 10 suggère des résidus His ou Lys,
respectivement. Cependant un groupement carboxylate d'un résidu Asp en pont
salin (interaction électrostatique) avec un groupement Lys est stabilisé par la charge
positive de Lys et possède un pK plus bas (plus difficile à protoner).
H
O
N
H
Lys
BCM 1502
C
H
pKa
O
Asp
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Inversement un groupement aminé dans une région peu polaire est moins
basique que dans une région polaire. Dans ce cas, il s’agit du fait qu’un résidu chargé
est toujours plus difficile à stabiliser dans une région hydrophobe que sa forme
neutre correspondante.
NH3
NH2
Micro-environnement
hydrophobique
pKa
Donc il faut être prudent dans l'identification des groupements essentiels pour
l'activité catalytique.
RÉACTIONS BISUBSTRATS
Les réactions enzymatiques impliquant deux substrats et deux produits
représentent  60% des réactions biochimiques connues.
E
P-X + B ⇌P + B-X
Presque toutes les réactions bisubstrats sont soient des réactions transférases
où l'enzyme catalyse le transfert d'un groupement fonctionnel spécifique, X, d'un
substrat à l'autre, soient des réactions oxydation - réduction où des équivalents
réducteurs sont transférés entre deux substrats. Parmi toutes les réactions bisubstrats
(bi bi) possibles seulement quelques sont observés.
Il y a deux classifications mécanistiques majeures.
a) Réactions séquentielles ou tous les substrats doivent combiner avec
l'enzyme avant qu'il y ait transformation de substrat en produit. Le transfert du
groupe X de A (= P - X) à B donne P et Q (= B - X) est connu sous le nom de
réactions à déplacement simple. Il y a deux sortes de réactions dans l’addition des
substrats.
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i) Mécanisme séquentiel au hasard
A
B
P
EA
E
Q
EAB ⇌ EPQ
E
E
EB
B
Q
EP
A
Q
P
ii) Mécanisme ordonné ou obligatoire
A
E
B
EA
P
EAB ⇌ EPQ
Q
EQ
E
b) Réactions ping pong où un ou plusieurs produits sont libérés avant que
tous les substrats aient participé dans la réaction. Dans la réaction ping pong bi bi, le
produit P est libéré après l'attachement de substrat A et l'enzyme devient accepteur
du groupement X. La liaison de B à l'enzyme permet le transfert d'X au produit Q.
Mécanisme enzyme substitué (ping pong)
- ces réactions connues sous le nom déplacement double impliquent une
modification de l'enzyme et les deux substrats, A et B, ne se rencontrent pas sur la
surface de l'enzyme.
A
E
P
EA ⇌ E’P
B
E’
Q
E’B ⇌ EQ
E
Les équations cinétiques pour le cas bisubstrats sont plus complexes et il est
possible de distinguer entre les mécanismes différents.
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MÉCANISMES CATALYTIQUES
La catalyse est un processus qui augmente le taux par lequel une réaction
atteint l’équilibre.
La raison que les enzymes sont des catalyseurs puissants est due à leur
spécificité de liaison au substrat et leurs arrangements optimaux des groupements
catalytiques.
Les mécanismes que les enzymes utilisent sont classifiés de manière
suivante :
● L'enzyme fournit les groupes accepteur/donneur de protons, dans un
mécanisme de catalyse acide/base.
● L’enzyme peut se combiner de façon covalente avec le substrat pour former
un intermédiaire qui permet une réaction plus rapide.
● L'enzyme utilise des ions comme co-facteurs, pour stabiliser différentes
charges (intermédiaires), pour ioniser les molécules d'eau et les rendre plus
nucléophiles, et/ou pour cacher des charges.
● L'enzyme utilise les forces électrostatiques, pour aligner le substrat et
stabiliser l'état de transition.
● L'enzyme fixe le substrat de telle sorte que les liens réactionnels sont situés
près du site catalytique et sont orientés de telle sorte que l'état de transition est
atteint très rapidement.
● L'enzyme peut induire la distorsion et/ou la tension au niveau du lien à couper,
ce qui le déstabilise et le rend plus facile à couper. L'enzyme fixe donc
préférentiellement le substrat sous forme d'état de transition.
CATALYSE ACIDE/BASE
Une catalyse acide générale est un procédé dans lequel le transfert partiel d'un
proton à partir d'un groupe acide (acide Bronsted - une molécule qui peut fournir un
proton) abaisse l'énergie libre de l'état de transition.
Une réaction peut aussi être stimulée par la catalyse basique générale, si le
taux de réaction est augmenté par l'abstraction partielle d'un proton par une base
(base Bronsted - une molécule qui peut attirer un proton).
Certaines réactions utilisent les deux types de catalyse et si les deux réactions
sont simultanées, la réaction devient acide - base générale concertée.
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Exemple : La tautomérie cétone - énol; l’état de transition [ ] ressemble à un énolate
R
R
C
R
δ
C
O
-
O
δ
CH2
CH2
H
H
δ
C
O
H
-
CH2
+
Catalyse acide générale - l’acide, AH, est donneur de son proton H
R
R
C
O + H
R
δ
A
C
-
O
δ
CH2
CH2
H
H
δ
+
δ
-
H A
C
H + AH2O
-
H
+
δ
O
+
CH2
H
A + OH-
Catalyse base générale – la base, :B, joue le rôle d’accepteur de proton cétone H
R
R
C
O + :B
R
δ
C
-
O
δ
CH2
CH2
H
H
δ
+
δ
-
-
C
H+
O
H + B+
H
CH2
+
:B + H
B
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Réaction catalysée par Ribonuclease A illustre la catalyse acide - base générale
La RNase A est un enzyme digestif qui hydrolyse l’ARN. Le profil pH de la
réaction démontre un maximum vers pH de 6 et correspond en effet à l'ionisation de
deux groupements, His 12 et His 119.
Deux acides aminés histidines (His 12 et His 119) agissent de façon concertée
dans un mécanisme acide/base.
1) His 12 agit comme la base, retirant un proton du groupe 2'-OH de l’ARN,
ce qui permet une attaque nucléophile sur l'atome de phosphore adjacent. De même,
His 119 agit comme un acide et provoque le bris du lien en protonant le groupe
R'-O-.
2) L'intermédiaire 2'-3'-cyclique est hydrolysé par le processus inverse de
l’acide/base. His 12 est maintenant l'acide et His 119 la base.
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CATALYSE COVALENTE
La catalyse covalente implique l'accélération de la vitesse par la formation
transitoire d'une liaison catalyseur - substrat.
La formation de base de Schiff par l'enzyme représente un des mécanismes le
plus souvent rencontré. Dans l’exemple, l'azote protoné dans l’intermédiaire agit
comme puit d'électron afin de réduire la barrière de transition de l’énolate.
Im ine protoné
E nolate
δ
R
-
O
δ
H 3C
C
H
N
-
δ
CH2
H 3C
-
CH2
C
La formation et la décomposition de la base de Schiff est très rapide et ne
représente pas l'étape limitante de la réaction.
La catalyse covalente se divise en deux étapes :
1) la réaction nucléophile entre le catalyseur et le substrat afin de former une
liaison covalente
2) le retrait d'électron du centre réactionnel par le catalyseur qui est devenu
électrophile
H
1
+
N
C
O
H
2
N
C
OH
H
N
C
+ OH -
H
B
H
Imine protonée
A
Les résidus utilisés sont les groupements : ε-amine de Lys, la portion
imidazole d'His, le groupement thiol de Cys, la fonction carboxyle d'Asp et le
groupement hydroxyle de Ser.
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CATALYSE MÉTALLO-DÉPENDANTE
● Presque un tiers des enzymes connus sont dépendants des ions métalliques
pour leur catalyse
Les métalloenzymes se divisent en deux classes qui sont distinguées par la
force des interactions protéine - ion :
a) Métalloenzymes possédant des ions métalliques fortement liés comme Fe2+,
Fe3+, Cu2+, Zn2+, Mn2+, ou Co2+.
b) Des enzymes activés par des ions métalliques faiblement lie en solution
comme Na+, K+, Mg2+, ou Ca2+.
Les ions de métal participent à la catalyse en trois façons majeures :
1) dans la liaison des substrats afin de l'orienter
2) facilitation des réactions oxydation-réduction par leurs changements
réversibles de leur état d'oxydation
3) stabilisation électrostatique des charges négatives
Les métaux sont très souvent des meilleurs catalyseurs que des protons parce
que les ions métalliques peuvent être présents en hautes concentrations et possèdent
des charges stable > +1  super acides
La coordination par le métal rend les molécules d'eaux attachées plus acides et
donc une source OH- à des pH neutres.
- par exemple la molécule d'eau dans le complexe (NH3)5 Co3+ (H2O) ionise
(NH3)5 Co3+ (H2O) ⇌ (NH3)5 Co3+ (OH-) + H+
avec un pKa de 6.6 et qui est quelques 9 unités de pH plus bas que celui de l’eau. La
conséquence est la création d'un groupement hydroxyle métallo-dépendant qui est
un nucléophile puissant.
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L'enzyme d’anhydrase carbonique est un bon exemple. L'enzyme utilise le
zinc pour catalyser la réaction :
CO2 + H2O ⇌ HCO3- + H+ en trois étapes.
1) coordination d’une molécule de zinc par trois histidines et une molécule
d'eau. Il est postulé que l'ionisation de la molécule d'eau est facilitée par catalyse
base générale impliquent le résidu histidine-64 voisin – voir figure.
Site de
liaison de
CO2
5iéme site de coordinance
Glu-106
His-64
His-96
HCO3His-119
His-94
Site actif de l’anhydrase carbonique
montrant la surface électrostatique. Le
CO2, une fois lié, est immédiatement
transformé en HCO3- au fond du site actif.
Site actif montrant l’intermédiaire enzyme HCO3- stabilisé par le zinc. His-64 active par un
relais de 2 molécules d’eau (non montrées) la
molécule d’eau qui sert à attaquer le CO2.
2) attaque nucléophile par le OH- du CO2 et la conversion en HCO33) régénération du site catalytique par la liaison d'une autre molécule de H2O
possiblement avant le départ de HCO3- à travers un intermédiaire du complexe de
zinc penta coordonné.
O
Zn2+ O
H
+
O
2
Zn2+ O
C
H
O
C
OH 2O
3
His
O
3'
+
Zn2+ O + H + HO C
H
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OCatalyse Enzymatique
His
Zn2+ O
His
H2O
H
O
C
OPage 10/14
CATALYSE ÉLECTROSTATIQUE
Les distributions de charges dans un site actif sont arrangées afin de stabiliser
les états de transition. Les simulations sur ordinateur indiquent que la réduction de la
barrière de l’état de transition par des effets électrostatiques est un composant
important de catalyse. On pense que l'enzyme pliée fournit un environnement
polaire pré-organisé qui déjà est partiellement orienté pour stabiliser l'état de
transition.
CATALYSE PAR LES EFFETS DE PROXIMITÉ ET FACTEUR D’ORIENTATION
L'alignement spatial des réactifs sur une surface enzymatique permet leur
réaction de façon optimale dans le site actif. Les réactions catalysées sont accélérées
par la réduction relative en translation et rotation des réactifs. Le tableau montre des
exemples des vitesses relatives de la formation d’anhydrides à partir d’esters ayant
des degrés de libertés différents.
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La bonne orientation des réactifs augmente encore le taux par un facteur 100.
Les enzymes lient les substrats de manière à les immobiliser et les aligner afin
d'optimiser leur réactivité. L'énergie pour réaliser ceci provient de l'énergie libre de
liaison du substrat avec l'enzyme.
CATALYSE PAR LIAISON À L'ÉTAT DE TRANSITION
Le mécanisme de catalyse parmi les plus importants qui est basé sur la notion
que la conformation contrainte du réactif ressemble plus à celle de l'état de transition
d’une réaction que la conformation non contrainte correspondante
Ceci d'abord suggéré par Linus Pauling en 1946 et élaboré par Wolfenden et
Lienhard. Leur principe est le suivant :
Les interactions qui favorisent la liaison préférentielle à l'état de transition
augmentent sa concentration et par conséquent augmentent de façon
proportionnelle la vitesse de la réaction catalysée
Ce principe peut se comprendre de façon suivante :
La formation du produit P à partir du substrat S peut se faire de façon
spontanée ou par catalyse enzymatique soit :
kN
S
kE
P
et
ES
EP
où kN et kE représentent les constantes de vitesse de premier ordre décrivant
les réactions respectives
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La relation entre les deux réactions est décrite par le schéma suivant :
KN
E+S
KR
S +E
où KN =[E][S ]/[E][S]
P+E
KT
KR = [ES]/[E][S], KT = [ES ]/[E][S ]
KE
ES
ES
EP
et KE =[ES ]/[ES] sont tous des constantes
d'association
Par conséquent KT / KR = [S][ES‡] / [S‡][ES] = KE‡ / KN‡ .
(1)
Les vitesses de la réaction non catalysée ou catalysée sont les suivantes :
v  k N [ S ]  k B T  [ S ‡]  k B T   K ‡N [ S ] pour la réaction non catalysée
(2)
v  k E [ ES]  k B T [ ES‡]  k B T  K ‡E [ES] pour la réaction catalysée
(3)
En manipulant les équations 1-3, on obtient k E k N  K ‡E K ‡N  K T K R
(4)
Cette équation indique que plus l’enzyme favorise la liaison à l’état
transitionnel (KT) par rapport à la liaison au substrat (KR), plus l’augmentation de
vitesse de la réaction catalysée est grande (kE) par rapport à celle de la réaction non
catalysée (kN) ; en d’autres mots
La catalyse enzymatique est due à la liaison et à la stabilisation préférentielle de
l’état transitionnel (S‡) par rapport à celle du substrat (S)
Le rapport en énergie libre entre les deux vitesses s’exprime par :
‡
k E K E‡ e  GE / RT


‡
k N K N‡ e GN / RT

alors k E k N  exp GN  GE
‡
‡
 RT   e
G / RT
Pour gagner un facteur d’accélération de 106 à 25°C, l’enzyme doit lier l’état
transitionnel d’avantage par 34.2kJ.mol-1.
Ceci correspond approximativement à l’énergie libre provenant de la
formation de deux ponts hydrogène.
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Donc la liaison préférentielle à l’état transitionnel due à la formation de
seulement deux ponts hydrogène qui ne sont pas présents dans le complexe ES
augmenterait la vitesse par un facteur ~106
non catalysée
Stabilisation
implique la
réduction de la
barrière de l’état
de transition
Minimum d’énergie
puisque l’enzyme favorise
la liaison de ces ligands
Dans l’approximation de l’équilibre rapide, KR = 1/KM, ke = kcat et définissant
la constant dissociation de l’état de transition par K‡diss = 1/KT ; l’équation 4 devient
‡
K diss  k N K M kcat 
Mettons kN ~ 10-6 s-1 et kcat/KM ~ 106 M-1 s-1 où KM ≈ KS ~ 10-4 M et kcat = 102s-1
K‡diss = 10-12 M pour l’état de transition d’une enzyme typique
 Dans cet optique « un bon substrat ne se lie pas nécessairement à son enzyme
avec une affinité élevée mais pourra le faire lors de l’activation à son état
transitionnel »
Si un enzyme lie préférentiellement le substrat à l’état transitionnel, il est
donc possible d’envisager des molécules stables qui ressemblent plutôt à S‡ ou une
de ses composantes. Ces types de molécules sont considérés des analogues de l’état
transitionnel et ils sont des inhibiteurs compétitifs parmi le plus puissant.
Le fait que les enzymes lient d’avantage les états transitionnels plutôt que le substrat
représente le principe fondamental dans le design des médicaments et dépend de la
connaissance au niveau moléculaire du mécanisme réactionnel de l’enzyme.
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