PDF - Université Paul Sabatier

THÈSE
En vue de l'obtention du
DOCTORAT DE L’UNIVERSITÉ DE TOULOUSE
Délivré par : l’Université Paul Sabatier – Toulouse III
Discipline ou spécialité : immunologie
Présentée et soutenue par Emilie BERGEREAU
Le 22 septembre 2010
Titre : ROLE DES LT-CD8+ DANS L’AUTO-IMMUNITE DU SNC :
INFLUENCE DES AUTRES EFFECTEURS DE L’IMMUNITE ADAPTATIVE
JURY
Pr Salvatore VALITUTTI
Pr José BOUCRAUT
Pr Serge NATAF
Pr Patrick VERMERSCH
Pr Roland LIBLAU
Président
Rapporteur
Rapporteur
Rapporteur
Directeur de thèse
Ecole doctorale : Biologie – santé - Biotechnologie
Unité de recherche : U563 INSERM
Directeur(s) de Thèse : Roland LIBLAU
1
REMERCIEMENTS
J’exprime toute ma reconnaissance aux membres du jury de cette thèse pour le temps
et l’énergie qu’ils y ont consacré. Merci à vous Mr Nataf, Mr Boucraut et Mr Vermersh
pour vos disponibilités et vos qualités scientifiques incontestables.
Je remercie le professeur Salvatore Valitutti pour avoir accepté la présidence de ma
soutenance de thèse.
J’exprime ma gratitude à mon directeur de thèse, le professeur Roland Liblau, pour
ses encouragements et l’investissement qu’il a eu au cours de ces quatre années difficiles et
riches en émotion. Merci pour l’apport scientifique de grande qualité et l’ouverture d’esprit
que vous m’avez offert.
Je remercie également toute l’équipe auto-immunité et immuno-régulation qui m’a
permis de mener à bien mes expériences et qui a su me conseiller, m’aider, m’épauler tout au
long de ce travail.
Pour terminer, je voudrai exprimer une tendresse et reconnaissance particulière à mes
proches pour leur soutien et leur affection. Merci d’avoir cru en moi, de m’avoir permis de
réaliser mes projets et d’avoir fait que ces années soient ce qu’elles ont été. La dernière phrase
sera pour ma fille sans qui tout cela n’aurait pu aboutir.
2
SOMMAIRE
RESUME…………………………
ESUME………………………………………………………………………..…………..…p7
………………………………………………………………………..…………..…p7
LISTES DES ILLUSTRATIONS
…………………………………………………………..……p9
………………………………………..……p9
ILLUSTRATIONS…………………
ONS…………………………………………………………..……p
LISTES DES ABBREVIATIONS
……………………………………………...………….....
…………………...………….....…p
...…p10
…p10
ABBREVIATIONS…………………………
ONS……………………………………………...…………..
……………………………………………………
…………………………………………
…………………..
…..……p
……p113
INTRODUCTION…………………………
INTRODUCTION
…………………………
…………………………
………………
…..
……p
LE SYSTEME IMMUNITAIRE
IMMUNITAIRE…………………………
MMUNITAIRE………………………………..…………………
………………………………..…………………………..….p1
……..…………………………..….p13
………..….p13
1. Généralités……………………………………………………………………………p13
a. Définition et rôles du système immunitaire………………………… .p13
b. Description générale du système immunitaire…………………….…p17
i. Les organes…………………………………………….……………p17
ii. Les cellules …………………………………………………………p19
2. Les lymphocytes Tα
αβ………………………………………………………………...…p23
a. Le récepteur à l’antigène des lymphocytes T (TCR) …………………..p24
i. Le complexe majeur d’histocompatibilité (CMH)
et ses interactions peptidiques……..…………………………………p24
ii. Le complexe TCR/CD3……………………..………………………p34
iii. Les co-récepteurs CD4 et CD8………………..……………………p37
b. Signalisation et activation des LTα
αβ ………………………………...…..p39
i. Les cellules présentatrices d’antigènes (CPA) ……………………..p39
ii. La migration et l’adhésion des LT avec leur CPA……………...…..p41
iii. La co-stimulation…………………………………………………...p43
iv. La synapse immunologique………………………………………....p45
v. Activation …………………………………………………………..p46
c. Les lymphocytes T-CD4 et T-CD8……………………………………....p49
i. Ontogénie …………………………………………………………..p49
ii. Les lignages CD4/CD8……………………………………………..p52
iii. Description ………………………………………………….……..p56
iv. Rôles………………………………………………………………..p59
3
3. La tolérance des lymphocytes Tα
αβ aux antigènes de l’organisme…………………...p64
a. Tolérance intrathymique ………………………………… ……………....p64
i. Sélection négative….…………………………….……………….....p64
ii.
Les Auto-antigènes………………………………………..………..p68
iii. Les lymphocytes T régulateurs générés dans le thymus………… ..p69
b. Tolérance périphérique……………………………………….…………..p71
i. La tolérance passive………………………………….……………..p71
ii. Tolérance active……………………………………………………..p78
LES MALADIES AUTOAUTO-IMMUNES ET MODELES ANIMAUX
ANIMAUX………………………..…
NIMAUX………………………..… ...p87
...p87
1. Les maladies auto-immunes ………………………………...……………………p87
a. Généralités…………………………………………………..................…..p87
b. Maladies systémiques……………………………………………….…….p87
c. Maladies spécifiques d’organes…………………………………………...p89
2. Les modèles animaux de SEP……………………………………………….……p94
a. Les modèles viraux………………………………………………………..p94
b. Le modèle auto-immun : l’encéphalomyélite auto-immue expérimentale
i. Historique………………………………………………………………p95
ii. Les antigènes……………………………………………………………p96
iii. Les différentes formes d’EAE…………….……………………………p97
3. EAE et sclérose en plaques (SEP) ………………………………………….……p99
a. Le SNC…………………………………………………………………….p99
i. Les cellules du SNC…………………………………………………..p99
ii. Spécificité ………………………………………...…………………p102
b. Similarités entre EAE et SEP………………………………………….p113
i. Les caractéristiques et le déclenchement de la pathologie………….p113
ii. L’évolution…………………………………..............………………p114
iii. L’histologie……………………………………..……………………p115
iv. Les facteurs de susceptibilité…………………………………………p116
c. Rôles des cellules immunitaires…………………………………….….p118
i.
Immunité innée……………………………………….……………..p118
ii. LB et anticorps ……………………………………………………....p120
iii. LT…………… ;……………………………………………………..p127
iv. Cytokines …………………………………………………………….p141
d. Pathogenèse……………………………………………….……….p145
4
LES MODELES D’AUTOD’AUTO-IMMUNITE DU SYSTEME NERVEUX CENTRAL …………….P14
…………….P147
147
1. Elaboration des modèles d’auto-immunité dans le SNC …………………………..p147
a.
Les outils expérimentaux.…………………..………………………p147
b.
Applications au SNC…………………………………………………p149
i. Généralités……………………………………………………..p149
ii. Quelques exemples…………………………………………....p150
2 . Les différents modèles utilisés………………………………………………………. p152
a.
Souris TCR transgéniques………………………………………………p152
i. Souris CL4 – TCR Tg…………………………………………p152
ii. Souris 6.5 –TCR Tg………………………………………….p153
b. Souris MOG-HA………………………………………...……………p154
i. Souris MOG-Cre…………………………….……………….p154
ii. Souris Rosa26-HA………………………………………....p155
iii. Souris MOG-HA……………………………………..…….p156
OBJECTIFS………………………………………………………………………………….p157
157
OBJECTIFS
MATERIELS ET METHODES………………………………………………………...…….p15
158
METHODES
158
Les souris………………………………………………………………………….. p159
Extraction d’ADN pour le génotypage des souris ……………………………… p160
Les milieux de cultures …………………………………………………………... p160
Les anticorps ……………………………………………………………………… p160
Les réactifs ………………………………………………………………………... p161
Culture Th1 …………………………………………………………………….. p162
Culture Tc1 ……………………………………………………………………….. p163
Transfert adoptif des lymphocytes ………………………………………………p164
Suivi des souris ………………………………………………………………….. p164
Histologie …………………………………………………………………………. p165
Préparation de lymphocytes du cerveau ……………………………………….. p166
Analyses en cytométrie de flux ………………………………………………….. p166
5
RESULTATS………………………………………………………………………………
RESULTATS……………………………………………………………………………….
………………………………………………………………………………. p167
167
1. Coopération des Tc1 et des Th1 ? ……………………………………………..p169
a. Pureté des cellules mises en culture ….…………………………..….p169
b.
Activation des LT transférés……………………………...…..…….p171
c. Suivi clinique………………………………..……………………..…..p174
d. Histologie……………………………..……………………………….p178
e. Etude des cellules inflammatoires par cytométrie en flux. …….….p181
f. conclusion……………………………..…………………………...….p184
2. Coopération des Tc1 et des anticorps ? …………………………………….....p185
a.
Suivi clinique………………………………………………..……..…….p185
b. Histologie…………………………………………………………..…….p188
DISCUSSION ET PERSPECTIVES………………………………………………………
PERSPECTIVES………………………………………………………...
………………………………………………………... p191
191
1. Implication des Tc1 …………………………………...………………………….p192
a. Dans la SEP et l’EAE ………………………………….…………..…….p192
b. Dans d’autres maladies auto-immunes………………..………….…….p194
2. Implication des Th1 …………………………………………………………...….p194
a. Dans la SEP et l’EAE ………………………………….…………..…….p194
b. Dans d’autres maladies auto-immunes………………..………….…….p196
3. Une possible collaboration Tc1/Th1 ? ……………………………….……...….p196
a. Dans la SEP et l’EAE ………………………………….…………..…….p196
b. Dans d’autres maladies auto-immunes………………..………….…….p201
4. Une hypothétique synergie d’action entre Tc1 et Ac……………………...…..p202
BIBLIOGRAPHIE………………………………………………………………………
BIBLIOGRAPHIE…………………………………………………………………………
………………………………………………………………………… p204
204
ANNEXES………………………………………………………………………………
ANNEXES………………………………………………………………………………....
……………………………………………………………………………….... p240
6
RESUME
La sclérose en plaques est une maladie inflammatoire chronique multifactorielle caractérisée par
de nombreux infiltrats inflammatoires (lymphocytes T, lymphocytes B, macrophages activés, cellules
de la microglie) et par des lésions focales résultant en une démyélinisation des axones et une perte
d’oligodendrocytes. Afin de comprendre le rôle pathogène des LT-CD8+ et l’implication des autres
effecteurs de l’immunité adaptative comme les LT-CD4+ auto-réactifs et les auto-Ac, des transferts
adoptifs de LT-CD8+ spécifiques de l’Hémaglutinine du virus Influenza (HA) différenciés in vitro en
Tc1 spécifiques de HA et/ou de LT-CD4+ spécifiques de HA différenciés in vitro en Th1 ont été
réalisés dans les souris MOG-HA (exprimant le néo-auto-antigène exclusivement dans les
oligodendrocytes). Il a ainsi pu être évalué les conséquences cliniques et pathologiques de
l’inflammation du système nerveux central (SNC).
Les résultats obtenus ont montré que le transfert de Th1 seuls ne provoque pas de signes
cliniques apparents : pas de perte de poids ni de diminution des performances physiques suite à un
effort malgré la présence d’une inflammation (sans démyélinisation) au niveau du SNC. Le transfert
de Tc1 seuls induit dans 30% des cas, des pertes de poids ainsi qu’une mobilité réduite et des
défaillances motrices. Au niveau histologique, il existe une infiltration massive de LT suite à ce
transfert conduisant à une inflammation sévère du SNC et une démyélinisation des axones. Le cotransfert des deux populations aggrave ces signes cliniques et histologiques suggérant une coopération
des deux populations lymphocytaires au niveau du SNC. Des analyses complémentaires en cytométrie
de flux ont permis de caractériser les cellules immunes qui infiltrent le SNC. Nous avons ainsi pu
montrer qu’il existe une différence au niveau de l’activation de la microglie entre les différents types
de transfert. En effet, lors du co-transfert Tc1/Th1, il y a une activation très importante de la microglie,
des macrophages et un recrutement plus important de cellules dendritiques et de LT au niveau du SNC
comparé aux transferts isolés des populations.
Dans le même esprit de recherche d’une synergie entre les effecteurs de l’immunité adaptative,
des transferts adoptifs de LT-CD8+ spécifiques de HA différenciés in vitro en Tc1 suivis d’injection
d’anticorps démyélinisants (anti-MOG) ont été réalisés chez les souris MOG-HA. Cette injection
d’anticorps potentialise également le phénotype induit par le transfert de Tc1 seuls. Ceci est associé à
un recrutement précoce des molécules du complément au niveau des lésions.
Ces travaux ont ainsi permi de conclure en une synergie d’action entre les LT-CD8+ spécifique
d’un auto-antigène et d’autres effecteurs de l’immunité adaptotive tels que les LT-CD4+ et les Ac.
7
SUMMA
SUMMARY
Multiple sclerosis is a multifactoriral chronic inflammatory disease characterized by numerous
inflammatory infiltrats (T lymphocyte, B lymphocyte, activated macrophages, microglia) and by focal
lesions resulting in a demyelination of axons and loss of oligodendrocytes. To understand the
pathogenic role of LT-CD8+ and the implication of the other effectors of the adaptive immunity such
as auto-reactive CD4+-T cells and auto-Ab, adoptive transfers of CD8+-T cells specific for HA
differentiated in vitro in Tc1 and\or CD4+-T cells specific of HA differentiated in vitro in Th1 were
performed in mice MOG-HA (expressing the neo-auto-antigen exclusively in oligodendrocytes). We
then followed the clinical and pathological consequences of the inflammation of central nervous
system (CNS).
The obtained results showed that the isolated transfer of Th1 does not provoke visible clinical
signs: no weight loss nor decrease of the physical performances during an effort in spite of the
presence of an inflammation (without demyelination). The isolated transfer of Tc1 resulted in 30 % of
cases in weight loss as well as a reduced mobility. At the histological level, there is a massive
infiltration of T cells after this Tc1 transfer leading to a severe inflammation of CNS and a
demyelination of axons. The co-transfer of both populations aggravates these clinical and histological
signs suggesting a cooperation of both lymphocytes populations in the CNS. Complementary analyses
by flow cytometry allowed to characterize the immune cells that had infiltrated the CNS. We were so
able to show that there was a difference at the level of the activation of the microglia between the
various types of transfer. Indeed, during the co-transfer Tc1 / Th1, an important activation of
microglia, macrophages and a more important recruitment of dendritic cells and T cells in the CNS
was observed compared to transfers of isolated populations.
In the same spirit of research for synergy between the effectors of the adaptive immunity,
adoptive transfers of CD8+-T cells specific of HA differentiated in vitro in Tc1 followed by injection
of demyelinating antibody ( anti-MOG ) were realized in mice MOG-HA. This injection of antibody
also potentialise the phenotype induced by the transfer of Tc1. This is associated with an early
recruitment of complement factors at the level of the lesions.
So, these works permit to conclude in a synergy between CD8+-T cells specific of an autoantigene and others effectors of the adaptative immunity such as CD4+-T cells and Ab.
8
LISTE DES ILLUSTRATIONS
ILLUSTRATIONS
FIGURE 1 :
Organisation tissulaire du système immunitaire
FIGURE 2 :
Les composants cellulaires du système immunitaire
FIGURE 3 :
Structure d’une molécule de classe I du CMH
FIGURE 4 :
Structure d’une molécule de classe II du CMH
FIGURE 5 :
Le complexe TCR-CD3
FIGURE 6 :
La molécule CD4 et son interaction avec le CMH de classe II
FIGURE 7 :
La molécule CD8 et son interaction avec le CMH de classe I
FIGURE 8 :
Adhésion des lymphocytes T et diapédèse
FIGURE 9:
La synapse immunologique
FIGURE 10 :
Voie de transduction du signal et d’activation d’une cellule T
FIGURE 11:
Le développement thymique
FIGURE 12:
Le développement thymique
FIGURE 13 :
Mécanisme de tolérance thymique
FIGURE 14:
Le choix du lignage CD4/CD8 : les modèles instructifs et sélectifs
FIGURE 15 :
Le choix du lignage CD4/CD8 : le modèle force du signal
FIGURE 16 :
Influence des signaux environnementaux et des facteurs de transcription
sur le choix du lignage CD4/CD8
FIGURE 17 :
Les voies de différenciation des lymphocytes T CD4+
FIGURE 18 :
Nature des antigènes restreints aux tissus périphériques exprimés
par les cellules épithéliales thymiques médullaires
FIGURE 19 :
Les différents mécanismes d’induction de tolérance périphérique
FIGURE 20:
Les cellules myéloïdes tolérogènes dans la tolérance active
FIGURE 21:
Composition de la gaine de myéline
FIGURE 22 :
Représentation schématique des cellules constituants le SNC.
FIGURE 23 :
Les différentes barrières au niveau du SNC
FIGURE 24 :
Hypothèse du trajet intracérébral d’un antigène.
FIGURE 25 :
Le système humoral dans la sclérose en plaques et l’EAE
FIGURE 26 :
Schéma récapitulatif de la pathogenèse de la SEP et EAE
FIGURE 27 :
Souris MOG-HA
FIGURE 28 :
Schéma de la construction de la souris transgénique MOG-Cre
FIGURE 29 :
Schéma de la construction de la souris transgénique RoSA26-HA .
TABLEAU 1 :
liste non exaustive des produits des gènes activés au cours de la
signalisation au sein des lymphocytes T (adapté (Crabtree 1989)
TABLEAU 2 :
Les différentes classes de maladies auto-immunes
9
ABBREVIATIONS
A2AR
Ac
ADCC
ADE
ADN
AEP
Ag
AHR
AICD
AIRE
AMP
APECED
AQP4
ARN
ATP
B-reg
BAFF
BCR
BHE
BME
CAM
CD
CD (xx)
CDR
cellule ES
CLIP
CMH
CNS
CPA
cTEC
CTL
DN
DP
EAE
EBV
ERAD
ERAP
GFAP
GM-CSF
Gzm
HA
HAM/TSP
HEV
HHV6
HLA
HLV
Adenosine Receptor 2A
Anticorps
Antibody-Dependant Cell-mediated Cytotoxicity
Encéphalomyélite aiguë dissiminée
Acide DésoxyriboNucléique
Asparagine Endopeptidase
Antigène
Aryl Hydrocarbon Recepteur
Activation Induced Cell Death
AutoImmuneREgulator gene
Adenosine MonoPhosphate
Autoimmune Polyendocrinopathy Candidiasis Ectodermal Dstrophy
Aquaporine 4
Acide RiboNucléique
Adenosine TriPhosphate
B régulateur
B cell Activating Factor of TNF Family
B-Cell Recepteur
Barrière Hémato-Encéphalique
Barrière MéningoEncéphalique
Complexe d'Attaque Membranaire
Cellule Dendritique
Cluster of Differenciation (xx)
Complementarity Determining Region
cellule Souche Embryonnaire
Class II associated Invariant chain Peptides
Complexe Majeur d'Histocompatibilité
Central Nervous system
Cellule Présentatrice d'Antigène
Cellule corticale de l'Epithélium Thymique
Cellule T Lytique
Double Négatif
Double Positif
Encéphalomyélite Autoimmune Expérimentale
Epstein Barr Virus
Endoplasmic Reticulum Associated Degradation
Endoplasmic Reticulum Amino Peptidase
Glial Fibrillary Acidic Protein
Granulocyte Macrophage Colony Stimulating Factor
Granzyme
Hemaglutinine du virus Influenza
HTLV-1-Associated Myelopathy/Tropical Spastic Paraparesis
High Endothelial Venules
Herpes Virus de type 6
Human Leucocyte Antigens
Human Leukaemia Virus
10
HSV
HTLV-1
IBB
IBD
ICA
ICAM
ICOS-L
IDO
IFN
Ig
IL
iNKT
ITAM
ITIM
KGF
LAG3
LAT
LB
LBP
LCMV
LCR
LED
LFA1
LPS
LT
M2
MAG
MALT
MBP
MdSC
MMP
MOG
Mtec
NFAT
NFKB
NK
NKT
NMO
NO
NOD
NODS
NOS2
OLP
OLS
OVA
PAMPS
PC
PCR
PFN
PI3K
Herpes Simplex Virus
Human T-Lymphotropic Virus type 1
Barrière Immuno-Encéphalique
Inflammatory Bowel Disease
Islet Cell Antibody
Intercellular Adhesion Molecule
Inducible Costimulator Ligand
Indoleamine 2,3-DiOxygenase
Interferon
Immunoglobuline
Interleukine
invariant NKT
Immunoreceptor Tyrosine-based Activation Motif
Immunoreceptor Tyrosine-based Inhibition Motif
Keratocyte Growth Factor
Lymphocyte Activation Gene 3
Linker for Activation of T cells
Lymphocyte B
Lipopolysaccharide Binding Protein
Lymphocytic Choriomeningitis Virus
Liquide Céphalo-Rachidien
Lupus Erythémateux Disséminé
Lymphocyte Function-Associated molecule
LipoPolySaccharide
Lymphocyte T
Macrophage de type 2
Myelin Associated Glycoprotein
Mucosa-Associated Lymphoïd Tissue
Myelin Basic Protein
Myeloid-derived Suppressor Cell
Matrix MetalloProtéinase
Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein
Cellule Epithéliale Thymique medullaire
Nuclear Factor of Activated T cells
Nuclear Factor kB
Natural Killer
Natural Killer T
Neuromyélite Optique de Devic
Oxyde Nitrique
Non-Obese-Diabetic
Nucleotide-binding Oligomerization Domain Proteins
Oxyde Nitrique Synthase 2
Organe Lymphoïde Primaire
Organe Lymphoïde Secondaire
Ovalbumine
Pathogen-Associated Molecular Patterns
Plexus Choroïde
Proteine C Réactive
Perforine
Phosphoinositide Kinase 3
11
PKC
PKR
PLP
PRR
Pten
RE
ROG
ROR
ROS
RR
SEP
SH2
SI
SLE
SNC
SOCS1
SP
TAP
TCR
TEC
TGF
TLR
TNF
T-reg
TRAIL
TSH
VIH
VIP
VDR
Proteine Kinase C
Protéine Kinase R
Proteolipid Protein
Pattern-Recognition Receptors
Phosphatase ant tensin homolog
Réticulum Endoplasmique
Repressor Of Gata-3
Retinoïd-related Orphan Receptor
Reactive Oxygen Species
Risque Relatif
Scérose En Plaques
Src Homology 2
Synapse Immunologique
Lupus Erythémateux Systémique
Système Nerveux Central
Suppressor of Cytokine Signaling
Simple Positif
Transporter associated with Antigen Processing
T-Cell Receptor
Cellule Epithéliale Thymique
Tumor Growth Factor
Toll Like Recepteur
Tumor Necrosis Factor
lymphocyte T régulateur
Tumor necrosis factor Related Apoptosis Inducing Ligand
Thyroid Stimulating Hormon
Virus de l'Immunodéficience Humaine
Vasoactive Intestinal Peptide
Vitamine D Receptor
12
INTRODUCTION
13
LE SYSTEME IMMUNITAIRE
1. Généralités
a. Définition et rôles du système immunitaire
Le système immunitaire est un système de défense remarquablement adaptatif qui nous
protège des pathogènes aussi variés que les virus, les bactéries, les champignons et les
parasites. Il est composé d’une multitude de cellules et de molécules composant un réseau
dynamique capable de reconnaître spécifiquement et d’éliminer un grand nombre de microorganismes étrangers.
D’un point de vue fonctionnel, la protection immunitaire peut être divisée en deux
activités apparentées : la reconnaissance et la réponse. La reconnaissance immunitaire est
remarquable par sa capacité à distinguer les composants étrangers de ceux du Soi. En effet, le
système immunitaire est capable de reconnaître des profils moléculaires qui caractérisent des
groupes de pathogènes présentant des caractéristiques connues, et de fournir une réponse
rapide dirigée contre ces pathogènes. Il peut également détecter les subtiles différences
chimiques qui distinguent un pathogène étranger d’un autre. Et surtout, il peut faire la
discrimination entre les molécules étrangères et les cellules ou protéines de l’organisme qui le
possède (discrimination Soi – non Soi). Cependant, il arrive parfois que ce système puisse être
défaillant. Il devient alors délétère pour l’organisme en s’attaquant à certains organes comme
s’il s’agissait de corps étrangers provoquant ainsi des maladies auto-immunes.
Typiquement, la reconnaissance d’un pathogène conduit à une réponse effectrice qui
élimine ou neutralise l’organisme étranger. Dans une telle réponse, les divers composants du
système immunitaire sont capables de convertir l’évènement de reconnaissance initial en
différentes réponses effectrices, chacune étant conçue spécifiquement pour éliminer un type
particulier de pathogène. Une exposition ultérieure au même organisme étranger peut induire
une réponse mémoire, caractérisée par une réaction immunitaire plus rapide et plus intense,
permettant un contrôle précoce des agents infectieux, prévenant ainsi les infections. Le
principe de cette mémoire est à la base de la vaccination qui consiste, en réalité, en une
éducation du système immunitaire, préparant ainsi l’organisme à de futures expositions au
même organisme étranger et lui permettant de répondre plus rapidement et plus efficacement.
14
Bien que l’on fasse référence au système immunitaire, il est important de mentionner
qu’il existe deux systèmes de l’immunité, l’immunité innée et l’immunité adaptative qui ne
cessent de collaborer pour protéger l’organisme.
L’immunité innée :
L’immunité innée est l’ensemble des mécanismes cellulaires et moléculaires
préexistants à une infection dans un organisme.
Cette première ligne de défense, très efficace, empêche la plupart des infections de se
propager et permet ainsi d’éliminer l’agent infectieux dans les quelques heures qui suivent sa
rencontre avec l’organisme.
De prime abord, le système immunitaire utilise ses barrières physiques. En effet, le
premier obstacle rencontré par les pathogènes sont les barrières anatomiques protectrices de
l’hôte. C’est l’exemple de la peau et de la surface des muqueuses qui constituent des barrières
efficaces contre l’entrée de la plupart des microorganismes. L’acidité de l’estomac et de la
transpiration empêche également le développement des organismes incapables de se
développer dans des conditions acides. Les enzymes, comme le lysozyme, qui sont présentes
dans les larmes peuvent également contribuer à cette défense en altérant la paroi cellulaire de
certaines bactéries.
Au-delà de ces premières barrières, l’immunité innée comporte non seulement des
acteurs cellulaires, comme les phagocytes mis en évidence par Metchnikoff (Williamson
1973), mais aussi des composants anti-microbiens synthétisés par l’hôte, et des molécules
solubles comme les interférons et les facteurs du complément. L’ensemble de ces mécanismes
permet de reconnaître et neutraliser ces organismes étrangers. Cependant, les éléments de
reconnaissance du système immunitaire inné, capables de discriminer le Soi du non Soi, ne
sont pas spécialisés dans la reconnaissance des différences subtiles entre les molécules
étrangères. La plupart de ces molécules de l’immunité innée ont ainsi développé la capacité
de reconnaître des groupes ou ″patterns″ de molécules communément retrouvés sur certains
pathogènes via des récepteurs appelés PRR (Pattern-Recognition Receptors). Ces récepteurs
reconnaissent des molécules aux motifs structuraux conservés présents sur l’enveloppe des
microorganismes mais absents des cellules eucaryotes : les PAMPS (Pathogen-Associated
Molecular Patterns). Nous pouvons, parmi ces récepteurs de l’immunité innée, distinguer trois
groupes : les PRR solubles, les PRR membranaires et les PRR intracellulaires. Parmi les PRR
sécrétés, nous pouvons citer la protéine C réactive (PCR) responsable de l’activation du
complément et de l’opsonisation, la protéine liant le lippoppolysaccharide (LBP) permettant
15
de réduire la production cellulaire de cytokines et chimiokines pro-inflammatoires ou les
lectines de type C qui reconnaissent les hydrates de carbone contribuant ainsi à la migration
des cellules immunitaires au sein de l’organisme et permettant la phagocytose. Les PRR
membranaires sont très nombreux. Ils comprennent les récepteurs au complément (CD14,
CD3 et récepteurs Fc) qui permettent l’opsonisation et la phagocytose des pathogènes, les
récepteurs au mannose qui sont des récepteurs de phagocytose et les récepteurs scavengers
liant les lipoprotéines oxydées qui véhiculent le cholestérol destinées à être éliminées par
phagocytose et jouant un rôle dans la clairance des corps apoptotiques et dans le métabolisme
lipidique. Parmi tous ces PRR, la famille la plus connue reste à ce jour les TLR (Toll like
recepteur) permettant la synthèse de cytokines pro-inflammatoires, de chimiokines,
d’interféron de type I, l’augmentation de l’expression de molécules de co-stimulation ainsi
que la maturation des cellules présentatrices d’antigènes faisant un lien avec l’immunité
adaptative. Les PRR intracellulaires plus récemment découverts sont composés quant à eux
des récepteurs PKR et NODs (Nucleotide-binding oligomerization domain proteins)
responsables de l’autophagie des pathogènes (McGuinness, Dehal et al. 2003).
L’immunité adaptative.
Cependant, il arrive que l’immunité innée ne soit pas suffisante et que le pathogène
parvienne à échapper à cette première ligne de défense. Ainsi, afin de reconnaître et
d’éliminer cette fois-ci sélectivement les pathogènes, il existe une seconde forme d’immunité,
connue sous le nom d’immunité adaptative, dépendante de l’immunité innée, qui se met en
place quelques jours après l’infection initiale.
Cette réponse constitue une seconde ligne de défense qui permet d’éliminer les
pathogènes qui ont échappé à la réponse innée ou qui persistent malgré cette réponse. Cette
réponse adaptative nécessite la communication entre deux populations cellulaires : les
lymphocytes et les cellules présentatrices d’antigène (CPA). Les lymphocytes sont l’un des
nombreux types de cellules blanches du sang produites dans la moelle osseuse par le
processus de l’hématopoïèse et jouant un rôle important dans cette immunité. Ces
lymphocytes quittent la moelle osseuse, circulent dans le sang et les vaisseaux lymphatiques
et résident dans différents organes lymphoïdes. Parce qu’ils produisent et exposent à la
surface de leur membrane des récepteurs qui fixent l’antigène, les lymphocytes portent les
attributs spécifiquement immunologiques de spécificité, de diversité, de mémoire et de
reconnaissance du Soi et du non Soi. Deux populations de lymphocytes coexistent dans
l’organisme : les lymphocytes B (LB), sécréteurs d’anticorps, conduisant à une immunité
16
humorale et les lymphocytes T (LT), schématiquement divisés en cellules auxiliaires et en
cellules cytotoxiques, conduisant à une immunité cellulaire. Les cellules présentatrices
d’antigènes, quant à elles, sont en charge de capturer l’antigène, qu’il soit intra ou
extracellulaire et de le présenter aux lymphocytes afin d’initier cette réponse adaptatrice.
Cependant, il arrive que ce système immunitaire faillît à sa fonction de protection
adéquate de l’hôte ou oriente mal ses activités, provoquant ainsi maladie ou même mort. Il
existe à ce jour plusieurs manifestations fréquentes d’un dysfonctionnement immunitaire
comme l’allergie ou l’asthme, ou les maladies auto-immunes ou encore les déficits
immunitaires. Pour l’asthme et l’allergie par exemple, l’organisme atteint présente des
réponses immunitaires inappropriées, souvent contre des antigènes banals, comme certains
pollens de plantes ou des aliments. Chez certains individus, le dysfonctionnement de ce
système immunitaire peut aussi être dû à la perte de son sens de discrimination du Soi et du
non Soi, ce qui permet une attaque immunitaire contre les composants de l’organisme qui
l’héberge: il s’agit de l’auto-immunité, pouvant être à l’origine de maladies chroniques
invalidantes.
b. Description générale du système immunitaire
i. Les organes
Organes lymphoïdes primaires (OLP) [figure 1] :
Les organes lymphoïdes primaires sont composés du thymus, de la moelle osseuse et du
foie (chez le fœtus). Les lymphocytes immatures générés par l’hématopoïèse effectuent leur
maturation dans ces OLP où ils acquièrent une spécificité antigénique particulière. Ce n’est
qu’après cette maturation qu’un lymphocyte devient une cellule immunocompétente. Chez les
mammifères, les cellules T effectuent leur maturation dans le thymus et les cellules B dans la
moelle osseuse.
Organes lymphoïdes secondaires (OLS) [figure 1] :
Les plus organisés de ces organes sont la rate et les ganglions. Alors que les ganglions
lymphatiques sont spécialisés dans la capture antigénique venant des tissus environnants, la
rate est spécialisée dans la filtration du sang et la capture des antigènes circulants. Ces deux
OLS comprennent non seulement des follicules primaires constitués d’un réseau de cellules
dendritiques folliculaires et de petites cellules B au repos, mais également des régions
17
distinctes supplémentaires d’activité de cellules T et de cellules B, le tout entouré d’une
capsule fibreuse. Un tissu lymphoïde un peu moins organisé, appelé tissu lymphoïde associé
aux muqueuses (MALT) est également rencontré dans différentes régions du corps comme les
plaques de Peyer (dans l’intestin), les amygdales et l’appendice ainsi que les nombreux
follicules de la lamina propria des intestins et des muqueuses qui bordent les voies aériennes
supérieures, les bronches et le tractus génital.
Organes Lymphoïdes Secondaires
Organes Lymphoïdes Primaires
Ganglions lymphatiques
cervicaux
Amygdales
Thymus
Ganglions lymphatiques
axilaires
Moelle osseuse
Rate
Ganglions mésentériques
Plaques de Peyer
Ganglions lymphatiques
inguinaux
FIGURE 1 : Organisation tissulaire du système immunitaire
Notre organisme est constitué au niveau immunologique d’organes lymphoïdes primaires ou
OLP constitués par le thymus et la moelle osseuse et d’organes lymphoïdes secondaires ou
OLS tels que les divers ganglions et la rate. Ces organes sont des sites privilégiés de
rencontre entre les antigènes et les cellules du système immunitaire.
18
ii. Les cellules
Cellule souche
hématopoïétique
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sont requis pour visionner cette image.
Auto-renouve l
lement
Cellule dendritique
Progéniteur
myeloïde
Progéniteur
lymphoïde
C
e
l l u
l e
NK
Cellule NK
LT auxiliaire
Basophile
Myeloïde basophile
Progéniteur T
LT cytotoxique
Eosinophile
Myeloïde éosinophile
Progéniteur B
Neutrophile
LB
Granulocytemonocy te
Macrophage
Cellule dendritique
Plaquettes
Erythrocytes
Mégacaryocyte
Erythroblaste
FIGURE 2 : Les composants cellulaires du système immunitaire
Toutes les cellules du système immunitaire sont issues de précurseurs
hématopoïétiques de la moelle osseuse. Ces précurseurs, suivant le milieu cytokinique
dans lequel ils sont, se différencieront soit en progéniteurs myeloïdes à l’origine des
érythrocytes, plaquettes, macrophages, éosinophiles, basophiles et cellules dendritiques
soit en progéniteurs lymphoïdes à l’origine des cellules NK, des lymphocytes T et B et des
cellules dendritiques.
19
Les cellules monocytaires-macrophagiques : [figure 2]
Au cours de l’hématopoïèse dans la moelle osseuse, des cellules progénitrices se
différencient en promonocytes puis quittent la moelle et passe dans le sang où ils vont se
différencier en monocytes. Ces derniers vont circuler dans le sang pendant 8H, période durant
laquelle ils grossissent et migrent vers les tissus où ils se différencient en macrophages tissusspécifiques. Ainsi suivant le tissu où ils résident et leur fonction, ces macrophages sont
appelés macrophages alvéolaires dans le poumon, histiocytes dans les tissus conjonctifs,
cellules de Kupffer dans le foie, cellules mésangiales dans le rein, cellules microgliales dans
le cerveau ou encore ostéoclastes dans les os. Ces cellules font partie intégrante du système
phagocytaire mononucléé responsable de la digestion et de la présentation antigénique.
Les cellules granulocytaires : [figure 2]
Ces cellules sont classées selon leur morphologie en neutrophiles, éosinophiles et
basophiles. Chaque sous-population possède un rôle spécifique.
Les neutrophiles ont un rôle primordial de phagocytose lorsqu'ils rencontrent une cellule
étrangère ou infectée. La phagocytose se déroule juste après la stimulation du neutrophile par
un antigène porté par la cellule cible (cet antigène étant le plus souvent un fragment de
membrane bactérienne ou un fragment de virus, reconnu comme étranger). Le neutrophile va
alors émettre des pseudopodes (longs prolongements cytoplasmiques) qui vont entourer la
cellule cible, et finir par l'inclure dans le corps cellulaire du neutrophile. Des vacuoles
contenues dans ces neutrophiles fusionnent alors avec la vacuole de phagocytose : leur
contenu (lysozyme et granulations sécrétoires) détruit la cellule cible par un mécanisme
toxique. Les éosinophiles sont des cellules clés de l'inflammation allergique. Elles
représentent de 2 à 5% des leucocytes circulants impliqués dans la défense antiparasitaire. Les
basophiles sont les plus rares des granulocytes (0.5%, et même absent chez certaines
personnes). Leurs inclusions cytoplasmiques contiennent de nombreuses molécules
chimiques, et en particulier l’histamine, la sérotonine, et l’héparine. L'histamine et l'héparine
servent à empêcher la coagulation dans les vaisseaux sanguins, mais aussi à augmenter la
perméabilité des capillaires, ouvrant ainsi la voie à la diapédèse. L'histamine active la réaction
inflammatoire et intervient également dans les réactions allergiques. Ces cellules activées
jouent un rôle majeur dans l'inflammation, capables de relarguer leurs vacuoles au contact
d'allergènes auxquels ils sont sensibles.
20
Les mastocytes : [figure 2]
Le mastocyte est une cellule granuleuse présente essentiellement dans les tissus
conjonctifs, qui se caractérise par la présence dans son cytoplasme de très nombreuses
granulations contenant des médiateurs chimiques. Une de ces principales caractéristiques est
d’exprimer à sa membrane le récepteur de haute affinité des IgE (FcεRI), dont l’agrégation
par des complexes IgE-allergène induit la dégranulation mastocytaire, évènement à l’origine
des réactions d’hypersensibilité immédiate. Les mastocytes produisent de nombreux
médiateurs physiologiques (l’histamine, l'héparine, les prostaglandines, le PAF, l'ECF-A, des
leucotriènes et des enzymes protéolytiques) qui jouent un rôle important dans des processus
variés : hypersensibilité de type immédiate, inflammation, défense vis-à-vis de certaines
bactéries ou parasites, réponse à une prolifération tumorale, processus de cicatrisation et de
fibrose, angiogénèse.
Les cellules dendritiques : [figure 2]
Identifiées en 1868 lors d’une étude anatomique de la peau par Paul Langherans, les
cellules dendritiques (CD) ont été les premières cellules découvertes du système immunitaire.
Ces cellules présentent des caractéristiques originales qui rendent difficile leur étude. En effet,
ces cellules, en plus du fait qu’elles soient rares dans l’organisme, présentent une très grande
plasticité phénotypique, morphologique et fonctionnelle. Phénotypiquement, on caractérise
une cellule par la présence de marqueurs membranaires. Or pour ces CD, il n’existe pas de
marqueur qui les identifie distinctement. De plus, au cours de leur vie, le profil de leur
marqueur évolue. Cette versatilité dépend de leur état (immature ou mature) et de leur
microenvironnement moléculaire (les cytokines produites par les autres cellules mais aussi
par elles-mêmes). Ce profil phénotypique évolue aussi en fonction de leur localisation dans
l’organisme. Cependant, malgré cette complexité et cette plasticité, on peut définir une CD,
indépendamment de son origine, par sa richesse en molécules de CMH de classe II et par sa
capacité phagocytique associée à celle de présentation de l’antigène, permettant ainsi d’initier
la réponse adaptative.
Ces cellules interviennent à différents niveaux dans le système immunitaire et leurs
fonctions diverses et parfois opposées sont accomplies par différentes sous populations de
cellules qui se distinguent sur des bases phénotypiques, morphologiques, ontogéniques et
fonctionnelles.
21
Les cellules dendritiques des tissus non lymphoïdes se trouvent dans l’épiderme où elles
prennent le nom de cellules de Langherans. Elles constituent alors une barrière naturelle à
l’entrée des pathogènes. Après une activation par ces derniers, elles migrent vers les organes
lymphoïdes et sont caractérisées par l’expression du marqueur CD1a.
On retrouve également des CD dans le derme au niveau des espaces interstitiels où elles
sont nommées cellules dendritiques interstitielles.
Les cellules dendritiques des tissus lymphoïdes sont des CD activées (à l’état mature)
qui proviennent d’autres tissus.
Enfin, on retrouve ces CD dans le sang où nous pouvons distinguer deux populations :
les CD d’origine myéloïde et les CD d’origine plasmacytoïde.
Les CD myéloïdes, anciennement appelées CD1 car elles orientent la réponse
immunitaire vers la production de cytokines de type 1 comme l’interféron α et γ, ont des
cellules souches CD34+ localisées dans le foie fœtal, la moelle osseuse et le sang
périphérique. Le progéniteur myéloïde génère des précurseurs circulants dans le sang et la
lymphe qui se déplacent ensuite vers les tissus périphériques où, après différenciation, ils
résident sous forme immature. Cette différenciation révèle deux voies possibles : la voie des
précurseurs CD1a+ qui deviennent les cellules de Langherans de la peau et les précurseurs
CD14+ qui deviennent les CD situées dans la plupart des tissus. Ces précurseurs peuvent aussi
générer des monocytes devenant CD ou macrophages. Ainsi, à l’état immature, ces CD
myéloïdes sont localisées dans les tissus périphériques où elles ont la capacité de capturer les
antigènes et d’activer les cellules de l’immunité innée. En cas d’inflammation, ces cellules
deviennent matures et migrent vers les ganglions lymphatiques où elles jouent leur rôle de
cellule présentatrice d’antigène capable de stimuler les lymphocytes T naïfs.
Les CD plasmacytoïdes, quant à elles, orientent la réponse immunitaire vers la
production de cytokines de type 2 comme l’IL-4 et l’IL-5. Ces cellules sont retrouvées dans
les ganglions, la moelle osseuse ainsi que dans le thymus. Elles possèdent une grande
plasticité fonctionnelle en intervenant dans les mécanismes de tolérance aux auto-antigènes,
en contribuant aux défenses innées virales et bactériennes et en induisant une réponse immune
adaptative.
22
Les cellules lymphoïdes : [figure 2]
Dans un organisme, les lymphocytes représentent 20 à 40% des cellules blanches du
sang et 99% des cellules de la lymphe. Ces lymphocytes peuvent être divisés grossièrement en
trois populations, les cellules natural killer (NK), les lymphocytes B (LB) et les lymphocytes
T (LT), sur la base de leur fonction et des constituants de leur membrane cellulaire.
Les lymphocytes NK sont des cellules de l'immunité innée des mammifères capables de
lyser des cellules étrangères à l'organisme de manière indépendante de l'antigène et sans
activation préalable. Ces cellules NK reconnaissent leurs cellules cibles potentielles de deux
façons différentes : soit grâce à leurs récepteurs activateurs (portant des séquences « ITAM » :
immunoreceptor tyrosine-based activation motif) ou inhibiteurs (portant des séquences
« ITIM » : immunoreceptor tyrosine-based inhibition motif) soit via leur CD16 qui leur
permet de se fixer à des anticorps et, par la suite, lyser les cellules ainsi marquées. Ceci est un
exemple d'un processus connu sous le nom de cytotoxicité cellulaire dépendante des anticorps
(ADCC, Antibody-Dependant Cell-mediated Cytotoxicity). La lyse des cellules cibles quant à
elle se fait principalement par les voies perforine/granzyme, mais également par la voie
Fas/Fas ligand.
Les lymphocytes B ont pour rôle de fabriquer des immunoglobulines appelées
anticorps : ils sont donc responsables de l'immunité humorale. Pour être actifs, d'autres
cellules telles que les macrophages, doivent leur présenter des fragments d'antigène, afin qu'ils
se différencient en plasmocytes. Ces lymphocytes possèdent bien plus de vésicules de Golgi,
qui permettent ainsi de fabriquer des anticorps en masse, afin de neutraliser efficacement les
antigènes.
En ce qui concerne les lymphocytes T, le chapitre suivant leur est entièrement consacré.
αβ
2. Les lymphocytes Tα
Les lymphocytes T (LT) sont générés dans le thymus et expriment à leur surface un
récepteur appelé TCR (pour T-cell receptor) capable de reconnaître des déterminants
antigéniques spécifiques. Il existe deux types de LT différenciés par la structure du TCR
qu’ils expriment, et qui peut être un hétérodimère de chaînes α et β dit LTαβ ou un
hétérodimère de chaînes γ et δ dit LTγδ. Ces derniers sont majoritairement générés au cours
de la vie foetale alors que les LTαβ, auxquels nous allons nous intéresser exclusivement,
constituent plus de 95% des LT produits après la naissance.
23
a. Le récepteur à l’antigène des lymphocytes T (TCR)
Les cellules T peuvent détecter la présence de pathogène qu’il soit intracellulaire ou
extracellulaire. Le ligand reconnu spécifiquement par un TCR donné est un complexe formé
par une molécule de présentation spécifique de l’hôte (le CMH) et un peptide antigénique à la
surface d’une cellule présentatrice d’antigène (CPA).
i. Le complexe majeur d’histocompatibilité (CMH) et ses interactions
peptidiques
Les gènes du CMH
Le CMH est un ensemble de gènes distribués le long d’un fragment d’ADN sur le
chromosome 6 chez l’homme où il est appelé HLA (Human Leukocyte Antigens) alors que
chez la souris il est nommé H2 et se trouve sur le chromosome 17. Ce CMH s’étend sur au
moins 4 centimorgans d’ADN soit environ 4 millions de paires de base. Chez l’homme, il
contiendrait plus de 200 gènes. Bien que la disposition soit quelque peu différente, dans les
deux cas, les gènes du CMH sont organisés en région codant trois classes de molécules :
classe I, classe II et classe III. Nous nous intéresserons ici plus particulièrement aux deux
premières classes, impliquées dans la présentation antigénique aux cellules T, la classe III
codant principalement pour des protéines sécrétées et ayant des fonctions immunitaires telles
que les facteurs C2 et C4 du complément ou des molécules impliquées dans l’inflammation
comme le TNF et les protéines de choc thermique.
Les protéines du CMH
Des études ont tout d’abord permis de caractériser ces molécules du CMH de classe I
et II par isolement et purification. Il a ainsi été défini que les deux types de glycoprotéines
membranaires se comportent comme des molécules présentatrices d’antigène hautement
spécialisées qui forment des complexes très stables avec les peptides antigéniques.
Des études cristallographiques aux rayons X complémentaires ont quant à elles permis
d’analyser la structure tridimensionnelle de leur domaine extracellulaire. Chaque molécule
possède un sillon permettant l’interaction avec une grande variété de peptides dont ces études
cristallographiques ont permis de mieux comprendre les interactions (Fremont, Matsumura et
al. 1992; Stura, Chen et al. 1992; Stern, Brown et al. 1994).
24
Les molécules de classe I [figure 3]
Ces molécules de CMH de classe I (CMH-I) sont exprimées à la surface de toutes les
cellules nucléées de l’organisme à l’exception des érythrocytes, des spermatozoïdes et des
neurones. Cependant, leur niveau d’expression diffère selon les types cellulaires considérés.
Les taux les plus élevés sont retrouvés sur les lymphocytes, où ces molécules constituent
environ 1% des protéines de la membrane plasmique. Ces molécules de classe I résultent de
l’association non-covalente d’une chaîne lourde de 45 kDa comportant
trois domaines
semblables à ceux des immunoglobulines α1, α2 et α3 contenant chacun environ 90 amino
acides, d’un domaine trans-membranaire de 25 amino acides hydrophobes suivi d’un court
fragment hydrophyle, d’un domaine C-terminal intracytoplasmique de 30 acides aminés et de
la β2-microglobuline (12 kDa), dont le gène n’est pas localisé dans le CMH.
FIGURE 3 : structure d’une molécule de classe I du CMH determinée par
cristallographie aux rayons X (Janeway, immunobiology)
a : Représentation graphique d’une molécule humaine de CMH de classe I, HLA-A2.
La surface de la molécule est colorée de manière à ce que chaque domaine puisse être
distingué. Les teintes correspondent à celles qui sont utilisées dans les panneaux b et
d. b et c : représentation par un diagramme en rubans du CMH de classe I. d :
représentation schématique du CMH de classe I et de son ancrage à la membrane.
25
La purification et la cristallisation de la portion extracellulaire ont mis en évidence
deux paires de domaines interactifs : une paire, éloignée de la membrane, constituée des
domaines α1 et α2 et une paire proximale composée des domaines α3 et de la β2microglobuline. Les séquences peptidiques du domaine α3 et de la β2-microglobuline ont des
structures repliées similaires alors que les domaines α1 et α2, en se repliant, ne forment
qu’une seule structure de deux segments d’hélice α allongés sur un feuillet de huit brins β
anti-parallèles. Cette disposition des domaines α1 et α2 crée une grande fente ou sillon,
constituant le site dans lequel les antigènes peptidiques se lient aux molécules du CMH et où
se concentre le polymorphisme qui détermine la reconnaissance de l’antigène par les LT.
Ces molécules de classe I présentent aux LT-CD8+ des peptides de 8 à 10 acides
aminés qui sont ancrés aux deux extrémités par des interactions entre le CMH et les résidus
N- et C- terminaux du peptide (Matsumura, Fremont et al. 1992). Les peptides présentés par
les molécules de classe I du CMH sont en général issus de la dégradation des protéines
endogènes par le protéasome (Baumeister, Walz et al. 1998). L’hypothèse que le cytosol ou le
réticulum endoplasmique (RE) pourraient héberger des protéines capables de protéger ces
peptides et de les acheminer vers le lieu d’assemblage avec les molécules CMH-I a été à
l’origine de plusieurs études. Étant capables de fixer des peptides, les protéines de choc
thermique, abondantes autant dans le cytosol que dans le RE, ont été proposées pour cette
fonction (Srivastava, Udono et al. 1994). Cependant, aucune preuve pour un rôle important de
ces protéines dans l’apprêtement cellulaire des antigènes n’a été rapportée, ce rôle restant
donc hypothétique. Ce qui est certain, c’est que la translocation des peptides antigéniques de
leur lieu de production au site où intervient l’assemblage avec les molécules du CMH-I est
prise en charge par le transporteur TAP (transporter associated with antigen processing) ; ce
dernier est composé de deux sous-unités homologues et appartient à la grande famille des
protéines ABC, qui utilisent l’énergie fournie par l’hydrolyse de l’ATP pour transporter des
solutés à travers les membranes (van Endert, Saveanu et al. 2002). La très faible expression de
molécules CMH-I à la surface de cellules déficientes en TAP témoigne de la nature essentielle
de cette pompe, dont l’expression est induite par l’interféron γ. Les pompes TAP chez les
rongeurs, mais aussi chez l’homme, montrent une spécificité pour la longueur et la séquence
des peptides qui varie entre les espèces et contribue à la sélection des épitopes
immunodominants. Chez toutes les espèces étudiées, TAP semble avoir une préférence pour
des peptides d’une longueur de 8 à 16 résidus, ce qui permet le transport de peptides ayant
26
une longueur optimale pour les molécules de CMH-I. Une fois transportés dans le RE, les
peptides peuvent subir une ultime étape protéolytique qui permet de produire certains épitopes
à partir de peptides précurseurs portant des extensions aminoterminales (Rock, York et al.
2004).
Chez
l’homme,
deux
aminopeptidases,
ERAP1
(endoplasmic
reticulum
aminopeptidase 1) et ERAP2, sont impliquées dans ce processus, alors que la souris
n’exprime qu’ERAP1. Les deux enzymes sont induites par l’interféron γ et peuvent former
des complexes hétérodimériques. Elles possèdent des spécificités distinctes, qui leur
permettent d’agir de façon complémentaire : ERAP1 se fixe sur les acides aminés
hydrophobes, tandis qu’ERAP2 montre une forte préférence pour les acides aminés basiques
(Saveanu, Carroll et al. 2005). Il est intéressant de noter qu’ERAP1 digère de façon
préférentielle les substrats d’une longueur de 9 à 16 résidus, en parfaite adéquation avec la
longueur reconnue par les pompes TAP (Chang, Momburg et al. 2005). La formation d’un
complexe entre un peptide et une molécule CMH-I impliquera par la suite l’action de quatre
protéines chaperonnes différentes, dont trois appartiennent au système de contrôle de qualité
du RE, qui empêche les protéines dont la conformation n’est pas adéquate de sortir de ce
compartiment (Cresswell, Bangia et al. 1999). Du fait de leur faible stabilité en l’absence de
peptide fixé, les molécules CMH-I restent en permanence associées à ces protéines, jusqu’à ce
qu’elles acquièrent un peptide de haute affinité. Les chaînes lourdes nouvellement
synthétisées sont d’abord associées à la calnexine, une lectine « de ménage » du RE qui aide
au repliement correct de glycoprotéines. L’association des chaînes lourdes avec la β2microglobuline est accompagnée par le remplacement de la calnexine par une deuxième
lectine, la calréticuline, ainsi que par l’entrée en jeu de l’ERp57, une oxydoréductase
catalysant la formation des ponts disulfures au sein des chaînes lourdes. Les complexes ainsi
formés se lient enfin directement aux pompes TAP, par l’intermédiaire d’une protéine
chaperonne spécialisée, la tapasine, constituant ainsi les « complexes de chargement » des
molécules CMH-I. La tapasine, une protéine transmembranaire ayant une structure similaire
aux molécules de CMH, n’est pas seulement requise pour rapprocher les molécules de classe I
dépourvues de peptides à la « source » de ces derniers, mais joue aussi un rôle important en
optimisant les peptides présentés par les molécules de classe I. En effet, dans les cellules
déficientes en tapasine, le nombre et la stabilité des molécules CMH-I à la surface sont réduits
de façon importante. Le mécanisme de cette optimisation est encore mal compris, mais la
rétention des molécules de classe I dépourvues de peptide par la tapasine, de concert avec la
calréticuline, semble jouer un rôle important. Cinétiquement stable, ce complexe
peptide/CMH-I migre ainsi à la surface cellulaire via l’appareil de Golgi puis vers la
27
membrane plasmique pour y être présenté aux LT-CD8+ (Germain and Margulies 1993;
Hansen and Bouvier 2009).
Il existe une alternative à cette voie dite endogène qui permet l’apprêtement et la
présentation d’antigènes exogènes par les molécules de classe I aux LT-CD8+ : c’est la
présentation croisée (Stura, Chen et al. 1992; Williams and Brady 2001; Ackerman and
Cresswell 2004). Elle permet aux LT-CD8+ de répondre notamment aux antigènes viraux qui
n’infectent pas directement les CPA. Cette voie se distingue par la communication entre la
voie endosomique, responsable de l’acquisition des antigènes, et les compartiments impliqués
dans leur apprêtement, le cytosol et le RE. La nature précise de cette communication reste
incertaine, mais plusieurs modèles ont été proposés (Saveanu and van Endert 2005). Tout
d’abord, la voie de la présentation croisée via le transport vacuolaire indépendant des TAP :
dans ce modèle, les antigènes endocytés sont fragmentés par des cystéines protéases
(cathepsine S) dans les endosomes. Les peptides sortants de cette fragmentation sont chargés
sur les molécules de CMH-I recyclées au sein même de l’endosome. Les nouveaux complexes
peptide/CMH-I sont alors exportés à la membrane plasmique où ils peuvent présenter le
peptide aux LT-CD8+. Les autres voies envisagées sont elles dépendantes des TAPs. Nous
pouvons citer le modèle de la translocation rétrograde où les antigènes solubles sont
directement redirigés vers le RE, suivant le retro-transport du réseau trans-golgien et
l’appareil de Golgi. Une fois dans le RE, l’antigène est retro-transloqué dans le cytosol via la
machinerie ERAD (Endoplasmic Reticulum Associated Degradation) puis présenté selon la
voie classique des protéines endogènes sur les CMH de classe I. Une troisième voie
phagosomale dépendante des TAPs est également décrite. Cette voie s’appuie sur la présence
de composants du RE dans les phagosomes. Les antigènes ainsi phagocytés utilisent un canal
Sec61 (translocon) pour sortir du phagosome, être segmentés par le protéasome et réimportés
dans le phagosome pour être chargés sur les molécules de CMH de classe I qu’ils contiennent.
Une fois chargées, les molécules de CMH de classe I transitent vers la membrane plasmique
et peuvent présenter l’antigène aux LT-CD8+. Une nouvelle voie endosomale dépendante des
TAPS a récemment été suggérée. Via un signal TLR4/MyD88, les TAPS seraient recrutées
vers l’endosome précoce. Les antigènes ainsi endocytés sortiraient de l’endosome par un
transporteur encore inconnu et subiraient une protéolyse par le protéasome et une
rétrotranslocation via les TAPs de l’endosome où ils seraient chargés sur les molécules de
CMH de classe I. Ces nouveaux complexes seraient alors exportés vers la membrane
plasmique pour jouer leur rôle auprès des LT-CD8+ (Raghavan, Del Cid et al. 2008).
28
Les molécules de classe II [figure 4] :
Ces molécules de classe II (CMH-II) ne sont exprimées que par les cellules
monocytaires/macrophagiques, les cellules dendritiques (de Saint-Vis, Vincent et al. 1998),
les LB (Lanzavecchia 1990) et dans certaines espèces comme l’homme et la souris par les LT
activés (Lal, Shaila et al. 2005).
FIGURE 4 : structure d’une molécule de classe II du CMH determinée par
cristallographie aux rayons X (Janeway, immunobiology)
a : Représentation graphique d’une molécule humaine de CMH de classe II, HLADR1. La surface de la molécule est colorée de manière à ce que chaque domaine
puisse être distingué. Les teintes correspondent à celles qui sont utilisées dans les
panneaux b et d. b et c : représentation par un diaphragme en rubans du CMH de
classe II. d : représentation schématique du CMH de classe II et de son ancrage à la
membrane.
Ce sont des molécules hétérodimériques
composées de deux glycoprotéines
transmembranaires : une chaîne α de 30-32kDa associée de façon non covalente à une chaîne
β de 27-29 kDa (Beck and Trowsdale 1999). Le domaine NH2 des chaînes α et β forme un
29
sillon pouvant fixer des peptides de 12 à 24 acides aminés pour les présenter aux LT-CD4+
(Pieters 2000). Le sillon ainsi formé est ouvert à chaque extrémité permettant l’accès au
peptide à la fois des cotés N- et C- terminaux (Stern, Brown et al. 1994). Ces peptides
proviennent de la dégradation d’antigènes extracellulaires internalisés par endocytose ou de
protéines endogènes ayant accès à ce compartiment cellulaire (Brodsky and Guagliardi 1991;
Germain and Margulies 1993). De nombreuses familles de protéases sont présentes dans les
compartiments endocytiques, dont les cathepsines. On distingue les cathepsines B, H, L
(cystéine protéases) et les cathepsines D et E (aspartyl protéases), qui ont pu être colocalisées
avec les molécules de classe II dans ces vésicules. Chaque protéase est caractérisée par des
sites préférentiels de clivage et l'action simultanée de plusieurs protéases a été mise en
évidence pour certains antigènes.
Les molécules de classe II sont synthétisées dans le réticulum endoplasmique, où
s'associent trois dimères αβ avec un trimère de chaîne invariante. Les nonamères ainsi formés
sont exportés vers les endosomes via l'appareil de Golgi. La chaîne invariante est une protéine
chaperonne qui exerce plusieurs fonctions auprès des molécules de classe II. Tout d'abord,
elle contribue à l'assemblage des chaînes α et β nouvellement synthétisées et assure leur
stabilisation dans le réticulum sous une conformation permettant leur transport vers la voie
endocytique. Elle empêche également la fixation de peptides endogènes, présents dans le
réticulum ou le réseau de Golgi, aux molécules de classe II. De plus, des signaux localisés
dans la région cytoplasmique de la chaîne invariante sont responsables du transport des
molécules de classe II depuis le réticulum endoplasmique vers la voie endocytique.
Au niveau des endosomes, la chaîne invariante est progressivement dégradée par des
protéases auxquelles résistent les molécules de classe II. Quelques fragments peptidiques
restent temporairement associés aux dimères αβ de molécules de classe II. En particulier,
différents peptides de la région 81-104, appelés peptides CLIP (pour "class II associated
invariant chain peptides"), isolés lors de l'élution des peptides naturels associés aux molécules
de classe II, sont associés au dimère αβ et empêchent la fixation de peptides endogènes. Deux
modes d'interaction ont été envisagés pour les peptides CLIP. D'une part, les motifs
d'interaction de CLIP avec les molécules de classe II sont semblables aux motifs des peptides
ligands naturels et cette interaction est modulée par le polymorphisme allélique des molécules
de classe II, ceci suggérant la fixation de CLIP dans le sillon peptidique de la molécule de
classe II. D'autre part, la fixation d'autres peptides pourrait être inhibée par un blocage
30
allostérique exercé par CLIP. En fait, la structure cristallographique de CLIP associé à la
molécule HLA-DR3 a révélé qu'il se fixe au niveau du sillon peptidique de façon quasiment
identique aux peptides antigéniques. La protéolyse de la séquence correspondant à CLIP
permet de démasquer le site de liaison au peptide et supprime le signal de rétention dans les
endosomes pour le dimère αβ, qui peut alors s'associer à un peptide antigénique. La
dissociation entre la chaîne invariante et les molécules de classe II dépend donc d'une part, de
l'activité protéolytique des endosomes et d'autre part, de l'affinité de la chaîne invariante pour
les différents allèles des molécules de classe II. L'étude de LB déficients dans la présentation
d'antigènes exogènes et mutés dans les gènes HLA-DM, situés dans la région des gènes des
molécules de classe II, a suggéré un rôle primordial des molécules DM pour la liaison de
peptides aux molécules de classe II. L'équivalent de ces molécules DM a également été
identifié chez la souris et est appelé molécules H2-M. Des travaux récents ont montré que les
protéines DM catalysent la dissociation de peptides déjà présents sur les molécules de classe
II, dont CLIP, permettant l'échange de CLIP contre des peptides antigéniques. Ces résultats
sont confirmés par l'étude de souris n'exprimant plus les molécules H2-M par des mutations
au niveau des gènes codant pour ces protéines. Les cellules spléniques de ces animaux
expriment à leur surface des molécules de classe II stables auxquelles sont fixés surtout des
peptides dérivés de la chaîne invariante. Ces cellules ne sont pas, ou peu, capables de
présenter des protéines ou des peptides à des cellules T. De plus, l'activité des molécules
HLA-DM est optimale dans un environnement acide (pH=5) correspondant au pH des
vésicules tardives ou lysosomiales de la cellule, où sont générés les peptides antigéniques.
Les molécules de classe II associées à la chaîne invariante sont ainsi transportées
depuis le réticulum endoplasmique, à travers le réseau golgien vers la voie endocytique.
Cependant, il n'y a pas à l'heure actuelle, de consensus sur la distribution et le trafic des
complexes classe II-chaîne invariante parmi les différents compartiments de la voie
endocytique, que constituent schématiquement les endosomes précoces, les endosomes tardifs
et les lysosomes. La liaison de peptides aux molécules de classe II a t-elle lieu dans un
compartiment unique, ou au contraire dans les différentes vésicules constituant la voie
endocytique? La notion d'un compartiment endocytique spécialisé dans l'accumulation des
molécules de classe II et où aurait lieu leur rencontre avec les peptides antigéniques a été
initialement suggérée par une étude morphologique et immunocytochimique d'une lignée
lymphoblastoïde B humaine. Les molécules de classe II ont été révélées dans un
compartiment prélysosomal en absence de chaîne invariante, mais elles n'ont pas été détectées
dans les endosomes précoces, suggérant un transport direct des molécules de classe II vers
31
cette vésicule. Par ailleurs, les molécules de classe II ont été localisées dans les lysosomes et
les phagolysosomes de macrophages ayant capté des bactéries Listeria monocytogenes par
phagocytose. Les complexes peptide-classe II ont également été retrouvés au niveau de
prélysosomes dans les macrophages.
Plus récemment, à l'aide de techniques de fractionnement subcellulaire des vésicules
de la voie endocytique, plusieurs études analysant des LB ont mis en évidence un
compartiment endocytique spécialisé, appelé CIIV (vésicule de classe II) où sont retrouvées
les molécules de classe II nouvellement synthétisées, associées de façon stable à des peptides
antigéniques. Les molécules de classe II ayant perdu leur chaîne invariante dans les
endosomes, seuls des peptides de la région CLIP provenant de la chaîne invariante ont été
retrouvés associés aux molécules de classe II dans ces compartiments CIIV. L'association de
peptides antigéniques aux molécules de classe II s'effectuerait dans ce compartiment, différent
des endosomes précoces, tardifs ou lysosomaux, auquel toutefois, les antigènes internalisés
par endocytose auraient accès. Au contraire de ce compartiment spécialisé dans la liaison
peptide-classe II, une étude sur des lymphoblastes B spléniques de souris a révélé la présence
de complexes classe II-chaîne invariante et de complexes classe II-peptide antigénique dans
diverses catégories de vésicules de la voie endocytique. Cette étude suggère que la fixation du
peptide aux molécules de classe II peut s'effectuer tout au long du cheminement des
molécules de classe II depuis le réseau golgien dans la voie endocytique en fonction du niveau
de dégradation des antigènes dans chaque compartiment.
Chaque molécule du CMH ayant chargé efficacement un peptide antigénique, quitte le
compartiment où ce complexe s'est formé puis est transporté vers la membrane plasmique par
un mécanisme d'exocytose non encore exploré, pour être reconnu par les lymphocytes T
spécifiques.
Diversité du CMH :
La fonction des molécules du CMH est, comme nous venons de le voir, de fixer des
fragments peptidiques dérivés de pathogènes et de les présenter à la surface cellulaire afin
qu’ils soient reconnus par les cellules T spécifiques.
Deux propriétés distinctes du CMH font qu’un pathogène échappe difficilement aux
réponses immunes. Tout d’abord le fait que le CMH soit polygénique. En effet, cette propriété
permet à l’individu de posséder un grand nombre de molécules du CMH avec différentes
gammes de spécificité de liaison des peptides. En ce qui concerne les molécules de classe I,
les trois gènes de chaînes α de classe I chez l’homme, nommée HLA-A, -B et –C, et celles
32
codées par les régions K et D chez la souris ont été les premières découvertes. Des gènes
supplémentaires ou des groupes de gènes au sein des complexes H2 ou HLA, désignés Qa,
Tla et M chez la souris et HLA-E, -F, -G, -H, -J, -X chez l’homme ainsi qu’une famille de
gènes récemment découverte appelée MIC chez l’homme codent aussi pour des molécules de
classe I dites non classiques. Il existe également trois paires de gènes de chaînes α et β, les
régions DP, DQ et DR chez l’homme (Schreuder, Hurley et al. 2001) et pour la souris les
gènes IA α et β et IE α et β qui codent pour les molécules de CMH de classe II. Tout comme
pour les molécules de classe I, il existe des molécules de classe II non classiques dont la plus
étudiée est le HLA-DM qui a un rôle important dans l’apprêtement et la présentation
d’antigènes aux lymphocytes T auxiliaires. La deuxième particularité de ce CMH est le fait
qu’il soit polymorphe c'est-à-dire qu’il y ait de nombreux allèles de chaque gène dans
l’ensemble de la population et qui rend ainsi l’échappement difficile aux pathogènes.
L’analyse des molécules de HLA de classe I a révélé en 2007, l’existence d’environ 767
allèles A, 1178 allèles B et 439 allèles C (IMGT-HLA database, last updated January 2009).
Chez la souris le polymorphisme est lui aussi étonnant avec plus de 55 allèles identifiés
actuellement au niveau du locus K et 60 allèles au niveau du locus D. Les molécules de classe
II sont elles aussi très polymorphiques avec plus de 600 allèles de DR-B décrits. Dans
certains cas, il y existe même des nombres différents de gènes entre individus de la même
espèce.
L’expression de ces allèles est co-dominante, et les protéines correspondantes aux
deux allèles du même locus sont exprimées dans une même cellule, avec la capacité de
présenter des antigènes aux cellules T. Le polymorphisme à chaque locus double ainsi le
nombre de molécules de CMH différentes exprimé chez un individu donné.
Régulation du CMH :
L’obtention récente de la carte génomique complète du CMH a permis d’identifier les
régions codantes et les régions régulatrices. En effet, les gènes de classe I et II du CMH sont
encadrés par des séquences promotrices en 5’ qui fixent des facteurs de transcription
spécifiques et permettent de réguler ces gènes du CMH. Ces éléments régulateurs sont des
groupes conservés comme les boîtes de transcription S, X1, X2 et Y (Ting and Baldwin 1993;
Rohn, Lee et al. 1996; Collawn and Benveniste 1999; Nagarajan, Louis-Plence et al. 1999;
Reith and Mach 2001). Les boîtes X1 et X2 se lient à RFX (trimère constitué de RFX5,
RFXAP et RFXB/RFXANK) et ATF/CREB respectivement et la box Y à NFY. La
transactivation de tous ces complexes multiprotéiques est sous la dépendance du
33
transactivateur CIITA qui lui-même est sous contrôle des voies de signalisation de l’IFN
(Piskurich, Wang et al. 1998). Ce CIITA est un transactivateur crucial pour les gènes du CMH
de classe II (Reith and Mach 2001) et possède une fonction complémentaire pour la
transactivation des gènes du CMH de classe I (Martin, Chin et al. 1997). En effet, les gènes du
CMH de classe I possèdent des éléments régulateurs spécifiques comme les enhancers A et
ISRE qui se fixent sur les sites NFκB et IRF1 respectivement, contrôlant la production de
cytokines et induisant des niveaux d’expression constitutif de ce CMH de classe I.
L’expression des molécules de CMH est également régulée par des cytokines, en
particulier les interférons et les facteurs nécrosants des tumeurs (TNF). Certaines infections
virales (cytomégalovirus, hépatite B) peuvent également diminuer l’expression du CMH et
ainsi échapper au système immunitaire.
Sensibilité aux maladies :
Certains allèles HLA sont retrouvés plus fréquemment chez les sujets présentant
certaines maladies comme les maladies auto-immunes. L’association entre certains allèles
d’HLA et une maladie donnée peut être quantifiée en déterminant la fréquence des allèles
HLA exprimée chez les patients atteints de cette maladie, et en les comparant avec la
fréquence de ces allèles dans la population générale. C’est ce que l’on appelle le risque relatif
(RR). C’est ainsi que l’origine génétique de différentes maladies auto-immunes, comme la
sclérose en plaques (associée à HLA-DR2 avec un RR=3.5) ou la polyarthrite rhumatoïde
(associée à HLA-DR4 avec un RR allant de 6 à 12) a pu être établie.
ii. Le complexe TCR/CD3
Les LT reconnaissent leurs antigènes spécifiques grâce à des glycoprotéines
transmembranaires de type I de 80-90 kDa faisant partie de la superfamille des
immunoglobulines appelées TCR.
Ce TCR est un hétérodimère formé d’une chaîne α de 43-49 kDa et d’une chaîne β de
38-44 kDa qui sont liées de façon covalente par un pont dissulfure. Ces deux chaînes assurent
à elles seules la fonction de reconnaissance spécifique de l’antigène (Dembic, Haas et al.
1986). Elles ne sont jamais exprimées isolément à la membrane des LT et sont constamment
associées de façon non covalente à un complexe de polypeptides invariants appelé CD3 (pour
cluster of differentiation 3) permettant la transduction du signal [figure5]. Ce complexe est
34
formé de chaînes accessoires dites invariables : le CD3δ, le CD3γ, deux CD3ε et d’une chaîne
ζ présente sous forme d’un homodimère majoritairement intracytoplasmique.
Récepteur T
FIGURE 5 : le complexe TCR-CD3 (Shumacher 2002)
Le TCR (T cell receptor) est le récepteur des cellules T. Il est composé de deux chaînes α
et β, comportant chacune deux domaines de la superfamille des immunoglobulines, reliées
par un pont dissulfure. Ce récepteur est toujours associé à un complexe de signalisation :
le CD3. Ce CD3 est fréquemment composé de quatre molécules CD3ε/CD3γ et
CD3ε/CD3δ comportant chacun un domaine de la superfamille des immunoglobuline et
un seul ITAM (immunoreceptor tyronise-based activation motif) ainsi qu’un homodimère
de chaîneζ comportant 3 ITAM relié par un pont dissulfure servant à la signalisation
intracellulaire.
Les trois protéines CD3 sont codées par des gènes adjacents formant une unité de
régulation et sont nécessaires pour l’expression de surface des hétérodimères α:β ainsi que
pour la signalisation par le récepteur. En effet, elles contiennent chacune un domaine
extracellulaire, qui présente le repliement de l’immunoglobuline, suivi d’une région
transmembranaire et d’un domaine cytoplasmique de plus de 40 acides aminés.
La chaîne ζ, codée ailleurs dans le génome, est aussi nécessaire pour une expression et
une signalisation optimale, mais sa structure diffère de celle des autres chaînes. Elle a un
domaine externe très court mais sa portion cytoplasmique comporte 113 acides aminés.
Les régions transmembranaires de tous les composants du complexe CD3 contiennent
un résidu acide aminé chargé négativement (acide aspartique ou glutamine) permettant au
complexe d’entrer en interaction avec un ou deux acides aminés chargés positivement dans la
région transmembranaire de chaque chaîne du TCR. Les régions cytoplasmiques des chaînes
du CD3 contiennent des motifs ITAM (pour immunoreceptor tyrosine-based activation motif),
35
permettant l’activation des immunorécepteurs via une tyrosine. Les chaînes δ, γ,
ε
contiennent chacune une seule copie d’ITAM, tandis que la chaîne ζ en contient trois.
Chaque chaîne du TCR est composée de deux domaines immunoglobuliniques : un
domaine variable (V) et un domaine constant (C) ainsi qu’une région charnière courte (H)
contenant un résidu cystéine formant un pont dissulfure intercaténaire. Une région
hydrophobe transmembranaire permet l’ancrage des molécules à la membrane et leur
association au complexe CD3 qui assure ainsi la transduction du signal. Le domaine C est
invariant pour chaque chaîne du TCR et quelque soit le clone lymphocytaire T. Le domaine
V varie considérablement d’un clone T à l’autre. Cette variabilité se trouve concentrée en
certaines régions de la molécule dites régions hypervariables. Par études cristallographiques
comparatives avec les immunoglobulines, ces régions hypervariables se projetteraient sur la
face externe de la molécule du TCR au niveau de boucles CDR (pour complementarity
determining region) déterminant ainsi une région de complémentarité et pouvant entrer en
contact avec les complexes CMH/peptide (Davis and Bjorkman 1988; Chien and Davis 1993).
C’est ainsi qu’en connaissant la structure précise de ce complexe en termes de
composition, arrangement stœchiométrique et interaction
avec l’antigène que l’on a pu
comprendre comment un LT pouvait proliférer, et répondre à sa fonction mais aussi
appréhender les phénomènes de modulation d’activation lors d’alloréactivité et de réactions
auto-immunes (Rojo, Bello et al. 2008).
Au niveau génétique, les gènes codants pour les chaînes α et β du TCR sont de grande
taille. Par exemple, chez la souris, les gènes du locus α s’étendent sur plus de 900 kb et ceux
du locus β sur plus de 600 kb (Steinmetz and Dembic 1986). Le locus α situé sur le
chromosome 14 se compose de segments Vα (plus de 100 gènes), Jα (49 gènes) et d’un gène
Cα. Le locus β situé sur le chromosome 7 se compose de segments Vβ (60 gènes), Jβ (13
gènes), Dβ (2 gènes) et de deux gènes Cβ.
Lors de la différentiation thymique des LT, la disposition génomique de ces fragments
est régie par le réarrangement des segments V(D)J via des heptamères et nonamères servant
probablement d’ancrage à la machinerie enzymatique responsable de la recombinaison
(Sigaux 1994). Ce réarrangement des gènes du TCR fait intervenir le produit des gènes RAG1
et RAG2. La recombinaison s’accompagne fréquemment de délétions et/ou additions de
nucléotides au niveau des extrémités codantes libres des segments V, D et J. Des actions
d’éxonucléase et de désoxynucléotidyltransférase ainsi que tous les différents mécanismes
36
générateurs de diversité peuvent se combiner pour générer un nombre très élevé de TCR (1015
chez la souris) (Davis, Boniface et al. 1998).
Il est également intéressant de noter que des études structurales sur les TCR spécifiques
des antigènes du soi démontrent une remarquable similitude au niveau topologique avec les
TCR qui reconnaissent des antigènes étrangers.
Cependant, il a été récemment découvert trois TCR auto-immuns qui présentent eux
des structures et fonctionnalités différentes des autres TCR (Hahn, Nicholson et al. 2005;
Nicholson, Hahn et al. 2005). Deux de ces TCR ont été retrouvés chez des patients atteints de
sclérose en plaques (maladie auto-immune sur laquelle un chapitre entier sera consacré
ultérieurement) et auraient des topologies non conventionnelles. Un troisième TCR issu cette
fois-ci du modèle animal de la sclérose en plaques chez la souris aurait une orientation
conventionnelle mais une structure différente car le peptide du soi ne remplirait que
partiellement le sillon peptidique. L’interaction de ces trois TCR avec le CMH est par
conséquent sub-optimale, interaction que nous allons approfondir dans le chapitre ci-après.
Une étude encore plus récente (Harkiolaki, Holmes et al. 2009) montre comment au niveau
structural et biophysique les molécules de CMH peuvent prédisposer un individu à une
maladie. En effet, dans cet exemple, le peptide se fixe de façon non conventionnelle (plus
faible affinité) au CMH. Ce qui permet au LT ayant ce TCR auto-réactif d’échapper à la
sélection négative durant la maturation thymique mais d’être activé en périphérie (Li, Huang
et al. 2005), phénomène qui pourrait apporter un poids à une des explications de l’initiation de
la réponse immune qu’est le mimétisme moléculaire.
iii. Les co-récepteurs CD4 et CD8
Au cours de la lymphopoïèse, les LTαβ matures se divisent en deux sous-types
fonctionnellement distincts, chacun restreint par une classe de molécules du CMH et
distinguable sur l’expression de leur co-récepteur, CD8 ou CD4. La reconnaissance du
complexe CMH:peptide par le TCR est donc favorisée par ces molécules co-réceptrices que
sont le CD8 et le CD4. Elles interagissent respectivement avec le CMH de classe I ou II
(Swain 1983).
37
La molécule CD4 [figure 6] :
LT
D4
D3
D2
D1
CMH de classe II
CPA
FIGURE 6 : la molécule CD4 et son interaction avec le CMH de classe II (d’après
Janeway, immunobiology)
La molécule CD4 est composée d’une seule chaîne comprenant quatre domaines
semblables à des immunoglobulines (D1 à D4). Le premier de ces domaines se lie à la
molécule de classe II au niveau du domaine β2. Le domaine intracytoplasmique participe
à la transduction du signal.
La molécule CD4 est une glycoprotéine de 55-60 kDa. La première structure décrite chez
l’homme provient d’une banque d’ADN complémentaire (Gay, Maddon et al. 1987) qui
indique que la protéine est composée de 458 acides aminés. Parmi les 25 premiers se situe un
site de clivage qui résulte en une maturation de la protéine en 433 acides aminés. Un
alignement de séquence de cet ADNc avec des résultats de cristallographie aux rayons X ont
montré que cette molécule CD4 était composée d’une seule chaîne comprenant quatre
domaines semblables à ceux des immunoglobulines (D1 à D4) (Gay, Maddon et al. 1987;
Brady and Barclay 1996). Les domaines D1 et D3 sont des domaines qualifiés de variables
alors que D2 et D4 sont qualifiés de constants (Williams and Barclay 1988). C’est le premier
de ces domaines qui se lie à la molécule de CMH de classe II au niveau du domaine β2. Le
domaine intracytoplasmique participe à la transduction du signal. La présence de la molécule
CD4 augmente considérablement la sensibilité du LT vis-à-vis de l’antigène présenté.
La molécule CD8 [figure 7] :
La molécule CD8 est une glycoprotéine composée de deux chaînes, α et β ou α et α, liées par
un pont dissulfure et contenant chacune un domaine immunoglobulinique. Le CD8 se lie au
38
domaine α3 des molécules de CMH de classe I. Elle augmente fortement la sensibilité du LT
pour l’antigène.
CMH de classe I
Cellule cible
FIGURE 7 : la molécule CD8 et son interaction avec le CMH de classe I (d’après
Janeway, immunobiology)
La molécule CD8 est composée de deux chaînes, α et β ou α et α, liées par un pont
dissulfure et contenant chacune un domaine immunoglobulinique. Cette molécule CD8
se lie au domaine α3 des molécules de CMH de classe I.
b. Signalisation et activation des LTα
αβ
i. Les cellules présentatrices d’antigènes (CPA)
La régulation des réponses immunes dépend d’interactions multiples entre les cellules
présentatrices d’antigènes et les LT. Ces interactions impliquent des molécules de surface
comme le CMH exprimées à la surface des CPA et le TCR à la surface du LT.
De nombreuses cellules peuvent agir en tant que CPA. La caractéristique distincte de
ces cellules est leur capacité à exprimer des molécules de CMH et à délivrer un signal de costimulation. Trois types de cellules sont classées comme CPA : les cellules dendritiques, les
macrophages et les lymphocytes B. Ces cellules diffèrent par leur mécanisme de capture de
l’antigène, par les molécules de CMH qu’elles expriment et par les signaux de co-stimulation
qu’elles envoient.
Les principales cellules impliquées dans l’activation des LT naïfs c'est-à-dire qui n’ont
pas été préalablement activés par un antigène sont les cellules dendritiques (CD). Elles sont à
39
l’origine de l’initiation des réponses immunes spécifiques et sont dites cellules présentatrices
professionnelles. Au site d’infection, les CD capturent par pinocytose et phagocytose des
antigènes du microorganisme en cause. Elles sont alors activées soit par des cytokines
inflammatoires, telles que l’interleukine-1 (IL-1), le facteur de croissance des granulocytes
(GM-CSF) et le TNF-α soit par la liaison de récepteurs de surface reconnaissant des motifs
moléculaires associés aux pathogènes, tels que les TLR (pour toll like receptor). Elles entrent
alors dans un processus de maturation caractérisé par l’expression de récepteur de migration
vers les organes lymphoïdes primaires. Durant cette migration, elles deviennent alors matures
et subissent des modifications morphologiques, phénotypiques et fonctionnelles (Banchereau
and Steinman 1998). En particulier, ces cellules dendritiques vont exprimer de forts niveaux
de complexes CMH:peptide, ainsi que des molécules accessoires (que nous détaillerons par la
suite) jouant un rôle majeur dans l’activation efficace des LT naïfs. Elles vont également
produire des cytokines qui influenceront la différentiation des LT naïfs et dont la nature est
variable en fonction du stimulus activateur (Re and Strominger 2001). Arrivés dans les zones
riches en LT des organes lymphoïdes secondaires, les LT naïfs entrent en contact avec
plusieurs cellules dendritiques qui leur présentent les antigènes capturés en périphérie, sous la
forme de complexe CMH:peptide. L’interaction entre le TCR d’un LT naïf et son complexe
CMH:peptide spécifique à la surface d’une CD induit l’arrêt de la migration du LT et son
activation.
Outre ces cellules dendritiques, les macrophages peuvent devenir des CPA s’ils sont
activés par phagocytose de microorganismes, leur permettant d’exprimer les molécules de
CMH de classe I et II et les molécules B7 de co-stimulation.
Le LB quant à lui peut aussi être considéré comme une CPA professionnelle car il
exprime constitutivement des molécules de CMH de classe I et II mais une activation
préalable lui sera nécessaire afin d’exprimer les molécules de co-stimulation. Cette activation
peut se faire de manière dépendante ou indépendante des LT. L’efficacité du LB étant
beaucoup plus importante lorsqu’elle est activée de manière dépendante des LT puisque son
signal d’activation va provenir à la fois de la reconnaissance de l’antigène par le BCR et de la
co-stimulation fournie par un LT qui a reconnu le même antigène. Ainsi les LB et les LT qui
auront reconnu le même antigène vont permettre une réponse immune plus spécifique et plus
efficace.
Ces trois types de cellules sont dits CPA professionnelles. Divers autres types de
cellules, capables d’exprimer les molécules de CMH ou un signal de co-stimulation, de façon
induite peuvent aussi faire office de CPA « non professionnelle ». C’est le cas par exemple
40
des fibroblastes de la peau, des cellules gliales dans le cerveau, des cellules épithéliales du
thymus et de la thyroïde ou encore des cellules endothéliales des vaisseaux.
ii. La migration et l’adhésion des LT avec leur CPA
Afin que les LT migrent et interagissent avec ces CPA, il est nécessaire d’acquérir des
molécules d’adhésion. En effet, ces molécules vont servir à maintenir le contact cellulaire
entre cette CPA et le LT et à stabiliser l’interaction TCR et CMH:peptide (Springer 1990).
Les sélectines:
Parmi ces molécules d’adhésion, les sélectines joueront un rôle particulièrement
important (Celie, Beelen et al. 2009). C’est le cas de la sélectine CD62-L ou L-sélectine,
présente à la surface du LT naïf (Springer 1990; Cai and Sprent 1994; Tough and Sprent
1994) qui va favoriser l’entrée ou « homing » dans les ganglions lymphatiques par interaction
avec des structures vasculaires spécifiques, les HEV (pour high endothelial venules) (Springer
1990). Cette sélectine va également pouvoir guider l’entrée des LT dans les tissus lymphoïdes
des muqueuses comme celles de l’intestin par interaction avec des adressines (CD43,
GlyCAM-1 et MAdCAM-1). Une étude récente montre également le rôle important de ces
molécules dans le passage de la barrière hématoencéphalique par les LT (Engelhardt 2008).
Les chimiokines et intégrines:
Au cours de la phase initiale d’adhésion faible, des chimiokines exprimées par des cellules
non lymphoïdes des zones riches en LT des OLS telles que CCL19 et CCL21, stimulent le
récepteur CCR7 exprimé par les LT naïfs. Ceci induit l’activation d’intégrines exprimées par
les LT telles que LFA-1 (pour lymphocyte function-associated molecule 1). Cette intégrine
joue un rôle majeur dans l’interaction LT-CPA (Davignon, Martz et al. 1981; Davignon,
Martz et al. 1981; Kurzinger, Reynolds et al. 1981). Elle est exprimée par les LT et interagit
avec les molécules ICAM (pour intercellular adhesion molecules) exprimées par les CPA
[figure 8]. Les trois ICAM actuellement connues ont une structure proche, constituée d’un
nombre variable de domaines extracellulaires apparentés aux immunoglobulines. La molécule
ICAM-1 ou CD54 (Rothlein, Dustin et al. 1986) est la plus étudiée et semble-t-il la plus
importante. Une des particularités des interactions LFA-1/ICAM tient au fait que l’affinité de
LFA-1 pour ses ligands est augmentée lors du contact du LT avec sa CPA. En effet,
l’activation du LT via son TCR augmente l’affinité de LFA-1 et ICAM-1 (Dustin and
41
Springer 1989; Staunton, Dustin et al. 1989), ce qui peut renforcer l’interaction LT-CPA.
Cette interaction LFA-1/ICAM permet ainsi d’initier le processus d’extravasation (Dunon and
Imhof 2000). L’engagement d’autres molécules telles que le CD28 (Shimizu, van Seventer et
al. 1992), le CD44 (Koopman, van Kooyk et al. 1990) et le CD2 (Meuer, Acuto et al. 1984)
exprimées par les LT peuvent favoriser également l’adhésion cellulaire.
Adressage du LT à
l’endothélium par les sélectines
Lymphcocyte T
Ligand des
sélectines
Activation du LT (intégrines
activées par PAF)
LFA-1
P- sélectine
Activation
de
l’endothélium
Récepteur PAF
Endothélium
Vésicule contenant
la P-selectine
Synthèse de PAF
Adhésion du LT à
l’endothélium par
les intégrines :
LFA-1/ICAM-1
Diapédèse
FIGURE 8 : Adhésion des lymphocytes T et diapédèse
Lors d’une réaction immunitaire, les lymphocytes vont devoir traverser les barrières
physiques que sont les membranes en réponse à des signaux chimiques inflammatoires. La
première étape est une phase de roulement du leucocyte sur la paroi vasculaire qui implique
des sélectines. Les interactions entre ces sélectines P et leur ligand sont de nature
relativement faibles. Elles sont renforcées par le PAF qui nécessite que la cellule endothéliale
soit activée pour sa synthèse et son expression au niveau de sa membrane. Un fois exprimé il
pourra ainsi interagir avec son récepteur présent sur le leucocyte ce qui aura pour effet
d'activer ce dernier. Une fois activé, l'affinité du leucocyte pour les ICAM comme ICAM-1
(intracellular adhesion molecules ),présentes sur les vaisseaux, via ses intégrines telle que
LFA-1(lymphocyte function-associated molecule-1) va augmenter et permettre l’adhésion et
l'immobilisation nécessaire à l'invasion des tissus adjacents.
Les intégrines peuvent être impliquées également dans des relations avec le
cytosquelette et des éléments extracellulaires. LFA-1 peut, par exemple, être localisée avec la
taline et ICAM-2 avec l’α-actine (Helander, Carpen et al. 1996). De plus, l’engagement de
LFA-1 pourrait transduire des signaux intracellulaires permettant d’amplifier la réponse T :
l’activation de LFA-1 par des anticorps agonistes peut en effet générer des réponses calciques
(Kanner, Grosmaire et al. 1993). Parallèlement, ICAM-1 pourrait être impliquée dans la
42
phosphorylation de tyronises menant à l’activation d’éléments transductionnels plus en aval et
à la transduction de cytokines par les CPA (Koyama, Tanaka et al. 1996).
iii. La co-stimulation
Comme nous venons de le préciser, le programme complet de différenciation d’un LT
naïf en LT effecteur n’est généralement pas déclenché par la seule liaison du TCR avec le
CMH mais requiert des signaux complémentaires, dits de co-stimulation. La balance entre les
co-signaux activateurs et inhibiteurs va déterminer la nature de la réponse émise par le LT
concerné [figure 9].
FIGURE 9: La synapse immunologique (encyclopedia of life sciences, 2005)
La synapse immunologique est organisée spatialement en trois zones. La zone centrale,
le cSMAC contient les TCR, les molécules de co-stimulations telles que CD28 (…). Cette zone
va permettre l’initiation de la signalisation intracellulaire en aval du TCR. Le pSMAC
contient la protéine d’adhérence LFA-1 et la taline qui permettront l’ancrage au
cytosquelette d’actine. Le dSMAC zone la plus externe de la synapse regroupe de grandes
molécules telles que les phosphatases CD45 et CD148 qui permettront l’arrêt du signal.
Les molécules B7:
Les deux membres de la famille B7, les molécules B7-1 ou CD80 (Freeman, Freedman et
al. 1989; Koulova, Clark et al. 1991) et les molécules B7-2 ou CD86 (Azuma, Ito et al. 1993;
Freeman, Borriello et al. 1993) ont des récepteurs identiques : le CD28 et le CTLA-4
(Chikuma and Bluestone 2003). Ce sont des protéines monomériques avec deux domaines
extracellulaires apparentés aux immunoglobulines qui sont exprimées principalement par les
43
CPA professionnelles et par les cellules hématopoïétiques (Mao, Brigham et al. 2004). Ils ont
cependant des cinétiques d’expression et des affinités particulières. En effet, seul le CD86 est
constitutivement exprimé sur les cellules T au repos, le CD80 étant absent (Taylor, Lees et al.
2004). Les cellules dendritiques matures expriment de forts niveaux des deux molécules
(Inaba, Witmer-Pack et al. 1994). D’autres CPA telles que les LB au repos ne les expriment
pas ou peu (Inaba, Witmer-Pack et al. 1994). Le niveau d’expression de ces molécules peut
également être régulé par l’IFNγ, le LPS ou par des interactions cellulaires (Freeman,
Freedman et al. 1989; Freedman, Freeman et al. 1991; Karandikar, Vanderlugt et al. 1998;
Tan, Gordon et al. 1998).
Les molécules CD28:
La molécule CD28 fait partie de la famille des immunoglobulines. Elle contient un
domaine intracellulaire présentant les résidus critiques pour l’efficacité de la signalisation. Par
exemple, le motif YMNM sur la tyrosine 170 de ce domaine permet le recrutement de
protéines contenant des domaines SH2 essentielles à la signalisation d’un LT. Nous pourrons
citer parmi ces protéines, la PI3K, le GrB2 ou encore les Gads. Cette molécule CD28 est un
homodimère de 44 kDa exprimé de façon constitutive sur la surface de certains LT humains
(50% LT-CD8+ n’expriment pas CD28) et sur tous les LT murins (Gross, Callas et al. 1992;
Linsley, Greene et al. 1992; Linsley, Bradshaw et al. 1993; Linsley and Ledbetter 1993). Il
s’agit du récepteur aux molécules B7-1 (CD80) et B7-2 (CD86). Son gène est localisé sur le
chromosome 2p33 chez l’homme (Naluai, Nilsson et al. 2000) et sur le chromosome 1 chez la
souris (Howard, Rochelle et al. 1991). Sans ce signal CD28, le TCR ne répond pas à
l’antigène, provoquant anergie ou mort cellulaire du LT (Linsley and Ledbetter 1993). En
effet, ce co-signal amplifie l’activation des facteurs de transcription NFAT et NFκB. Il permet
ainsi la production de nombreuses cytokines comme l’IL-2, l’IL-4, l’IlL-5, le TNF et l’IFN-γ.
De plus, il a été montré que l’engagement du CD28 jouait un rôle important des stades
précoces de développement et de différenciation des LT (King, Stupi et al. 1995). Ce CD28
est également impliqué dans l’homéostasie et la fonction des LT régulateurs (Earle, Tang et
al. 2005).
Les molécules CTLA-4:
Le CTLA-4 a lui une affinité dix fois supérieure au CD28 et n’est exprimé que par les LT
activés. Il s’agit d’une glycoprotéine transmembranaire faisant partie de la superfamille des Ig
44
(Brunet, Denizot et al. 1987). Son gène est situé sur le chromosome 2 chez l’homme et sur le
chromosome 1 chez la souris (Dariavach, Mattei et al. 1988; Ling, Sandor et al. 2003). Il a
une fonction inhibitrice dans l’activation des LT (Alegre, Frauwirth et al. 2001; Chambers,
Kuhns et al. 2001; Rudd, Martin et al. 2002). Ce mécanisme assure le contrôle des réponses
immunitaires spécifiques en limitant l’expansion des clones T activés. En effet, l’expression
constitutive de CD28 permet d’induire l’activation des LT reconnaissant leur antigène à la
surface des CPA. Cette activation induit progressivement l’expression de CTLA-4 à la surface
des LT et compte tenu de l’affinité supérieure de CTLA-4 comparée à CD28 pour les
molécules B7, les interactions B7/CTLA-4 deviennent alors favorisées délivrant des signaux
inhibiteurs aux LT (Crabtree 1989).
Les molécules CD40 :
Une protéine transmembranaire a également un rôle très important : le CD40. Elle est
présente à la surface des LB, des monocytes et des CD et favorise, après engagement par le
CD40L exprimé notamment par les LT activés, l’expression des molécules de CMH de classe
II ainsi que celle des molécules B7, ICAM-1 et LFA-3 à la surface des CPA. La liaison de
CD40 à son ligand CD40-L aboutit à la sécrétion par les CPA de multiples cytokines
activatrices des réactions immunitaires telles que l’IL-1, l’IL-6, l’IL-10, l’IL-12 et le TNF-α.
Les molécules CD134 :
Plus récemment, il a été montré qu’en plus de toutes ces molécules, le CD134 (récepteur
de OX40), membre de la famille des récepteurs TNF, pouvait affecter la réponse T en
favorisant l’expansion clonale des LT, leur différenciation en effecteurs ainsi que leur survie
(Redmond, Gough et al. 2009).
iv. La synapse immunologique
Ces signaux de co-stimulation seront donnés lors d’une interaction stable et prolongée
entre les LT et les CPA, nécessaire à l’activation des LT naïfs. Bien que la spécificité de
reconnaissance antigénique soit déterminée par l’interaction du TCR avec son ligand
(complexe CMH:peptide), le devenir de l’interaction entre un LT et une CPA dépend de
l’intégration des signaux provenant du TCR et de molécules accessoires engagées à l’interface
cellulaire. L’interaction entre un LT et une CPA aboutit à la formation d’une aire spécialisée
à l’interface cellulaire appelée synapse immunologique (SI) (Grakoui, Bromley et al. 1999;
45
Dustin 2009), dans laquelle de multiples molécules de surface sont engagées simultanément,
induisant l’activation de voies de signalisation multiples et interconnectées [figure 9] Ainsi,
sous l’influence de mobilisateur du cytosquelette, sont recrutés à cette synapse à la surface des
CPA, les complexes CMH:peptide, les molécules de co-simulation et d’adhésion ainsi qu’à la
surface des LT les molécules de TCR et le complexe de signalisation associé, le CD3. C’est
ainsi que l’on peut dire que les deux acteurs principaux que sont le CMH et le TCR ne sont
pas les seuls à rentrer en ligne de compte pour une signalisation et activation optimale du LT.
v. Activation
Ce n’est qu’après la mise en place de cette synapse immunologique entre les CPA
matures et les LT naïfs, avec toutes les composantes citées ci-dessus que le LT va pouvoir
s’activer, entrer dans le cycle cellulaire, proliférer et se différencier en cellules effectrices
et/ou mémoires. Comme nous l’avons vu précédemment, les chaînes α et β du TCR ne
peuvent pas transduire à elles seules le signal. Elles dépendent en cela du complexe CD3 dont
les chaînes εδ et εγ apporteront chacune un motif ITAM alors que les chaînes ζζ en
apporteront trois. Schématiquement, la transduction du signal au sein du LT va mettre en jeu
des éléments proximaux de signalisation (recrutement et activation de protéines tyrosines
kinases et de protéines adaptatrices) puis des éléments plus distaux permettront la mise en
place des différentes voies de signalisation existantes en aval du TCR. Ces voies de
signalisation auront pour finalité d’activer plusieurs facteurs de transcription qui décideront de
la réponse de la cellule T : prolifération, différenciation, production de cytokines ou encore
mise en place du potentiel cytotoxique. Ce sont donc ces évènements qui conditionneront la
mise en place et la spécificité des fonctions effectrices des LT.
Les évènements proximaux:
Ces évènements proximaux de signalisation correspondent à l’activation et au recrutement
rapide de protéines tyrosines kinases comme Lck et Fyn (Src kinases) qui vont phosphoryler
les tyrosines des motifs ITAM du complexe CD3. Ces tyrosines phosphorylées vont pouvoir
ainsi recruter la protéine tyrosine kinase Zap70 via ses deux domaines SH2. Cette protéine
ZAP70 va alors phosphoryler son substrat : la protéine adaptatrice LAT (linker for activation
of T cells), molécule centrale dans la mise en place et la connexion des différentes voies de
transduction du signal (Lin and Weiss 2001).
46
Les évènements distaux : les voies de signalisation
Les voies de signalisation activées seront majoritairement les voies Ras/Raf/MAP Kinases
et Rac/JNK qui amèneront à la synthèse de facteur de transcription tel que AP-1, la voie de la
protéine PKC qui permettra la translocation nucléaire du facteur de transcription NFκB et la
voie des phosphoinositides et du métabolisme calcique avec activation de la calcineurine et la
translocation nucléaire de NF-AT (Pawson and Scott 1997) [figure 10]. L’activation de tous
ces facteurs de transcription vont permettre l’initiation de l’expression sélective de gènes
codant pour des cytokines, des récepteurs, etc. [tableau 1].
FIGURE 10 : Voie de transduction du signal et d’activation d’une cellule T suite à
l’engagement de son TCR (encyclopedia of life sciences, 2005).
Quatre principales voies sont observables, chacune identifiée par une couleur
différente : la voie calcique impliquant le Ca2+ et la calcineurine en violet, la voie de la PKCθ
en orange, la voie Ras/Erk en vert et la voie Vav1/Jun en bleu. Toutes ces voies de
signalisation convergent vers le noyau de la cellule T où des facteurs de transcription vont
pouvoir induire l’expression de certains gènes tels que l’interleukines 2.
47
PRODUIT DU GENE
c-Fos
c-Jun
NF-AT
c-Myc
NF-κ
κB
IFN-γγ
IL-2
Récepteur
de l’insuline
IL-3
TGF-β
β
Récepteur
de l’IL-2 (p55)
TNF-β
β
Cycline
IL-4
IL-5
IL-6
c-Myb
GM-CSF
HLA-DR
VLA-4
VLA-1, -2, -3, -5
FONCTION
LOCALISATION
IMMEDIATE
Prooncogène
nucléaire
Oncogène cellulaire, Facteur de
nucléaire
transcription
Facteur de transcription
nucléaire
Oncogène cellulaire
nucléaire
Facteur de transcription
nucléaire
PRECOCE
Cytokine de type TH1 affectant la
sécrétée
l’activation, la croissance et la
différenciation des LT, LB,
macrophages et NK.
Cytokine reponsable de la croissance et
sécrétée
diffférenciation des LT, LB et NK
Récepteur hormonal
Membrane
cellulaire
Facteur de croissance pour les cellules
sécrétée
hématopoïétiques et les lymphocytes
Cytokine inhibitrice de la croissance
sécrétée
cellulaire
Récepteur de cytokine
Membrane
cellulaire
Cytokine responsable de la production
sécrétée
de radicaux oxygénés. Elle augmente
l’adhésion et la phagocytose
Protéine du cycle cellulaire
cytoplasmique
Cytokine favorisant la croissance et le
sécrétée
développement des LT
Cytokine impliquée dans la formation
sécrétée
et la différenciation des éosinophiles
Cytokine responsable de la régulation
sécrétée
des fonctions B et T. phase aiguë de la
réponse immune
Protooncogène
nucléaire
Cytokine
sécrétée
TARDIVE
Molécule de CMH II
Membrane
cellulaire
Molécule d’adhésion
Membrane
cellulaire
Molécules d’adhésion
Membrane
cellulaire
TABLEAU 1 : liste non exaustive des produits des gènes activés au cours de la
signalisation au sein des lymphocytes T (adapté (Crabtree 1989)
48
c. Les lymphocytes T-CD4 et T-CD8
i. Ontogénie
C
O
R
T
E
X
Signalisation via le
TCR inappropriée
Cellule
Epihtéliale
corticale
Reconnaissance du CMHI
Reconnaissance du CMHII
Mort par
négligence
Progéniteur lymphoidde
Jonction corticomédullaire
Orientation CD8
Selection
négative
M
E
D
U
L
L
A
Orientation CD4
Selection
positive
Selection
négative
Progéniteur
hématopoïétique
Cellulaes épithéliales
méduallaires ou
cellules dendritiques
Mort
Mort
Cellulaes épithéliales
méduallaires ou
cellules dendritiques
Migration en périphérie
FIGURE 11: le développement thymique (Anderson and Jenkinson 2001)
On distingue des stades successifs de différenciation du thymocyte principalement sur
l’expression des co-récepteurs CD4 et CD8. Les cellules les plus immatures sont les
thymocytes CD4-CD8-, appelés doubles négatifs (DN). L’expression de CD44 et de CD25
caractérisera quatre étapes dans cette différenciation précoce, DN1 à DN4. Les thymocytes
vont ensuite subir la sélection β, et acquérir l’expression de CD8, puis de CD4, pour devenir
des cellules double positives (DP). Ces DP perdent ensuite l’une de ces deux molécules, signe
de mise en place d’un programme de différenciation vers le stade mature simple positif (SP),
ceci de façon concommitente à la sélection positive et négative. Ces SP, cellules différenciée
du thymus migreront enfin en périphérie.
Comme nous l’avons précisé dans le chapitre des généralités, les LT commencent leur
maturation dans le thymus. Issues des précurseurs de la moelle osseuse, certaines cellules vont
donc migrer dans le thymus pour acquérir des caractéristiques fonctionnelles et phénotypiques
qui caractériseront cette population de LT. Le thymus est ainsi composé de cellules
leucocytaires appelées à ce stade thymocytes, et de très nombreuses cellules stromales comme
49
les cellules épithéliales thymiques (TEC) qui apportent de nombreux signaux nécessaires au
déroulement fonctionnel du développement de ces thymocytes (Kingston, Jenkinson et al.
1985; Williams, Kingston et al. 1986). On distingue ainsi différents stades successifs de
différenciation du thymocyte, distinction qui se fera principalement sur l’expression des
molécules CD4, CD8, CD25 et CD44 [figure 11].
Les cellules les plus immatures arrivant directement de la moelle osseuse sont
caractérisées par la non-expression des co-récepteurs CD4 et CD8 : ce sont les cellules
doubles négatives (DN) CD4-CD8- (Scollay, Bartlett et al. 1984). La survie et le
développement de ces thymocytes DN sont principalement induits par la synthèse de
cytokines comme l’IL-7 produite par les TEC corticales (Murray, Suda et al. 1989; Moore,
von Freeden-Jeffry et al. 1996).
Pour cette population de DN, l’expression des deux molécules de surface CD44 et
CD25 caractérisera quatre étapes de différenciation précoce : DN1 (CD44+CD25-), DN2
(CD44+CD25+), DN3 (CD44-CD25+) et DN4 (CD44-CD25-). Durant le stade DN3, les
thymocytes vont réarranger leur TCR (réarrangement somatique des gènes codant pour le
TCR-β) (Habu, Kimura et al. 1987). Si un réarrangement productif du locus TCR-β a lieu,
alors son produit s’associe à une chaîne invariante pTCRα pour former un pré-TCR. Le signal
que celui-ci délivre, associé à des signaux cytokiniques, promeut la survie, la prolifération et
la progression dans ce processus de différenciation vers le stade DN4. Cette étape, nommée
sélection β, permet donc la survie des lymphocytes porteurs d’une chaîne β fonctionnelle
[figure 12].
Thymocytes DN
CD4+ CD8+
DN1
Progéniteur
commun
DN2
Thymocytes DP
CD4+ CD8+
DN3
Thymocytes
SP
DN4
Réarrangement
du gène TCR α
Réarrangement
du gène TCR¸β
Sélection β
Sélection positive
Sélection négative
FIGURE 12: le développement thymique (Sebzda, Mariathasan et al. 1999)
Les différentes étapes de la sélection thymique sont caractérisées par l’expression
séquentielle de différents marqueurs: CD44, CD25, CD4 et CD8.
(DN double négatif ; DP double positif ; SP simple positif).
50
L’assemblage du pré-TCR avec le complexe CD3 va ensuite permettre l’engagement
du lignage TCRαβ dans le stade double positive (DP) CD4+CD8+ où se déroulera le
réarrangement de la chaîne α du TCR et où le thymocyte va subir une sélection positive. En
effet, les récepteurs des thymocytes DP sont générés comme nous l’avons vu précédemment
de façon aléatoire, ce qui permet de faire face à l’immense variété des antigènes. Mais cela
engendre aussi de très nombreux TCR incapables d’interagir avec le complexe CMH:peptide.
Un écrémage est donc à ce stade nécessaire pour sélectionner les LT « utiles ». Au stade DP,
les cellules sont privées du signal anti-apoptotique apporté par les cytokines à cause de la
répression par SOCS1 (suppressor of cytokine signaling 1) et de l’expression du récepteur à
l’IL-7 (Yu, Park et al. 2006). Elles sont donc fortement sensibles à la mort cellulaire. Seul un
signal de survie, transmis par l’engagement du TCR, peut permettre de passer ce cap (Scott,
Bluthmann et al. 1989). De ce fait, l’immense majorité des thymocytes, dont l’affinité pour le
complexe CMH:peptide du soi est insuffisante meurt par négligence (Williams and Brady
2001). Par contre, les cellules DP qui reçoivent un signal via le TCR de forte intensité peuvent
survivre et se différencier en thymocytes matures : c’est la sélection positive (AshtonRickardt 1993; Ashton-Rickardt, Van Kaer et al. 1993). Le rôle du thymus dans ce
phénomène là a pu être mis en évidence dans des chimères thymectomisées et greffées avec
un thymus allogénique, dont les LT sont spécifiques du CMH porté par l’épithélium
transplanté (Zinkernagel, Callahan et al. 1978). Un faisceau d’indices a amené à identifier le
cortex comme compartiment spécialisé dans la sélection positive des LT (Ceredig,
MacDonald et al. 1983; Cosgrove, Chan et al. 1992; Laufer, DeKoning et al. 1996). Ainsi le
degré d’affinité/avidité entre le TCR et le complexe CMH:peptide présenté par les cTEC
(pour cellules corticales de l’épithélium thymique) dirige le devenir du thymocyte [figure 13]
Capsule
Sélection
positive
Cellules épithéliales
ˇ
Sous-capsulaires
Thymocytes
Sélection β
TEC corticale
Macrophage
TEC médullaire
Vaisseaux
sanguins
Lymphocytes B
DC médullaire
Sélection
négative
Les différents types cellulaires et les
interactions
séquentielles
cellulecellule durant la migration des
thymocytes au cours du développement
thymique sont représentés ici. La
sélection β et la sélection positive ont
lieu dans le cortex thymique suite à
l’interaction des thymocytes avec les
cellules épithéliales thymiques (TEC)
corticales. La sélection négative se
déroule dans la médulla. Les TEC et
les DC médullaires jouent un rôle
essentiel dans l’induction de tolérance
centrale.
FIGURE 13 : mécanisme de tolérance thymique (Sebzda, Mariathasan et al. 1999)
51
ii. Les lignages CD4/CD8
Durant cette sélection positive, les différentes cinétiques des interactions TCR-ligand va
déterminer le lignage simple positif (SP) CD4+CD8- ou CD4-CD8+ (Singer and Bosselut
2004). Ainsi, la perte de l’une de ces deux molécules CD4 ou CD8, signe de mise en place
d’un programme de différenciation vers le stade mature simple positif (SP), se fait
concomitamment à la sélection positive.
La spécificité du TCR étant générée de façon aléatoire, le processus permettant de faire
correspondre cette réactivité à l’expression du co-récepteur approprié, a fait l’objet de
nombreux travaux. Deux thèses principales ont été ainsi avancées [figure 14] : celle d’une
sélection positive décidant du destin du thymocyte, et une seconde où le lymphocyte DP est
prédéterminé aléatoirement à un lignage et sélectionné par la suite (Guidos, Danska et al.
1990). Plus récemment, une nouvelle hypothèse selon laquelle la force du signal en aval des
co-récepteurs serait importante pour le choix du lignage a été émise (Corbella, Moskophidis et
al. 1994) [figure 15] .
Dans une étude élégante ayant pour but de mesurer le degré de réactivité croisée du
TCR, Garcia et ses collaborateurs ont développé une série de décapeptides dans laquelle des
substitutions par les 20 acides aminés ont été réalisées à chacune des 10 positions (Maynard,
Petersson et al. 2005). Cette base de données combinée a été passée au crible en utilisant un
TCR reconnaissant un peptide de la protéine basique de la myéline (MBP) dans le contexte de
CMH de classe II chez la souris. La structure tridimensionnelle du complexe a ensuite été
réalisée alors que les résidus de contact du TCR avaient déjà été identifiés. Ainsi, les peptides
de cette librairie combinée représentant toutes les substitutions à toutes les positions du
peptide ne réagissaient pas avec le TCR lorsque les acides aminés étaient substitués dans les
résidus impliqués dans l’ancrage aux molécules du CMH. Cette sélectivité a été initialement
révélée par le séquençage des peptides clivés des molécules de CMH de classe I : c’est le
phénomène de restriction du CMH aux différents peptides.
52
Interaction
TCR-CD8 / CMH I
Interaction
TCR-CD4 / CMH II
Choix stochastique du
lignage CD4 ou CD8
Cellule
épithéliale
corticale
Choix CD8
correct
Signal unique pour
le lignage CD8
Choix CD4
incorrect
Signal unique pour
le lignage CD4
Interaction
TCR-CD8 / CMH I
Interaction
TCR / CMH I sans
implication du CD8
Survie
Mort
Il se passe les mêmes évènements pour le DP dont le
TCR est spécifique pour des complexes CMH II :peptide
FIGURE 14: le choix du lignage CD4/CD8 : les modèles instructifs et sélectifs
(Kalinski and Moser 2005)
a : Le modèle instructif propose que des signaux intracellulaires, biochimiquement distincts,
sont générés par le TCR lorsqu’il est associé à CD4 ou à CD8. Ces signaux seraient
suffisants à engager le thymocyte vers l’un des deux lignages, et l’appariement TCR/corécepteur serait toujours pertinent puisque dans le cas inverse, le thymocyte ne progresse pas
dans sa différenciation. b : D’autre part, le modèle sélectif suggère que le choix de lignage se
fait préalablement à la sélection positive et indépendamment de la spécificité du TCR. Les
thymocytes dont le TCR et le co-récepteur ne sont pas bien coordonnés seraient éliminés lors
d’une étape de sélection où le bon assortiment des deux molécules procurerait un signal de
survie.
53
Interaction TCR-CD8 / CMH I
Signal long/ intensité modérée
Engagement CD4
Signal inadéquat
Interaction TCR-CD4 / CMH II
Signal court/ intensité faible
Signal long/ intensité modérée
Engagement CD8
Engagement CD4
Signal
persistant
Mort
Signal court/ intensité faible
Engagement CD8
Signal inadéquat
Mort
FIGURE 15 : le choix du lignage CD4/CD8 : le modèle force du signal (Kalinski and
Moser 2005)
Ce modèle propose que l’engagement vers les lignages CD4 et CD8 se fait selon
l’intensité ou la durée de la signalisation du TCR, un signal fort ou soutenu orientant
vers un devenir CD4. Dans ce modèle il est envisagé que dans de rares cas, une
signalisation inappropriée conduirait au mésappariement de la spécificité du TCR et du
co-récepteur. Les cellules mourraient alors lors d’une étape de sélection ultérieure,
semblable à celle décrite dans le modèle stochastique.
54
Le devenir d’un lymphocyte DP en LT-CD4 ou CD8 peut aussi s’expliquer par
l’expression de certains facteurs de transcription connus pour contrôler l’émergence du
lignage CD4 ou CD8. En effet, seront requis pour un engagement dans la voie CD4 les
facteurs Thpok et GATA-3 alors que l’engagement dans la voie CD8 nécessitera l’expression
des facteurs Runx1 et Runk3 (Wang and Bosselut 2009) [figure 16] . Très récemment, un
nouveau facteur a été découvert comme critique dans la sélection positive des cellules T :
Themis. En effet, il a été montré que les thymocytes déficients en Themis (thymus-expressed
molecule involved in selection) n’avaient pas de défaut dans la signalisation proximale du
TCR mais que l’engagement et la maturation dans la lignée SP CD4+ étaient compromis (Fu,
Vallee et al. 2009; Johnson, Aravind et al. 2009; Lesourne, Uehara et al. 2009).
FIGURE 16 : influence des signaux environnementaux et des facteurs de
transcription sur le choix du lignage CD4/CD8 (Singer, Adoro et al. 2008)
55
iii. Description
LT-CD4 :
Les LT-CD4+ naïfs se différencient en LT effecteurs auxiliaires ou « helpers ». Ils sont
stimulés par les cellules exprimant les molécules de CMH de classe II. De nombreuses études
expérimentales ont mis en évidence que les LT-CD4+ pouvaient se différencier en plusieurs
types d’effecteurs [figure 17] . Cependant la plupart des LT-CD4+ naïfs activés se
différencieront en LT helper de type I (Th1) et de type 2 (Th2) (Mosmann, Cherwinski et al.
2005).
Les populations de LT helpers Th1 et Th2 sont caractérisées par les profils de cytokines
qu’ils produisent en réponse à une stimulation antigénique : les Th1 sécrètent des cytokines
proinflammatoires comme l’IL-2, l’IFNγ, la lymphotoxine et le TNFα. Les Th2 produisent
eux des cytokines comme l’IL-4, l’IL-5, l’IL-10 et l’IL-13. Il faut bien noter que cette
division est un modèle théorique. Un LT effecteur généré in vivo au cours d’une infection ne
rentre qu’exceptionnellement dans l’une ou l’autre de ces catégories strictes, mais produit des
cytokines plutôt de type Th1 ou plutôt de type Th2. Les LT auxiliaires sont également
caractérisés par l’expression différentielle de récepteurs de chimiokines, les Th1 exprimant
par exemple le CXCR3 et CCR5 et les Th2 exprimant par exemple les CCR4 et CCR3
(Heydtmann and Adams 2002).
Les facteurs gouvernant la différenciation des LT-CD4+ Th1 ou Th2 ne sont pas
complètement identifiés. La dose d’antigène, la forme sous laquelle l’antigène est administré,
l’affinité du TCR pour son ligand CMH:peptide, la densité des complexes CMH:peptide et le
niveau d’expression des molécules de co-stimulation à la surface des CPA sont des
paramètres influençant cette différenciation des LT-CD4+ en Th1 ou Th2 (Constant and
Bottomly 1997). La nature des cytokines sécrétées par les cellules de l’immunité innée au
cours de la réponse initiale à l’infection pourrait également jouer un rôle déterminant, comme
les cytokines sécrétées plus tardivement par les CD. En effet, la production d’IL-12 par les
CD activées est impliquée dans la génération des Th1. Les CD qui, cultivées en présence
d’IL-10, ont une capacité réduite à sécréter de l’IL-12, induisent préférentiellement le
développement Th2 (De Smedt, Van Mechelen et al. 1997; Moser and Murphy 2000). L’IL-4
produite par les polynucléaires basophiles, les mastocytes ou les lymphocytes NK-T apparaît
56
jouer un rôle majeur dans la différenciation des LT de type Th2 (Constant and Bottomly
1997).
De plus la nature de l’agent infectieux pourrait avoir un impact sur cette différenciation
des LT-CD4+. En effet, les cellules dendritiques expriment à leur surface plusieurs TLR
différents, et la nature du TLR stimulé et du signal intracellulaire transmis varient en fonction
des agents infectieux impliqués. Il a ainsi été montré que si, sur ces CD, le TLR4 est stimulé
alors la cellule produit des cytokines influençant la différenciation Th1 (production d’IL-12 et
d’IP-10) alors que si c’est le TLR2 qui est stimulé, les CD produisent de l’IL-8, p19/Il-23
amenant à une différenciation Th2 (Re and Strominger 2001). La nature de la CPA pourrait
aussi avoir un effet sur cette différenciation. En effet, il a été montré que des macrophages
péritonéaux et des cellules dendritiques de type CD8α- induiraient préférentiellement le
développement de LT de type Th2 (De Becker, Moulin et al. 1998).
Au niveau transcriptionnel, la différenciation des LT-CD4+ est associée à l’expression
de facteurs de transcription particuliers, T-bet et GATA-3, qui contribuent à l’induction de la
production des cytokines IFN-γ et IL-4 respectivement. Cependant cette dichotomie de la
réponse immune a été récemment remise en cause. En effet, l’on sait désormais que l’on peut
induire la différenciation des LT en cellules dites régulatrices inhibant ces deux types de
réponses, sous l’effet de la cytokine TGF-β : ce sont les cellules T régulatrices ou T-reg
(Fehervari and Sakaguchi 2004). Nous décrirons ces cellules dans le chapitre suivant.
Encore plus récemment, une quatrième population de lymphocytes T, nommés Th17, a
été caractérisée (Tato, Laurence et al. 2006). Elle est induite par la combinaison de TGF-β et
d’IL-6 et amplifiée en présence d’IL-21 et d’IL-23. Deux facteurs de transcription sont
impliqués dans la différenciation de ce lignage : ROR-C (retinoïd-related orphan receptor C)
ou son homologue ROR-γt chez la souris et ROR-α. Les Th-17 expriment spécifiquement le
CCR6. Après activation, ces cellules produisent majoritairement de l’IL-17 (connue pour être
une cytokine hautement inflammatoire sur les cellules stromales de nombreux tissus) mais
aussi du TNF-α, de l’IL-6, de l’IL-21, de l’IL-22 et du GM-CSF. Alors que la production
d’IL-22 par les cellules T était considérée être caractéristique des Th-17, deux études ont
identifié un nouveau lignage produisant de l’IL-22 mais pas ou très peu d’IL-17 : les Th-22
(Duhen, Geiger et al. 2009; Trifari, Kaplan et al. 2009). L’engagement vers ce lignage est
dépendant d’un facteur de transcription AHR (aryl hydrocarbon recepteur). Ces cellules
expriment le CCR6 mais aussi le CCR4 et le CCR10. Une fois activés, ces cellules produisent
donc de l’IL-22 mais également de l’IL-13 et du TNF-α.
57
L’existence d’une sixième population, celle des LT-Th25 a également été proposée.
Moins bien caractérisée que les précédentes, elle serait apparenté aux Th2. Ces cellules
produisent principalement de l’IL-25, cytokine montrée récemment comme impliquée dans la
prévention de l’infiltration des cellules inflammatoires au sein du système nerveux central
(Sonobe, Takeuchi et al. 2009).
FIGURE 17 : les voies de différenciation des lymphocytes T CD4+ (Tato, Laurence
et al. 2006; Chitnis 2007)
Suivant les facteurs de transcription exprimés ainsi que le milieu cytokinique dans
lequel la cellule se situe, le lymphocyte T naïf non différencié (TH0) peut se différencier
en cellule immunosuppressive (T-reg), en cellules impliquées dans l’immunité mucosale
telles que TH25 ou TH3, en cellules permettant la défensede l’organisme TH17 et TH22
face à des pathogènes intracellulaires (TH1) ou extracellulaires (TH2). Ces différentes
sous populations sécrètent ainsi différentes cytokines responsables de leur rôle dans
l’immunité.
58
LT-CD8 :
La différenciation des LT naïfs en LT effecteurs est associée à plusieurs modifications
profondes du métabolisme des LT : ils acquièrent la capacité de synthétiser des molécules
impliquées dans leurs fonctions, ils expriment un nouvel ensemble de molécules d’adhésion
cellulaire et de récepteurs aux chimiokines et acquièrent la capacité de migrer dans le
parenchyme des organes et vers le site d’inflammation. Plusieurs changements phénotypiques
sont caractéristiques des LT activés. Ils
incluent l’expression de CD25, l’expression
transitoire de CD69 permettant un influx calcique extracellulaire responsable de l’expression
de certaines cytokines et de leurs récepteurs (Testi, Phillips et al. 1989). L’augmentation du
niveau d’expression de CD44 induit également la production de cytokines. La diminution
d’expression de CD62L prévient la recirculation des LT dans les ganglions lymphatiques. La
réexpression de S1P1 et la perte de l’expression du récepteur de chimiokines CCR7
permettent la sortie du ganglion lymphatique. L’acquisition de l’expression de différents
récepteurs de chimiokines selon le type de LT effecteurs généré sera impliquée dans la
régulation de la migration des LT effecteurs (Heydtmann and Adams 2002).
iv. Rôles
•
Les LT-CD4+
Les LT-CD4+ de type Th1 :
Les LT-CD4+ de type Th1 sont impliqués dans les réponses immunes à médiation
cellulaire, au cours desquelles les macrophages sont les cellules effectrices principales. Ils
contribuent également aux réponses immunes à médiation humorale au cours desquelles les
anticorps sont les molécules effectrices spécifiques d’antigène.
Les Th1 migrent vers le site d’inflammation, recrutent et activent les macrophages
infectés par les germes intracellulaires ou ayant récemment phagocyté un agent infectieux, et
qui présentent aux Th1 des complexes CMH:peptide spécifiques. L’activation des
macrophages repose sur un signal délivré lors de l’interaction entre la molécule CD40 sur le
macrophage et CD40L sur le LT-CD4+ activé et sur la synthèse et la sécrétion rapide, ciblée
vers le macrophage, de cytokines telles que l’IFN-γ, l’IL-2, le TNF-α, la lymphotoxine, ou
encore le TNF-β.
59
Les Th1 peuvent aussi contribuer à stimuler les réponses immunes induites par les LTCD8+, notamment par la sécrétion de l’IL-2 (Lehar and Bevan 2004) et d’IFNγ (Ferrone,
Perales et al. 2006). Cette aide aux fonctions effectrices des LT-CD8+ dépend en fait de
plusieurs mécanismes récemment démontrés par l’équipe de Zhao (Zhao, Balato et al. 2009).
Le rôle de l’interaction CD40/CD40L est primordial pour activer via les LT-CD4+ les cellules
dendritiques qui à leur tour permettront l’activation et la différenciation en cellules mémoires
des LT-CD8+ (Bourgeois, Rocha et al. 2002) comme en cellules effectrices (Lee, Hartson et
al. 2003). Les cellules dendritiques peuvent ainsi activer ces LT-CD8+ via différentes
interactions telles que l’interaction B7/CD28 (Prilliman, Lemmens et al. 2002) ou encore
CD70/CD27 (Bullock and Yagita 2005), 4-1BBL/4-1BB (Diehl, van Mierlo et al. 2002) et via
la synthèse de cytokines comme l’IL-12 et l’IL-15 (Oh, Perera et al. 2008).
Les LT-CD4+ de type Th2 :
Les LT-CD4+ de type Th2 stimulent des réponses immunes à médiation humorale
dirigées contre les antigènes protéiques thymo-dépendants, au cours desquelles les
lymphocytes B sont les cellules effectrices principales.
L’activation du LB repose sur la reconnaissance par leur récepteur à l’antigène de
surface d’un ligand conformationnel spécifique, qui est alors internalisé, dégradé et présenté
sous forme de complexe CMH:peptide aux LT auxiliaires. L’interaction entre un LB et un
lymphocyte Th2 spécifique d’un même antigène induit l’activation et l’expansion clonale du
LB, et la différenciation des cellules filles en plasmocytes sécréteurs d’anticorps spécifiques.
Les signaux activateurs fournis par les LT reposent entre autres sur l’interaction entre la
molécule CD40 exprimée par les LB et CD40L, et sur la sécrétion d’IL-4.
Ces Th2 pourront aussi développer une réponse cellulaire contre des pathogènes
extracellulaires en produisant des cytokines comme l’IL-4, l’IL-5, l’IL-10 et l’IL-13 qui
joueront également un rôle dans les réactions allergiques et dans l’inhibition de la réponse
pro-inflammatoire.
Les LT-CD4+ de type Th17 :
Cette population de Th17 possède des rôles paradoxaux : ils peuvent être soit
bénéfiques dans le cas de réponses protectrices pour l’hôte soit délétères et engendrer des
situations pathogéniques (Crome, Wang et al.).
En effet, le rôle des Th17 dans la défense de l’hôte contre des pathogènes a été bien
caractérisé dans des modèles murins où l’IL-17 était requise pour une immunité protectrice
60
contre les bactéries telles que Escherichia coli et salmonella. Par contre ce rôle anti-bactérien
chez l’homme reste largement inexploré.
Plusieurs études ont montré également que les Th17 jouaient un rôle important dans la
clairance des infections opportunistes par Cryptococcus neofarmans, Pneumocystis carinii et
candida albicans.
Des virus comme le HSV (herpes simplex virus) ou le HLV-1 (human leukaemia virus
type 1) peuvent aussi induire des réponses Il-17 dépendantes.
Par contre, ces Th17 peuvent être largement délétères et participer à la physiopathologie
de maladies telles que le psoriasis, l’arthrite rhumatoïde, la sclérose en plaques ou l’IBD
(inflammatory Bowel Disease). En effet, pour la sclérose en plaques par exemple, il est
clairement établi aujourd’hui une association entre la maladie et la production d’IL-17, même
si le rôle précis de cette IL-17 sur la démyélinisation reste limitée. De plus, des études ont
montré que les Th17 jouaient un rôle critique dans l’induction et la progression de l’EAE,
modèle murin de la sclérose en plaques. Chez l’homme, il a été prouvé que les cellules
endothéliales de la barrière hématoencéphalique des patients exprimaient des récepteurs à
l’IL-17 et l’IL-22, ce qui engendrait une faible expression des protéines des jonctions serrées,
augmentant ainsi la transmigration des LT-CD4+ (Kebir, Kreymborg et al. 2007).
Les LT-CD4+ suppresseurs:
Dans certaines conditions de stimulation, notamment dans le MALT (mucosa-associated
lymphoid tissue), les LT-CD4+ naïfs peuvent se différencier en LT dits suppresseurs ou
régulateurs, capables d’inhiber les réponses immunes. Leur fonction repose sur la production
de grandes quantités de cytokines immunosuppressives, telles que le TGF-β pour les LT-Th3
ou de l’IL-10 pour les Tr1. Ces deux sous populations joueraient un rôle important dans le
maintien de la tolérance vis-à-vis d’antigènes alimentaires et de la flore commensale.
Les LT-CD4+ de type Th25 interviendraient dans l’immunité induite au niveau des
muqueuses, en particulier au niveau du tractus gastro-intestinal, et dans la régulation de
l’inflammation chronique (Owyang, Zaph et al. 2006).
Le cas des LT régulateurs CD25+ sera abordé dans le chapitre sur la tolérance.
61
•
Les LT CD8+
Les LT-CD8+ effecteurs sont dits cytotoxiques (Tc). Ils induisent l’apoptose des cellules
infectées par les virus ou d’autres agents infectieux intracellulaires.
Ils sont également impliqués dans l’élimination des cellules tumorales. En effet, un
travail récent réalisé par Boissonas et al. utilisant des approches de microscopie bi-photonique
intra-vitale a permis de visualiser in vivo l’infiltration de tumeurs solides par des CTL (pour
cellules T lytiques) spécifiques d’antigènes tumoraux ainsi que l’élimination des cellules
cancéreuses par ces mêmes CTL (Boissonnas, Fetler et al. 2007).
Ils sont activés par reconnaissance de complexe de CMH de classe I:peptide spécifique
à la surface d’une cellule, en l’absence de co-stimulation. L’apoptose des cellules cibles peut
se faire par deux mécanismes. Le mécanisme principal est celui de la voie
perforine/granzyme, l’autre étant la voie Fas/FasL ; l’activation des LT-CD8+ induisant ainsi
la transcription des gènes codant pour la perforine, les granzymes et le FasL.
La voie perforine/granzyme implique le relargage polarisé vers la cellule exprimant les
complexes CMH:peptide spécifiques du contenu de granules lytiques : la perforine, la
serglycine et les granzymes. En effet, la reconnaissance de la cellule portant l’antigène
spécifique induit la polarisation rapide de la machinerie lytique du CTL vers cette cellule
cible (Yannelli, Sullivan et al. 1986). Cette polarisation rapide et efficace peut se faire en
absence d’une réorganisation moléculaire typique d’une synapse immunologique mature à la
zone de contact CTL/cellule cible : on parle de synapse lytique car seule l’activité
cytotoxique est présente (Faroudi, Utzny et al. 2003; Wiedemann, Depoil et al. 2006). La
polarisation de la machinerie lytique conduit à la sécrétion de granules cytotoxiques, des
lysosomes de sécrétion spécialisés qui contiennent la perforine (PFN) et la granulysine - deux
protéines capables de former des pores dans la membrane plasmique et d’altérer la paroi des
bactéries - ainsi qu’une famille de protéases à sérine appelées granzymes. Parmi les cinq
granzymes décrites chez l’homme et les dix identifiées chez la souris, les granzymes A
(GzmA) et B (GzmB) sont les plus abondantes. Une fois les cellules cibles reconnues, les
CTL ou les cellules NK sécrètent le contenu de leurs granules dans la synapse
immunologique. PFN permet l’entrée des Gzm dans la cellule cible, déclenchant ainsi des
cascades biochimiques multiples qui, bien que distinctes, conduisent toutes à la mort
cellulaire (Chowdhury and Lieberman 2008). Au cours des dernières décennies, de
62
nombreuses recherches ont permis de mieux comprendre les mécanismes apoptotiques initiés
par GzmB. Comme les caspases, GzmB clive ses substrats au niveau de résidus d’acide
aspartique, et initie ainsi la perforation de la membrane externe de la mitochondrie, libérant
des protéines pro-apoptotiques (cytochrome c, HtrA2/Omi, endo G, Smac/Diablo et AIF,
apoptosis-inducing factor) depuis l’espace inter-membranaire de la mitochondrie vers le
cytoplasme. Suivant les cas, cette voie est dépendante ou indépendante des caspases
(Chowdhury and Lieberman 2008).
L’essentiel des travaux portant sur la voie de la mort cellulaire induite par une autre
granzyme, GzmA, a été effectué par l’équipe du Pr. Judy Lieberman. Au sein de cette équipe,
il a été montré que la mort cellulaire induite par GzmA présentait toutes les caractéristiques
morphologiques de l’apoptose, c’est-à-dire la condensation de la chromatine, la fragmentation
de l’ADN, l’externalisation des phosphatidyl-sérines à la surface cellulaire, la perte du
potentiel de membrane mitochondrial et la production de ROS (reactive oxygen species)
(Barouki 2006). Cependant, cette voie est complètement indépendante des caspases et des
protéines anti-apoptotiques de la famille Bcl2. Dans cette nouvelle voie apoptotique, la
fragmentation de l’ADN se fait par cassures simple brin. Par ailleurs, il a été établi que le
complexe SET est une cible-clé de GzmA (Beresford, Zhang et al. 2001). Ce complexe, qui
est associé au réticulum endoplasmique, comprend les nucléases activées par GzmA, NM23H1 et TREX 1, la protéine phosphatase PP2A et son inhibiteur pp23, et trois substrats directs
de GzmA, les protéines Set, Ape1 et HMGB2 impliquées respectivement dans l’assemblage
des nucléosomes, la réparation des altérations de l’ADN induites par le stress oxydatif et le
remodelage de la chromatine. Lors de l’apoptose induite par GzmA, la translocation rapide du
complexe SET vers le noyau conduit à la dégradation de la protéine Set par GzmA, libérant
ainsi l’endonucléase NM23-H1 qui, de concert avec l’exonucléase TREX 1, induit la
fragmentation de l’ADN. En même temps, GzmA clive et inactive Ku70, HMGB2, Ape 1,
empêchant ainsi la réparation de l’ADN (Fan, Beresford et al. 2002).
L’autre voie cytotoxique utilisée par les LT-CD8+ est la voie Fas/FasL, indépendante
du flux calcique (Ostergaard, Kane et al. 1987). L’engagement du récepteur Fas (récepteur de
mort appartenant à la superfamille des récepteurs au TNF) à la surface d’une cellule cible par
la molécule FasL exprimée à la surface du LT-CD8+ effecteur et de certains LT-CD4+ de type
Th1 initie l’apoptose de la cellule cible par activation de la caspase 8 induisant la cascade
d’activation des caspases (Scaffidi, Fulda et al. 1998).
63
3. La tolérance des lymphocytes Tα
αβ aux antigènes de l’organisme
Afin de générer des réponses immunes spécifiques efficaces quel que soit l’agent
infectieux, l’ensemble des TCR exprimés par les LT, appelé le répertoire T, doit pouvoir
reconnaître un nombre quasi infini de séquences peptidiques. Cependant, il est indispensable
que ces LT soient limités dans leur capacité à s’activer contre les antigènes exprimés par les
cellules normales de l’organisme et ne puissent pas induire des réponses auto-immunes
destructrices. Cet état de tolérance immunitaire vis-à-vis des antigènes du soi est obtenu et
maintenu par plusieurs mécanismes, qui sont mis en jeu pendant le développement des LT
dans le thymus (tolérance centrale), mais aussi lorsque les LT circulent dans les organes
lymphoïdes secondaires, ainsi qu’au cours des réactions immunes (tolérance périphérique).
a. Tolérance intrathymique ou centrale
i.
Sélection négative
Comme nous l’avons vu dans le chapitre concernant l’ontogénie des LT, les thymocytes
CD4+CD8- et CD4-CD8+ fraîchement différenciés constituent grâce à une sélection positive
une population de LT fonctionnels au répertoire varié. Néanmoins, le contrecoup de ce
processus est l’enrichissement du compartiment LT en cellules ayant une forte affinité pour
les antigènes du soi : potentiellement auto-réactives, qui représenteraient une menace pour
l’organisme si elles s’activaient en périphérie. L’ensemble des mécanismes concourant à
préserver l’organisme d’un excès de réponse immune et de l’attaque de ses composants
constitue la tolérance.
La tolérance centrale, premier rempart contre les dommages que peuvent causer les LT
consiste en une neutralisation des thymocytes auto-spécifiques. En 1984, il a été mis en
évidence l’existence d’une tolérance restreinte par le CMH. En effet, si les LT sont capables
de s’activer au contact d’un antigène du non-soi présenté par le CMH du soi ou d’un antigène
du soi complexé à un CMH allogénique, l’interaction avec un complexe peptide du soi/CMH
du soi reste non immunogène (Matzinger, Zamoyska et al. 1984; Rammensee and Bevan
1984). L’équipe de Huseby a montré également qu’une sélection thymique reposant sur le
seul couple CMH:peptide, limitant sévèrement la sélection négative, conduirait à une
génération d’une population T enrichie en cellules capables de reconnaître plusieurs
64
combinaisons CMH:peptide (Huseby, White et al. 2005). Ainsi en éliminant les LT à la
réactivité dégénérée, la sélection négative contribuerait à façonner un répertoire plus
spécifique.
Ainsi, au terme du développement intrathymique, le répertoire des LT matures est
sélectionné et l’avidité des thymocytes SP pour les complexes CMH:peptide du soi doit être
comprise dans une étroite fenêtre. En effet, si elle est en dessous, il n’y aura pas de sélection
positive, les LT ne recevant alors aucun signal de survie meurent, et si elle est trop élevée, les
LT auto-réactifs seront éliminés en recevant des signaux apoptotiques. Les mécanismes précis
de cette sélection négative par mort cellulaire induite (AICD) font l’objet de nombreux
travaux et restent l’objet de controverse. Cependant, il semble qu’elles impliquent des
récepteurs de la superfamille des récepteurs du TNF, en particulier TRAIL (tumor necrosis
factor related apoptosis inducing ligand). La trimérisation de ces récepteurs thymocytaires par
leurs ligands peut induire en effet un signal de mort en recrutant une molécule adaptatrice,
FADD, permettant l’activation de caspases 8. Néanmoins, ce mécanisme d’activation des
caspases par TRAIL ne semble pas le mécanisme principal de la sélection thymique. La
phosphorylation et l’inactivation du facteur de survie Bcl-2 par les Jun kinases semblent
plutôt être en cause (Pinkoski and Green 2002). D’autres voies indépendantes de TRAIL
semblent aussi impliquées, comme celles induisant l’activation de Bim, protéine de la famille
de Bcl-2, capable à son tour d’activer d’autres protéines de la même famille, comme Bax et
Bak. Ces deux protéines perméabilisent la membrane externe des mitochondries et entrainent
la libération de molécules pro-apoptotiques comme le cytochrome c.
Cependant l’existence de maladies auto-immunes prouve que certains des LT autoréactifs réussissent à sortir du thymus. Les causes d’échappement des thymocytes autoréactifs à la sélection négative peuvent être de plusieurs natures, qui ont été particulièrement
explorées dans le cadre du diabète et de la sclérose en plaques (SEP) (Anderton and Wraith
2002).
Nous pouvons tout d’abord mentionner le faible niveau d’expression thymique de
l’auto-antigène. Il est maintenant admis que la majorité des antigènes y compris des antigènes
spécifiques d’organes sont exprimés dans le thymus chez l’homme, par exemple le GAD et
l’insuline impliqués dans le diabète, l’antigène S de la rétine dans l’uvéite, les composants de
la myéline PLP (Proteolipid protein) et MBP (Myelin basic protein) dans la SEP. Les
mécanismes diminuant l’expression de ces antigènes prédisposent au développement de
l’auto-immunité en altérant la sélection négative et en favorisant le passage de lymphocytes T
65
auto-réactifs en périphérie. On observe ainsi des corrélations entre le niveau d’expression des
auto-antigènes dans le thymus et la susceptibilité aux pathologies auto-immunes, chez
l’homme et les rongeurs (Klein and Kyewski 2000). Par exemple, chez l’homme, la
susceptibilité au diabète de type 1 est associée à un polymorphisme au niveau de la région 5’
du gène de l’insuline, qui influence le niveau d’expression des peptides dérivés de l’insuline
par les CPA dans le thymus. L’allèle « protecteur » est associé à un haut niveau d’expression
thymique de l’insuline et l’allèle de « susceptibilité » à un faible niveau (Klein and Kyewski
2000). Dans ce dernier cas, les lymphocytes T autoréactifs ne sont pas soumis à une sélection
négative efficace. Les souris Non-Obese-Diabetic (NOD) qui n’expriment pas la pro-insuline
2 dans le pancréas ni dans le thymus développent rapidement un diabète (Thebault-Baumont,
Dubois-Laforgue et al. 2003). De même, l’expression thymique des antigènes potentiellement
impliqués dans la pathogenèse de la SEP chez l’homme est variable. En effet, la PLP chez
l’homme existe sous deux isoformes générés par épissage alternatif du gène : l’isoforme «
complèt » et un isoforme délété au niveau des acides aminés 116-150 appelée DM20 (Bruno,
Sabater et al. 2002). Ces deux isoformes sont exprimés dans le cerveau mais le niveau
d’expression thymique de l’isoforme « complèt » est variable d’un individu à l’autre. Chez
certains individus, c’est l’isoforme DM20 qui est exclusivement exprimée dans le thymus.
Chez ces derniers, l’épitope immunodominant pourrait être sous-exprimé et il y aurait
échappement à la sélection négative des lymphocytes T spécifiques de cet épitope. C’est le
cas de la souris SJL/J où l’épitope immunodominant (résidus 139-151) n’est pas exprimé dans
le thymus et où l’on retrouve des lymphocytes T spécifiques de cet épitope en périphérie. De
la même façon, la MBP présente plusieurs isoformes, dont certaines ont une expression
restreinte au système nerveux central, contrairement à l’isoforme golli-MBP qui est
principalement exprimée hors du système nerveux central dans le thymus. Seul l’antigène
MOG (Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein) est un antigène « séquestré » c’est-à-dire
exprimé exclusivement dans le système nerveux central (Bruno, Sabater et al. 2002). Il n’y a
donc pas de sélection négative vis-à-vis des lymphocytes T spécifiques de cet autoantigène
dans le thymus, et cet antigène pourrait jouer un rôle majeur dans le développement de la
SEP.
La deuxième possibilité pour un défaut de sélection thymique est un défaut de
présentation du peptide. Soit en raison de la faible affinité du TCR pour les complexes CMH–
peptide soit en raison d’un défaut dans « l’apprêtement » de l’antigène. En ce qui concerne la
faible affinité du TCR pour les complexes CMH-peptides, nous l’avons vu précedemment, le
système du CMH est très polymorphe et un peptide se liera avec une plus ou moins grande
66
efficacité à différentes molécules du CMH. Quand des molécules du CMH lient faiblement un
peptide, le complexe CMH–peptide est instable et très faiblement exprimé à la membrane
cellulaire, ce qui ne permet pas la délétion des lymphocytes T autoréactifs spécifiques de ce
peptide. Ainsi, dans le cadre du modèle murin de la SEP, l’EAE (encéphalomyélite autoimmune expérimentale), l’épitope immunodominant de la MBP correspond à la partie aminoterminale de la MBP et se fixe très faiblement aux molécules CMH de classe II Au (Anderton
and Wraith 2002). Chez les souris Au, les lymphocytes T spécifiques de la MBP échappent à
la sélection négative et passent en périphérie. Quant à l’apprêtement de l’antigène, nous
savons que l’efficacité de la présentation de l’antigène par les cellules présentatrices
thymiques est un facteur limitant la reconnaissance des complexes « CMH–peptide » par le
TCR et donc la sélection négative. En particulier, les protéases qui coupent les protéines en
peptides jouent un rôle important. Chez l’homme, la région incluant les acides aminés 80 à
100 de la MBP est immunodominante et l’épitope MBP85-99 est reconnu par les sujets CMH
DR2. L’asparagine endopeptidase (AEP) clive la MBP après l’asparagine 94, détruisant donc
l’épitope MBP85-99. L’AEP, exprimée à haut niveau par les cellules dendritiques thymiques,
diminue de ce fait la présentation de l’épitope MBP85-99 par ces cellules. La faible densité de
l’antigène consécutive à sa destruction pendant son apprêtement ne permettrait pas aux
lymphocytes T spécifiques de la MBP85-99 d’être sélectionnés négativement (Anderton and
Wraith 2002). L’AEP est moins exprimée dans les CPA en périphérie que dans le thymus,
l’épitope MBP85-99 y est donc présenté. Les lymphocytes T autoréactifs non délétés dans le
thymus peuvent reconnaître cet antigène en périphérie, en raison de la différence d’activité de
l’AEP entre les CPA thymiques et périphériques.
La troisième raison de l’apparition de maladie auto-immune est l’architecture du stroma
thymique. En effet, elle intervient également dans l’efficacité de la sélection négative. Chez la
souris NOD, cette architecture est perturbée et des cellules épithéliales médullaires sont
présentes dans le cortex. Cette localisation anormale perturbe le mécanisme de sélection
négative (Rosmalen, van Ewijk et al. 2002).
Enfin nous pouvons parler du défaut d’apoptose pour expliquer ce défaut de sélection
négative. En effet, cette sélection négative est fondée sur l’apoptose des lymphocytes T autoréactifs, et on comprend qu’un défaut de facteurs apoptotiques est associé à une anomalie de
cette sélection. Une étude récente a montré que des souris déficientes en TRAIL ont une
susceptibilité accrue aux pathologies auto-immunes. Le mécanisme causal de la survenue de
ces pathologies reste à éclaircir (Lamhamedi-Cherradi, Zheng et al. 2003). Il existe des
67
polymorphismes du gène TRAIL chez l’homme et on ne connaît pas encore leurs
conséquences sur la survenue de pathologies auto-immunes (Gray, Sorensen et al. 2001).
ii.
Les Auto-antigènes
On a longtemps considéré que les auto-antigènes ubiquitaires, ceux qui sont exprimés
par les cellules du stroma thymique, et les auto-antigènes circulants, étaient les seuls à être
présentés dans le thymus et à contribuer à l’induction de la tolérance centrale. L’absence de
réactivité des LT vis-à-vis des auto-antigènes spécifiques des tissus, « séquestrés » dans les
organes, était supposée être obtenue par les mécanismes périphériques d’induction de
tolérance et l’absence de pénétration des LT naïfs dans le parenchyme des organes.
Cependant, plusieurs travaux ont mis en évidence l’expression d’auto-antigènes
spécifiques des tissus dans le thymus [figure 18] , notamment d’antigènes impliqués dans les
maladies auto-immunes spécifiques d’organe, telles que la tyroglobuline, l’antigène S de la
rétine, l’insuline et les décarboxylases de l’acide glutamique 65 et 67 chez le rat, la souris et
l’homme (Jolicoeur, Hanahan et al. 1994; Heath, Moore et al. 1998; Sospedra, FerrerFrancesch et al. 1998). Des auto-antigènes du système nerveux central (SNC) sont également
exprimés dans le thymus, tels que la MBP, la protéine protéo-lipidique (PLP) (Fritz and Zhao
1996; Pribyl, Campagnoni et al. 1996), la glycoprotéine oligodendrogliale (MOG) et la S100β
(Kojima, Reindl et al. 1997), qui sont des cibles potentielles de la réponse auto-immune
impliquée dans le développement des lésions de la sclérose en plaques (SEP) (Kojima, Reindl
et al. 1997; Anderson, Waldner et al. 2000; Delarasse, Daubas et al. 2003).
FIGURE 18 : Nature des antigènes restreints aux tissus périphériques exprimés par
les cellules épithéliales thymiques médullaires (Kyewski and Derbinski 2004).
68
En 2001, Derbinski et al. ont mis en évidence que les cellules épithéliales thymiques
medullaires (mTEC) et dans une moindre mesure les cellules épithéliales thymiques corticales
(cTEC) exprimaient de nombreux auto-antigènes spécifiques de tissus. Cette expression
« illégitime » d’auto-antigènes spécifiques de tissus par un petit nombre de mTEC est en
partie régulée par l’activateur de transcription AIRE et semble jouer un rôle majeur dans
l’induction de la tolérance du soi (Coutinho, Caramalho et al. 2005; Derbinski, Gabler et al.
2005). En effet, chez l’homme, des mutations dans le gène AIRE causent un syndrome
caractérisé par la présence d’anticorps auto-immuns spécifiques de nombreux auto-antigènes :
APECED (autoimmune polyendocrinopathy candidiasis ectodermal dstrophy). Les souris
ayant des mutations de ce même gène AIRE ont des symptômes identiques aux patients
atteints d’APECED (production d’anticorps et infiltration de lymphocytes dans plusieurs
organes). De plus, plusieurs études ont montré que AIRE était un facteur crucial pour
l’expression de TSAs dans le thymus et que la mutation de ce gène permettait aux LT autoréactifs d’échapper à toute sélection, ce qui impliquait par conséquent le développement
d’auto-immunité (Ramsey, Winqvist et al. 2002; Jiang, Anderson et al. 2005; Kuroda, Mitani
et al. 2005; Niki, Oshikawa et al. 2006). Très récemment, des études ont montré que dans des
souris déficientes pour AIRE, les LT, en particulier les Th1, étaient des médiateurs cruciaux
dans les dommages tissulaires, conséquences de l’auto-immunité, alors que les LB n’avaient
qu’une fonction limitée (Gavanescu, Benoist et al. 2008). Il a également été montré que chez
des patients atteints d’APECED, la candidose était attribuée à la présence d’anticorps
neutralisants tels que l’IL-17A, l’IL-17F et l’IL-22, impliquant les Th17 dans cette pathologie
(Puel, Doffinger et al.). Les évidences expérimentales de la fonction de AIRE dans la
sélection négative ont été obtenues grâce à des souris transgéniques pour le TCR spécifique
d’un néo-auto-antigène (Kont, Laan et al. 2008) suggérant que les LT qui échappent à la
sélection négative étaient capables d’induire une auto-immunité.
iii.
Les lymphocytes T régulateurs générés dans le thymus
Différentes populations de lymphocytes différenciés dans le thymus et ayant des
propriétés régulatrices des réponses immunes en périphérie ont été décrites : les lymphocytes
NK-T, les LT-CD8+-CD28- et les Treg de type CD4+CD25+.
69
Les lymphocytes NK-T :
Ces cellules expriment les marqueurs de surface des NK comme le CD161 et expriment
un TCR-αβ, comprenant une chaîne α invariante, restreint par la molécule CD1d. Ces
lymphocytes pourraient avoir des fonctions régulatrices et contribueraient au contrôle des
réponses auto-immunes. Mais ce rôle protecteur contre l’auto-immunité n’est pas
prédéterminé et des études récentes montrent que ces cellules, une fois activées, pourraient
intervenir également dans le phénomène d’inflammation en produisant des cytokines proinflammatoires, alors qu’au niveau basal elles produiraient des cytokines anti-inflammatoires
nécessaires à l’arrêt de l’inflammation. Cependant le mécanisme de la régulation et le ou les
ligands naturels de ces NK-T ne sont pas encore connus. Les facteurs modulant la mise en
œuvre de leurs fonctions régulatrices in vivo restent à caractériser afin d’envisager une
utilisation thérapeutique de cette sous-population (Mars, Novak et al. 2004).
Les lymphocytes T- CD8+-CD28- :
Les fonctions régulatrices des LT-CD8+-CD28- ont été récemment mises en évidence
dans le modèle murin de la sclérose en plaques induit par une immunisation avec le peptide
MOG. Le mécanisme de l’immunosuppression induite par cette sous-population n’est pas
connu, et pourrait reposer sur une diminution du niveau d’expression des molécules de costimulation B7, voire des molécules de CMH, par les CPA, et/ou sur la production d’IL-10
par les LT-CD8+-CD28- (Najafian, Chitnis et al. 2003; Filaci, Fravega et al. 2004).
Les lymphocytes T- CD4+-CD25+ :
Les LT régulateurs de type CD4+CD25+ (T-reg) jouent un rôle majeur dans le maintien
de la tolérance au soi, et ont récemment fait l’objet de nombreuses études. Les T-reg
représentent 2 à 10% des LT-CD4+ présents en périphérie, chez l’homme, la souris et le rat
(Najafian, Chitnis et al. 2003). Ces T-reg sont capables d’inhiber la prolifération des LTCD4+ et LT-CD8+, de même spécificité antigénique ou non, d’une manière dépendante de
l’engagement de leur TCR (Takahashi, Kuniyasu et al. 1998; Thornton and Shevach 2000;
Baecher-Allan, Brown et al. 2001; Piccirillo and Shevach 2001). Sur le plan phénotypique, les
T-reg sont caractérisés par leur expression membranaire constitutive de CD25, CTLA4 et de
GITR, et par l’expression constitutive du facteur de transcription FoxP3 (Fontenot, Gavin et
al. 2003; Hori, Nomura et al. 2003).
Les T-reg semblent constituer une sous-population distincte de lymphocytes T et
acquièrent leur phénotype et leur fonction régulatrice dans le thymus (Itoh, Takahashi et al.
70
1999). La thymectomie de la souris avant le troisième jour de vie est associée au
développement d’une maladie auto-immune multi-organique sévère, avec un tableau lésionnel
variable en fonction de la souche de souris. Le transfert de T-reg syngéniques prévient le
développement de ce syndrome (Suri-Payer, Amar et al. 1998). Les cTEC ont été largement
impliquées dans la sélection de cette sous-population (Bensinger, Bandeira et al. 2001;
Jordan, Boesteanu et al. 2001; Apostolou, Sarukhan et al. 2002). Les T-reg expriment un
répertoire de TCR aussi varié que les LT conventionnels, mais seraient enrichis en LT autoréactifs (Itoh, Takahashi et al. 1999; Romagnoli, Hudrisier et al. 2002; Hsieh, Liang et al.
2004). De plus, la sélection de ces T-reg serait induite par interaction de forte avidité avec des
CPA thymiques présentant un peptide du soi (Jordan, Boesteanu et al. 2001; Hsieh, Liang et
al. 2004). Le rôle de ces cellules sera discuté dans un chapitre ultérieur.
b. Tolérance périphérique
Divers mécanismes sont mis en jeu en périphérie pour limiter les risques d’activation
des clones auto-réactifs exportés du thymus et leur différenciation en LT effecteurs capables
d’induire des réponses auto-immunes destructrices. On peut les séparer en deux catégories :
ceux que l’on qualifie de passifs et qui résultent des caractéristiques physiologiques des tissus
sains et les mécanismes actifs qui sont assurés par des populations immunitaires régulatrices.
i.
La tolérance passive
Le concept d’immunoprivilège est né il y a plus de 100 ans, lorsqu’un ophtalmologiste
observa la prise d’une greffe de peau murine placée dans la chambre antérieure de l’œil d’un
chien (Niederkorn 2006).
On sait aujourd’hui que plusieurs tissus possèdent un statut
immunologique particulier, qui les préserve des conséquences délétères d’une inflammation
locale. Il s’agit du cerveau, de la chambre antérieure de l’œil, de la cornée, des testicules et de
l’utérus en gestation. Cette évolution permet de protéger des tissus cruciaux pour la survie de
l’organisme, au faible pouvoir de régénération ou qui sont le siège temporaire d’une « greffe »
allogénique. Les autres organes et tissus ne sont pas pour autant dépourvus de défense et les
mécanismes de régulation qui s’y déroulent font qu’un tissu sain peut être considéré comme
un site temporairement immunoprivilégié. Il existe différents mécanisme de tolérance passive
que nous détaillerons [figure 19] .
71
• L’ignorance
L’ignorance est un mécanisme qui permet une absence de rencontre entre les CPA et les
LT, ceci dû à une compartimentalisation. Les LT naïfs ne peuvent ainsi entrer que dans les
OLP. Ainsi les LT potentiellement auto-réactifs ignorent leur antigènes puiqu’il ne peut pas y
avoir de présentation antigénique par les CPA matures qui se trouvent elles dans les tissus.
Les LT sont ainsi physiquement isolés des CPA ou séquestrés. La constatation de l’absence de
drainage lymphatique dans le cerveau, la chambre antérieure de l’œil et l’endomètre a été
corrélée au statut immunoprivilégié de ces sites (Niederkorn 2006). Cependant, ces derniers
ne sont pas réellement isolés du système immunitaire, en particulier l’utérus, leur accès est
seulement moins favorisé que la normale. La barrière hémato-encéphalique constitue en outre
un filtre supplémentaire limitant l’accessibilité au SNC.
Par ailleurs les molécules de CMH de classe I classiques sont absentes ou faiblement
exprimées sur les cellules nerveuses, oculaires ou trophoblastiques (Lampson and Fisher
1984; Abi-Hanna, Wakefield et al. 1988). Cette déficience exclut toute attaque cytotoxique
par les LT-CD8+ (Joly, Mucke et al. 1991). Toutefois elle les rend potentiellement vulnérables
à la lyse par les cellules NK, lymphocytes majoritairement représentés dans l’utérus gravide.
L’expression de molécules de MCH de classe Ib, comme HLA-E et HLA-G, à la surface des
cellules de la cornée, de la rétine et du trophoblaste extravilleux prévient l’activation des
lymphocytes NK par l’interaction avec le récepteur inhibiteur CD94/NKG2 (Kovats, Main et
al. 1990; Niederkorn, Chiang et al. 1999).
Cependant, l’ignorance est un état réversible. L’organisme encourt ainsi toujours un
risque d’auto-immunité si l’auto-antigène sort du tissu dans lequel il est ignoré.
• Indifférence des lymphocytes T auto-réactifs
Il est établi que certains LT sont capables in vitro de répondre à une stimulation par
l’antigène mais semble ignorer celui-ci in vivo sans qu’aucune maladie ne se développe. C’est
l’exemple du modèle de souris transgéniques GP-LCMV développé par Ohashi et al. où la
glycoprotéine du LCMV (Lymphocytic Choriomeningitis Virus) est exprimée sous le contrôle
du promoteur de l’insuline de rat dans les cellules β du pancréas (Ohashi, Oehen et al. 1991).
Les LT-CD8+ auto-réactifs des souris double transgéniques TCR x GP-LCMV présentent in
vitro une activité cytotoxique vis-à-vis de cellules infectées par le virus, mais, in vivo, les
souris ne développent pas de diabète spontanément.
72
Cette indifférence peut s’expliquer par le fait qu’en l’absence d’inflammation, les LT
naïfs n’ont pas accès aux tissus non lymphoïdes. En effet, lorsque les LT sortent du thymus,
ils circulent dans le sang vers la lymphe en passant par les organes lymphoïdes secondaires,
où ils sont susceptibles de rencontrer l’antigène pour lequel ils sont spécifiques. Ce n’est
qu’après activation que les LT peuvent migrer dans les tissus non lymphoïdes grâce à
l’expression de molécules comme LFA-1 et VLA-4 à leur surface.
• Inactivation fonctionnelle des lymphocytes T
auto-réactifs ou anergie
L'anergie est un phénomène physiologique, particulièrement important pour désactiver
les LT et les cellules NK qui réagiraient contre des antigènes du soi et seraient ainsi délétères
pour l’organisme hôte. C’est un mécanisme réversible par l’IL-6, qui va permettre d’activer
ces LT. Un point important du rôle de l’anergie sera traité dans le chapitre concernant les LT
régulateurs dont une des propriétés majeures est le fait d’être anergique.
Ce mécanisme de tolérance peut être obtenu grâce à une modulation de l’expression des
molécules de surface des LT, ce LT devenant ainsi incapable de répondre face à l’antigène,
sauf si ce dernier est présent en concentration supra-optimale. Pour démontrer ceci, l’équipe
de Schönrich a fait exprimer chez une souris la molécule de classe I-Kb sous contrôle du
promoteur de la GFAP dans les astrocytes. Ces souris ont ensuite été croisées avec des souris
transgéniques exprimant un TCR spécifique de la molécule Kb. Ces souris double
transgéniques ne développent pas de pathologie du SNC. L’utilisation d’un anticorps anticlonotypique reconnaissant le TCR transgénique anti-Kb a permis d’identifier et de suivre les
LT transgéniques. Chez la souris double transgénique, les auteurs ont observé un nombre
normal de cellules LT-CD8+CD4- dans le thymus mais une diminution dans la rate et les
ganglions lymphatiques. Ceci n’est pas dû à une élimination des LT mais à une diminution de
l’expression des molécules CD8 et du TCR transgénique par ces cellules.
Lorsque les
splénocytes issus de ces souris sont isolés et restimulés in vitro avec l’antigène, l’expression
de ces deux molécules est restaurée. Ainsi, chez ces souris une tolérance par diminution de
l’expression des molécules servant à activer les LT a été induite.
Les cellules dendritiques immatures présentes dans les organes lymphoïdes secondaires
et les tissus périphériques induisent l’anergie des LT qu’elles rencontrent par l’absence des
molécules de co-stimulation CD80 et CD86 à leur surface (Keir and Sharpe 2005). L’anergie,
ou incapacité fonctionnelle des LT naïfs à être activés par un antigène et à proliférer lors
73
d’une restimulation, est un processus qui se fait en deux étapes : un processus d’activation
incomplète, généralement lié à l’engagement du TCR sans signaux de co-stimulation, mais
aussi dans certains modèles à l’altération du premier signal par liaison du récepteur avec un
ligand peptidique modifié, de faible affinité pour le récepteur, ou par modification de la
présentation peptidique par l’IL-10. Sur le plan moléculaire, l’anergie nécessite l’engagement
du TCR et la translocation nucléaire du facteur de transcription NFAT car il a été clairement
démontré que les LT déficients en NFAT étaient résistants à l’anergie (Luo, Burgeon et al.
1996). En effet, l’interaction avec CD28 induit l’hétérodimère AP-1, qui se complexe avec le
facteur de transcription NFAT, activé par la signalisation calcique soutenue qui suit
l’engagement du TCR. Un programme transcriptionnel alternatif est accompli par NFAT en
absence d’AP-1, conduisant à l’incapacité du LT d’engager une réponse proliférative, de
produire de l’IL-2 ou de se différencier, ainsi qu’à la synthèse d’IL-10 (Macian, Garcia-Cozar
et al. 2002).
De plus, la plupart des études sur l’induction d’anergie in vivo utilisent des LT ayant
un TCR transgénique. L’administration d’un antigène peptidique soluble pour ce TCR
transgénique peut induire un état de non-réponse (Kearney, Pape et al. 1994). Il a été montré
également que des souris déficientes pour les molécules identifiées comme importantes pour
l’induction d’anergie in vitro, telles que Cbl-b(Bachmaier, Krawczyk et al. 2000), Egr-3
(Safford, Collins et al. 2005) ainsi que les souris exprimant la molécule GRAIL (Seroogy,
Soares et al. 2004) sont résistantes à l’induction d’anergie in vivo (Heissmeyer and Rao 2004).
Les cellules dendritiques immatures expriment par ailleurs PD-L1, une molécule de costimulation inhibitrice dont le récepteur est exprimé par les LT activés. PD-L1 est également
présent sur des cellules non lymphoïdes, comme les cellules β du pancréas, les cellules gliales
ou placentaires. Ce mécanisme inhiberait la prolifération et la sécrétion de cytokines amenant
à l’anergie du LT. Un autre mécanisme de rétro-contrôle négatif serait impliqué dans cette
anergie : l’induction de CTLA-4 qui permet comme nous l’avons mentionné précédemment
de passer d’une signalisation activatrice à inhibitrice en limitant l’expansion et l’activité des
clones T engagés dans la réponse.
• Délétion des lymphocytes T auto-réactifs
L’absence de lymphocytes T auto-réactifs matures peut résulter d’une sélection négative
intra-thymique comme montré ci-dessus, mais aussi d’une délétion induite en périphérie,
74
seule forme de tolérance périphérique irrévocable. Les facteurs impliqués dans cette tolérance
ne sont pas clairement connus. Cependant plusieurs mécanismes ont aujourd’hui été suggérés.
Tout d’abord, la persistance antigénique est montrée comme une variable déterminante
dans le choix entre délétion ou survie. Pour étudier ce phénomène, des études de transfert
adoptif de LT issus de souris CL4 transgéniques (cf matériel et méthode) dans des souris InsHA, exprimant constitutivement l’antigène HA dans les îlots β pancréatiques, montrent que 4
jours après l’engagement initial, les cellules transférées seules prolifèrent beaucoup moins que
les cellules ayant été transférées avec un signal activateur supplémentaire. Cependant, il
demeure un certain nombre de LT survivants (Redmond, Hernandez et al. 2003), montrant
que l’engagement initial induit par le stimulus de l’auto-antigène ne suffit pas à lui seul à
provoquer une délétion totale des LT concernés. La même équipe a montré, toujours par
divers transferts adoptifs, qu’une stimulation antigénique soutenue dans un environnement
tolérogène pouvait mener à une tolérance par délétion. De plus, il a été montré que de
multiples stimulations antigéniques à haute dose provoquaient une anergie alors que de
multiples stimlulations antigéniques à faible dose provoquaient une délétion complète des LT
(Redmond and Sherman 2005) due à une incapacité à maintenir l’expression des gènes antiapoptotiques suite à la signalisation par le TCR. De plus, il a été montré que des stimulations
réitérées par l’antigène conduisaient à l’expression du ligand du récepteur de mort Fas (FasL)
par les LT. Ces cellules expriment déjà constitutivement Fas, ce qui entraîne l’activation de la
voie pro-apoptotique en aval et donc la mort du LT (Brunner, Mogil et al. 1995; Dhein,
Walczak et al. 1995). La voie plus efficace pour éviter qu’un clone T ne provoque une
réaction auto-immune est de déléter sa spécificité par AICD (activation induced cell death).
Ce mécanisme implique la voie Fas/FasL (Sobel, Kakkanaiah et al. 1993; Suda, Takahashi et
al. 1993). Des études récentes montrent également un rôle important de Pten (phosphatase ant
tensin homolog) (Suzuki, Yamaguchi et al. 2001) et du TGF-β dans cette voie. Comme nous
l’avons vu précédemment, la présentation croisée désigne le fait que des antigènes restreints
par les molécules CMH de classe I soient présentés par des cellules n’exprimant pas ellesmêmes ces antigènes. Il a été montré que des CPA possèdent cette capacité à capturer des
antigènes dans les tissus et migrer ensuite dans les ganglions lymphatiques drainant l’organe
exprimant l’antigène pour le présenter aux lymphocytes T (Kurts, Heath et al. 1996). C’est
ainsi que des auto-antigènes trouvés dans les îlots pancréatiques peuvent être drainés dans les
ganglions où ils seront capables d’activer des LT auto-réactifs qui seront ensuite délétés :
c’est la tolérance croisée. Des études ont en effet montré que de faibles taux de LT-CD8+
auto-réactifs spécifiques de l’ovalbumine étaient incapables de provoquer un diabète après un
75
transfert adoptif de ces cellules dans une souris exprimant l’ovalbumine dans les îlots
pancréatiques. En faisant une co-injection de LT-CD4+ spécifiques de OVA, plus de la moitié
des souris développaient un diabète, suggérant que l’aide apportée par ces LT-CD4+ favorisait
l’auto-immunité, ceci en empêchant la délétion des LT-CD8+. Ces données montrent donc que
ce contrôle des LT-CD8+ auto-réactifs par les LT-CD4+ est un mécanisme critique pour la
maintenance de l’induction de tolérance de ces LT-CD8+ par présentation croisée (Kurts,
Carbone et al. 1997). Cette cross-présentation d’épitopes de classe I pourrait donc être un
mécanisme de tolérance périphérique. De plus, il apparaît être plus important chez l’adulte
que chez le nouveau-né (Morgan, Kreuwel et al. 1999; Morgan, Kurts et al. 1999). En effet,
en immunisant des souris InsHA avec le virus A/PR/8 à différents âges, des études ont montré
qu’en période périnatale les LT ne sont pas tolérogènes et que par conséquent l’infection
virale provoque un diabète auto-immun. Par contre, chez l’adulte, beaucoup de LT
tolérogènes sont retrouvés, protégeant l’animal de la maladie. Ce phénomène peut être
expliqué par le fait qu’en période périnatale, l’absence de tolérance est corrélée avec
l’absence d’activation des LT-CD8+ spécifiques de l’antigène alors que chez l’adulte, cette
activation ainsi que la prolifération des LT-CD8+ spécifiques de HA ont lieu (Morgan, Kurts
et al. 1999).
L’induction d’une maladie auto-immune n’est donc pas la conséquence obligatoire
d’une situation d’auto-réactivité, même lorsque les LT auto-réactifs activés peuvent pénétrer
les tissus où l’auto-antigène est exprimé. L’activation lymphocytaire et l’accessibilité au tissu
non lymphoïde sont deux étapes nécessaires pour déclencher la réponse auto-immune.
D’autres paramètres peuvent également intervenir pour permettre de limiter l’extension d’une
réaction auto-immune comme le blocage de l’expansion des LT auto-réactifs in situ par
l’engagement de la molécule CD30 à la surface des LT (Kurts, Carbone et al. 1999). En effet,
il a été montré que les LT-CD8+ spécifiques des îlots pancréatiques déficients en CD30
étaient 6000 fois plus auto-aggressifs que les LT sauvages. De plus le transfert de LT
déficients en CD30 provoque une destruction complète de l’îlot pancréatique et par
conséquent un diabète très rapide. Ainsi, la signalisation par le CD30 limite le potentiel
prolifératif des LT-CD8+ et protège contre l’auto-immunité.
• Déviation de la réponse immune
La déviation immune est le processus selon lequel un tissu influence la réponse pour se
préserver des lésions inflammatoires, ce qui aboutit à privilégier la fonction humorale et
76
inhiber l’inflammation et la cytotoxicité. L’exemple le plus étudié est celui de la chambre
antérieure de l’œil, où l’introduction d’un antigène soluble induit une tolérance systémique à
celui-ci (Niederkorn, Chiang et al. 1999). De nombreuses cellules occulaires sont postmitotiques. Les dommages causés par une réaction inflammatoire s’avèreraient donc
irréversibles. Il s’agit d’un mécanisme complexe débutant par la capture de l’antigène par les
cellules présentatrices d’antigènes tolérogènes qui migrent par la circulation veineuse
jusqu’au thymus où elles induisent des lymphocytes NKT (Niederkorn, Chiang et al. 1999).
Ceux-ci vont rejoindre la rate, où à leur tour ils vont favoriser la génération de LT-CD8+
suppresseurs en collaboration avec les cellules présentatrices d’antigènes tolérogènes issues
de l’œil, aboutissant ainsi à l’inhibition des réactions inflammatoires, tout en autorisant une
réponse humorale IgG1.
Un phénomène semblable a lieu dans la sphère intestinale où le TGF-β maintient la
tolérance vis-à-vis de la flore commensale et des antigènes alimentaires, et favorise de
surcroît la commutation de classe vers les IgA, qui sont une des bases de l’immunité mucosale
(Mowat 2003).
A. Ignorance
D. Apoptose
ou AICD
C. Déviation
ˇ
Phénotypique
B. Anergie
cytokine
B7.1/ 2
FIGURE 19 : les différents mécanismes d’induction de tolérance périphérique
(Walker, Ausubel et al. 2002).
A. Les cellules T auto-réactives peuvent rester dans un état d’ignorance. C’est le cas lorsque
l’Ag est séquestré dans un tissu ou s’il ne peut pas être présenté par les DC ou encore, si l’Ag
est exprimé à des niveaux trop faibles. B. La rencontre avec l’auto-Ag peut induire l'anergie
de la cellule T. L’induction d’anergie implique l'interaction entre les molécules CTLA-4 ou
PD-1 exprimées par les cellules T et leurs ligands (B7.1/ B7.2, PDL1/2) exprimés par les
APC. C. Les cellules T peuvent être activées suite à leurs rencontres avec l’Ag du soi mais
pourraient développer un phénotype non pathogène en terme de cytokines et de récepteurs
aux chimiokines qu’elles expriment. Dans ce scénario, les cellules T autoréactives sont
activées mais n'induisent pas des dommages auto-immuns. D. Les cellules T auto-spécifiques
peuvent être éliminées suite à leur rencontre avec l’APC. L’induction d’apoptose implique la
surexpression des molécules Fas et FasL par la cellule cible.
77
ii.
Tolérance active
• Les cellules myéloïdes tolérogènes
Les cellules myéloïdes suppressives (Myeloid-derived suppressor cells ou MdSC) sont
des cellules immunitaires, d'origine myéloïde, comme les monocytes, mais dont les propriétés
sont immunosuppressives. Chez la souris, leur définition phénotypique est Gr1 (Ly-6G/C)+ et
CD11b+. Chez les humains, la définition phénotypique n'est pas encore standardisée.
Cependant, les MdSC humaines sont souvent définies comme monocytaires (CD33+) et
immatures (HLA-DR-) ou encore comme CD14- et CD11b+ [figure 20] .
Ces cellules vont modifier le métabolisme de l’arginine, acide aminé essentiel qui induit
par sa dégradation l’arrêt de la prolifération, voire l’apoptose des LT. A l’origine de ce
changement sont impliquées l’arginase-1 induite par les cytokines de type II produisant l’urée
et l’oxyde nitrique synthase 2 (NOS2) induite par les cytokines de type I produisant l’oxyde
nitrique. L’activité de l’arginase-1 semble conduire à une inhibition transcriptionnelle de
CD3ζ alors que l’oxyde nitrique semble interférer avec la signalisation en aval de l’IL-2. Ces
cellules myéloïdes suppressives participeraient donc à un rétrocontrôle des réponses T
initiées par les cytokines de type I et II. De plus, il a été montré que ces cellules myéloïdes
suppressives pouvaient produire du TGF-β en conséquence de l’action de l’IL-13 sécrétée par
les NKT (Terabe, Matsui et al. 2003).
Des études chez la souris et chez l’homme ont montré que ces cellules infiltraient les
tumeurs et contrôlaient ainsi les réponses anti-cancéreuses. L'accumulation de ces cellules est
l'un des principaux mécanismes d'échappement tumoral (Bunt, Sinha et al. 2006). Ezernitchi
et al (Ezernitchi, Vaknin et al. 2006) ont rapporté également que ces cellules myéloïdes
suppressives pouvaient inhiber l'expression de la chaine ζ du TCR. En effet, la diminution
d’expression de cette chaine sur les LT dans la rate, le sang périphérique et la moelle osseuse,
est corrélée avec des niveaux élevés de cellules myéloïdes suppressives. Les auteurs suggèrent
ainsi une limite sur le succès des stratégies d'immunothérapie basée sur la vaccination et le
transfert des LT. De plus, Serafini et al (Serafini, Carbley et al. 2004) ont montré que de fortes
doses de GM-CSF produit par les vaccins inhiberaient la réponse immunitaire par le
recrutement de cellules myéloïdes suppressives.
78
• Les macrophages de type 2
Les macrophages de type 2 (ou M2) ont la particularité d’avoir été activés dans un
contexte Th2 (Gordon 2003). Ces cellules produisent des cytokines anti-inflammatoires telles
que l’IL-10 et le TGF-β, de la prostaglandine E2 et l’antagoniste du récepteur à l’IL-1β.
Des études ont montré que ces cellules étaient capables de supprimer l’EAE (Tierney,
Kharkrang et al. 2009). Les macrophages M2 sont également impliqués dans l’angiogénèse et
ont des capacités de réparation et de remodelage du tissu endommagé. La découverte récente
de la présence des macrophages M2 dans les lésions athérosclérotiques humaines, démontre
pour la première fois l’existence d’une population hétérogène de macrophages au sein des
plaques d’athérosclérose.
• Les cellules dendritiques tolérogènes
Le rôle central joué par les CD dans le maintien de la tolérance ne se limite pas à
l’anergie provoquée en l’absence de signaux de co-stimulation. Elles sont également capables
de produire du TGF-β, qui pourrait concourir à la tolérisation des LT et au maintien de leur
propre statut immature (Li, Wan et al. 2006), et de l’IL-10. Les CD immatures étant
incapables d’être à l’origine d’une réponse immunitaire productive, la création d’un
microenvironnement qui les maintient à ce stade est une stratégie suppressive.
Outre la sécrétion de ces cytokines immunosuppressives, ces CD peuvent induire des Treg. En effet, Akbari a montré que l’expression de la molécule de co-stimulation ICOS-L
(inducible costimulator ligand) à la surface des CD permettait la conversion de LT vers le
phénotype suppresseur (Akbari, Freeman et al. 2002). Ces T-reg inhibent alors, par la
sécrétion de cytokines anti-inflammatoires, l’acquisition des fonctions présentatrices par les
CD.
79
a
b
MSC
NOS2 et ARG1
TCR invariant
CD1d
PRESENTATION
DE L’ANTIGENE
NK T
LT
CPA
IL-6, MCSF, VEGF
ET IL-1β
APOPTOSE
IL-13
RECRUTEMENT
STAT6
MATURATION DES CD DANS
LES GANGLIONS DRAINANTS
IL-13R
TFG-β
MSC
d
c
T-Reg
CD80
ou CD86
IFN-γ
LT-CD8 naïf
IL-10
CMH de
classe I
Tryptophane
Inhibition de la lyse des
CTL et de la maturation
des CD
IL-3R
INHIBITION DE LA
PROLIFERATION
DES LT-CD8,
APOPTOSE DES LTCD4
CTLA4
IL-3
CD40-L
CD40
pCD
LT-reg producteur
d’IL-10
LT-CD4
naïf
CMH de classe
II
TCR
e
LT-CD4
f
LT-reg
Th2
IL-10
CD immature
Macrophage
IL-10
PGE2
INHIBITION DE LA LYSE
DES CTL ET DE LA
PROLIFERATION DES LT
ANERGIE
LT-CD8
TGF-β
Figure 20: les cellules myéloïdes tolérogènes dans la tolérance active (Zitvogel,
Tesniere et al. 2006)
a : les cellules myéloïdes suppressives constituent une population hétérogène utilisant le
métabolisme de l’arginine pour appauvrir le milieu et générer des molécules inhibitrices de la
prolifération, voire de la survie, des LT. b : la sécrétion d’IL-13 par les cellules NKT induit la
synthèse de TGF par les cellules myéloïdes suppressives. c : le catabolisme d’un autre acide
aminé essentiel, le tryptophane, est manipulé par les cellules dendritiques tolérogènes.
L’enzyme IDO est induite par l’interaction avec CTLA4 porté par les T-reg. d : les cellules
dendritiques suite à la stimulation de TLR9, promeuvent la génération de lymphocytes Tr1
CD8+ et de T-reg. e : le contact avec les CD immatures conduit les LT à devenir anergiques.
De plus, en présence de l’IL-10, une différenciation en cellules Tr1 est favorisée. .f : les
macrophages de type M2 relarguent des cytokines anti-inflammatoires et de la
prostanglandine E2 qui inhibent la prolifération, la différenciation et les fonctions effectrices
des LT conventionnels.
80
• Les lymphocytes NKT
Une sous-population de LT naturels a été définie sur l’expression de récepteurs
habituellement exprimés par les cellules NK : les NKT.
Elles se subdivisent en trois
groupes dont le plus représenté est le groupe des iNKT (invariant NKT). Ces cellules ont un
répertoire très limité, la majorité exprimant chez la souris le Vα14/Jα18 et chez l’homme le
Vα24/Jα18. Ce TCR est spécifique de glycoprotéines présentées par les molécules de CMH
de classe I non classique, le CD1d. Les deux autres sous-groupes, très minoritaires, sont les
NKT de type II (qui sont restreints par la molécule CD1d mais un répertoire de TCR divers) et
les NKT de type III (qui ne sont pas restreints au CD1d).
Ces cellules ont pour particularité de produire très rapidement après activation des
cytokines de type I comme le TNF ou l’IFN-γ et des cytokines de type II telles que l’IL-4 ou
l’IL-13. Ces iNKT ont donc la faculté d’orienter la réponse immune, bien que les facteurs qui
déterminent cette polarisation ne soient pas encore bien compris. L’on sait tout de même que
l’environnement cytokinique pourrait être un paramètre important (Brigl, Bry et al. 2003)
ainsi que la nature du glycolipide ou le contexte de présentation. Ainsi des facteurs
immunologiques comme les cytokines mais aussi non immunologiques comme l’oestradiol
dictent ou régulent les fonctions des iNKT. Les mécanismes d’action des iNKT dans les
maladies auto-immunes restent en partie obscurs. Selon certaines études, dans les maladies
dites de type Th1, l’action protectrice des iNKT s’accompagnerait d’une orientation de la
population auto-réactive vers un profil Th2. Un biais de la production des cytokines Th1 et
Th2 par ces cellules pourrait expliquer partiellement leur rôle protecteur (Chiba, Oki et al.
2004; Yamamura, Miyamoto et al. 2004). Dans d’autres études, aucune immuno-déviation de
la réponse auto-réactive n’est mise en évidence et l’effet protecteur mettant en jeu les iNKT
dépend de l’IL-10 (Miellot, Zhu et al. 2005) et non des cytokines comme l’IL-4 (Mars,
Laloux et al. 2002). Ces iNKT pourraient également participer à la génération de LT-CD8+
suppresseurs via leur sécrétion d’IL-10 (Sonoda, Faunce et al. 2001; Nakamura, Sonoda et al.
2003) ainsi qu’à l’homéostasie et la génération des T-reg. Leur sécrétion d’IL-4 et d’IL-10
permettrait également de favoriser l’apparition de cellules dendritiques tolérogènes (RoelofsHaarhuis, Wu et al. 2004).
81
• Les lymphocytes γδ
Les LT γδ se distinguent par l’expression d’un TCR au répertoire limité qui reconnaît
l’antigène indépendamment de la présentation par les molécules de CMH. Ces LT ont un
potentiel cytotoxique et sécrètent des cytokines (IFN-γ), et participeraient de ce fait à
l’immunité anti-infectieuse, à la réponse anti-tumorale et à la cicatrisation. Une activité
suppressive a également été proposée, notamment dans l’homéostasie des épithelia, en
sachant que leur rôle régulateur serait spécifique de leur tissu. La capacité des LTγδ
d'intervenir dans la coopération lymphocytaire T/B est un premier argument montrant qu'ils
ont des propriétés régulatrices. Ces fonctions peuvent aussi s'exercer vis-à-vis de cellules
épithéliales n'appartenant pas au système immunitaire. Les LTγδ sont particulièrement
abondants au sein des épithéliums. L'étude de souris rendues génétiquement déficientes pour
le TCR-γδ a montré que ces cellules influencent la prolifération et la différenciation des
cellules épithéliales intestinales. Au niveau de la peau, les LTγδ produisent un facteur de
croissance pour les kératinocytes (KGF, keratocyte growth factor) (Boismenu and Havran
1994).Les LTγδ jouent donc un rôle dans le maintien de l'intégrité des épithéliums qui sont
une première barrière de défense.
Les LTγδ assurent aussi des fonctions régulatrices vis-à-vis des cellules de l'immunité
non spécifique que sont les macrophages et les cellules NK. Chez des souris génétiquement
déficientes pour le TCR-γδ, on observe une altération de la production de TNF-α par les
macrophages stimulés par le LPS. Ces mêmes souris, infectées par une dose sub-létale de
Listeria monocytogenes, présentent une altération de l'immunité véhiculée par les cellules NK
et une diminution de la production d'IFN-γ (Ladel, Blum et al. 1996).
Les LTγδ semblent aussi exercer des fonctions immunomodulatrices vis-à-vis des
cellules de l'immunité spécifique, notamment des LTαβ. Chez la souris, l'induction d'une
déplétion in vivo en LTγδ à l'aide d'un anticorps monoclonal anti-TCR γδ s'accompagne
d'une importante activation des LTαβ caractérisée in vitro par une intense activité
proliférative, la production d'IL-2 et une très grande activité cytotoxique des LTαβ-CD8+
(Kaufmann, Blum et al. 1993). Chez la souris sauvage, l'infection par L. monocytogenes
entraîne l'activation des LTαβ responsables de la formation de lésions granulomateuses qui
ont pour but de circonscrire l'infection. Ces formations histologiques sont absentes chez les
souris TCR-γδ et sont remplacées par des lésions abcédées suggérant, en l'absence de LTγδ,
82
un défaut de contrôle de l'activation des LTαβ (Mombaerts, Arnoldi et al. 1993).
Enfin, les LTγδ pourraient, au cours des manifestations allergiques, assurer un
rétrocontrôle négatif de l'action amplificatrice des LTαβ-Th2+ sur la production d'IgE. Le rôle
régulateur des LTγδ fait intervenir la sécrétion d'IFNγ dont l'action suppressive sur la
différenciation des LTαβ-CD4 Th2 est très largement documentée (McMenamin, McKersey
et al. 1995). Les LTγδ semblent donc jouer un rôle central dans le maintien de l'homéostasie
du système immunitaire.
• Les lymphocytes B régulateurs
L’existence de cette population a été proposée pour la première fois par le groupe de
Janeway dans le modèle de l’Encéphalomyélite Auto-immune Expérimentale (EAE) (Wolf,
Dittel et al. 1996). Si les souris de fond génétique C57Bl/6 déficientes en lymphocytes B ne
présentaient ni retard dans le déclenchement de la maladie, ni une sévérité accrue du pic de la
maladie, elles se distinguaient par une rémission faible, voire inexistante. Quelques années
après, une sous-population de LB producteurs d’IL-10, indispensable à cette rémission, a pu
être identifiée (Fillatreau, Sweenie et al. 2002). Cette population est une population induite
car elle n’existe pas in vivo en absence d’inflammation (Mizoguchi, Mizoguchi et al. 2002).
D’autres études ont suggéré un rôle de ces B-reg dans la tolérance orale via une
stimulation des TLR et une production de TGF-β (Gonnella, Waldner et al. 2001; Parekh,
Prasad et al. 2003).
Il a également été proposé que ces B-reg pouvaient jouer un rôle dans l’inhibition des
allergies (Tsitoura, Yeung et al. 2002).
• Les lymphocytes T-CD8+ suppresseurs
Dès 1978, l’équipe de Cantor rapportait l’existence de cellules induites par contact avec
les LT-CD4+, par le biais de la molécule de CMH de classe I non classique Qa-1 (Stanton,
Calkins et al. 1978). Plusieurs années après, l’équipe de Mak relança l’intérêt pour ces
cellules en décrivant une tendance des souris invalidées pour le gène de CD8 à développer
une pathologie chronique dans le modèle de l’EAE (Koh, Fung-Leung et al. 1992). Il a de
plus été montré que les LT-CD8+ déficients en CD28 avait une activité suppressive in vitro et
que leur transfert protégeait de l’induction de l’EAE (Najafian, Chitnis et al. 2003). Des
83
résultats similaires ont été obtenus dans le modèle de la colite avec des cellules CD8+CD28naturelles (Menager-Marcq, Pomie et al. 2006).
Les mécanismes de ces cellules sont
multiples. In vivo, leur fonction dépend de leur aptitude à sécréter des cytokines antiinflammatoires, IL-10 et TGF-β.
Il est remarquable que chez la souris, la moitié des LT intra-épithéliaux soit des LTCD8αα+. Ces cellules ont un développement particulier qui se termine hors du thymus. Leur
fonction régulatrice a été rapportée dans le contrôle des infections et de l’inflammation de
l’intestin par reconnaissance, via le TCR ou les récepteurs NK co-exprimés à leur surface, de
molécules du soi modifiées ou inductibles par le stress ou l’inflammation.
Une autre sous-population, les CD8+CD122+, qui possèdent des propriétés suppressives
en culture, et dont l’absence in vivo entraîne un désordre hyperprolifératif a également été
décrite.
Récemment, une nouvelle population a été découverte chez le rat, caractérisée par la
faible expression de CD45RC et qui a une fonction suppressive passant par le contact
(Xystrakis, Dejean et al. 2004). Ces cellules ont démontré leurs capacités régulatrices dans le
cadre de l’alloréactivité.
• Les lymphocytes Tr1
Ces cellules sont définies par leur capacité à sécréter de grandes quantités d’IL-10, leurs
propriétés immunosuppressives et leur génération dépendante de l’IL-10. Ces LT-CD4+-Tr1
se distinguent des Th1 et Th2 par leur profil cytokinique, à savoir la production d’IL-10 et de
TGF-β mais pas d’IL-4. La discrimination vis-à-vis des T-reg se base sur l’absence
d’expression constitutive de FoxP3 (Levings, Gregori et al. 2005) et la présence de ROG
(repressor of GATA-3) (Roncarolo, Gregori et al. 2006). La capacité suppressive de ces Tr1
joue un rôle in vivo dans le contrôle de l’inflammation et de l’auto-immunité. En effet, un rôle
préventif de ces Tr1 a été montré dans plusieurs modèles de pathologies inflammatoires
comme la sclérose en plaques, l’athérosclérose, l’IBD et les réactions d’hypersensibilité
retardée cutanée. En effet de nombreuses études ont montré l‘importance de l’IL-10 dans la
régulation de l’EAE (Rott, Fleischer et al. 1994; Bettelli, Das et al. 1998; Burkhart, Liu et al.
84
1999; Cua, Groux et al. 1999; Anderson, Reddy et al. 2004; Zhang, Koldzic et al. 2004) : la
neutralisation de l’IL-10 endogène augmente la sévérité et l’incidence des crises, et la maladie
est plus sévère chez des animaux déficients pour l’IL-10 comparés aux animaux sauvages.
Ainsi, des auteurs ont suggéré un rôle des Tr1 puisque comme nous l’avons vu précédemment
cette population lymphocytaire est productrice d’IL-10. Or ces Tr1 produisant de l’IL-10
peuvent être induits par la vitamine D3 (Cantorna, Hayes et al. 1996). Une étude récente
(Spach, Nashold et al. 2006) a prouvé ce rôle de l’Il-10 dans le contrôle de l’EAE. En effet,
les auteurs ont démontré qu’une forte inhibition du développement par la vitamine D3 d’une
EAE induite par le peptide MOG35-55 était dépendante de l’expression fonctionnelle de l’IL-10
et l’IL-10R. Ceci est également supporté par des études chez des patients atteints d’asthme
sévère où le potentiel inhibiteur des Tr1 induit par la vitamine D3 permet d’inhiber la
production de cytokines de type 2 spécifiques de l’allergène (Xystrakis, Kusumakar et al.
2006).
• Les T-reg
Si la plupart des cellules régulatrices LT-CD4+-FoxP3 sont générées dans le thymus, la
différenciation en périphérie de LT conventionnels en cellules régulatrices a pu être
démontrée (Apostolou, Sarukhan et al. 2002). Il est clairement établi que les T-reg ont besoin,
pour survivre en périphérie, d’être activés par la rencontre avec leur antigène spécifique, et
que cette stimulation est également indispensable à l’exercice de leurs propriétés
suppressives. La question de spécificité d’action se pose toutefois car in vitro, les T-reg, une
fois activés, inhibent sans restriction (Thornton and Shevach 2000). Cependant il s’avère que,
in vivo, les T-reg spécifiques d’un tissu sont plus efficaces qu’une population polyclonale
(Jones, Dahm-Vicker et al. 2002; Joffre, Gorsse et al. 2004; Tang, Boden et al. 2004; Tarbell,
Yamazaki et al. 2004).
Ces T-reg ont la capacité d’inhiber la prolifération des LT (Thornton and Shevach 1998;
Piccirillo and Shevach 2001) mais leur action touche l’ensemble des populations
lymphocytaires à savoir les LT, les NK (Ghiringhelli, Menard et al. 2005), les NKT (Azuma,
Takahashi et al. 2003) et les LB (Nakamura, Kitani et al. 2001) ainsi que les cellules du
lignage myéloïde, en particulier les cellules dendritiques dont elles inhibent la maturation et
les fonctions présentatrices (Cederbom, Hall et al. 2000; Misra, Bayry et al. 2004).
Le potentiel suppresseur de ces cellules peut être regroupé en quatre mécanismes :
85
-
la suppression par production de cytokines inhibitrices : IL-10 (Bergmann,
Strauss et al. 2007 ; Erhardt, Biburger et al. 2007)., TGF-β (Glinka and
Prud'homme 2008), IL-35 (Collison, Workman et al. 2007).
-
la suppression par cytolyse : expression de la granzyme A et B (Zhao,
Thornton et al. 2006)
-
la suppression par modulation de la maturation et de la fonction des CD :
implication du CTLA-4 (Takahashi, Kuniyasu et al. 1998; Read, Greenwald et
al. 2006), synthèse de l’IDO (Fallarino, Grohmann et al. 2003; Mellor and
Munn 2004).
-
la suppression par perturbation du métabolisme : expression des ectoenzymes
CD39 et CD73 (Kobie, Shah et al. 2006; Borsellino, Kleinewietfeld et al.
2007; Deaglio, Dwyer et al. 2007), liaison au A2AR (Zarek, Huang et al.
2008).
Les T-reg contrôlent ainsi les réponses immunes in vivo, rôle initialement mis en
évidence dans des modèles d’auto-immunité. Un rôle des T-reg dans le contrôle des réponses
immunes anti-tumorales et des réponses spécifiques d’allo-antigènes et d’antigènes exogènes
a largement été mis en évidence in vivo dans de nombreux modèles animaux (Fehervari and
Sakaguchi 2004).
Des travaux récents ont également suggéré que les Treg contribueraient au contrôle des
réponses immunes spécifiques dans des modèles animaux d’infection par des microorganismes tels que Leishmania major, Pneumocystis carinii et candida albicans qui sont
faiblement pathogènes dans les conditions physiologiques chez l’individu immunocompétent
(Belkaid, Piccirillo et al. 2002; Hori, Carvalho et al. 2002; Netea, Sutmuller et al. 2004). Dans
ces trois modèles, l’élimination des T-reg a été en effet corrélée à une augmentation de
l’efficacité du système immunitaire à détruire l’agent infectieux. Les T-reg seraient de plus
impliqués dans le maintien d’un faible nombre de micro-organismes vivants, ce qui leur
permettrait de jouer un rôle dans l’induction/survie de lymphocytes mémoires spécifiques et
ainsi dans la résistance à une réinfection. Des expériences complémentaires ont permis de
montrer que ces T-reg étaient aussi capables de contrôler des réponses immunes
« hyperinflammatoires », délétères pour les tissus, voire pour l’organisme .
86
Les maladies autoauto-immunes et
modèles animaux
1. Les maladies auto-immunes
a. Généralités
Au début du XXème siècle, Paul Ehrlich a réalisé que le système immunitaire pouvait
présenter des dysfonctionnements et qu’au lieu de réagir contre les antigènes étrangers il
pouvait concentrer son attaque sur des auto-antigènes. Il s’en est ainsi déduit que l’autoimmunité résultait donc d’une réponse immunitaire délétère contre les antigènes propres d’un
individu. Chez l’humain, l’auto-immunité apparaît généralement de façon spontanée, ce qui
signifie que nous ne savons pas quels évènements amorcent la réponse immunitaire
pathogène. Certaines affections peuvent être déclenchées par des agents infectieux comme le
rhumatisme articulaire aigu, d’autres impliquent la survenue d’un dérèglement interne du
système immunitaire, sans intervention d’agents infectieux, comme les sarcoïdoses ou les
atopies. Ces maladies auto-immunes peuvent être classées selon le type de réaction qui peut
être spécifique d’un organe ou systémique [tableau 2].
b. Maladies systémiques
Les maladies auto-immunes systémiques résultent d’une réponse dirigée contre des
antigènes disséminés dans tout l’organisme. Ces maladies reflètent un déficit général de la
régulation de l’immunité qui conduit à des cellules T et à des cellules B hyperactives. Les
dommages tissulaires disséminés sont ainsi provoqués par des réponses immunitaires à
médiation cellulaire causées par des auto-anticorps. La majorité d’entre elles sont cependant
causées par le dépôt de complexes immuns dans les vaisseaux sanguins. C’est l’exemple du
lupus érythémateux systémique (SLE) qui résulte de la production excessive de complexes
antigènes-anticorps et de leur dépôt dans la paroi des vaisseaux sanguins de nombreux autres
organes. La pathologie du lupus ainsi que de nombreuses maladies auto-immunes
87
systémiques, est dictée par le ou les sites dans lesquels les complexes immuns se déposent et
non par la source de l’antigène.
Maladie
Autoantigène
Réponse immunitaire
Maladies auto-immmunes spécifiques d’organes
Maladie d’Addison
Anémie hémolytique autoimmune
Syndrome de Goodpasture
Maladie de Graves-Basedow
Cellules de la surrénale
Protéines de la membrane des
globules rouges du sang
Membrane basale du rein et du
poumon
Récepteur de la TSH
Purpura thrombocytopénique
idiopathique
Protéines et cellules de la
thyroïde
Protéines membranaires des
plaquettes
Diabète insulinodépendant
Cellules β du pancréas
Myasthénie
Infarctus du myocarde
Anémie pernicieuse
Glomérulonéphrite poststreptococcale
Stérilité spontanée
Récepteurs de l’acétylcholine
Cœur
Cellules pariétales gastriques
Sclérose en plaque
Cerveau et moelle épinière
Thyroïdite d’Hashimoto
Reins
Spermatozoïdes
Auto-anticorps
Auto-anticorps
Auto-anticorps
Auto-anticorps
(stimulateurs)
Cellules Th1, Autoanticorps
Auto-anticorps
Cellules Th1, Autoanticorps
Auto-anticorps (bloquant)
Auto-anticorps
Auto-anticorps
Complexes antigèneanticorps
Auto-anticorps
Cellules Th1, Cellules T
cytotoxiques, Autoanticorps
Maladies auto-immmunes systémiques
Spondylarthrite ankylosante
Vertèbres
Polyarthrite rhumatoïde
Tissu conjonctif, IgG
Complexes immuns
Auto-anticorps , complexes
immuns
Noyau, cœur, poumons, ractus
Auto-anticorps
gastro-intestinal, reins
Glandes salivaires, foie, reins,
Auto-anticorps
Syndrome de Sjögren
thyroïde
ADN, protéines nucléaires,
membranes des globules
Auto-anticorps , complexes
Lupus érythémateux disséminé
rouges du sang et des
immuns
plaquettes
Sclérodermie
TABLEAU 2 : Les différentes classes de maladies auto-immunes
88
c. Maladies spécifiques d’organes
Les maladies auto-immunes spécifiques d’organes sont la conséquence d’une réponse
dirigée contre un antigène dont la localisation est restreinte à un organe en particulier. Les
cellules de l’organe cible peuvent être lésées directement par des mécanismes humoraux
(anticorps auto-réactifs) ou à médiation cellulaire (LT auto-réactifs).
Rôle des anticorps :
Ces anticorps (Ac) peuvent agir de différentes façons selon qu’ils sont dirigés contre des
auto-antigènes (Ag) cellulaires ou contre des auto-Ag extracellulaires.
Pour les Ac dirigés contre les auto-Ag cellulaires, nous retiendrons trois modes d’action :
les Ac anti-cellules sanguines, les Ac anti-cellules tissulaires et les Ac anti-récepteurs.
En effet, des Ac de type IgG ou IgM contre des Ag membranaires des cellules sanguines
peuvent entraîner la destruction rapide de ces cellules. C’est le cas lors des anémies
hémolytiques auto-immunes. Les mécanismes d’action des Ac impliquent alors soit
l’activation du complément à la surface des globules rouges avec formation d’un complexe
d’attaque membranaire et lyse intravasculaire, soit, plus fréquemment, la phagocytose par les
macrophages spléniques et hépatiques via les récepteurs aux fragments Fc des
immunoglobulines ou au complément.
Or les cellules nucléées sont, en général, résistantes à la lyse par le complément en raison
de l’expression de nombreuses protéines de régulation. Néanmoins, l’activation locale du
complément peut entraîner une puissante réponse inflammatoire locale (recrutement
cellulaire, action de cytokines), source de lésions tissulaires. Ce type de lésions intervient
probablement dans différentes maladies auto-immunes et notamment dans la thyroïdite de
Hashimoto qui s’accompagne de la production d’Ac anti-péroxydase et anti-thyroglobuline.
Certains auto-Ac reconnaissent également des récepteurs membranaires et peuvent alors
exercer un effet agoniste ou antagoniste. Dans la maladie de Basedow, des auto-Ac antirécepteur de la TSH (thyroid stimulating hormon) exprimés par les cellules thyroïdiennes
entraînent une production accrue d’hormones thyroïdiennes en raison de la stimulation
chronique de ce récepteur à la TSH et de l’inefficacité du rétro-contrôle négatif normalement
effectué par la diminution de la synthèse de TSH. Par contre, dans la myasthénie, des auto-Ac
dirigés contre le récepteur de l’acétylcholine qui joue un rôle majeur dans la transmission
neuromusculaire, entraînent une internalisation de ce récepteur et sa dégradation. Les
symptômes sont ainsi caractérisés par une faiblesse musculaire progressive.
89
En ce qui concerne les Ac dirigés contre des auto- Ag extracellulaires, nous citerons deux
exemples.
Tout d’abord, il peut être produit des auto-Ac contre des protéines de la matrice
extracellulaire. C’est le cas dans le syndrome de Goodpasture qui est dû à des Ac dirigés
contre la chaîne α3 du collagène de type IV présent dans la membrane basale des glomérules
rénaux et des capillaires pulmonaires. La liaison de ces Ac au collagène active les phagocytes
via les récepteurs Fc entraînant des lésions tissulaires sévères amplifiées par l’activation
locale du complément.
Le deuxième exemple repose sur la formation de complexes immuns circulants survenant
quand des Ac sont produits contre un Ag soluble. La pathogénicité des complexes immuns
dépend de leur taille, les gros étant plus facilement éliminés que les petits qui sont donc plus
pathogéniques. Normalement, les complexes immuns sont éliminés par les globules rouges
qui les transportent à leur surface via le récepteur CD35 vers la rate, et par les macrophages
qui expriment à la fois des récepteurs au fragment Fc et des récepteurs au complément. Un
défaut d’élimination ou une production accrue de complexes immuns peuvent entraîner leur
accumulation dans l’organisme responsable de lésions tissulaires dues à leur dépôt dans
certains vaisseaux et au niveau des glomérules, des articulations et de la peau. Les lésions
tissulaires sont dues à l’activation du complément qui entraîne le recrutement de cellules
inflammatoires et leur activation. Ces phénomènes se produisent lors du lupus érythémateux
disséminé, une maladie auto-immune systémique caractérisée par la production d’auto-Ac
dirigés contre des particules nucléoprotéiques (Ac anti-ADN, Ac anti-ARN). Le lupus
s’accompagne d’une production continue de complexes immuns qui se déposent dans les
parois des petits vaisseaux notamment glomérulaires, dans les articulations et dans divers
organes. Ces dépôts entraînent l’activation chronique du complément et des macrophages,
source de lésions tissulaires qui libère de plus grandes quantités d’auto-Ag, formant ainsi un
cercle vicieux.
Rôle des LT auto-réactifs :
Certains LT échappant à la sélection thymique peuvent réagir contre les antigènes du
soi et provoquer des maladies auto-immunes spécifiques de l’organe où cet antigène est
majoritairement exprimé. En effet, lors de maladies auto-immunes, des LT auto-réactifs
peuvent induire des lésions cellulaires directes par liaison à des antigènes cellulaires
membranaires, provoquant ainsi la lyse de la cellule et/ou une réaction inflammatoire dans
l’organe affecté. Progressivement la structure cellulaire endommagée est remplacée par du
90
tissu conjonctif et la fonction de l’organe diminue. Parmi ces maladies auto-immunes
spécifiques d’organes induites par des LT auto-réactifs nous pouvons citer le diabète
insulinodépendant et la sclérose en plaques.
Le diabète insulinodépendant résulte d’une infiltration des îlots de Langerhans par les
lymphocytes, d’une destruction des cellules β insulino-sécrétrices, et d’une détection d’autoAc circulants reconnaissant des antigènes insulaires sur des pancréas sains résultant en un
défaut de sécrétion d’insuline. De plus, l’association de la maladie à des allèles HLA
particuliers a permis d’établir la nature auto-immune du diabète de type 1. L’activation de la
réaction auto-immune précède de plusieurs années le syndrome hyperglycémique et son
cortège de signes cliniques.
Le processus conduisant à la destruction des îlots de Langerhans implique donc un
processus auto-immun. Néanmoins le ou les antigènes qui initient le diabète de type 1 ne sont
pas connus, une infection virale, un facteur nutritionnel, un superantigène étant les hypothèses
émises. Chez l’homme, dans la pathogenèse du diabète de type 1, l’infiltration des îlots se fait
par des cellules mononucléées. En effet, pendant longtemps l’on a cru que le diabète de type 1
était une maladie auto-immune impliquant exclusivement les LT-CD4+. Mais il est clairement
reconnu aujourd’hui que les LT-CD8+ jouent un rôle fondamental dans la physiopathologie de
la maladie (Tsai, Shameli et al. 2008). En effet, chez des souris NOD (modèle murin spontané
du diabète de type 1), ces LT-CD8+ ont une place centrale dans la destruction des cellules β et
contribuent également au maintien de l’inflammation au sein des îlots. Le mécanisme proposé
est donc basé sur le fait que les LT-CD4+ agissent en stimulant les lymphocytes B et les LTCD8+ cytotoxiques. Ces derniers vont alors pouvoir détruire l’îlot selon deux voies. La
première est une voie indirecte, où le LT interagit avec un peptide des îlots de Langerhans,
présenté par une CPA. Cette interaction conduit principalement à la libération de cytokines
telles que l’IFN-γ, le TNF-α et l’IL-1 et de radicaux libres, mais aussi à la production de
lymphokines par les LT-CD4+ et à l’activation des CPA et d’autres cellules inflammatoires
alors recrutées. La seconde voie est une voie directe où les LT-CD8+ interagissent directement
avec une cible de surface de la cellule β pour initier un processus cytotoxique.
Cependant des anticorps dirigés contre les îlots de Langherans sont aussi détectés chez
des patients atteints de diabète suggérant que ces derniers pourraient également jouer un rôle
dans la pathologie. Il s’agit des anticorps anti-îlots (islet cell antibody : ICA), des anticorps
anti-GAD (glutamate acide décarboxylase), des auto-anticorps anti-insuline et des anticorps
anti-IA2 qui sont dirigés contre une phosphatase membranaire des cellules ß. Ces Ac facilitent
91
ainsi la lyse via le complément et accentuent la cytotoxicité à médiation cellulaire par un
mécanisme qui leur est propre, l’ADCC (pour cytotoxicité à médiation cellulaire dépendante
des anticorps).
Pour mon étude, je me suis intéressée de plus près à une autre maladie, la sclérose en
plaques (SEP) qui se caractérise par une réaction inflammatoire développée contre la myéline
du SNC. Pour des causes encore inconnues, des lymphocytes naïfs spécifiques de la myéline
s’activent, passent la barrière hémato-encéphalique, deviennent agressifs contre cette gaine de
myéline et provoquent une réaction inflammatoire au sein du SNC avec production de
cytokines et sécrétion d’Ac aboutissant à la destruction de cette gaine. En effet, il a clairement
été montré que le liquide céphalorachidien des patients présentant une SEP active contient des
LT activés qui infiltrent le tissu cérébral et provoquent des lésions inflammatoires
caractéristiques qui détruisent cette myéline. Etant donné la fonction protectrice de la fibre
nerveuse par la myéline, il s’en découle qu’une rupture de cette gaine de myéline conduit à de
nombreux dysfonctionnements neurologiques.
Facteurs de prédispositions :
Certains facteurs de prédispositions aux maladies auto-immunes ont été décrits. Chez
l’homme, la meilleure preuve de l’existence des gènes de prédisposition à l’auto-immunité est
fournie par les études familiales, tout particulièrement sur les jumeaux. Plusieurs d’entre elles
ont été entreprises pour des maladies comme le diabète de type I, la polyarthrite rhumatoïde,
la sclérose en plaques et le lupus. Les résultats de ces études ont montré que des facteurs
héréditaires ainsi que des facteurs environnementaux jouaient un rôle important dans
l’apparition et le développement de la maladie auto-immune humaine (Ebers, Yee et al. 2000;
Willer, Dyment et al. 2003; Dyment, Ebers et al. 2004; Compston and Coles 2008).Une
constatation supplémentaire a confirmé ces résultats : le fait que des lignées pures de souris
aient une prédisposition presque identique à développer certaines maladies auto-immunes
spontanées ou provoquées, tandis que d’autres lignées ne l’ont pas.
Ces résultats ont donc conduit à la recherche de gènes de prédisposition. Cette
prédisposition à une maladie auto-immune a été très régulièrement associée au génotype du
CMH. Pour la plupart des maladies, la prédisposition est fortement liée au CMH de classe II.
Cette association du génotype du CMH à une maladie auto-immune n’est pas surprenante, car
les réponses auto-immunes impliquent des LT, et leur capacité à répondre à un antigène
92
particulier dépendant du génotype du CMH. Par conséquent, les associations peuvent
s’expliquer par un modèle simple dans lequel la prédisposition à une maladie auto-immune est
déterminée par les variations dans la capacité des différents variants alléliques des molécules
de CMH de présenter des peptides auto-antigéniques aux LT auto-réactifs. Une autre
hypothèse peut expliquer l’association entre le génotype du CMH et la prédisposition à des
maladies auto-immunes : le rôle des allèles du CMH dans l’établissement du répertoire du
TCR. En effet, comme nous l’avons vu dans le premier chapitre, les peptides du soi associés à
certaines molécules du CMH peuvent conduire à la sélection positive de thymocytes
spécifiques de certains auto-antigènes, ces peptides auto-antigéniques s’exprimant à un niveau
trop faible ou se liant de façon trop faible aux molécules du CMH du soi.
Ces hypothèses sont ainsi en accord avec nos connaissances sur l’implication des LT
dans certaines maladies. Si nous prenons l’exemple du diabète de type 1, l’association à des
allèles du CMH tant de classe I que de classe II, sont compatibles avec les résultats montrant
que des LT-CD4+ et LT-CD8+ sont les médiateurs de la réponse immune. En effet, ce diabète
possède une susceptibilité plurigénique avec au moins 10 gènes en cause. Néanmoins, le
principal se situe sur le chromosome 6 au niveau des gènes du système HLA de classe II, avec
un risque relatif de 3 à 5, lorsqu'il existe un allèle HLA DR3 ou DR4. Le risque relatif atteint
20 à 40 lorsque les deux allèles DR3 et DR4 sont associés. Ainsi, le risque pour des frères et
soeurs d'un enfant diabétique peut être précisé en fonction de l'identité HLA avec l'enfant
atteint. Le risque est de 15 % lorsque les frères ou soeurs présentent les deux haplotypes HLA
en commun avec l'enfant diabétique. Il n'est que de 7 % lorsqu'ils n'ont qu'un seul haplotype
en commun et il est inférieur à 1 % lorsque les deux haplotypes sont différents. Il en est de
même pour la SEP, où il a largement été prouvé une association entre suceptibilité à la
maladie et CMH (cf chapitre 3/b/iv)
Mais outre ces facteurs génétiques, des composantes environnementales et épigénétiques
(dont les facteurs sont encore inconnus) peuvent expliquer ces prédispositions aux maladies
auto-immunes. Nous pouvons citer par exemple pour la sclérose en plaques, l’influence de la
situation géographique, de la vitamine D et de l’ensoleillement dans la prévalence de la
maladie et pour le diabète de type 1, le rôle des virus.
Dans les paragraphes suivants, nous nous intéresserons exclusivement à la SEP et aux
modèles animaux qui s’y réfèrent.
93
2. Les modèles animaux de SEP
La SEP étant une affection complexe aux causes probablement multiples, l’utilisation
de maladies animales modélisant la pathologie humaine est indispensable pour déterminer les
facteurs responsables de son développement ou influençant son évolution, comprendre ses
processus, et tenter de mettre au point des stratégies thérapeutiques spécifiques et efficaces.
Bien qu’aucune maladie animale ne corresponde exactement à la SEP humaine, deux grandes
catégories de modèles animaux miment ses manifestations et permettent d’illustrer les
mécanismes conduisant à cette maladie (Hemmer, Archelos et al. 2002; Hemmer, Cepok et al.
2002).
a. Les modèles viraux
Plusieurs virus sont capables d’induire une démyélinisation dans le SNC, chez
l’homme (rougeole, VIH, HTLV-1) ou chez les animaux : les virus de la maladie de Carré (le
chien), le virus de l’hépatite murine (la souris), le Visna (le mouton), le virus de la forêt de
Semliki (isolé chez le moustique, son hôte privilégié n’étant pas connu) et le virus de Theiler
(la souris) qui reste l’un des meilleurs modèles viraux de la SEP (Ercolini and Miller 2006).
En effet, le virus de Theiler induit, chez la souris, une maladie neurologique qui évolue en
deux phases. Une encéphalomyélite aiguë, observée durant les deux premières semaines, est
suivie, au stade chronique, par une infection persistante de la substance blanche. Cette
démyélinisation tardive est étudiée comme modèle de la sclérose en plaques, du fait de sa
chronicité et du type de lésions histologiques. Les souches de souris diffèrent par leur
sensibilité à la maladie démyélinisante. II a été montré que le locus de la région H-2D du
CMH joue un rôle dans le contrôle de la sensibilité à l'infection persistante, ce qui permet
d'aborder le rôle des lymphocytes cytolytiques. Des gènes situés en-dehors de la région H-2
ont également été impliqués, en particulier dans la région télomérique du chromosome 10,
près du locus IFN-γ. Le rôle de l'IFN-γ a été démontré et précisé dans ce modèle mettant en
jeu les cellules productrices de cette cytokine telles que les cellules NK, LT-CD8+ et LTCD4+ de type Th1 dans la physiopathologie de l’infection.
Plusieurs mécanismes peuvent expliquer la démyélinisation déclenchée suite à
l’infection virale.
94
Tout d’abord, nous pouvons citer le mimétisme moléculaire. Ce concept repose sur la
similarité possible entre un pathogène et un antigène du soi. Cette similarité peut concerner la
séquence en acides aminés ou la structure conformationnelle des protéines. Ce mimétisme
moléculaire est donc caractérisé par une réaction immune à un antigène environnemental qui
cross-réagit avec un antigène de l’hôte provoquant ainsi une maladie auto-immune (Oldstone
1998; Albert and Inman 1999). Cette hypothèse est encouragée par le fait qu’un TCR peut
interagir avec différents complexes CMH et répondre à différents peptides (Wucherpfennig
and Strominger 1995; Lang, Jacobsen et al. 2002; Marrack, Rubtsova et al. 2008). Ce
mécanisme est indirectement impliqué dans la SEP. En effet, une haute charge virale durant
une primo-infection au EBV (Epstein Barr virus) est associée avec une augmentation du
risque de développement d’une SEP. De plus, des peptides viraux et bactériens qui miment la
PLP ou la MBP ont été identifiés et utilisés dans des modèles animaux pour adresser
directement que la maladie auto-immune pouvait être induite par ce mimétisme moléculaire
(Carrizosa, Nicholson et al. 1998). Ainsi, ces données démontrent que le mimétisme
moléculaire est une explication plausible qui pourrait expliquer le lien entre infection et autoimmunité, même si cette évidence dans les pathologies humaines n’a pas encore été établie.
Une explication possible est l’effet « bystander ». Dans ce mécanisme là, les antigènes
pris pour cible sont ceux du virus mais ce sont les produits de l’inflammation qui causent des
dommages collatéraux aboutissant indirectement à la dégradation de la myéline.
Enfin, l’inflammation créée par la présence du virus attirerait des lymphocytes non
liés à la réponse anti-virale mais spécifiques d’antigènes de la myéline : c’est ce qui est
communément appelé l’extension d’épitopes.
b. Le modèle auto-immun : l’encéphalomyélite auto-immue expérimentale
i. Historique
L’EAE a été découverte au début du XXème siècle, comme une complication
« allergique » observée chez les individus ayant reçu le vaccin antirabique de Pasteur. Environ
0,1% des receveurs ont développé une encéphalomyélite aiguë disséminée (ADE) qui se
caractérisait par une paralysie monophasique, des infiltrations périvasculaires de cellules
mononucléées et des foyers de démyélinisation dans le SNC (Stuart 1928). Il a été postulé que
le tissu nerveux dans lequel le vaccin était préparé constituait la cause de la maladie
(Remlinger 1905). Plus tard, il a été montré que des préparations de moelle épinière provenant
95
de lapins ou d’êtres humains pouvaient induire l’ADE lorsqu’elles étaient transférées à
d’autres lapins. Il avait donc été spéculé que le tissu du SNC et non pas le vaccin antirabique
était responsable de la paralysie observée. En 1947, l’introduction des adjuvants (qui
permettent une libération prolongée de l’antigène dans l’organisme, une augmentation des
réponses immunes en élevant le niveau de maturation des CPA) a permis aux scientifiques
d’induire pour la première fois et de manière reproductible l’encéphalomyélite autoimmune
expérimentale (d’abord appelé allergique) dans des modèles animaux (Kabat 1947). Depuis,
l’EAE a été induite avec succès dans un grand nombre d’espèces animales comprenant la
souris, le rat, le cochon d’Inde, le lapin, le poulet, la chèvre et le singe (paterson 1976) et
représente donc le modèle auto-immun préférentiel de la SEP (Steinman 1999).
L’EAE peut être aujourd’hui induite de différentes façons. Tout d’abord, par
immunisation avec des extraits de SNC ou des Ag purifiés administrés sous forme d’émulsion
avec un adjuvant : c’est l’EAE active, ou par transferts de LT auto-réactifs activés in vitro ou
issus d’un animal malade à des individus naïfs : c’est l’EAE passive (Schroeter, Stoll et al.
2003).
ii. Les antigènes
En 1947, Kabat suggère que les antigènes du soi présents dans la substance blanche du
SNC sont responsables de l’EAE puisque l’injection de tissu provenant du SNC fœtal
dépourvu de myéline ne permet pas d’induire cette EAE (Kabat 1947).
Quelques années plus tard, plusieurs antigènes de la substance blanche du SNC capables
d’induire l’EAE ont été identifiés.
La proteolipid protein ou PLP et la myelin basic protein ou MBP représentant
respectivement 50% et 25% des protéines constituant la myéline sont les plus abondantes.
MBP et PLP ont été les premiers antigènes encéphalitogènes à être identifiés (Folch and Lees
1951; Einstein, Robertson et al. 1962). Plus récemment, un autre antigène, la myelin
oligodendrocyte glycoprotein ou MOG a été identifiée comme encéphalithogènes (Mendel,
Kerlero de Rosbo et al. 1995). Ce dernier représente 0,01% à 0,05% des protéines
membranaires constituant la gaine de myéline.
Tous ces antigènes diffèrent non seulement par leur représentation mais également par
leur localisation dans la gaine de myéline [figure 21]. La myéline du SNC est synthétisée et
maintenue par les oligodendrocytes qui enroulent les axones fonctionnels avec une expansion
spiralée de leur membrane plasmique. Durant le processus de myélinisation, les surfaces
96
cytoplasmiques et extracellulaires de la membrane se condensent pour exclure le cytoplasme
et le liquide extracellulaire de la gaine de myéline. Cette structure est maintenue par des
interactions intramoléculaires entre les lipides de la membrane. La MBP est localisée à
l’apposition des surfaces cytoplasmiques de la membrane alors que la PLP, intégralement
membranaire, est située dans la myéline internodale compacte. Seul MOG, qui est situé dans
la surface la plus extérieure de l’oligodendrocyte et de la gaine de myéline, est en contact
direct avec l’espace extracellulaire (Linington 1998). Cependant, lorsque le processus de
démyélinisation est initié, les jonctions complexes maintenant l’intégrité de la gaine de
myéline sont déstabilisées et d’autres antigènes comme la PLP sont susceptibles d’être
exposés.
FIGURE 21: composition de la gaine de myéline (Hemmer, Archelos et al. 2002)
La gaine de myéline synthétisée par les oligodendrocytes est composée de différents
antigènes capables d’induire l’EAE. Ceux-ci semblent également être les auto-antigènes
cibles de la réponse auto-immune dans la sclérose en plaques.
iii. Les différentes formes d’EAE
La description qui va suivre se focalisera principalement sur les modèles de rats et de
souris qui ont été très largement étudiés. L’EAE induit chez la souris peut présenter
différentes formes cliniques qui dépendent de l’antigène et de la souche de souris utilisée.
97
L’EAE peut cependant se développer sous trois formes cliniques distinctes : l’EAE aiguë,
l’EAE chronique et l’EAE avec des phases de poussées et de rémissions.
L’EAE aiguë est notamment induite chez des souris portant le locus CMH-H-2u
immunisées par le peptide MPB1-11. Ces animaux développent une paralysie puis retrouvent
l’usage complet ou partiel de leurs membres inférieurs (Zamvil, Mitchell et al. 1986).
L’immunisation des souris C57Bl/6 (H-2b) avec le peptide MOG35-55 induit une maladie
chronique durant laquelle la condition des animaux s’aggrave progressivement après les
premiers signes cliniques de paralysie. Dans ce modèle, la condition des souris s’améliore
rarement (Mendel, Kerlero de Rosbo et al. 1995) : c’est l’EAE chronique.
L’EAE avec les phases de poussées et de rémissions est observée chez les souris SJL
(H-2s) immunisées avec le peptide PLP139-151. Ces souris subissent une attaque initiale qui est
ensuite
suivie
d’une
rémission
durant
laquelle
certains
animaux
redeviennent
asymptomatiques, puis d’une ou plusieurs nouvelles rechutes (Tuohy, Lu et al. 1989).
Cependant, quel que soit l’antigène utilisé, les manifestations cliniques restent similaires
et sont classiquement classées sur une échelle clinique de zéro à cinq. Le grade 0 représente
celui où la souris est asymptomatique. Lorsque la queue de la souris se paralyse et devient
faible le stade 1 est alors atteint. Une faiblesse des membres postérieurs ou une paralysie
partielle est désignée par le grade 2 alors qu’une paralysie complète des membres postérieurs
représente le grade 3. La paralysie des membres antérieurs conduira au stade 4 qui se
poursuivra par le grade 5 qu’est l’état moribond de la souris, stade où elle sera euthanasiée.
3. EAE et sclérose en plaques (SEP)
a. Le SNC
i. Les cellules du SNC
Le SNC est composé de deux types de cellules : les neurones et des cellules gliales
toutes connectées entre elles [figure 22].
98
Corps
neuronaux
Vaisseaux sanguins
Oligodendrocytes
Astrocytes
Cellules
é pendymaires
Axone
Cellules microgliales
FIGURE 22 : Représentation schématique des cellules constituants le SNC.
L'axone est protégé par une gaine de myéline qui est produite par des
Oligodendrocytes. Cette gaine de myéline est un isolant électrique qui facilite
l'influx nerveux le long de l'axone, il sert de liaison entre les capillaires sanguins
et le neurone. L'astrocyte permet d'apporter au neurone tout ce dont il a besoin
(nutriments). Les cellules épendymaires séparent les tissus nerveux du Liquide
Céphalo-Rachidien. Les cellules microgliales assurent la défense du Système
Nerveux Central contre les attaques virales et bactériennes.
Les neurones :
Les neurones, cellules hautement spécialisées, établissent entre eux des milliards de
connexions qui contribuent au traitement des informations. Ils sont composés d'un corps
cellulaire et de prolongements : l'axone, unique, et les dendrites, prolongements fins et
ramifiés (on parle d'arbre dendritique). Le neurone est une cellule polarisée : les dendrites
reçoivent les signaux du neurone précédent qui seront ensuite transmis au neurone suivant par
l'axone. Certains axones sont recouverts d'une gaine de myéline, formée par des cellules
gliales ou oligodendrocytes dans le SNC.
Les cellules gliales :
Elles assurent le soutien et la nutrition des neurones, et jouent un rôle dans
l'établissement de nouvelles connexions. Elles sont, en quantité, dix fois plus importantes que
les cellules nerveuses, occupant l'espace laissé vacant par les neurones. Elles créent autour
d'eux un micro-environnement qui les isole de tout contact avec les autres tissus. Elles jouent
un rôle primordial en isolant physiquement les neurones, en formant la barrière hématoencéphalique. Elles assurent également des fonctions métaboliques, de soutien squelettique et
de protection vis à vis des corps étrangers en cas de lésions.
99
On distingue 4 types de cellules gliales suivant leur morphologie, fonction ou origine qui sont
classées en deux catégories : les cellules microgliales contenant la microglie d’origine
mésodermique et les cellules macrogliales contenant les astrocytes, les cellules épendymaires
et les oligodendrocytes d’origine neurectodermique.
- Les cellules microgliales :
La microglie est un type de cellule gliale qui correspond au système phagocytaire
mononucléé résident du SNC. Les cellules de la microglie ont été décrites et caractérisées
pour la première fois dans les années 1920 par del Río Hortega. Elles ont une origine
hématopoïétique. Elles représentent de 5 à 25% de toutes les cellules SNC. Elles ont été
largement décrites comme impliquées dans de nombreuses maladies telles que la maladie
d’Alzheimer, la SEP (Carson 2002; Eikelenboom, Killestein et al. 2002; Streit 2002; Danton
and Dietrich 2003). Ces petites cellules, généralement de forme étoilée, sont très mobiles et
lors d’une lésion du SNC elles s’activent très rapidement et prolifèrent. Cette activation
participe ainsi à la pathogénèse de désordres neurologiques par sécrétion de nombreuses
molécules inflammatoires comme les cytokines pro-inflammatoires ou des oxydes nitriques
(NO). Lorsque des cellules du SNC meurent, cette microglie peut se transformer en
phagocytes et ainsi éliminer les débris cellulaires. Ces cellules établissent également un réseau
entre les différentes cellules du SNC responsables d’une réponse immune. En effet, la
microglie peut sécréter des cytokines et des prostanglandines qui donnent un signal aux
astrocytes d’amplifier la réponse inflammatoire résultant ainsi en une accumulation de
neurotoxines dans le SNC. Elles permettent également, au niveau du site d’activation
l’infiltration de cellules immunomodulatrices provenant du sang périphérique. Ainsi cette
microglie peut dans certains cas, participer à l’extinction de la réponse immune et la
régulation de leur propre apoptose. Ces cellules microgliales sont ainsi la preuve directe que
le SNC n'est pas un site de privilège immun total et qu'il existe des réactions immunitaires
réalisées par ces dernières.
- Les astrocytes :
Les astrocytes ont une forme étoilée, avec de nombreux prolongements autour de la
cellule et forme une sorte de squelette qui joue un rôle de support structural au sein du SNC.
Ils ont également un rôle nourricier. Les pieds astrocytaires entourent les capillaires sanguins
qui irriguent le cerveau, constituant la couche interne de la barrière hémato-encéphalique. Les
astrocytes captent ainsi les éléments nutritifs présents dans le sang pour fournir l'énergie
nécessaire à l'activité des cellules nerveuses.
100
- Les cellules épendymaires :
Les cellules épendymaires constituent la paroi des cavités cérébrales contenant le
liquide céphalo-rachidien ou LCR. Leur localisation fait de ces cellules une barrière filtrante
qui règle les échanges entre le LCR et le système nerveux central.
- Les oligodendrocytes :
Les oligodendrocytes, par leurs prolongements, sont à l'origine des gaines de myéline
qui entourent les axones des fibres nerveuses et permet d'accélérer la transmission de l'influx
nerveux. Il existe des portions d'axones non recouvertes de myéline appelées nœuds de
Ranvier. Le segment situé entre deux nœuds est appelé inter-nœud (zone myélinisée de
l'axone). Les oligodendrocytes peuvent myéliniser plusieurs inter-noeuds d'un même axone ou
des inter-noeuds d'axones différents. Cette capacité permet un gain de place considérable dans
le SNC. Malheureusement, ceci s'accomplit au prix d'une vulnérabilité de la myéline du SNC
puisque la perte d'un oligodendrocyte va entraîner des altérations de plusieurs axones.
Chez l'homme, bien que les oligodendrocytes apparaissent dans la moelle à partir de 45
jours après la conception, la myélinisation ne commence dans le cerveau que plusieurs
semaines plus tard (fin du 2ème, début du 3ème trimestre de grossesse), après la croissance
des axones. La myélinisation parachève la mise en place de structures déjà fonctionnelles.
Elle s'intensifiera après la naissance jusque 5-6 ans et se poursuivra pendant l'adolescence,
parallèlement au développement des fonctions cognitives.
Les précurseurs des oligodendrocytes ont la capacité de division et de migration pour
leur permettre de rejoindre leur position finale au niveau des axones. Au cours de sa
maturation, l'oligodendrocyte devient une cellule post-mitotique fortement ramifiée. Les
changements morphologiques qui accompagnent cette différenciation semblent impliqués
dans la perte de mobilité de la cellule. L'étape ultime de maturation des oligodendrocytes
s'accompagne de la synthèse des protéines spécifiques de la myéline.
La gaine de myéline est formée grâce à l'enroulement compact de la membrane des
prolongements des oligodendrocytes. Elle se présente comme une structure lamellaire
répétitive parfaitement régulière et compacte et possède une très haute résistance électrique.
De ce fait, les potentiels d'action, signaux électriques permettant aux neurones de
communiquer entre eux ou avec d'autres cellules, se propagent rapidement le long de l’axone
d’un nœud de Ranvier à l’autre. Outre le gain en rapidité et en fidélité dans la conduction de
l'influx nerveux, ce mode de transmission saltatoire représente une économie d'énergie et
d'espace. En effet, à vitesses de conduction égales, le volume d'un axone non myélinisé serait
101
100 fois supérieur à celui d'un axone myélinisé.
L'autre rôle de la gaine de myéline sur l'axone est probablement un rôle protecteur,
l'oligodendrocyte produisant vraisemblablement des facteurs trophiques qui protègent l'axone
et permettent de maintenir son intégrité. De plus, il a été montré que cette gaine de myéline
pouvait jouer un rôle dans la communication entre les cellules du SNC. En effet, des signaux
issus de l'axone sont absolument indispensables à l'élaboration de la gaine de myéline comme
par exemple l'activité électrique de l'axone qui est nécessaire à l'initiation du processus de
myélinisation dans le cerveau, puisque son blocage expérimental inhibe la myélinisation.
L'activité électrique induirait la libération d'adénosine tout le long de l'axone et celle-ci, en se
fixant sur les récepteurs purinergiques des oligodendrocytes, médierait l'interaction entre
l'axone électriquement actif et la cellule myélinisante. De plus, la myélinisation est
dépendante de molécules d'adhérence localisées à la surface de l'axone. Certaines de ces
molécules, comme la PSA-NCAM, sont inhibitrices de la myélinisation et c'est avec leur
disparition, au cours du développement, que la myélinisation peut débuter.
ii. Spécificité
•
Les barrières
Le SNC est considéré comme un tissu immunoprivilégié. Ceci peut s’expliquer par
plusieurs éléments cellulaires et moléculaires. Tout d’abord, l’accès au SNC est limité pour
les composants du système immunitaire. En effet, outre les jonctions serrées étroites entre les
cellules endothéliales des capillaires sanguins irrigant ce tissu qui gênent la diapédèse, il
existe un obstacle physique composé d’une double membrane basale entourant ces vaisseaux
et derrière laquelle sont accumulées des cellules microgliales et des extensions astrocytaires.
L’ensemble de ces éléments constitue la barrière hémato-encéphalique qui limite la diffusion
des facteurs solubles tels que les cytokines, les anticorps et les chimiokines entre le sang et le
parenchyme nerveux (Engelhardt and Sorokin 2009). Cette barrière hémato-encéphalique se
subdivise en trois barrières ou interfaces. Premièrement, la barrière entre le LCR et le tissu
cérébral est constituée par les épendymocytes formant l’épendyme et par la glia limitans
composée de prolongements astrocytaires. En microscopie électronique, ces cellules sont
unies entres elles par des jonctions gap et portent des cils et des microvillosités apicales qui
facilitent le flux du LCR. Contrairement aux véritables cellules épithéliales, les cellules
épendymaires ne reposent pas sur une lame basale, mais envoient des prolongements effilés
102
qui se mêlent aux prolongements des astrocytes sous-jacents. A l’interface entre le sang et le
parenchyme cérébral, se situe la barrière hémato-tissulaire qui est constituée de jonctions
serrées (tight junctions) qui relient entre elles les cellules endothéliales de la paroi des
vaisseaux sanguins cérébraux. Cette paroi empêche le passage de macromolécules (protéines
notamment), limite celui des petites molécules et favorise celui des molécules essentielles aux
fonctionnements du SNC telles que, le glucose ou les acides aminés (transport actif). De plus,
la barrière est renforcée par la présence de pseudopodes astrocytaires et d’extensions
cytoplasmiques de péricytes inclus dans un dédoublement de la lame basale. Enfin, les plexus
choroïdes (PC), constitués de cellules épithéliales polarisées possédant des jonctions serrées,
contrôlent le passage sélectif des molécules et des cellules entre le sang et le LCR. Ce passage
est dépendant de la lipophilie et de la taille du composé moléculaire mais aussi de la présence
ou non, de protéines de transport spécifiques. Les plexus choroïdes sont situés dans les
ventricules du cerveau et synthétisent le liquide céphalo-rachidien. Chaque plexus choroïde
est constitué d’un tissu de soutien richement vascularisé (stroma) recouvert de cellules
épithéliales cylindriques. Ces cellules sont unies par des complexes de jonction, reposant sur
une lame basale, possèdant des microvillosités apicales.
On a longtemps considéré que cette barrière pouvait bloquer l’entrée des lymphocytes
dans le SNC. En effet, cette barrière permet une quasi absence de flux intercellulaire et
transcellulaire grâce aux cellules endothéliales directement au contact du sang. Ces cellules
forment des jonctions serrées, ne sont pas ou peu capables de pinocytose. Entourant ces
cellules, la lame basale, qui contient des intégrines transmembranaires, des laminines, du
collagène (IV et VII), du perlécan (protéoglycane spécifique de la lame basale) et du
nidogène/entactine, permet la régulation de la vasomotricité et un ralentissement des
mouvements des cellules infiltrantes. Une troisième couche, les pieds astrocytaires, permet le
maintien de toute cette barrière hémato-encéphalique en régulant les échanges entre le sang et
les neurones. Ainsi à l’état basal cette barrière hémato-encéphalique est un mur quasi
infranchissable.
Mais ce concept d’imperméabilité de la barrière hémato-encéphalique aux lymphocytes
a dû être reconsidéré ces dernières années. Nous savons aujourd’hui que lorsqu’un
lymphocyte est activé, il exprime à sa surface des molécules d’adhésion qui lui permettent
d’être retenu à la surface de l’endothélium. Il a notamment été montré que l’interaction entre
l’intégrine VLA-4 exprimé par le LT activé et la molécule VCAM-1 présente à la surface des
cellules endothéliales jouait un rôle important dans le recrutement des lymphocytes à travers
la barrière hémato-encéphalique (Weller, Engelhardt et al. 1996). Par ailleurs, les
103
lymphocytes activés synthétisent des métalloprotéinases qui facilitent leur progression en
dégradant la matrice extracellulaire.
Mais le seul fait d’être activé ne suffirait pas aux LT pour entrer dans le SNC. Ceci est
montré chez des souris MBP TCR transgéniques où l’immunisation avec la MBP émulsionnée
dans de l’adjuvant induit une activation des LT spécifiques de l’antigène, mais ne suffit pas à
susciter le développement de l’EAE, car ces LT, malgré leur état d’activation, n’arrivent pas à
franchir la barrière hémato-encéphalique, à moins que ces souris soient traitées à la toxine
pertussique (Brabb, Goldrath et al. 1997) qui perméabilise cette barrière (Linthicum, Munoz
et al. 1982).
De plus, des données plus récentes montrent que des LT naïfs sont capables d’entrer
dans le SNC (Brabb, von Dassow et al. 2000; Cose, Brammer et al. 2006). Plus précisément,
il a été montré, chez le rat, que la substance blanche et la substance grise du SNC étaient
infiltrées par des LT naïfs majoritairement CD8+.
Des données récentes montrent également que les CD pourraient passer cette barrière
hémato-encéphalique et ainsi activer les LT dans des conditions neuroinflammatoires. Ces CD
se trouveraient dans le LCR (Pashenkov, Huang et al. 2001), dans les méninges (Baas, Prufer
et al. 2000; Serafini, Rosicarelli et al. 2006; Bailey, Schreiner et al. 2007), dans les espaces
périvasculaires (Serafini, Rosicarelli et al. 2006; Bailey, Schreiner et al. 2007) et dans le
parenchyme du SNC (Teleshova, Pashenkov et al. 2002). La manière dont ces CD migrent
dans le SNC reste très controversée. Des études récentes montrent cependant que lors d’une
EAE, il y a migration des CD du LCR dans le SNC au niveau des parenchymes périvasculaire
et cervical et des méninges (Hatterer, Touret et al. 2008) pouvant ainsi activer les LT,
particulièrement les LT-CD4+ (Bailey, Schreiner et al. 2007).
De plus, il est clairement admis aujourd’hui que cette barrière hémato-encéphalique est
une barrière imparfaite car certaines zones en sont dépourvues. C’est le cas par exemple des
organes circumventriculaires comme les plexus choroïdes, l’épiphyse, qui n’ont pas cette
barrière mais qui par contre ont un renforcement immunitaire puisqu’ils sont enrichies en
cellules de CMH de classe II. Ces organes seraient donc des sites privilégiés pour l’initiation
de la réponse immune.
Outre cette barrière hémato-encéphalique (BHE) [figure 23], il en existe trois autres
responsables d’une protection supplémentaire au sein du SNC. L’on peut citer la barrière
immuno-encéphalique (IBB) (Bechmann, Mor et al. 1999), la barrière méningo-éncéphalique
(BME) et la barrière hémato-méningée (BHM). La BHM est une barrière qui sépare le sang
des méninges. Elle est très peu perméable (quelques petits ions) dans le sens sang/LCR mais
104
par contre montre une très grande perméabilité dans le sens LCR/Sang. La BME, qui est une
barrière entre les méninges et l’encéphale est très mal caractérisée encore aujourd’hui.
Veine
Voûte du crâne
BME = Barrière Méningo-Encéphalique :
sépare l’encéphale des méninge.
Dure-mère
Arachnoïde
Espace sousarachnoïdien : LCR
BHM = Barrière Hémato-Méningée : sépare le
sang des méninges. Flux entre sang et LCR.
Pie-mère
Cortex
Espace
périvasculaire
BHE = Barrière Hémato-Encéphalique :
limite la diffusion de facteurs solubles entre le
sang et le parenchyme nerveux.
Figure 23 : les différentes barrières au niveau du SNC
•
Le drainage lymphatique
Au sein du SNC, il n’existe pas de système lymphatique bien défini. Cependant un
drainage lymphatique non conventionnel semble exister puisque d’après les travaux de Ling,
on retrouve des antigènes dans les ganglions cervicaux suite à une injection de ces mêmes
antigènes dans le SNC (Ling, Sandor et al. 2003). Trois hypothèses sont actuellement émises
(Ransohoff, Kivisakk et al. 2003; Walker, Calzascia et al. 2003) [figure 24].
La première hypothèse consiste à dire que les antigènes suivent le flux du liquide
céphalo-rachidien ou LCR.
La deuxième privilégie le rôle des cellules dendritiques qui pourraient prendre en
charge les antigènes et les transporter jusqu’au bulbe olfactif et ganglions cervicaux. Pour
cette hypothèse reste à connaître l’origine de ces cellules dendritiques ?
La dernière hypothèse est en faveur du rôle des cellules microgliales qui telles des CPA
prendraient en charge les antigènes et se dirigeraient vers les ganglions cervicaux.
105
Système lymphoïde périphérique
Espace sub-arachnoïde
Dure-mère
Arachnoïde
Feuillet profond de la pie-mère
Bulbe olfactif
Nœuds lymphatiques cervicaux
FIGURE 24 : hypothèse du trajet intracérébral d’un antigène.
Les cellules dendritiques résidant dans les méninges et les plexus choroïdes pourraient
capturer l’antigène et le transporter aux ganglions cervicaux ou la rate via soit le liquide
céphalo-rachidien (LCR) soit directement la circulation sanguine. Pour les antigènes
circulants par le LCR, ils longeraient le système ventriculaire pour arriver dans l’espace
sous-arachnoïdien (1). De ce compartiment, les antigènes pourraient entrer soit dans les
sinus veineux à travers les villosités de l’arachnoïde soit dans les ganglions lymphatiques
cérébraux. Les antigènes qui se trouvent dans les fluides interstitiels pourront eux drainer via
le LCR ou alimenter les ganglions cervicaux à travers les voies periartérielles du cerveau et
des méninges. (2). Les espaces périvasculaires sont peuplés de cellules monocytaires et
macrophagiques capables de migrer et d’entrer dans la circulation sanguine.
•
Les cellules présentatrices d’antigènes
Une autre particularité du SNC est qu’il a longtemps été considéré comme ne possédant
pas de cellules présentatrices d’antigènes professionnelles capables d’induire une réponse
primaire (Perry 1998).
La microglie :
Il a très vite été suggéré que la microglie pourrait être la source principale de CPA
résidentes du SNC. Mais cette hypothèse n’est pas encore démontrée. Leur origine reste
106
inconnue même si l’hypothèse privilégiée est une colonisation précoce du parenchyme
nerveux par des précurseurs du mésoderme qui se différencieraient en microglie. Puis en cas
d’inflammation, il y aurait recrutement de précurseurs hématopoïétiques (Soulet and Rivest
2008).
Malgré le fait que ces cellules de la microglie présentent une plasticité morphologique
et fonctionnelle différente suivant le stade de développement (fœtal, adulte quiescent, adulte
activé) (Becher, Prat et al. 2000; Ponomarev, Shriver et al. 2006), il a récemment été montré
qu’elles pouvaient avoir les fonctions de CPA et présenter l’antigène comme les CPA du reste
de l’organisme. C'est-à-dire qu’elles sont capables d’activer, dans le SNC, des LT CD4+
(Matyszak, Denis-Donini et al. 1999; Aloisi, Ria et al. 2000; Mack, Vanderlugt-Castaneda et
al. 2003; Heppner, Greter et al. 2005), des LT CD8+ (Havenith, Askew et al. 1998) par
présentation classique des molécules de CMH de classe II et I respectivement. Ces cellules
sont aussi capables d’activer des LT CD8+ par présentation antigénique croisée (Beauvillain,
Donnou et al. 2008).
Ces cellules de la microglie sont également capables de sécréter un très large répertoire
de facteurs influençant la réponse immunitaire. De manière non exhaustive, nous pouvons
citer des facteurs anti-inflammatoires tels que le TGF-β et l’IL-10, des facteurs
chimioattractants qui recrutent et activent les cellules immunitaires comme l’IL-8, MCP-1,
RANTES, des facteurs neurotrophiques permettant la survie neuronale et la régénération
axonale tels que le BDNF, GDNF ou NGF, des facteurs cytotoxiques comme le NO ou encore
des facteurs pro-inflammatoires favorisant les réponses Th1 comme l’IL-12, l’IL-23 ou le
TNF-α qui est aussi un activateur de cette microglie.
Les astrocytes :
D’autres cellules résidentes du SNC pourraient jouer un rôle de CPA. C’est par exemple
le cas des astrocytes dont la fonction majoritaire est le soutien neuronal et la formation de la
barrière hémato-encéphalique. Ses fonctions en tant que CPA sont très récemment décrites
(Seth and Koul 2008). Elles ont été mises en évidence tout d’abord après activation in vitro
permettant à ces cellules d’exprimer les molécules de CMH de classe II et de co-stimulation.
Mais par rapport à la microglie, ces expressions sont tardives et ne surviennent seulement
qu’en cas de stimuli très importants. Il leur est donc donné plutôt un rôle régulateur,
intervenant plutôt dans l’arrêt des réponses inflammatoires.
107
Les macrophages périvasculaires :
Les cellules périvasculaires pourraient potentiellement être des CPA (Bechmann, Priller
et al. 2001). Les macrophages périvasculaires auraient un rôle dans l’initiation de certaines
réponses immunitaires dans le SNC (Polfliet, Zwijnenburg et al. 2001; Polfliet, van de
Veerdonk et al. 2002; Silva, Nagib et al. 2004). Un rôle probable de CPA pour les péricytes a
également été suggéré mais aucune démonstration n’a pu être faite de par la difficulté de leur
isolement mais il semblerait qu’ils jouent un rôle dans l’initiation de certaines réponses
immunes (Thomas 1999).
Les cellules dendritiques :
La question reste également entière pour les CPA les plus efficaces de l’organisme : les
cellules dendritiques. Ce que l’on sait c’est qu’elles ne sont pas présentes dans un SNC sain à
l’exception de certaines zones comme les plexus choroïdes (Matyszak and Perry 1996) mais
qu’elles apparaissent très rapidement dans le parenchyme lors d’une inflammation. Plusieurs
hypothèses sont actuellement émises. Plus anciennement il a été suggéré une différenciation
in situ à partir de cellules résidentes (Fischer and Reichmann 2001; Ponomarev, Shriver et al.
2005). Deux hypothèses supplémentaires sont apparues ces dernières années : celle du
recrutement à partir du sang (Newman, Galea et al. 2005) et celle de la différenciation à partir
de précurseurs localisés dans les méninges et/ou plexus choroïdes (Nataf, Strazielle et al.
2006).
De plus, l’on sait que pour la présentation antigénique, les molécules de CMH sont des
acteurs fondamentaux. Or, seules de rares cellules expriment les molécules de CMH de classe
II à l’état physiologique. Mais après exposition à un environnement pro-inflammatoire, les
oligodendrocytes, neurones et astrocytes, déjà capables d’exprimer des molécules de CMH de
classe I et donc d’activer des LT-CD8+, vont pouvoir exprimer de manière inductible des
molécules de CMH de classe II à leur surface et conduire à l’activation de LT-CD4+ (Wong,
Bartlett et al. 1984; Ford, Foulcher et al. 1996). Aujourd’hui il est également beaucoup
discuté la possibilité que certaines CD puissent entrer ou être générées au sein du SNC
inflammé. En effet, des CD ont été identifiées dans les lésions de SEP humaine. Sur le plan
fondamental, des CD exprimant des marqueurs phénotypiques de cellules microgliales sont
nécessaires et suffisants pour réactiver des LT-CD4+ entrant dans le SNC dans un modèle
d’EAE passive (Greter, Heppner et al. 2005) ou des CD sont capables d’initier l’extension
d’épitopes (McMahon, Bailey et al. 2005). La présence donc de CPA professionnelles dans le
108
SNC pourrait changer considérablement la façon d’envisager la pathogenèse de l’EAE et de la
SEP, pouvant ouvrir la voie à de nouvelles approches thérapeutiques.
•
Le statut immunologique particulier du SNC
Le SNC présente toutefois un statut immunologique particulier. Il a longtemps été
considéré comme un site immuno-privilégié. Mais est-ce bien une réalité ? Nous pouvons
définir un site immunologiquement privilégié par trois caractéristiques :
-
un site sur lequel les greffes allogéniques et xénogéniques ont une durée de vie
prolongée par rapport aux greffes sur les sites classiques (Barker and Billingham 1977)
[tableau 3].
Pour le SNC, il est clairement admis que les réponses T destructrices dans le parenchyme
sont plus difficiles à initier que dans d’autres sites.
Peau
Tissu é tranger
Rejet
Greffe
Parenchyme
du SNC
peau
Bact é rie
(BCG)
Infection
Parenchyme
du SNC
Survie prolongée
Recrutement
neutrophiles et
macrophages
R é ponse T
anti -BCG proinflammatoire
Recrutement
macrophages
Pas de réponse
T proinflammatoire
TABLEAU 3 : le SNC un site immuno-privilégié
-
Un site interdisant le développement et la dissémination d’une réponse
inflammatoire, car même une petite inflammation peut altérer l’intégrité et la fonction de
l’organe.
Ceci reste incontestable pour le SNC si l’on imagine les conséquences que peuvent avoir des
inflammations au sein du cerveau. Une altération ou perte d’intégrité ou de fonction de cet
organe serait handicapante voire fatale pour l’individu.
109
-
Un site dans lequel les cellules immunocompétentes, du fait de leurs localisations
particulières, vont tolériser les cellules/antigènes. Cette définition se révèle vrai pour le SNC
grâce aux travaux de Carson qui montrent que les cellules de la microglie sont
immunocompétentes mais orientent vers ces réponses lymphocytaires neuro-protectrices
(Carson, Doose et al. 2006).
Malgré l’immunoprivilège du SNC, il n’en demeure pas moins que dans certaines
situations des réponses immunologiques se développent. En effet, lorsque les LT ont réussi à
franchir la barrière hémato-encéphalique, ils se retrouvent confrontés à un environnement
constitutivement immunodéprimé dans lequel les réactions inflammatoires ne se déclenchent
qu’en cas d’absolue nécessité. Cette immunosuppression est active et dépend des cellules
gliales et neuronales elles-mêmes. Le TGF-β est l’un des acteurs majeurs de cette
immunosuppression. Appartenant à une superfamille très étendue, le TGF-β comprend 3
isoformes chez les mammifères : TGF-β1, β2 et -β3. Dans le système nerveux central, les trois
isoformes peuvent être produit mais pas forcément par tous les types cellulaires, ni dans les
mêmes circonstances (Constam, Philipp et al. 1992; Gomes, Sousa Vde et al. 2005). Ainsi, les
astrocytes constituent la source principale de TGF-β dans un cerveau sain en secrétant
constitutivement les isoformes 2 et 3 (Flanders, Ludecke et al. 1991), bien que les neurones et
les oligodendrocytes en produisent également (Dobbertin, Schmid et al. 1997; Zhu, RothEichhorn et al. 2000). Les cellules microgliales quant à elles ne produisent que l’isoforme 1,
notamment après activation par du TNF-α ou de l’IL-1 in vitro (Chao, Hu et al. 1995) ou dans
un cerveau ischémique ou infecté par le VIH in vivo (Lehrmann, Kiefer et al. 1998). Les effets
du TGF-β sont nombreux et variés mais contribuent généralement à inhiber les réponses
inflammatoires (Pratt and McPherson 1997). Il va ainsi activer les astrocytes, les rendre
hypertrophiques et stimuler leur synthèse de composants de la matrice extracellulaire
favorisant les cicatrices (Baghdassarian, Toru-Delbauffe et al. 1993) ou encore inhiber leur
expression d’ICAM-1 bloquant l’interaction avec les lymphocytes T infiltrants (Shrikant, Lee
et al. 1996). Sur la microglie, le TGF-β va avoir pour action générale d’inhiber leur fonctions
immunitaires (Paglinawan, Malipiero et al. 2003). Il peut ainsi inhiber l’expression de CMH
de classe II et des molécules costimulatrices, induites par des stimuli inflammatoires à leur
surface (Wei and Jonakait 1999), inhiber leur production de radicaux oxygénés ou encore
bloquer leur prolifération (Suzumura, Sawada et al. 1993). Un autre facteur important de
l’immunosuppression du système nerveux central est la vitamine D3 ou plus particulièrement
sa forme active : la 1,25 dihydroxy-vitamine D3 (1,25-(OH)2-D3) (Lemire 2000). Son
110
récepteur, le VDR, est exprimé par les neurones et les cellules gliales (Neveu, Naveilhan et al.
1994; Prufer, Veenstra et al. 1999; Baas, Prufer et al. 2000). La 1,25-(OH)2-D3 a des effets
généralement neuroprotecteurs et entraîne également une inhibition de l’activation
microgliale. Etant donné ce potentiel, des analogues non hypercalcémiants de la vitamine D3
ont donné des résultats encourageants dans le traitement de l’EAE (Garcion, Sindji et al.
2003). Certains neuropeptides ont également une fonction immunosuppressive, à l’image du
VIP (vasoactive intestinal peptide), qui inhibe la production de cytokines pro-inflammatoires
(Delgado and Ganea 2003) ou de chimiokines (Delgado, Abad et al. 2002) par la microglie.
Ainsi, VIP, somatostatine, hormone a stimulant les mélanocytes (a-MSH) et neuropeptide Y
contribuent au statut immunitaire particulier du système nerveux central (Reinke and Fabry
2006). Les neurones ont donc un rôle particulièrement actif dans le contrôle des réactions
immunitaires par la sécrétion de ces neuropeptides, de facteurs neurotrophiques, mais aussi en
contrôlant l’état d’activation des cellules microgliales. Tout cela permet ainsi de créer un
environnement anti-inflammatoire et de maintenir activement une immunosuppression
constitutive au sein du SNC via l’inhibition de l’expression des molécules de CMH, le
blocage de l’activation du complément et l’induction d’apoptose des LT.
Il est clairement admis aujourd’hui qu’une réponse immunitaire peut se développer dans
le SNC mais nécessite des stimuli beaucoup plus importants que dans le reste de l’organisme.
Comme dans tout l’organisme, le SNC peut être la cible de réponses innées et adaptatives.
En ce qui concerne les fonctions innées des cellules du SNC, il existe plusieurs
mécanismes à l’origine de ces réactions. Tout d’abord les cellules du SNC peuvent
reconnaître des pathogènes grâce à l’expression à leur surface de PRR (pattern recognition
receptors). Ces PRR permettent en effet la reconnaissance des motifs conservés des microorganismes. Plusieurs types de PRR sont présents dans le SNC. Les plus représentés sont les
TLR (Toll-like receptors) qui sont des récepteurs membranaires conservés reconnaissant les
motifs propres aux micro-organismes. Ils sont exprimés sur toutes les cellules du SNC (Jack,
Arbour et al. 2005; Olson, Ercolini et al. 2005; Prehaud, Megret et al. 2005; Wadachi and
Hargreaves 2006; Mishra, Gundra et al. 2008). La deuxième famille de PRR sont les
récepteurs scavengers. Ils reconnaissent des molécules endogènes comme les cellules
apoptotiques et parfois des motifs de pathogènes. Ils ne sont exprimés que par la microglie
(Husemann, Loike et al. 2002; Alarcon, Fuenzalida et al. 2005). Il y a aussi au sein de ce SNC
d’autres types de récepteurs impliqués dans la réponse innée comme DC-SIGN, CR3, CD1d,
111
CD14. Au niveau fonctionnel, la microglie et les astrocytes sont capables de phagocyter et de
sécréter un large panel de facteurs pro-inflammatoires tels que l’IL-1, l’IL-6, le TNFα …
L’immunité adaptative dans le parenchyme du SNC peut se diviser en deux branches :
la branche afférente et la branche efférente. La branche afférente sert à la présentation
antigénique aux LT naïfs et agit selon une voie fluidique où les antigènes solubles sont
drainés par le LCR et par le sang à travers des villosités arachnoïdes permettant d’induire une
réponse humorale tolérisante (Th2). La branche efférente permet la migration dans le SNC de
neutrophiles, macrophages et de LT et LB périphériques activés par la voie afférente.
Toutefois, les LT migrant dans le parenchyme doivent faire face à de nombreux obstacles
avant d’exercer leur fonction effectrice : mort par apoptose Fas-dépendante, sécrétion de
molécules suppressives et neuroprotectrices par les astrocytes, la microglie et les neurones.
Une difficulté majeure s’impose également au niveau du
SNC : les cellules résidentes
n’expriment pas les molécules de CMH de classe II, il n’y a pas d’expression de
costimulateurs et il n’y réside pas de LT. La présentation antigénique en est donc rendu
impossible. Tout ceci est vrai lorsque le SNC est sain. Mais en conditions inflammatoires ou
lors de neurodégénérescences, un changement majeur s’opère sur les cellules résidentes du
SNC puisqu’elles se mettent à surexprimer les molécules de CMH de classe I, à exprimer les
molécules de CMH de classe II ainsi que les molécules co-stimulatrices B7 (Issazadeh,
Navikas et al. 1998; Juedes and Ruddle 2001).
•
La tolérance locale
Il existe aussi des mécanismes de tolérance locale dans le SNC.
Un de ces mécanismes, évoqué par Carson, est le phénomène de neuroprotection. La
présentation d’antigènes du SNC induirait une réponse T neuroprotectrice et non
inflammatoire. Mais ceci nécessite-t-il la présentation des antigènes par la microglie ou
l’induction d’une production de facteurs neurotrophiques par les LT ?
D’autres mécanismes mettent en jeu l’expression de molécules qui vont permettre une
protection du SNC. C’est le cas de l’expression de FasL (Suvannavejh, Dal Canto et al. 2000;
Reich, Spering et al. 2008), de la prostaglandine E2 (Mannie, Prevost et al. 1995), de la
galectine-9 (Zhu, Anderson et al. 2005) et la production de cytokines de type Th2 qui
pourraient, en changeant l’orientation de la réponse, induire une protection (Khoury, Hancock
et al. 1992). Paradoxalement une cytokine sécrétée notamment par les neurones (Yin, Zhao et
112
al. 2006), l’IL-6, considérée comme régulatrice est aujourd’hui grâce aux travaux de Bettelli,
impliquée dans le processus pathogénique car elle induit en combinaison avec le TGF-β la
différenciation de LT naïfs en Th17 encéphalithogènes.
Il a également été montré que des T-reg s’accumulent dans le SNC durant la phase de
guérison de l’EAE aiguë (McGeachy, Stephens et al. 2005). Ces cellules sont fortement
suppressives in vitro et leur transfert en faible nombre (2.10^4) améliore les scores cliniques
d’EAE des receveurs immunisés la veille ou le lendemain. Un rôle prépondérant leur est
donné dans la SEP puisque même si la fréquence de ces Treg dans le sang et le liquide
céphalo-rachidien ne diffère pas entre un patient et un individu sain (Haas, Hug et al. 2005),
leur activité suppressive est très largement réduite lorsqu’ils sont issus de patients atteints de
SEP à rechutes (Viglietta, Baecher-Allan et al. 2004; Huan, Culbertson et al. 2005; Venken,
Hellings et al. 2006). De plus une corrélation a été établie entre la durée de la maladie et une
augmentation de l’activité de Treg. De récentes études ont suggéré que des LT-reg étaient
capables de migrer dans le SNC dans des conditions inflammatoires et d’ainsi moduler
activement la fonction des LT effecteurs. Des résultats montrent également que lors d’une
EAE, les T-reg, activés en périphérie, se retrouvent accumulés dans le SNC (Korn, Reddy et
al. 2007). La population T-reg se retrouve également enrichie dans le LCR de patients atteints
de SEP (Venken, Hellings et al. 2006; Feger, Luther et al. 2007). Ainsi, dans l’EAE comme
dans la SEP, ces T-reg sembleraient contribuer à restreindre la susceptibilité et la sévérité de
la maladie.
b. Similarités entre EAE et SEP
Un grand nombre de signes cliniques et de caractéristiques histologiques sont similaires
entre la SEP et l’EAE. Ce modèle animal de SEP a ainsi permis de valider au stade préclinique plusieurs stratégies thérapeutiques actuellement en développement clinique ou
approuvées chez les patients atteints de SEP.
i.
Les caractéristiques et le déclenchement de la pathologie
Tout d’abord les deux maladies sont invalidantes pour l’individu et conduisent à une
paralysie des membres dans leurs formes les plus sévères. Nous venons de voir les différents
stades cliniques chez la souris dans le paragraphe précédent. Chez l’homme, les symptômes
dus à la SEP diffèrent d’un sujet à l’autre. La SEP peut ainsi engendrer des troubles visuels
113
(atteinte inflammatoire du nerf optique), des troubles de la sensibilité (engourdissements,
fourmillements…), des troubles de la motricité (baisse de la force musculaire qui avec le
temps peut s’accompagner de spasticité ou raideur des membres), des troubles de l’équilibre
et de la coordination des mouvements, des troubles urinaires, intestinaux et sexuels.
Pour déclencher une maladie auto-immune, un auto-antigène doit être efficacement
présenté. La meilleure cellule présentatrice d’antigène est comme nous l’avons vu
précédemment la cellule dendritique. L’importance du mode de présentation de l’antigène
dans le déclenchement des pathologies auto-immunes a été démontrée pour la première fois
par l’équipe d’Ohashi en 1991 en utilisant les techniques de transgénèse (Ohashi, Oehen et al.
1991), montrant un mimétisme moléculaire. À l’occasion d’une infection par une bactérie, un
virus ou un parasite exprimant des peptides antigéniques communs avec les autoantigènes du
patient, l’organisme va déclencher une réponse immunitaire qui va détruire à la fois cet agent
infectieux mais aussi ses propres cellules. Une élégante démonstration du déclenchement
d’une maladie auto-immune HAM/TSP (HTLV-1-associated myelopathy/tropical spastic
paraparesis) suite à une infection par le virus HTLV-1 (human T-lymphotropic virus type 1)
qui partage des antigènes avec les cellules de patients infectés a récemment été publiée
(Levin, Lee et al. 2002; Levin, Lee et al. 2002) en montrant que l’infection virale entraîne une
présentation efficace des antigènes viraux déclenchant une réponse immunitaire où LT et LB
sont activés aboutissant ainsi à la production d’anticorps responsables des lésions neuronales.
Il en est de même dans les maladies auto-immunes expérimentales où la seule injection de
l’auto-antigène (par exemple la myéline pour induire l’EAE) ne permet pas le déclenchement
de la maladie. Il faut simultanément une injection de protéine ou stimulant immunitaire pour
entraîner une inflammation favorisant la réaction immunitaire. Toutes ces substances
(adjuvant de Freund, séquences CpG déméthylées…) qui déclenchent une immunité non
spécifique sont appelées signaux de danger et sont souvent d’origine infectieuse. Cette
réaction inflammatoire déclenche ainsi l’attraction et l’activation de cellules de l’immunité
innée comme les macrophages, cellules NK, polynucléaires via leur TLR mais aussi de
cellules de l’immunité adaptative qui expriment sur leur membrane des TLR et des récepteurs
aux chimiokines et cytokines libérées.
114
ii.
L’évolution
Tant l’EAE que la SEP présentent des formes évolutives très variables. Nous avons vu
trois formes chez la souris dans le chapitre précédent. Chez l’homme, nous retiendrons
également trois grandes catégories de SEP suivant leur évolution.
La forme la plus courante est la SEP rémittente. Elle affecte au moins 85% des
personnes atteintes de SEP. Elle se traduit par une succession de « poussées » (nouvelle
attaque ou récidive d’un ancien symptôme) et de « rémissions » (phase de stabilité). Au
moment des poussées, il existe une inflammation due aux cellules immunocompétentes,
dirigée contre la gaine de myéline qui s'altère, suivie d'un processus de remyélinisation
complète ou partielle. Cette forme de sclérose en plaques peut évoluer vers une forme
secondairement progressive.
La SEP secondairement progressive survient après une forme évoluant par poussées,
dans un délai variable selon les individus (15, 20, 30 ans.). Cette forme est définie lorsque
l'état du sujet n'est pas stable entre les poussées, et s'altère progressivement. Le sujet peut
encore présenter des poussées, mais elles sont de moins en moins fréquentes.
La troisième catégorie est la SEP progressive qui concerne 10 % des personnes
atteintes. Elle se caractérise par une aggravation d’emblée progressive des symptômes dès le
début de la maladie. Dans cette forme, les poussées sont absentes ou très peu individualisées.
iii.
L’histologie
Histologiquement, l’EAE comme la SEP présentent des zones de démyélinisation du
SNC caractérisées par des lésions focales. En effet, la démyélinisation est définie comme un
processus inflammatoire ayant pour conséquence des lésions focales dans la substance
blanche du cerveau et de la moelle épinière. On retrouve au niveau des zones inflammatoires
du SNC une infiltration massive de LT, de LB, de macrophages activés et de cellules de la
microglie. Une désorganisation de la barrière hémato-encéphalique est également observée
(Kirk, Plumb et al. 2003; Hochmeister, Grundtner et al. 2006) ainsi qu’une expression locale
de cytokines et de chimiokines pro-inflammatoires et de leurs récepteurs (Cannella and Raine
1995). Cette démyélinisation est souvent corrélée avec divers degrés de dommages axonaux
voire pertes axonales (Trapp, Peterson et al. 1998), dommages accentués lorsque la
remyélinisation est inhibée (Irvine and Blakemore 2008).
115
Des analyses histologiques de tissus de patients atteints de SEP ont démontré qu’il y
avait des dépots d’Ac et de complément sur la gaine de myéline provoquant des lésions
hétérogènes en fonction du patient étudié. En effet, quatre classes de lésions ont pu être
établies en fonction des données inflammatoires et de l’état de la myéline (Bitsch, Kuhlmann
et al. 2001). Les deux premières classes se regroupent par le fait de l’apparition d’aires de
démyélinisations. Par contre elles sont démarquées par les régions d’infiltrations des LT dans
le premier groupe et de macrophages activés dans le deuxième. La présence (groupe 2) ou
l’absence (groupe 1) de dépots d’Ac et de complément distinguent également ces deux
groupes, suggérant un niveau d’implication des LB différent. Une infiltration de LT et de
macrophages a également été retrouvée pour les groupes 3 et 4. Ces patients présentaient
cependant un défaut d’oligodendrocytes avec une perte préférentielle de MAG pour le groupe
3 et une quasi perte complète d’oligodendrocytes et une absence de remyélinisation pour le
groupe 4.
Comme nous l’avons mentionné dans le paragraphe précédent, une des conséquences
de la démyélinisation est une perte axonale. Mais le ou les mécanismes amenant à cette perte
ne sont pas encore aujourd’hui élucidés.
iv.
Les facteurs de susceptibilité
Chez le rat et la souris, la contribution des gènes du CMH a largement été étudiée
(Nepom and Erlich 1991; Campbell and Milner 1993). Les premières expériences chez le rat
ont suggéré une association entre le CMH et la susceptibilité à la maladie (Gasser, Newlin et
al. 1973). Aujourd’hui, il est admis que les gènes responsables de la susceptibilité à l’EAE
sont vraisemblablement situés en dehors du locus pour les gènes du CMH (Happ, Wettstein et
al. 1988), la susceptibilité au déclenchement de l’EAE de rats congéniques dont les gènes du
CMH sont identiques étant variable (Gasser, Palm et al. 1975).
Chez la souris, l’importance de l’haplotype H-2 dans le développement de l’EAE a été
testée dans différentes lignées de souris congéniques. Le remplacement des haplotypes H-2
provenant des souches résistantes (a et k) par ceux provenant de souches susceptibles (s, b ou
q) n’augmente pas la susceptibilité à la maladie (Levine and Sowinski 1973). Par la suite, des
études plus poussées avec différentes souches congéniques ont trouvé que la susceptibilité à la
maladie corrélait plutôt avec le fond génétique qu’avec l’haplotype H-2 du CMH
(Montgomery and Rauch 1982). La susceptibilité des souris SJL et B10.S au développement
de l’EAE en constitue un exemple. En effet ces deux souches sont congéniques pour
116
l’haplotype H-2s du CMH. Cependant, les souris B10.S sont résistantes alors que les souris
SJL sont très sensibles au développement de l’EAE (Encinas, Lees et al. 1996). Ainsi nous
pouvons conclure que si les gènes codant pour les molécules du CMH sont clairement
impliqués, d’autres gènes en dehors de ce locus sont aussi déterminants pour conférer la
susceptibilité à l’EAE.
L’utilisation de micro-satellites a permis d’analyser, de manière non biaisée, des régions
génomiques qui sont associées au développement de l’EAE. Cette méthode a permis en effet
d’identifier plusieurs loci qui contribuent à la maladie (Baker, Rosenwasser et al. 1995;
Sundvall, Jirholt et al. 1995; Croxford, O'Neill et al. 1997; Butterfield, Blankenhorn et al.
1999). C’est ainsi, par exemple, qu’un locus situé sur le chromosome 3, qui correspond aussi
à un locus de susceptibilité pour le diabète chez la souris NOD, a été identifié par cette
approche. Ce locus contient, entre autres, le gène pour l’IL-2. Un polymorphisme dans le gène
de l’IL-2 a été retrouvé entre les souris SJL et B10.S (Encinas and Kuchroo 1999). Il est ainsi
possible que des différences dans le gène de l’IL-2 puissent affecter l’activation et/ou
l’expansion des LT auto-réactifs dans certaines souches.
En ce qui concerne l’homme, des études ont montré que la SEP était plus fréquente chez
certains groupes ethniques comme les caucasiens d’Europe du nord alors qu’elle est quasi
absente des populations non caucasiennes. Les patients caucasiens atteints de SEP expriment
les molécules HLA de classe II majoritairement sous l’haplotype DR15 Dw2 comprenant
deux hétérodimères, DR2a (DRα et DRB5*0101) (RR = 4,68) et DR2b (DRα et DRB5*1501)
(RR = 4,9). Un sous-groupe de patients exprimant DR3 a également été décrit ainsi que des
groupes ethniques exprimant DR4w4 ou DR6 (RR = 5,08) (Vogt, Killian et al. 1994; Epplen,
Jackel et al. 1997; Muraro, Vergelli et al. 1997).
Des études ont ensuite essayé d’étudier l’association des gènes codant pour des
cytokines, des récepteurs à ces cytokines et des gènes dont le produit est associé à la myéline.
Seule une faible corrélation entre le gène codant pour le récepteur à l’IL-2 et la susceptibilité
à la SEP a été trouvée par le premier groupe (Reboul, Mertens et al. 2000). La deuxième étude
révèle que le gène codant pour MOG semble être associé à la susceptibilité à la maladie.
Cependant l’interprétation de ces résultats est rendue délicate par le fait que ce gène est situé
dans le locus du CMH. Actuellement, bien que la région du CMH soit revendiquée comme la
seule région du génome conférant un risque majeur dans le développement de la SEP, il est
maintenant reconnu que d’autres gènes non-CMH contribuent aussi à ce risque, mais avec un
effet moindre. Au cours de ces deux dernières années, 16 gènes ont été identifiés comme
117
associés à la SEP (Fugger, Friese et al. 2009). Cependant peu de gènes ont été confirmés
génétiquement excepté le récepteur à l’IL-7 (gHafler, Compston et al. 2007), le récepteur à
l’IL-2 (Ramagopalan, Anderson et al. 2007; Weber, Fontaine et al. 2008), le CD58 (De Jager,
Baecher-Allan et al. 2009) et la tyrosine kinase 2 (Ban, Goris et al. 2009).
Outre ces facteurs génétiques, il existe également des risques associés à
l’environnement. En effet, parmi les facteurs environnementaux nous pouvons citer l’hygiène
de vie (pays développés, vaccins, contact avec certains pathogènes) qui augmente la
prévalence de la maladie, ou encore la géographie et l’exposition lumineuse. Il existerait
également une relation entre la présence d’agents infectieux et l’apparition de la maladie.
Nous pouvons citer par exemple l’EBV et le HHV6 (Ascherio and Munger 2007). La
vitamine D pourrait également prévenir la maladie (Orton, Morris et al. 2008; Correale,
Ysrraelit et al. 2009).
c. Rôles des cellules immunitaires
i. Immunité innée
Si les cellules T jouent un rôle primordial dans les désordres neurologiques induits dans
la maladie murine et humaine, des données actuelles indiquent que d’autres cellules du
système immunitaire sont non seulement impliquées dans la phase effectrice de la maladie,
mais également dans l’initiation et la régulation des réponses immunes associées à la
pathogénèse de l’EAE et de la SEP.
Les macrophages :
Les macrophages sont majoritaires dans les infiltrats des lésions de SEP (Lucchinetti,
Bruck et al. 2000). Ils sécrètent de l’IL-6 qui permet une prolifération et différenciation des
lymphocytes B, de l’IL-8 puissant agent chimiotactique, de l’IL-1 et du TNF-α qui jouent un
rôle important dans l’inflammation. Ils permettent également une stimulation de l'adhérence
des leucocytes à l'endothélium en augmentant l'expression des molécules d'adhésion à la
surface des cellules endothéliales (en particulier E-sélectine et ICAM-1). Ils sont également
capables de phagocyter la myéline (van der Laan, Ruuls et al. 1996). L’équipe de Prinéas a
ainsi démontré que suite à la mort cellulaire des oligodendrocytes et aux changements
impliqués sur la gaine de myéline, les macrophages amplifiaient, via leur activité
118
« scavenger », la réponse inflammatoire, attribuant ainsi à cette population un rôle premier
dans la pathogénie (Barnett, Henderson et al. 2006).
Les cellules NK et NKT :
Les lymphocytes NK, les cellules tueuses spécialisées impliquées dans les réponses
anti-virales ou anti-tumorales (Hamerman, Ogasawara et al. 2005) peuvent jouer aussi un rôle
dans la maladie. En effet, l’élimination de ces cellules in vivo par un anticorps dirigé contre
leurs récepteurs NK1.1 conduit à une aggravation de l’EAE chez les souris immunisées
(Zhang, Yamamura et al. 1997). Ces cellules sont capables de contrôler le développement des
réponses Th1 pendant la phase d’activation ainsi que pendant la phase effectrice de la
maladie, par un mécanisme encore inconnu mais indépendant des LT, LB et iNKT. Chez
l’homme, ces cellules NK semblent avoir à la fois un rôle protecteur et un rôle délétère. En
effet, chez certains patients en rémission, il a été montré que ces cellules NK pouvaient jouer
un rôle protecteur. Elles exprimeraient de forts taux de CD95 permettant de tuer les cellules T
pathogènes. Elles seraient également capables de sécréter des cytokines de type 2 comme
l’IL-5 et l’IL-13 et d’induire un phénotype régulateur aux LT via leur sécrétion d’IL10 (Sakuishi, Miyake et al. 2009).En contre partie, ces cellules NK infiltrant le SNC sont
aussi capables de synthétiser des facteurs induisant une lyse directe des neurones et
provoquant les dommages tissulaires assimilés à la SEP. Elles peuvent également promouvoir
la génération de LT auto-réactifs pathogènes via une différenciation Th1 et ainsi activer des
cellules dendritiques qui produiront à leur tour des cytokines pro-inflammatoires (Morandi,
Bramanti et al. 2008). La fonction, protectrice ou délétère, sera déterminée par la localisation
particulière qu’auront ces cellules NK (environnement cytokinique ou les récepteurs de
surface des cellules environnantes).
Les iNKT (invariant natural killer T) qui montrent des propriétés tantôt
immunorégulatrices tantôt augmentant les réponses auto-immunes (selon la façon dont elles
sont activées) induisent lorsqu’elles sont stimulées in vivo par leur ligand l’α-galSER une
protection des souris contre l’EAE (Singh, Wilson et al. 2001; Furlan, Bergami et al. 2003).
Des souris surexprimant ces cellules sont également protégées (Mars, Laloux et al. 2002). Les
mécanismes feraient intervenir une augmentation de la production de cytokines de type Th2
telles que l’IL-4, ou une activité cytotoxique dirigée contre les lymphocytes auto-réactifs, ou
encore un contrôle de l’activation des LT-CD8+ (Mars, Novak et al. 2004). Plus récemment, il
a été montré que ces iNKT pouvaient jouer un rôle sur le lignage Th17 en inhibant ce dernier
119
et donc devenir une barrière naturelle contre ces cellules pathogènes (Mars, Araujo et al.
2009).
Les mastocytes :
Il est clairement établi aujourd’hui qu’au niveau des sites inflammatoires, il existe une
infiltration cellulaire de mastocytes dans le cerveau et la moelle épinière. Le pourcentage de
dégranulation de ces mastocytes corrèle avec les signes cliniques de la SEP (Brenner, Soffer
et al. 1994). De même, des drogues inhibant la dégranulation mastocytaire serait bénéfique
chez la souris pour améliorer les signes cliniques de la maladie. De multiples effets pouvant
potentiellement aggraver la maladie ou la déclencher sont ainsi attribués aux mastocytes. Les
facteurs qu’ils sécrètent pourraient en effet favoriser la perméabilisation de la barrière
hémato-encéphalique, le recrutement et l’activation de lymphocytes dans le SNC, ainsi que la
mort des oligodendrocytes et des neurones (Zappulla, Arock et al. 2002). En 2003, une étude
de microscopie électronique a montré la présence de mastocytes dégranulés (donc activés)
dans le cerveau de ouistitis immunisés, avant l’apparition des signes cliniques d’EAE
(Letourneau, Rozniecki et al. 2003) alors qu’une étude chez la souris indiquait que les
mastocytes pouvaient influencer le développement de l’EAE sans entrer dans le SNC
(Tanzola, Robbie-Ryan et al. 2003). De plus, des études récentes ont montré que les
mastocytes producteurs de TNF-α et de VIP (vasoactive intestinal peptide) pouvaient
influencer la maturation des Th17 indépendamment de l’IL-6 (Kimura, Naka et al. 2007). Les
cellules Th2 productrices d’IL-4, d’IL-5 et d’IL-13 sont associées à la maturation des
mastocytes et ont été suggérées comme étant importantes dans la physiopathologie de la SEP
(Pedotti, DeVoss et al. 2003).
D’autres cellules du système immunitaire inné, tels que les neutrophiles, les
éosinophiles ainsi que des facteurs solubles contribueraient à la formation ou à l’aggravation
des plaques (Sospedra and Martin 2005), mais ils sont très rares dans les lésions actives de
SEP.
ii. LB et anticorps
Les évènements pathologiques de la sclérose en plaques comme de l’EAE, comme nous
l’avons précédemment évoqué, résultent en une infiltration cellulaire, une apparition de
lésions focales de démyélinisation et des pertes axonales. Par conséquent, l’hypothèse
120
dominante est que cette maladie aurait une origine médiée par les LT. Cependant plusieurs
arguments sont en faveur également d’un rôle des LB et des anticorps dans la pathologie
animale et humaine [figure 25].
Comme pour les LT, les LB auto-réactifs sont éliminés au cours de leur développement
qui se déroule pour eux non pas dans le thymus mais dans la moelle osseuse ainsi que durant
leur maturation dans la rate et les ganglions drainants (Hardy and Hayakawa 2001). Pour cette
tolérance B, deux facteurs semblent essentiels : l’IL-7 et BAFF (B cell activating factor)
(Miosge and Goodnow 2005).
A la fin des années 80, les premières expériences démontrant le rôle des anticorps ont
été réalisées sur le modèle du rat Lewis. En effet, les auteurs sont partis d’une observation
faite par le groupe de Linington où ils montraient que le transfert adoptif de LT spécifiques de
la MBP induisait une réponse inflammatoire dans le SNC avec une perméabilité accrue de la
barrière hématoencéphalique mais une démyélinisation modérée (Linington, Bradl et al.
1988). Dans ce modèle, les injections d’anticorps spécifiques de MOG (le 8-18C5)
conduisaient à l’aggravation des signes cliniques d’EAE ainsi que la démyélinisation dans le
SNC (Lassmann, Brunner et al. 1988). Une année auparavant, l’équipe de Schluesener avait
montré chez les souris SJL que l’injection de ce même anticorps induisait une mort subite
alors que les animaux étaient en rémission (Schluesener, Sobel et al. 1987). Suite à ces
résultats, il a ainsi été proposé qu’après infiltration des cellules T spécifiques des antigènes
myéliniques dans le SNC, initiation de l’inflammation et rupture de la barrière hématoencéphalique, les auto-anticorps dirigés contre les protéines myéliniques pouvaient pénétrer
dans le SNC et induire la démyélinisation. Des résultats ultérieurs ont suggéré que ces
anticorps induisant la démyélinisation seraient des anticorps capables de fixer le complément
(Linington and Lassmann 1987; Linington, Morgan et al. 1989; Piddlesden, Lassmann et al.
1993). Cela permettrait ainsi d’attirer les macrophages qui détruiraient les oligodendrocytes et
relargueraient des protéines du complément et des cytokines proinflammatoires ayant un effet
cytopathique direct. Mais les controverses sont nombreuses et certains résultats prouvent au
contraire que les LB pourraient jouer un rôle protecteur dans l’EAE en influençant la
production de cytokines et ainsi permettre une déviation de la réponse immune. En effet, le
traitement de rats Lewis immunisés avec le peptide encéphalithogène de la MBP lié de
manière covalente à un anticorps de souris IgD anti-rat protège ces animaux contre le
développement de l’EAE. Il a ainsi été suggéré que l’association anticorps-peptide permet la
présentation de l’antigène par les cellules B induisant ainsi la production de cytokines de type
Th2 qui elle-même contrôlerait les cellules Th1 pathogènes (Saoudi, Simmonds et al. 1995).
121
FIGURE 25 : le système humoral dans la sclérose en plaques et l’EAE
a : infiltrats inflammatoires périvasculaires : dans la pathogenèse de la SEP et de l’EAE, les
cellules T activées (T), les cellules B (B) et les macrophages (M) peuvent traverser la barrière
hémato-encéphalique provoquant ainsi une infiltration inflammatoire périvasculaire. b : Lésion
aigüe : les nombreuses cellules inflammatoires attaquent la gaine de myéline et les oligodendrocytes
provoquant ainsi une démyélinisation et une perte de ces oligodendrocytes. Les LB spécifiques de la
myéline peuvent être activés d’une manière dépendante des LT, ce qui résulte en une différenciation
des LB en plasmocytes (P) relargant des cytokines et synthétisant des anticorps localement. Ces
autoanticorps spécifiques de la myéline peuvent opsoniser leur cible et induire une démyélinisation
médiée par les macrophages. Les anticorps peuvent aussi agir via le complément (C) en détruisant la
myéline grâce au complexe d’attaque membranaire (CAM). Les fragments actifs du complément ainsi
que ces CAM servent de molécules chimioattractantes pour les lymphocytes et macrophages et
permettent le relargage de molécules potentiellement toxiques comme les radicaux oxygénés, les
cytokines proinflammatoires et les métalloprotéases. Ceci favorise la rupture de la BHE permettant
l’accès du SNC aux cellules effectrices, aux autoanticorps systémiques et au complément. c : il existe
des structures ressemblants aux follicules lymphoïdes, particulièrement dans l’espace périvasculaire
de Virchow-Robin, qui peuvent donner lieu à des réactions immunes en permettant l’accumulation, la
différenciation et l’activation de cellules immunes ainsi que la présentation d’antigène. Il est supposé
que ces sites sont des lieux privilégiés de persistance des cellules B et plasmocytaires, permettant une
présenattion antigénique continue et donc une synthèse d’anticorps permanente. d-i : rôles possibles
du système humoral dans la SEP et l’EAE : présenattion antigénique par les LB et production
d’anticorps (d), costimulation des LT par les LB (e), opsonisation de la myéline par les LB et les
anticorps (f), recrutement de cellules inflammatoires au niveau des lésions (g), influence de
l’immonorégulation par les LB et les anticorps (h), rémyélinisation par les LB (i).
122
D’autres études se sont intéressées au rôle spécifique des LB dans l’EAE par
l’utilisation de souris µMT (déficientes pour la chaîne lourde µ) sur fond B10.PL ou C57Bl/6
immunisées respectivement par le peptide MBPAc1-11 ou par le peptide MOG35-55. Ces souris
développent une maladie similaire à celle des souris contrôles de même fond génétique.
Cependant dans la phase chronique de la maladie, les souris déficientes en LB présentent
moins de rémissions que les contrôles. D’après ces résultats, les auteurs ont donc suggéré que
les LB ne jouaient pas de rôle dans l’activation des LT encéphalitogènes et donc dans
l’initiation de la maladie mais par contre que ces LB avaient un rôle régulateur dans la phase
chronique de l’EAE (Wolf, Dittel et al. 1996; Litzenburger, Fassler et al. 1998). Mais
l’implication des LB dans l’EAE semble plus complexe, puisque une autre étude a montré que
chez ces souris µMt de fond génétique C57Bl/6, bien qu’étant sensible au développement de
l’EAE induite par immunisation avec le peptide MOG35-55, sont complètement résistantes au
déclenchement de la maladie induite par la protéine entière MOG (Lyons, San et al. 1999).
Ces résultats suggérent ainsi que les LB pourraient jouer un rôle déterminant dans l’initiation
de la maladie en tant que cellules présentatrices d’antigènes.
Chez l’homme, il est clairement établi que la déplétion en cellules B chez un patient
atteint de SEP a des effets bénéfiques sur l’évolution de la maladie (Hauser, Waubant et al.
2008). Ainsi il est suggéré, comme chez l’animal, que les LB contribueraient à la pathogenèse
du SNC par différentes voies.
Les LB peuvent agir comme source d’anticorps qui reconnaissent les composants de la
myéline, des axones ou des neurones contribuant ainsi au phénomène de démyélinisation ou
de dommages axonaux. Ces Ac peuvent agir de différentes manières. Tout d’abord, ils
peuvent être dirigés directement contre des récepteurs de surface comme le récepteur à
l’acéthylcholine dans la myasténie ou contre le récepteur à la TSH dans la maladie de Grave
(Bain and Toublanc 2002; Kohn and Harii 2003). Ces Ac peuvent également former des
complexes immuns avec les Ag circulants qui s’accumulent dans les organes cibles comme
dans le lupus et l’arthrite rhumatoïde (Dorner and Lipsky 2004; Davidson and Aranow 2006;
Rahman and Isenberg 2008). D’autres Ac peuvent se lier aux cellules circulantes comme les
érythrocytes ou les plaquettes, favorisant la lyse médiée par le complément ou la phagocyte
via les récepteurs Fc des cellules (Elson and Barker 2000). Dans la SEP, on sait que la
présence oligoclonale d’IgG dans le LCR est caractéristique de beaucoup de patients (Owens,
Ritchie et al. 2003) ainsi que la présence d’anticorps au niveau des lésions (Dalakas 2008).
Cependant les IgG oligoclonaux du LCR ne sont pas retrouvés dans le sérum des patients
123
indiquant une production intrathécale de ces Ig. Ces hautes concentrations d’Ig dans le LCR
sont en partie dues à une réponse locale impliquant les isotypes IgG1 et les IgG3 (Walsh and
Tourtellotte 1986; Losy, Mehta et al. 1990; Archelos and Hartung 2000). Ainsi, cette réponse
Ac reste un marqueur très utilisé pour le diagnostic d’une SEP. De plus, il a été montré que le
réarrangement des gènes des immunoglobulines diffère entre les LB isolés du LCR et de la
périphérie des patients atteints de SEP, suggérant ainsi que les anticorps sont produits par les
LB qui maturent dans le SNC et répondent spécifiquement à l’antigène. Très récemment,
l’équipe de Obermeier a montré, grâce aux protéomes des Ig et au transcriptome des LB dans
le LCR de patients atteints de SEP, que les bandes oligoclonales d’Ig observées
correspondaient en fait à l’expansion clonale de LB, décrits comme marqueur de la SEP. Il
reste cependant à découvrir la cible de ces IgG oligoclonaux. En outre, la formation de
follicules tertiaires lymphoïdes (qui contiennent à la fois les LB et les cellules folliculaires
dendritiques) dans les méninges des patients développant une maladie progressive secondaire
implique un engagement des LB à la fois dans la présentation antigénique et dans la
production d’anticorps dans le SNC de ces patients. La présence de ces follicules est corrélée
avec une sévérité plus importante de la maladie (Magliozzi, Howell et al. 2007). Des analyses
histologiques de tissus provenants de patients atteints de SEP ont démontré des dépôts d’Ac et
de complément au niveau des lésions sur la gaine de myéline. Les Ac spécifiques pour la
myéline (Warren and Catz 1993; Genain, Cannella et al. 1999) et pour les protéines axonales
(Mathey, Derfuss et al. 2007) ont été largement étudiés pour les lésions de SEP. Le complexe
terminal du complément C9neo a également été retrouvé dans les lésions actives de SEP
contenant des IgG (Prineas and Graham 1981; Storch, Piddlesden et al. 1998). D’autres
analyses histologiques ont montré une phagocytose active médiée par les macrophages et une
détection de fragments de myéline opsonisés dans les vésicules endocytiques. L’étude
révélant que la présence des Ac dirigés contre MOG était corrélée avec une augmentation du
risque de progression dans la SEP (Berger, Rubner et al. 2003) n’a jamais été reproduit par
d’autres groupes alors que ces Ac peuvent être associés à des taux élevés dans les lésions en
IRM(Kuhle, Lindberg et al. 2007; Pelayo, Tintore et al. 2007). Des Ac contre les autres
composants de la myéline comprenant la MBP, la PLP et la MAG ont également été détectés
dans le sérum ou le LCR de patients atteints de SEP. Mais la fréquence de tous ces Ac varie
considérablement d’une étude à l’autre, les excluant pour un pronostic ou diagnostic de SEP.
De plus, une étude récente a mis en évidence chez des patients atteints de SEP, que la réponse
des LB pouvait être dirigée contre des protéines axonales, contribuant ainsi à la
démyélinisation et au dommage axonal. Un tiers des patients aurait des Ac dirigés contre la
124
neurofascine, une molécule d’adhésion exprimée par les oligodendrocytes et les neurones
(Mathey, Derfuss et al. 2007). Les Ac contre cette neurofascine agirait via l’activation du
complément.
Ils peuvent également jouer le rôle de CPA pour les LT spécifiques des antigènes du
SNC (Dalakas 2008; Dalakas 2008). En effet, l’épitope immunodominant de l’Ac de la MBP
collocalise avec l’épitope T du même Ag (Wucherpfennig, Catz et al. 1997). En se liant au
BCR, il confère ainsi une protection contre la dégradation via cet épitope. De manière
similaire, l’épitope majeur qui reconnaît les Ac de haute affinité spécifique de l’insuline est
localisé sur le même segment que l’épitope cible des LT spécifiques du même Ag. La
présence de cet auto-Ac avec cette spécificité est un moyen prédictif pour le développement
tardif du diabète de type 1. Ces actions synergiques des LB et des LT ont très récemment été
développées dans un modèle spontané de maladie auto-immune du SNC. Des souris qui
expriment seulement un TCR spécifique de MOG développent une inflammation du nerf
optique en absence de signes cliniques classiques d’une EAE (Bettelli, Pagany et al. 2003).
Un knock-in dans ces souris avec la chaine lourde de l’anti-MOG résulte en une fréquence
très importante de LT et de LB spécifiques de MOG responsables d’une maladie auto-immune
très agressive avec des lésions confinées dans le nerf optique et la moelle épinière, comme
pour les patients atteints de NMO (Bettelli, Carrier et al. 2006; Krishnamoorthy, Lassmann et
al. 2006).
De plus, les LB sont des producteurs abondants de cytokines immunomodulatrices et de
facteurs de croissance. Ils peuvent produire des cytokines de type 1 comme l’IFN-γ, l’IL-12
pour induire l’activation de LT de type Th1, contribuant ainsi aux dommages tissulaires
survenant dans les maladies auto-immunes. Le TNF-α produit par les LB peut également
influencer cette différenciation en Th1. La production d’IL-6 par les LB, en combinaison avec
le TGF-β, promouvoit la différenciation en Th17 producteur d’IL-17, autre cytokine proinflammatoire. Les LB peuvent également produire des cytokines de type 2 influençant la
différenciation des LT en Th2, alors modulateurs de l’inflammation par production de
cytokines responsables des clairances de pathogènes extracellulaires (Harris, Haynes et al.
2000). Il est aussi connu que les cytokines produites par les LB sont critiques pour la
formation des centres germinatifs dans les ganglions drainants et dans les tissus inflammés.
Par exemple chez la souris, la lymphotoxine et le TNF sont importants pour la maturation des
cellules folliculaires dendritiques et l’organisation des centres germinatifs dans la rate (Fu,
Vallee et al. 2009). Or, cette lymphotoxine et ce TNF sont retrouvés dans les lésions de
125
patients atteints de SEP, responsables de la formation de centres germinatifs ectopiques dans
le SNC de ces patients (Selmaj, Raine et al. 1991). De plus, la production de l’IL-10 par les
LB a permis de montrer un rôle régulateur de ces cellules. En effet, l’IL-10 a des propriétés
anti-inflammatoires et peut inhiber la présentation d’antigène par les LT-CD4+ indirectement,
en diminuant leur activation, leur production cytokinique ainsi que leur prolifération
(Roncarolo, Gregori et al. 2006). La production d’IL -10 par les LB est essentielle dans la
rémission de l’EAE induite par le peptide MOG (Fillatreau, Sweenie et al. 2002). La
surexpression de cet IL-10 permet également, chez les souris, une protection contre l’EAE
(Cua, Groux et al. 1999). Chez les patients atteints de SEP, il a été montré que leurs LB
produisaient moins d’IL-10 alors que de hauts titres de cette cytokine étaient retrouvés après
un traitement par le Rituximab qui permettait sa synthèse de novo par des LB nouvellement
générés (Duddy, Niino et al. 2007).
De récentes études ont également mis en évidence le rôle de BAFF dans la pathogenèse
de maladies auto-immunes. En effet, des taux élevés de BAFF solubles ont été retrouvés dans
le serum et les organes cibles des modèles murins de lupus (Gross, Johnston et al. 2000),
d’arthrite rhumatoïde. Ce facteur d’activation est également retrouvé en plus grande quantité
dans le cerveau des patients atteints de SEP, ceci étant corrélé avec l’activité et le titre d’Ac
pathogéniques dans la maladie (Piazza, DiFrancesco et al.).
Actuellement, il est clairement établi que les LB et les Ac sont impliqués dans la
pathogenèse de la SEP et qu’un traitement ciblant ces molécules pourrait avoir un effet
bénéfique à long terme. Une étude récente a mis en évidence que les follicules riches en LB
CD20+ étaient retrouvés dans le cerveau de patients atteints de SEP progressive secondaire
(Magliozzi, Howell et al. 2007). En effet, les LB mémoires et les plasmocytes sont capables
de migrer dans la moelle osseuse mais aussi dans la rate et les autres organes lymphoïdes et
dans le cerveau où ils se transforment, après rencontre avec l’Ag, en cellules productrices
d’Ac . Il a été montré que ce sont les chimiokines CXCL13, CXCL10 et CXCL12 à la surface
des cellules endothéliales qui interagissent avec leurs récepteurs à la surface du LB qui sont
fondamentales pour l’homéostasie de ces LB (Dalakas 2008; Dalakas 2008). Or ces molécules
sont surexprimées dans le cerveau des patients atteints de SEP, expliquant en partie le
recrutement et la transmigration de ces LB sécréteurs d’Ac dans le cerveau (Meinl,
Krumbholz et al. 2006).
126
Des traitements récents ont donc focalisé leurs effets sur la fonction des LB. C’est le cas
de l’IFN-β, de l’acetate glatiramer, du natalizumab. Un autre traitement, avec un anti-CD20
(Rituximab), a montré son efficacité en activant les facteurs du complément qui attaquent
ainsi les LB-CD20+ des radeaux lipidiques de la membrane et qui permettent d’induire une
apoptose de ces cellules provoquant ainsi une réduction du nombre de lésions et une
amélioration des signes cliniques (Hauser, Waubant et al. 2008).
iii. LT
•
Rupture de la tolérance vis-à-vis des antigènes du SNC
Le rôle joué par le thymus dans la maturation des LT et l’élimination des clones autoréactifs a été décrit précédemment. Nous allons dans ce paragraphe détailler les connaissances
sur ce phénomène de sélection négative dans le cas des antigènes spécifiques du SNC.
MBP :
Chez la souris, le rat et l’homme, le gène codant pour MBP peut être transcrit sous deux
formes, une pendant la vie fœtale (la forme golli-MBP pour gene expressed in
oligodendrocyte lineage), forme qui est exprimée dans le thymus et les oligodendrocytes et
l’autre après la naissance (forme MBP classique) exprimée dans les oligodendrocytes (Pribyl,
Campagnoni et al. 1993). Après la naissance, plusieurs types de cellules thymiques expriment
les golli-MBP, notamment les macrophages et les thymocytes (Feng, Givogri et al. 2000).
L’analyse des répertoires des LT chez les souris MBP TCR transgéniques croisées avec
des souris MPB+/+, MBP+/- ou MBP-/- montre qu’une sélection négative existe vis-à-vis de
clones de LT-CD4+ spécifiques de MBP, et qu’elle dépend du niveau d’expression de
l’antigène dans l’organisme. De façon intéressante, ce phénomène semble impliquer des
cellules issues de la moelle osseuse plutôt que des cellules thymiques épithéliales (Huseby,
Liggitt et al. 2001).
Les LT-CD8+ spécifiques de MBP peuvent également subir une sélection négative
intrathymique (Perchellet, Stromnes et al. 2004). Par ailleurs, chez des souris exprimant le
même CMH, mais avec des fonds génétiques distincts, une plus forte susceptibilité à l’EAE
est associée à la lignée présentant la plus faible expression de MBP dans le thymus (Liu,
MacKenzie-Graham et al. 2001). Cependant, en dépit de ces mécanismes de tolérance, il est
127
établi que des LT-CD4+ (Lafaille, Nagashima et al. 1994) et CD8+ spécifiques de MBP
participent au développement de l’EAE (Huseby, Liggitt et al. 2001), suggérant que les
facteurs influençant l’expression des auto-Ag in vivo pouvaient influencer la susceptibilité à
l’auto-immunité.
Chez l’homme, des clones isolés de sang de patients atteints de SEP ont montré une
spécificité pour l’épitope immunodominant CD4+ de la MBP85-99. (Sun, Link et al. 1991;
Olsson 1992; Olsson, Sun et al. 1992). En outre, le transfert de LT-CD4+ transgéniques
spécifiques de MBP111-129, générés à partir de clones T issus d’un patient SEP, à des souris
transgéniques exprimant le CMH humain HLA-DRB1*0401, induit une pathologie
caractérisée par des lésions inflammatoires et des altérations de la démarche ainsi qu’une
paralysie et dysphagie (Quandt, Baig et al. 2004). Ces données suggèrent donc que
l’expression de MBP dans le thymus, chez l’homme comme dans les modèles animaux, existe
mais à un niveau qui ne suffit pas à induire une délétion totale des LT auto-réactifs.
Une étude plus récente a montré qu’au niveau structural, un clone T-CD4+ spécifique
d’un peptide de MBP, isolé à partir du sang d’un patient atteint de SEP, présentait une
topologie particulière résultant en une réduction de l’interaction entre le TCR et le complexe
CMH:peptide, et donc à une faible affinité du TCR pour ce complexe, alors que l’association
du co-récepteur CD4 est elle aussi modifiée (Hahn, Nicholson et al. 2005). Ceci ayant pour
conséquence de rendre le clone auto-réactif réfractaire à la sélection négative et de favoriser
son activation par des peptides microbiens de structures proches.
PLP :
Ce gène est très peu exprimé dans le thymus. En revanche, les transcrits codant pour la
molécule DM20, issus du même gène par épissage alternatif (Nave, Lai et al. 1987), sont
transcrits dans le thymus et le SNC, chez l’homme et la souris (Pribyl, Campagnoni et al.
1996; Anderson, Nicholson et al. 2000; Klein, Klugmann et al. 2000).
L’expression thymique de DM20 semble être le fait de cTEC et de mTEC (Klein,
Klugmann et al. 2000; Bruno, Sabater et al. 2002). Chez la souris, l’expression naturelle de
DM20 par les cellules épithéliales thymiques radiorésistantes permet d’induire une tolérance
contre les peptides de DM20 mais pas contre les épitopes codés par l’exon de PLP excisé dans
DM20. On retrouve également des LT-CD4+, en périphérie, spécifiques de PLP139-151 chez des
souris SLJ non immunisées (mais susceptibles à l’induction de l’EAE par cet antigène) le
nombre de lymphocytes augmentant avec l’âge (Anderson, Nicholson et al. 2000; Kuchroo,
Anderson et al. 2002).
128
De plus, l’utilisation de greffes de thymus de souris sauvages ou déficientes pour PLP à
des souris sauvages a permis de montrer que l’induction de tolérance aux clones spécifiques
de PLP était due à l’expression de cet antigène par les cellules stromales du thymus. En outre,
si l’on force l’expression de PLP139-151 par injection aux souris gestantes d’une protéine de
fusion entre une immunoglobuline et ce peptide, l’on observe une réduction du nombre de LT
auto-réactifs (Anderson, Nicholson et al. 2000).
L’ensemble de ces données indique donc qu’il existe une tolérance marquée vis-à-vis
des seuls épitopes de la PLP qui sont exprimés dans le thymus.
MOG :
Son immunogénicité en fait l’une des cibles clés de la réponse immunitaire durant
l’EAE (Adelmann, Wood et al. 1995).
Des LT-CD4+ (Bettelli, Pagany et al. 2003; Mendel, Natarajan et al. 2004) et LT-CD8+
(Sun, Whitaker et al. 2001) spécifiques de MOG sont encéphalitogènes chez la souris. Les LT
de sang de patients atteints de SEP montrent également une forte réactivité contre MOG.
Contrairement aux deux protéines précédentes, l’expression thymique de MOG reste
très faible chez la souris (Delarasse, Daubas et al. 2003) et non détectable chez l’homme
(Bruno, Sabater et al. 2002). Elle a toutefois été mise en évidence dans des préparations
purifiées de cellules épithéliales médullaires thymiques humaines (Gotter, Brors et al. 2004)
et murines (Derbinski, Schulte et al. 2001). Cette faible expression a des conséquences
controversées sur l’induction de la tolérance. En effet, la comparaison des réponses immunes
chez les souris MOG-/- et sauvages a conduit certains laboratoires à conclure à une
élimination de certains clones T spécifiques de MOG (Linares, Mana et al. 2003) alors que
d’autres concluent à une absence totale d’induction de tolérance (Delarasse, Daubas et al.
2003; Fazilleau, Delarasse et al. 2007).
Il semblerait donc que le niveau d’expression de MOG soit insuffisant à l’élimination de
la grande majorité des clones auto-réactifs.
Au niveau du SNC, l’accessibilité de MOG a fait que cette cible potentielle des Ac a été
largement étudiée (Brunner, Lassmann et al. 1989). MOG a été découvert par purification
d’affinité avec un Ac bien caractérisé : le 8-18C5 qui reconnaît un épitope conformationnel
(Linington, Izumo et al. 1984) et qui peut exacerber la démyélinisation quand il est administré
à des animaux souffrant d’EAE (Linington, Bradl et al. 1988; Breithaupt, Schubart et al.
2003). L’habilité des Ac dirigés contre MOG à exacerber la démyélinisation dans les modèles
animaux en a fait un candidat antigénique attractif pour expliquer les lésions dans la SEP. De
129
plus, on retrouve une fréquence plus importante de ces Ac anti-MOG dans le sérum et le LCR
de patients atteints de SEP.
D’autres antigènes du SNC potentiellement cibles de la réponse auto-immune dans ce
tissu sont concernés par l’induction de tolérance dans le thymus. C’est le cas par exemple des
protéines astrocytaires comme la S100β qui pourrait participer au développement d’une autoimmunité dans le SNC. En effet, des LT-CD4+ spécifiques de cette protéine ont pu être isolés
à partir de thymus de rat adulte malgré une expression de S100β dans les cellules thymiques
médullaires des rats donneurs (Kojima, Reindl et al. 1997). Après activation in vitro, le
transfert de ces cellules a induit une encéphalite des animaux receveurs.
•
Infiltration et réactivation des LT dans le SNC
L’infiltration :
Pour initier l’inflammation au niveau du SNC, les cellules T spécifiques de la myéline
doivent être activées en périphérie, passer les barrières menant au système nerveux central et
enfin être réactivées par les CPA locales (Goverman 2009). Cette réactivation nécessite la
production de médiateurs solubles tels que l’IFNγ et le TNF-α (Allavena, Noy et al.; Cannella
and Raine 1995) par les cellules résidentes qui permet un recrutement massif de cellules
inflammatoires qui vont pouvoir passer, grâce à la présence à leur surface de molécules
d’adhésion, de récepteurs aux chimiokines et d’intégrines la barrière hémato-encéphalique
(Engelhardt and Sorokin 2009). Et c’est en effet le cas des lymphocytes T activés et mémoires
(Ransohoff, Kivisakk et al. 2003). Mais les conditions qui font que les CPA périphériques
présentent des épitopes de la myéline à des LT naïfs dans un contexte immunogénique ne sont
pas encore bien définies, même si l’hypothèse majeure reste le mimétisme moléculaire malgré
le fait qu’aucun pathogène spécifique n’a été découvert comme cause de la maladie.
Au cours de l’EAE, il a été décrit une interaction critique entre les leucocytes et
l’endothélium inflammé, l’interaction α4β1/VCAM-1, pour le passage de la barrière hématoencéphalique. Ainsi en bloquant l’intégrine α4 ou en délétant l’intégrine β1 sur les cellules T
spécifiques de la myéline, la maladie murine est inhibée (Kerfoot, Norman et al. 2006; Bauer,
Brakebusch et al. 2009). Les molécules concernant l’adressage et le « rolling » des LT à
l’endothélium durant l’EAE restent un sujet de controverse même si l’implication de la P-
130
sélectine et de son ligand PSLG-1 a largement été démontrée (Kerfoot, Norman et al. 2006). Il
reste également à déterminer les molécules impliquées dans la diapédèse au travers de cette
barrière inflammée. Cependant, il est clairement établi que les sites où les cellules T
encéphalitogènes peuvent traverser les cellules endothéliales sont déterminés par la
composition en laminine présente au niveau de la membrane. C’est ainsi que
l’équipe
d’Anderson a montré que la laminine α4 était cruciale pour la transmigration des T dans le
SNC. Toutefois, il a récemment été montré qu’une molécule d’adhésion présente sur les LT
activés, ALCAM (ou CD166) était surexprimée suite à un stimulus inflammatoire. Ainsi
durant la transmigration des LT, ALCAM co-exprimé avec son ligand CD6 forment un
complexe facilitant la traversée. Des coupes post-mortem de cerveau de patients atteints de
SEP et de cerveau de souris ayant développé une EAE montrent une forte expression
d’ALCAM alors que des Ac bloquants dirigés contre ALCAM permettent une réduction
d’accumulation des LT-CD4+ ainsi qu’une moindre sévérité et un délai plus important dans
l’apparition de la maladie (Cayrol, Wosik et al. 2008). Pour traverser cette barrière hématoencéphalique, les LT doivent migrer à travers des jonctions serrées. Or, récemment, le CD99,
une protéine O-glycosylée exprimée par les leucocytes, a été localisée dans l’endothélium
(Schenkel, Mamdouh et al. 2002). L’équipe de Bixel a montré, suite à cette observation, que
des Ac anti-CD99, inhibaient la transmigration des LT encéphalitogènes à travers la barrière
hémato-encéphalique in vitro, suggérant ainsi un rôle du CD99 dans le recrutement des LT à
travers cette barrière in vivo (Bixel, Kloep et al. 2004). Après avoir pénétré la monocouche de
cellules endothéliales, les lymphocytes doivent traverser la membrane basale en provoquant
une rupture de ses deux couches pour atteindre le parenchyme cérébral. Cette pénétration du
parenchyme corrèle avec des sites présentant des activités locales des métalloprotéinases
(MMP). Ainsi plusieurs MMP sont impliquées dans l’EAE incluant MMP-14/MMP-2, MMP9, et probablement MMP-7 et MMP-8 (Toft-Hansen, Nuttall et al. 2004; Toft-Hansen,
Babcock et al. 2007). Pour les Th17, il semblerait toutefois que c’est au niveau des plexus
choroïdes que les LT auraient le plus de facilité à pénétrer dans le SNC via le LCR. Le groupe
de Reboldi a mis en évidence très récemment un mécanisme moléculaire impliqué dans le
recrutement des populations T dans ce compartiment. En effet, ils ont montré l’importance
d’un récepteur aux chimiokines, le CCR6, présent à la surface d’un sous groupe de cellules T
pathogéniques qui faciliterait l’entrée des LT dans le SNC via une interaction avec le CCL20
constitutivement exprimé par les cellules des plexus choroïdes chez l’homme et chez la souris
suggérant ainsi que l’axe CCR6-CCL20 dans les plexus choroïdes contrôle la surveillance
immune dans le SNC (Reboldi, Coisne et al. 2009).
131
Réactivation des LT-CD4+ :
Des études d’imagerie (IRM) ont confirmé que l’espace sous-arachnoïdien (où circule le
LCR) était le premier site où les LT-CD4+ (préalablement activés en périphérie) serait
réactivés par les CPA locales dans un contexte CMH de classe II. Cette reconnaissance du
ligand conduit à la formation d’agrégats lymphocytaires dans cet espace (Kivisakk, Imitola et
al. 2009). Cette réactivation est suivie d’une activation des cellules endothéliales
périvasculaires qui permet le recrutement d’autres populations lymphocytaires. De plus, la
production locale de TNF semble importante pour la migration des LT-CD4+ de cet espace
périvasculaire vers le parenchyme (Gimenez, Sim et al. 2006). En effet, cette équipe a montré
que le récepteur TNF-R1 au TNF jouait un rôle important dans la production des chimiokines
CXCL2 et CCL2 associées à l’inflammation. Des expériences de chimères de moelle osseuse
ont démontré que l’expression de ce récepteur était critique pour l’induction d’une réponse
inflammatoire médiée par les Th1.
En outre, il a été montré que la force de réactivation était déterminée par le degré
d’inflammation du parenchyme et non par l’habilité des LT à infiltrer l’espace périvasculaire,
force due à la fois à l’affinité du TCR pour son ligand (l’épitope myélinique présenté par les
molécules de CMH) et par le nombre spécifique de complexes peptide:CMH reconnus.
Réactivation des LT-CD8+ :
Pour les LT-CD8+, il semblerait que cet espace sous-arachnoïdien soit également le
premier colonisé. Ceci a été montré par le groupe de McGavern où les LT-CD8+ qui
répondent au LCMV apparaissent en premier dans cet espace. Cependant les mécanismes
d’infiltration entre les populations CD4+ et CD8+ diffèrent. En effet, des expériences de
microscopie intravitale sur la souris montrent que des LT-CD8+ isolés de patients atteints de
SEP adhérent beaucoup plus fortement aux veinules inflammées du SNC que les LT-CD4+
issus de ces mêmes patients ou que les LT-CD8+ issus de sujets sains (Battistini, Piccio et al.
2003). Il a été montré que cette adhérence dépendait de l’expression de PSGL-1 dont le
récepteur est constitutivement exprimé sur les micro-vaisseaux des plexus choroïdes. La
différence d’adhérence peut s’expliquer par le fait que les LT-CD8+ expriment ce ligand alors
que les LT-CD4+ expriment préférentiellement l’intégrine α4 (Battistini, Piccio et al. 2003).
Le développement des nouvelles lésions au sein du SNC est ensuite corrélé à l’expression de
CCR5 et CXCR3 particulièrement sur les LT-CD8+ plus que les LT-CD4+, ce qui suggère
que les LT-CD8+ pourraient contribuer à la pathogénèse de la maladie à ce stade là.
132
•
Réponse des LT-CD4+
Les premières expériences montrant le rôle des lymphocytes T dans l’EAE ont été
apportées dans les années 1970. En effet, des rats déplétés en LT par thymectomie et
irradiation étaient résistants à l’induction de l’EAE, suggérant un rôle important de ces LT
dans le déclenchement de la pathologie (Gonatas and Howard 1974; Ortiz-Ortiz and Weigle
1976).
Spécificité antigénique :
Parmi les populations T, l’importance des LT-CD4+ est clairement admise aujourd’hui.
Cette importance a été observée pour la première fois en 1981 où seule l’élimination des LT
spécifiques de la MBP Ly1+ étaient capables de prévenir le transfert d’EAE (Pettinelli and
McFarlin 1981). Des expériences ultérieures ont montré que l’injection d’anticorps anti-CD4
pouvait inhiber ou freiner la progression de l’EAE (Brostoff and Mason 1984; Waldor, Sriram
et al. 1985). Mais la preuve directe du rôle des cellules LT-CD4+ dans la pathologie vient des
expériences montrant que le transfert de lignées cellulaires T ou de clones LT-CD4+
spécifiques de la MBP, PLP ou MOG sont capables d’induire l’EAE (Ben-Nun and Cohen
1982; Zamvil, Nelson et al. 1985; Kuchroo, Sobel et al. 1992; Baron, Madri et al. 1993).
D’autres observations, chez l’homme, sont venues à l’appui de cette hypothèse. Comme
le fait que la fréquence des LT-CD4+ sanguins présentant une forte affinité pour les antigènes
de la myéline est supérieure chez les patients atteints de SEP. Cette fréquence corrèle avec la
sévérité des lésions examinées par IRM (Bielekova, Sung et al. 2004). Ou encore que certains
allèles de gènes du CMH de classe II confèrent comme nous l’avons vu précédemment une
susceptibilité au développement de la maladie (Tienari, Bonetti et al. 2006; gHafler,
Compston et al. 2007).
En ce qui concerne cette spécificité antigénique, comme nous venons de le voir, la
susceptibilité à la maladie nécessite non seulement l’expression des molécules de CMH de
classe II qui peuvent se lier à des auto-Ag dérivés de la myéline ou d’autres composants du
SNC, mais aussi que les LT spécifiques de cette myéline échappent à la sélection thymique
(tolérance centrale) pour être activés en périphérie. Comme nous l’avons vu précédemment,
l’échappement à cette tolérance centrale peut être la conséquence de deux phénomènes : une
expression du TCR à faible affinité pour son complexe CMH:peptide ou une mauvaise
reconnaissance du CMH qui implique une absence de liaison du TCR à son complexe
133
CMH:peptide. Dans le cas de l’EAE et de la SEP, l’observation que les protéines de la
myéline sont exprimées dans le thymus suggère que ces LT spécifiques de la myéline qui
échappent à cette sélection sont les LT qui ont la plus faible affinité pour les auto-antigènes
(Seamons, Perchellet et al. 2003). Cependant, cette avidité des LT envers les auto-antigènes
peut être augmentée dans certaines circonstances, particulièrement quand les APC répondant
à un antigène immunogénique, comme dans le cas d’une infection, augmentent leur
expression de molécules co-stimulatrices et de complexe CMH à leur surface. Cette avidité
augmentée permet ainsi aux LT qui ont échappé à la sélection de désormais répondre à l’autoantigène (Seamons, Perchellet et al. 2003).
De plus, de hautes fréquences de cellules exprimant des TCR polyspécifiques (c’est à
dire qui peuvent lier de multiples complexes CMH :peptides distincts) sont retrouvés chez les
patients atteints de SEP (Zhang, Tang et al. 2008). Cette observation est intéressante dans
l’hypothèse du mimétisme moléculaire, où en effet, il a déjà été montré que des cellules
possédant à leur surface des TCR polyspécifiques pouvaient reconnaître les épitopes du
pathogène aussi bien que les antigènes de la myéline (Wucherpfennig and Strominger 1995;
Lang, Jacobsen et al. 2002; Zang, Li et al. 2004; Markovic-Plese, Hemmer et al. 2005). Ainsi,
la plupart des LT qui auraient un TCR polyspécifique aurait beaucoup plus de chance d’être
activés en réponse à un antigène spécifique qui initierait la réponse auto-immune contre les
antigènes de la myéline.
Chez la souris, la preuve formelle de cette implication des LT-CD4+ est donnée par les
résultats issus de l’élimination de ces LT-CD4+ par un traitement avec un anticorps anti-CD4
déplétant qui bloque totalement l’EAE (Montero, Nussbaum et al. 2004).
Réponse effectrice :
Les cellules effectrices impliquées dans la pathogénie de la SEP et de l’EAE ont été
longtemps décrites comme de type Th1. En effet, chez les patients atteints de SEP, les
lymphocytes auto-réactifs présentent une différenciation en Th1 (Bielekova, Sung et al.
2004). Durant la phase inflammatoire, la production des cytokines telles que le TNF-α, l’IFNγ et l’IL-2 est très largement augmentée dans le CNS et le LCR (Gutcher and Becher 2007).
De plus, il a été montré que l’IL-12, cytokine induisant la différenciation en Th1 jouait un rôle
majeur dans le développement de l’EAE. En effet, le traitement des souris par des anticorps
neutralisant l’IL-12 inhibe le développement de la maladie, tandis que l’injection d’IL-12 à
des souris aggrave l’EAE. On peut ajouter également que l’ajout d’IL-12 dans des cultures de
134
lymphocytes T stimulés avec PLP augmente leur encéphalogénicité (Leonard, Waldburger et
al. 1995).
De plus, plus récemment, des études ont montré que l’IL-12 partage une sous-unité avec
une autre cytokine l’IL-23 : la sous unité p40. Cette sous-unité est associée à la p19 pour l’IL23 et la p35 pour l’IL-12. Et l’utilisation de souris déficientes pour l’une ou l’autre sous-unité
a permis de montrer que c’est l’expression d’IL-23, plutôt que d’IL-12, qui permet de
maintenir l’inflammation nécessaire au développement de l’EAE, alors que les réponses Th1
sont conservées chez les souris déficientes en p19, qui sont pourtant résistantes à l’induction
de la maladie (Cua, Sherlock et al. 2003). Nous savons désormais que l’IL-23 induit une
nouvelle sous population de LT-CD4+ productrice d’IL-17, d’IL-22/21 et de TNF : les Th17
(McGeachy, Chen et al. 2009). Cette population s’avère très encéphalitogène et serait
essentielle pour le développement d’une réponse inflammatoire auto-immune dans le SNC
(Langrish, Chen et al. 2005). En effet, une forte production d’IL-17 a été mise en évidence
dans le SNC de souris ayant développé une EAE et la neutralisation de cette cytokine par
l’administration d’un anticorps réduit les scores cliniques (Hofstetter, Ibrahim et al. 2005). De
plus, la neutralisation de l’IL-23 permet également d’améliorer les signes cliniques d’EAE et
de diminuer l’inflammation du SNC (Chen, Langrish et al. 2006). Chez l’homme, il existe des
résultats similaires quant à l’importance de ce lignage, puisque les LT-CD4+ issus de patients
atteints de SEP sécrètent davantage d’IL-17 (Vaknin-Dembinsky, Balashov et al. 2006) et que
les transcrits IL-17 sont augmentés dans les lésions de SEP chronique comparées à des tissus
issus d’individus sans pathologie du SNC (Lock, Hermans et al. 2002). Si l’on transfère ces
Th17, la maladie induite est beaucoup plus sévère comparée à une EAE induite par les Th1
(Langrish, Chen et al. 2005). Ce qui suggère un rôle imminent des Th17 dans la pathologie
comme effecteur de l’auto-immunité dans le SNC (Hofstetter, Ibrahim et al. 2005;
Komiyama, Nakae et al. 2006).
Cependant, ce dogme Th1 pour l’EAE est aujourd’hui en partie remis en question. En
effet pendant de nombreuses années, on a donné une importance à la réponse Th1 dans
l’induction de la pathogénicité, et un rôle protecteur aux cytokines de type Th2 dont la
production augmente lors de la phase de rémission (Khoury, Hancock et al. 1992). Mais les
expériences du groupe de Lafaille démontrent que les LT-CD4+ spécifiques d’un peptide de
MBP, différenciés in vitro en Th2 en présence d’IL-4 sont encéphalitogènes après transfert de
ces cellules chez des souris receveuses déficientes pour Rag (Lafaille, Keere et al. 1997).
135
Régulation de l’inflammation (T-reg) :
Parmi ces LT-CD4+ les T-reg jouent un rôle important dans l’évolution de la maladie.
En effet, la première équipe à avoir mis en évidence l’importance de ces cellules a été
l’équipe de Furtado qui a démontré que les LT-CD4+ déplétés en CD25 ne conféraient pas de
protection contre le développement spontané de la maladie contrairement aux LT-CD4+
totales lorsque ces LT étaient transférés dans des souris MBP TCR Rag-/- (ces souris ne
possédant pas elles-mêmes de T-reg). De façon directe, le transfert de T-reg polyclonaux a
permis de réduire la sévérité de l’EAE chez des receveurs C57Bl/6 ou SLJ (Zhang, Koldzic et
al. 2004). De plus, une déplétion in vivo des T-reg CD25+ augmente la sévérité de la maladie
(Cabarrocas, Cassan et al. 2006).
Par la suite, il a été montré que des T-reg s’accumulent dans le SNC durant la phase de
guérison de l’EAE aiguë (McGeachy, Stephens et al. 2005). Ces cellules sont fortement
suppressives in vitro et leur transfert en faible nombre améliore les scores cliniques d’EAE
des receveurs préalablement immunisés. Plusieurs groupes ont montré l’importance de ces
cellules dans le contrôle de la réponse auto-immune contre le SNC par des modèles de
déplétion ou d’inactivation des T-reg (McGeachy, Stephens et al. 2005; Gartner, Hoff et al.
2006).
Chez l’homme, la fréquence des T-reg dans le sang des patients atteints de SEP et des
sujets sains ne diffèrent pas (Putheti, Pettersson et al. 2004; Haas, Hug et al. 2005), et leur
fréquence dans le LCR des patients est identique à celle que l’on trouve dans leur sang. Au
niveau fonctionnel, les T-reg issus de patients atteints de SEP possèdent un effet suppresseur
moindre (Venken, Hellings et al. 2006). Cette réduction est associée à une baisse de
l’expression du facteur de transcription FoxP3 par les cellules CD4+CD25+ du sang
périphérique, à la fois au niveau ARNm et protéique (Huan, Culbertson et al. 2005).
Que ce soit dans le modèle animal ou chez l’homme, les T-reg semblent donc contribuer
à restreindre la susceptibilité et la sévérité de la maladie.
•
Réponse des LT-CD8+
Spécificité antigénique :
Le rôle des LT-CD8+ dans la SEP est un concept beaucoup plus récent (Liblau, Wong et
al. 2002; Neumann, Medana et al. 2002; Friese and Fugger 2005; Goverman, Perchellet et al.
2005). Le postulat est bâti sur l’observation qu’une déplétion en LT-CD4+ chez des patients
136
atteints de SEP n’améliore pas la maladie alors que la déplétion des populations leucocytaires
(CD4 et CD8) semble être bénéfique.
Chez les patients atteints de SEP, ces lymphocytes, issus d’un nombre réduit de clones
ayant proliféré in situ, ont été identifiés au sein des lésions (Babbe, Roers et al. 2000). De
plus, les LCR et sang de patients atteint de SEP sont préférentiellement enrichis en CD8
mémoires par rapport aux CD4 mémoires, CD8 qui montrent une expansion oligoclonale.
Contrairement à la population des LT-CD4+ où aucune modification de fréquence n’a été
observée tant chez les sujets sains que chez les patients atteints de SEP, pour la population des
LT-CD8+, il a été démontré une fréquence plus élevée chez les patients (Crawford, Yan et al.
2004). En outre, l’équipe de Bitsch a trouvé une corrélation statistiquement significative entre
la présence de ces LT-CD8+ et le dommage axonal au sein des lésions (Bitsch, Schuchardt et
al. 2000; Kuhlmann, Lingfeld et al. 2002).
En ce qui concerne l’association génétique du CMH de classe I avec la SEP, le sujet est
controversé. Toutefois, l’allèle HLA-A3(A*0301) a été montré comme augmentant la
susceptibilité à la maladie alors que l’allèle HLA-A2 (A*0201) semble conférer une
protection, montrant ainsi la dualité des rôles des LT-CD8+ qui peuvent être soit bénéfiques
soit pathogènes (Brynedal, Duvefelt et al. 2007; Burfoot, Jensen et al. 2008).
Les premières expériences réalisées chez des souris déficientes pour le CD8 ont montré
une amélioration de la maladie avec plus de périodes de rémission suggérant ainsi un rôle
régulateur (Koh, Fung-Leung et al. 1992). Cependant, le transfert de LT-CD8+ spécifiques de
MOG35-55 (Sun, Whitaker et al. 2001) ou de MBP79-87 (Huseby, Ohlen et al. 1999) ou de
PLP45-53 (Friese, Jakobsen et al. 2008) induit une EAE chez des souris receveuses montrant
cette fois-ci un rôle pathogénique de ces cellules. Par ailleurs, le transfert de LT-CD8+ activés
in vitro et spécifiques d’un néo-autoantigène glial entraîne une encéphalomyélite, non suivi de
signes cliniques, mais montrant une dégradation spécifique des astrocytes, avec un profil
d’inflammation différent de celle qui est induite par des LT-CD4+ (Cabarrocas, Savidge et al.
2003).
Mécanismes effecteurs :
Les LT-CD8+ peuvent agir selon deux mécanismes: la lyse dépendante du contact et la
production de médiateurs solubles.
En effet, les granules lytiques contenues dans les LT-CD8+ sont polarisées vers les
axones et les oligodendrocytes et il a été clairement montré que les LT-CD8+ spécifiques de la
MBP isolés de patients atteints de SEP pouvaient lyser les oligodendrocytes humains
137
(Jurewicz, Biddison et al. 1998; Liblau, Wong et al. 2002; Neumann, Medana et al. 2002;
Friese and Fugger 2005; Goverman, Perchellet et al. 2005). Cependant, deux études ont
montré que la perforine n’apparaissait pas avoir un rôle majeur dans cette cytotoxicité. En
effet, les LT-CD8+ ne peuvent pas tuer les neurones grâce au processus dépendant de la
perforine, ce qui corrèle avec les expériences menées par l’équipe de Khanna où les LT-CD8+
contrôlaient l’infection des neurones sensitifs par le HSV sans initier cette cytotoxicité (Liu,
Khanna et al. 2000; Khanna, Bonneau et al. 2003). Les neurones semblent donc relativement
résistants à la cytotoxicité médiée par la perforine. Un autre mécanisme devait donc être
impliqué puisque l’amplification des dommages tissulaires est clairement corrélée avec le
nombre croissant de LT-CD8+ dans le SNC. Dans ce contexte, l’équipe de Neumann a
démontré que la molécule Fas Ligand était effectrice du dommage neuronal et promouvait
ainsi la cytotoxicité (Neumann, Cavalie et al. 1995; Neumann, Medana et al. 2002). Des
études complémentaires ont montré l’interaction de ces LT-CD8+ avec le tissu nerveux via
une cytotoxicité médiée par la molécule Fas Ligand entre ces LT et les neurones directement
en contact .
Une étude très récente a montré un rôle direct de ces LT-CD8+ infiltrant le SNC. En
effet, l’équipe de Wiendl a prouvé que les LT-CD8+ infiltrant le SNC pouvaient attaquer
directement les oligodendrocytes et provoquaient une apoptose des neurones collatéraux via
l’activation de la voie des caspases (Gobel, Melzer et al.).
Cependant, du fait de la difficulté d’obtention des tissus nerveux issus de patients
atteints de SEP, les études se sont plutôt portées sur l’analyse du sang périphérique des
patients, même s’il est admis que les cellules immunes en périphérie et au sein du SNC sont
différentes. Néanmoins, ces études pouvaient donner quelques indications indirectes sur
l’activité de ces LT-CD8+ au sein du SNC. C’est ainsi que l’équipe de Sepulcre a montré une
expression significativement plus élevée de l’IFN-γ produit à la fois par les LT-CD4+ et LTCD8+ isolés du sang de patient présentant une forme de SEP avec des périodes de poussées et
de rémissions successives. Cette étude a également montré que le niveau d’expression de
l’IFN-γ par les LT-CD8+ est corrélé avec l’handicap des patients (Sepulcre, Sanchez-Ibarrola
et al. 2005).
De plus des études ont prouvé que des LT-CD8+ spécifiques de la MBP issus de
patients atteint de SEP produisaient des cytokines pro-inflammatoires comme le TNF-α ou
l’IFN-γ (Zang, Li et al. 2004). Une étude récente montre aussi que plus de 70% des LT des
lésions aigues et chroniques de SEP sont productrices d’IL-17 (Tzartos, Friese et al. 2008).
138
Régulation de l’inflammation :
Pour cette population lymphocytaire, deux voies d’action sont actuellement mises en
évidence : l’une montrant comme nous venons de le voir précédemment que ces LT-CD8+
auraient un rôle effecteur et l’autre suggérant un rôle suppresseur de ces LT-CD8+ sur la
maladie.
En 1992, il a en effet été montré que des LT-CD8+ pouvaient protéger des périodes de
crises chez l’animal (Jiang, Zhang et al. 1992). Ces observations initiales ont été confirmées
par la suite grâce à des transferts adoptifs de LT-CD8+ isolés de souris souffrant d’EAE dans
des receveurs immunisés avec la MBP. Ces souris devenaient résistantes à l’induction d’EAE,
montrant la capacité des LT-CD8+ à inhiber la réponse LT-CD4+ spécifique de la MBP.
Tout comme pour les LT-CD4+, il existe donc une population régulatrice pour les LTCD8+. Et ces LT-CD8+-reg ont été retrouvés chez des patients atteints de SEP et chez la souris
développant une EAE (Zozulya and Wiendl 2008). Initialement, ce sont les LT-CD8+CD122+
naturels qui ont été décrits comme inhibant les fonctions effectrices des LT-CD8+ via la
sécrétion d’IL-10 (Rifa'i, Shi et al. 2008). Mais il existe aussi des LT-CD8+-reg induits qui
semblent supprimer la maladie par le biais d’une induction d’effets tolérogènes sur les cellules
dendritiques (Najafian, Chitnis et al. 2003). D’autres LT-CD8+-reg, induits par l’expansion
des LT-CD4+ effecteurs en périphérie, éliminent les LT-CD4+ par reconnaissance d’un CMH
non classique Qa-1 à la surface de ces lymphocytes (Lu, Kim et al. 2008).
Des études récentes montrent que l’on peut extrapoler ce rôle des LT-CD8+-reg aux
patients atteints de SEP, ces lymphocytes étant retrouvés chez ces patients en moindre nombre
durant la phase d’exacerbation de la maladie (Zozulya and Wiendl 2008).
•
Coopération des populations lymphocytaires
Nous venons de voir l’implication de chaque population lymphocytaire sur le
déclenchement et l’évolution de la maladie. Cependant comme nous l’avons discuté dans le
premier chapitre, tout le système immunitaire agit de façon intégrée impliquant chaque
population cellulaire. Mais malgré ce postulat très peu d’études ont été réalisées pour
comprendre, aux vues des rôles importants des LT-CD4+ et LT-CD8+ dans la pathologie, la
coopération de ces deux populations et analyser ainsi le poids de chacune d’elles et leur action
en synergie sur l’évolution de la maladie.
Ce sont par ces études que des populations régulatrices, qu’elles soient LT-CD8+ ou LTCD4+, et leur mécanisme d’action ont été découverts dans la SEP ou d’autres maladies auto139
immunes (Jiang, Braunstein et al. 2001). Mais le rôle de la coopération des populations
effectrices est très peu connu.
Or une suggestion avait été émise sur ce rôle là car, dans un modèle animal humanisé,
l’initiation de la maladie était due à l’implication de LT-CD8+ alors que le devenir de cette
maladie dépendait principalement des LT-CD4+. Mais une première collaboration des
populations LT-CD8+ et LT-CD4+ a toutefois été mise en évidence mais dans des conditions
particulières que sont les conditions lymphopéniques. En effet, pour de nombreuses maladies
auto-immunes comme la polyarthrite rhumatoïde, le syndrome de Sjögren, le lupus, l’autoimmunité avait été largement associée à une lymphopénie. Dans ce cadre, l’équipe
d’Hernandez est parti du postulat que la prolifération et la différenciation des LT auto-réactifs
pouvaient résulter d’une induction d’auto-immunité dans un environnement lymphopénique.
C’est ainsi que les auteurs ont démontré que des LT-CD8+ et LT-CD4+ mémoires pouvaient
coopérer pour rompre la tolérance périphérique dans des conditions lymphopéniques et
induire une auto-immunité (Hernandez, Shen et al. 2008). Dans ces mêmes conditions, Mak a
démontré que l’auto-immunité pouvait apparaître en conséquence d’un coopération
CD4+/CD8+ où les LT-CD4+ auto-réactifs permettaient l’expansion des LT-CD8+ non pas via
une interaction cellulaire (CD28 et CD40) mais via la production d’une cytokine produite
abondamment dans les conditions lymphopéniques, l’IL-7 (Calzascia, Pellegrini et al. 2008).
Récemment, il a également été montré qu’au cours de l’EAE, il y avait des changements
chronologiques de ces deux populations, la phase précoce étant dominée par les LT-CD4+
alors que les LT-CD8+ sont plus nombreux dans les phases tardives de la maladie. Une équipe
américaine s’est donc intéressée plus particulièrement aux rôles respectifs des LT-CD4+ et
LT-CD8+ dans l’EAE. Ils ont, par immunisation avec différents épitopes dominants, montré
que les LT-CD8+ pathogéniques spécifiques de MOG avaient besoin des LT-CD4+
spécifiques de MOG pour soutenir l’inflammation du CNS au cours d’une EAE chronique
(Bettini, Rosenthal et al. 2009).
Dans un contexte viral, l’équipe de C. Gerard a démontré également un rôle synergique
des deux populations lymphocytaires CD4+ et CD8+. En effet, l’aide des LT-CD4+ pour
l’activation des LT-CD8+ in vivo est très bien établie aujourd’hui. Cependant, le rôle de ces
LT-CD4+ auxilaires dans le contrôle de la réponse des CTL au stade effecteur n’avait jamais
été investigué. Cette équipe a ainsi pu montrer que les CTL seuls ne pouvaient pas pénétrer
dans le tissu infecté mais avaient un réel besoin d’aide des LT-CD4+ pour le faire. Dans ce
contexte là, les LT-CD4+ contrôlent la migration des CTL indirectement par la sécrétion
d’IFN-γ et l’induction de chimiokines dans le tissu infecté (Nakanishi, Lu et al. 2009)
140
•
Réponse des LT-γδ
Même si leur rôle précis n’a pas été clairement démontré, les LT-γδ restent
possiblement impliqués dans la pathogenèse de la SEP et de l’EAE. Récemment, leur rôle
potentiel dans l’auto-immunité du SNC a été fortement suggéré lorsque l’équipe de Miller a
montré que ces LT-γδ s’accumulaient chez les patients atteints de SEP et présentaient une
expansion oligoclonale suggérant une réponse antigène spécifique (Blink and Miller 2009).
Dans le modèle animal, un rôle régulateur a été suggéré par des études de déplétion de
cellules LT-γδ. En effet, chez les animaux présentant des déplétions en LT-γδ, la maladie
était exacerbée et il n’y avait plus de périodes de rémission (Ponomarev and Dittel 2005). En
outre, plusieurs études sont compatibles avec un rôle pathogénique de ces cellules car des
souris déficientes en LT-γδ ont une sévérité de la maladie moindre et une production réduite
de cytokines pro-inflammatoires.
De façon intéressante, nous avons vu précédemment que de nombreux LT produisant l’IL-17
sont recrutés dans le SNC durant l’EAE. Or 60% de ces LT sont des LT-γδ, suggérant ainsi un
rôle important de ces cellules dans la pathogenèse de la maladie.
iv. Cytokines
Les cytokines, produites par de nombreux types cellulaires (LT, macrophages,
microglie, astrocytes, oligodendrocytes…) sont susceptibles de jouer différents rôles dans la
maladie. Tout d’abord, l’on peut envisager un rôle de directionalité de la réponse immune. En
effet, comme nous l’avons vu précédemment, les cytokines peuvent influencer la
différenciation des LT vers un phénotype pathogénique ou « inoffensif ». Elles peuvent
également jouer un rôle dans le recrutement et le cheminement des cellules dans le SNC. On
peut également émettre l’hypothèse qu’elles peuvent agir sur l’activation ou la neutralisation
des cellules pathogéniques aux sites de l’inflammation.
•
Cytokines associées aux cellules Th1
Les cytokines produites par les LT-CD4+ de type Th1 jouant un rôle prépondérant dans
la sclérose en plaques et l’EAE sont l’IFN-γ et le TNF-α.
141
L’IFN-γ :
Cette cytokine est produite presque exclusivement par les LT. L’IFN-γ peut avoir des
influences importantes sur les CPA du SNC. En effet, il augmente l’expression des molécules
de CMH et d’adhésion à la surface de l’endothélium cérébrovasculaire, permettant ainsi aux
LT de traverser plus facilement la barrière hémato-encéphalique (Dore-Duffy, Balabanov et
al. 1996). Il induit aussi l’expression des molécules de co-stimulation à la surface des
macrophages et des cellules du SNC comme les astrocytes et les cellules de la microglie. Ceci
a pour conséquence de perpétuer l’inflammation du SNC et la démyélinisation en permettant
la présentation des auto-antigènes dans le SNC (Tan, Gordon et al. 1998). Toutefois son
implication dans l’EAE reste complexe. Alors que quelques études ont décrit un rôle
pathogène direct (Baron, Madri et al. 1993), beaucoup d’autres montrent que l’absence d’IFNγ ou de signal à travers son récepteur accentue l’EAE. En effet, l’on sait désormais que
(Duong, St Louis et al. 1992; Duong, Finkelman et al. 1994) l’administration d’anticorps
neutralisant l’IFN-γ conduit à une exacerbation de la maladie dans différentes souches de
souris. De manière similaire, les travaux de Lublin (Lublin, Knobler et al. 1993) et Billiau
(Billiau, Heremans et al. 1988) montrent que l’injection d’IFN-γ réduit la sévérité de la
maladie chez les souris.
Des analyses plus récentes ont montré que chez des souris IFN-γ-/- et IFN-γR-/- la
maladie était similaire voire exacerbée par rapport à des souris contrôles (Ferber, Brocke et al.
1996; Krakowski and Owens 1996). De plus, si l’on transfère des LT spécifiques de MOG
provenant de souris déficientes en IFN-γR à des souris IFN-γR+/+ alors on observe une
maladie très sévère qui progresse sans rémission alors que ces mêmes cellules transférées à
des souris sauvages induisent une maladie similaire, à la seule différence que les animaux
montrent la possibilité de rentrer en phase de rémission. Ces résultats montrent donc que ces
LT provenant des souris IFN-γR-/- induisent non seulement une pathologie mais en plus
stimulent le circuit inhibiteur en retour via leur production d’IFN-γ qui diminue le processus
inflammatoire et permet une rémission de la maladie. `
Le TNF-α et la lymphotoxine-α :
Comme l’IFN-γ, le TNF-α a été associé au pouvoir encéphalithogène des cellules Th1.
En accord avec ces observations, l’administration d’anticorps neutralisants anti-TNF-α
permet de diminuer la sévérité de l’EAE (Ruddle, Bergman et al. 1990). Il en est de même
pour la lymphotoxine (LT-α). L’analyse des souris déficientes en LT-α a montré des résultats
142
similaires puisque ces souris sous fond C57Bl/6 immunisées avec le peptide MOG35-55
développent une maladie moins sévère que les souris contrôles (Suen, Bergman et al. 1997).
Les résultats pour les souris déficientes en TNF-α sont beaucoup plus controversés. En effet,
une étude montre que ces souris TNF-α-/- générées directement sur fond C57Bl/6 développent
une maladie similaire à celle des souris contrôles à la seule différence que le déclenchement
de la maladie est retardé, alors que d’autres études montrent que ces souris TNF-α-/- croisées
sur fond C57Bl/6 développent une maladie plus sévère sans aucun délai de déclenchement
(Liu, Marino et al. 1998).
•
Cytokines régulatrices
Le TGF-β :
Une action admise aujourd’hui pour le TGF-β est qu’il inhibe la prolifération des LT et
LB (Kehrl, Roberts et al. 1986; Kehrl, Wakefield et al. 1986) et la production ou l’effet des
cytokines IFN-γ, TNF-α, TNF-β et IL-2 (Espevik, Figari et al. 1987). Par contre son effet sur
les macrophages est beaucoup plus complexe : il exerce un pouvoir chémoattractant sur ces
derniers tout en les inactivant de leurs fonctions lorsqu’ils sont différenciés (Tsunawaki,
Sporn et al. 1988). Des souris traitées avec un anticorps anti-TGF-β développent une maladie
plus sévère alors que l’administration de TGF-β réduit la sévérité de la maladie (Kuruvilla,
Shah et al. 1991; Racke, Dhib-Jalbut et al. 1991; Racke, Cannella et al. 1992). Des
expériences d’induction de tolérance chez des animaux ayant reçu des antigènes de la myéline
par voie orale ont aussi permis de montrer l’importance du TGF-β dans la régulation de
l’EAE. Des LT produisant du TGF-β apparaissent chez des rats entrant en rémission
spontanée, ces cellules inhibant la production d’IFN-γ par les LT pathogéniques. Ceci suggère
ainsi un rôle de régulation directe du TGF-β sur les LT encéphalitogènes (Racke, Dhib-Jalbut
et al. 1991).
L’IL-10 :
Une autre cytokine produite par les LT-CD4+ de type Th2 et Th0, les LB ainsi que par
les macrophages activés (Mosmann 1994) semble désormais jouer clairement un rôle dans la
différenciation des cellules T-CD4+ en cellules Th1 ou Th2 : l’IL-10.
Quant à son rôle dans la pathologie, il a été montré que l’ARNm pour l’IL-10 atteignait
son maximum d’expression lorsque débutait l’épisode de rémission (Kennedy, Torrance et al.
143
1992; Issazadeh, Ljungdahl et al. 1995; Tanuma, Kojima et al. 1997). De plus il semble que
l’expression de cet ARNm décroisse dans le sang périphérique des patients atteints de SEP
avant les épisodes de rechute. Cependant, un autre groupe ne trouve aucune corrélation entre
ce niveau d’expression de l’ARNm et les phases de rémission de la maladie. Au contraire, ces
auteurs trouvent que l’ARNm de l’IL-10 est induit rapidement après les premiers signes
cliniques de l’EAE et que son expression reste relativement stable durant la phase chronique
de la maladie (Begolka and Miller 1998).
Des résultats contradictoires ont également été trouvés pour les études in vivo. L’équipe
de Rott démontre que l’administration d’IL-10 durant la phase d’induction de l’EAE peut
supprimer l’apparition des signes cliniques chez le rat (Rott, Fleischer et al. 1994) alors que
l’équipe de Cannelle montre que l’injection d’IL-10 chez les souris exacerbe le
développement de la maladie.
Une étude très récente s’est intéressée aux effets différentiels du traitement à l’IFN-β
dans une cohorte de patients atteints de SEP et chez des animaux développant une EAE suite
à un transfert adoptif de Th1 ou Th17 spécifiques de la myéline. Cette équipe a ainsi montré
que le traitement à l’IFN- β améliorait l’EAE induite par les Th1 alors qu’elle intensifiait celle
induite par les Th17. Or la différence majeure entre les deux groupes (Th1 et Th17) est la
synthèse d’Il-17 et d’IL-10 dont la synthèse est augmentée après le traitement. Chez les
patients, les mêmes résultats ont été retrouvés à savoir que les patients non-répondeurs au
traitement IFN-β avaient des taux élevés d’IL-17F endogène (Wekerle and Hohlfeld).
L’IL-4 :
Même si l’IL-4 est la cytokine cruciale pour la différenciation des LT en Th2 (Swain,
Weinberg et al. 1990; Seder, Paul et al. 1992), l’inhibition ou l’élimination de cette cytokine
n’ont révélé jusqu’à présent que des effets modestes sur le développement de la maladie,
comme l’administration directe d’IL-4 recombinante qui réduit la sévérité de la maladie
(Racke, Bonomo et al. 1994). Par l’étude de souris déficientes pour l’IL-4, il a été montré que
ces souris, sur fond génétique PL/J, développaient une maladie similaire à celle des souris
contrôles (Liblau, Steinman et al. 1997). De plus, Estelle Bettelli a montré que le transfert de
Th2 spécifiques d’auto-antigènes qui produisaient de l’IL-4 et de l’IL-10 pouvait prévenir ou
réverser une EAE. Ces résultats ont été confirmés par l’utilisation de souris déficientes pour
ces deux cytokines montrant que les souris déficientes pour l’IL-10 étaient plus susceptibles et
développaient une EAE plus sévère. Par contre les souris déficientes en IL-4 développaient
une EAE similaire à des souris contrôles (Bettelli, Das et al. 1998).
144
d. Pathogenèse
FIGURE 26 : schéma récapitulatif de la pathogenèse de la SEP et EAE (Goverman
2009)
Activation des LT-CD4+ (rouge) : Les LT-CD4+ sont activés en périphérie par les cellules
dendritiques présentant des épitopes de la myéline. Les APC résidentes du SNC peuvent capturer les
antigènes de la myéline in situ et migrer vers les ganglions lymphatiques cervicaux. Parallèlement, les
antigènes solubles de la myéline peuvent être drainés du SNC vers les ganglions lymphatiques et être
phagocytés par les APC locales (1). Les LT-CD4+ entrent dans l’espace sous-arachnoïdien en
traversant les plexus choroïdes ou les veinules méningées (2). Les LT sont alors réactivés dans cet
espace par les macrophages exprimant les molécules de CMH de classe II et par les CD exprimants
les épitopes de la myéline (3). Ces LT réactivés vont à leur tour activer les cellules microgliales qui
vont elles-même activer d’autres cellules microgliales distales (4). Les LT ainsi activés vont pouvoir
également adhérer et traverser la barrière hémato-encéphalique, entrer dans l’espace périvasculaire
et être réactivés par les macrophages périvasculaires et les cellules dendritiques (5). Les LT pénètrent
alors dans le parenchyme et ensemble, avec les macrophages et les cellules microgliales activées, vont
sécréter des médiateurs solubles responsables de la démyélinisation (6). Activation des LT-CD8+
(bleu) : les LT-CD8+ sont activés par présentation croisée dans les ganglions drainants via les CD
(1). Les étapes 2 à 5 sont les mêmes que pour les LT-CD4+. Cependant, les LT-CD8+ sont uniquement
activés par les macrophages, cellules microgliales et CD par présentation croisée. Les cellules
endothéliales peuvent directement présenter l’antigène si elles ont accès aux épitopes de la myéline
(6). Toutes ces cellules sécrètent ainsi des médiateurs solubles (7). Les LT-CD8+ peuvent également
directement lyser les oligodendrocytes et les neurones exprimant les molécules de CMH de classe I et
les épitopes de la myéline.
145
Nous venons de voir que la SEP est une maladie particulièrement complexe, faisant
intervenir des acteurs multiples qui combinent leurs actions [figure 26]. D’une manière
générale, on peut constater un déroulement en deux phases de la maladie : une phase
d’induction et effectrice ou poussées et une phase de rémission. Durant la phase d’induction,
les LT-CD4+ s’activent en périphérie, par exemple par des antigènes viraux, et migrent vers le
SNC. Leur état d’activation leur permet de passer la barrière hémato-encéphalique et d’entrer
dans le tissu, où ils vont être réactivés par les cellules présentatrices locales, macrophages et
cellules dendritiques. Ces acteurs de l’activation ainsi que les LT-CD4+ eux-mêmes vont
sécréter des facteurs recrutant les autres populations du système immunitaire comme les LTCD8+. Ainsi les LT-CD4+ auraient un rôle d’orchestration de la réponse effectrice, alors que
les autres acteurs comme les macrophages, les anticorps, les facteurs solubles, …
participeraient à la dégradation de la myéline. Après cette phase inflammatoire traduite sur le
patient par une poussée, survient en général une phase de récupération ou « rémission » dont
les mécanismes ne sont pas totalement caractérisés. Quelques hypothèses ont été émises
comme : la réduction de l’inflammation par apoptose des cellules immunes activées dans le
SNC (Suvannavejh, Dal Canto et al. 2000), la production de cytokines protectrices (Khoury,
Hancock et al. 1992). Cependant, des facteurs, eux aussi non déterminés, aboutissent,
quelques semaines à quelques mois voire années plus tard, à la formation d’une nouvelle
plaque dans une autre zone du SNC et/ou dans une région déjà précédemment affectée.
146
LES MODELES D’AUTOD’AUTOIMMUNITE DU SYSTEME
NERVEUX CENTRAL
1. Elaboration des modèles d’auto-immunité dans le SNC
a.
Les outils expérimentaux
L’étude du système immunitaire chez les vertébrés nécessite des modèles animaux
appropriés. Le choix de l’animal dépend de sa pertinence pour atteindre un but de recherche
particulier. Dans la plupart des recherches en immunologie, la souris est l’animal
expérimental de choix. Elle est facile à manipuler, elle est génétiquement bien caractérisée et
elle a un cycle de reproduction rapide. Un autre aspect très avantageux chez la souris pour les
immunologistes : la création de souches consanguines qui réduisent les variations
expérimentales provoquées par les différences dans le génome des animaux expérimentaux.
Des animaux génétiquement identiques sont ainsi produits par croisement de souris de même
souche. De cette façon, l’hétérozygotie des allèles normalement rencontrée chez les souris
accouplées au hasard est remplacée par une homozygotie au niveau de tous les locus. Ces
modèles servent ainsi à étudier, aux vues de la syngénie de ces animaux, les caractères
immunologiques dans un contexte génétique fixé.
Des dysfonctionnements auto-immuns semblables à certaines maladies auto-immunes
humaines peuvent être induits expérimentalement chez certains animaux. Plusieurs méthodes,
génétiques ou cellulaires, sont aujourd’hui disponibles.
Au plan génétique, nous pouvons citer les transferts de gènes isolés et clonés grâce à
l’utilisation des techniques d’ADN recombinant. L’expression et la régulation de ces gènes
ont été étudiées en les introduisant dans des cellules de mammifère en culture et plus
récemment dans des lignées germinales d’animaux. Ce qui nous intéresse ici est le transfert de
gènes clonés dans des embryons de souris qui permet la création de souris transgéniques et
l’étude de la fonction du gène in vivo. En construisant un transgène avec un promoteur
147
particulier, il est ainsi aisé de contrôler l’expression de ce transgène donné. Par exemple, les
souris transgéniques porteuses d’un transgène lié au promoteur de la MOG expriment le
transgène dans le SNC au niveau des oligodendrocytes, mais pas dans les autres tissus. Étant
donné qu’un transgène est intégré dans l’ADN chromosomique des embryons de souris au
stade d’une cellule, il sera intégré à la fois dans les cellules somatiques et dans les cellules de
la lignée germinale. Les souris transgéniques résultantes pourront donc transmettre le
transgène à leur descendance comme un trait mendélien. Toute une variété de telles lignées
transgéniques sont couramment disponibles et largement utilisées dans la recherche
immunologique. Parmi ces dernières figurent des lignées porteuses de transgènes qui codent
des immunoglobulines, des récepteurs T, des molécules de CMH de classe I ou de classe II,
de nombreuses cytokines avec divers antigènes étrangers.
Cependant une des limitations des souris transgéniques est que le transgène est intégré
au hasard dans le génome. Ceci signifie que certains transgènes s’insèrent dans des régions de
l’ADN qui ne sont pas transcriptionnellement actives et où donc le gène ne pourra pas être
exprimé. Pour contourner cette limitation, une technique a été développée, permettant à un
gène choisi d’être dirigé vers des sites spécifiques au génome d’une souris. L’utilisation
essentielle de cette technique a été de remplacer un gène normal par un allèle mutant ou une
forme altérée du gène, invalidant ainsi la fonction du gène. Les souris transgéniques qui
portent un tel gène invalidé sont appelées souris knock-out. Outre cette délétion d’un gène
sélectionné, il est aussi possible de remplacer le gène endogène par une forme mutée de ce
gène. Comme dans la stratégie d’invalidation d’un gène, des constructions d’ADN qui portent
des mutations d’un gène particulier peuvent être échangées avec le gène endogène. Ce sont les
souris knock-in. Récemment, en plus de ces délétions de gènes par criblage, de nouvelles
stratégies expérimentales qui permettent la délétion spécifique d’un gène à étudier dans un
tissu précisément choisi ont été élaborées. Ces techniques s’appuient sur l’utilisation de
recombinases spécifiques de sites provenant de bactéries ou de levures. Le système le plus
fréquemment utilisé est le sytème Cre/lox. La recombinase Cre, isolée du bactériophage P1,
reconnaît un site spécifique de l’ADN de 34pb connu sous le nom de loxP et catalyse la
recombinaison. Par conséquent les séquences d’ADN flanquées par loxP sont reconnues par
Cre et l’évènement de recombinaison se traduit par la délétion des séquences d’ADN
intercalées. La réelle innovation de cette technique est que l’expression du gène de la
recombinase Cre peut être contrôlée par l’utilisation d’un promoteur spécifique de tissu.
148
Sur le plan cellulaire, une technique de transfert adoptif peut permettre d’étudier des
populations isolées de cellules in vivo. Pour cela, plusieurs outils sont nécessaires comme les
cultures primaires de cellules immunes dérivées du sang ou des organes lymphoïdes, les
lignées cellulaires lymphoïdes clonées ou hybrides, ou encore l’utilisation de l’irradiation
pour détruire le système
lymphoïde ou hématopoïétique (suivant la dose d’irradiation
utilisée).
b.
Applications au SNC
i. Généralités
Si parmi les modèles animaux de maladies auto-immunes du SNC, les modèles
spontanés, malheureusement peu nombreux, sont théoriquement les plus intéressants pour
l’analyse des mécanismes lésionnels dans leur ensemble, d’autres modèles n’en restent pas
moins utiles pour la compréhension des phénomènes d’auto-immunité, la mise au point et
l’évolution de nouvelles approches thérapeutiques.
L’on peut citer par exemple les modèles de transfert à l’animal par des injections
d’anticorps humains, ou les modèles induits par l’injection d’un auto-Ag, provoquant une
activation et une prolifération de ces lymphocytes avec une réaction auto-immune au site
anatomique de l’antigène. Il existe également des systèmes de croisement où des souris
knock-out sont créées déficientes pour un gène. Il existe ainsi des souris déficientes en LTCD4+ ou en LT-CD8+, pour des cytokines… Leur croisement avec des souris développant une
pathologie auto-immune peut permettre d’approcher le rôle des gènes invalidés. Cependant,
les plus utilisés restent les modèles transgéniques pour le TCR ou le BCR. Les gènes codant
pour les récepteurs T ou les immunoglobulines correspondantes peuvent être séquencés et
introduits par transgénèse dans le génome des animaux, ces animaux pouvant, spontanément
ou secondairement après injection des antigènes, développer des phénomènes auto-immuns.
Avant de citer différents modèles animaux, il est intéressant de souligner que c’est grâce
à un modèle animal de lapin d’une maladie auto-immune non pas du SNC mais du système
nerveux périphérique que le mimétisme moléculaire (un des mécanismes plausibles de
l’explication de la cause des maladies auto-immunes) a été décrit.
149
ii. Quelques exemples
En ce qui concerne l’auto-immunité du SNC, nous connaissons aujourd’hui plusieurs
maladies auto-immunes qui affectent cet organe et qui sont sujettes à des recherches sur des
modèles animaux.
Pour citer un exemple de maladie auto-immune du SNC spontanée nous pouvons
décrire les modèles animaux donnant une neuropathie optique spontanée ou la maladie de
DEVIC. En effet, pour plus de 50% des animaux MOG35-55-TCR Tg (souris transgénique pour
le TCR reconnaissant l’épitope 35-55 de la MOG), il y a développement de cette maladie
spontanément (Krishnamoorthy, Lassmann et al. 2006). Cette neuromyélite optique de Devic
ou NMO a également été caractérisée par immunisation de Rats Norway . Les cerveaux, nerfs
optiques et moelles épinières de ces rats ont été étudiés par histochimie et les résultats ont
montré chez ces animaux immunisés avec la MOG développaient une névrite optique sans
atteinte encéphalique. L’expression de l’aquaporine-4 (AQP4) et du principal marqueur
astrocytaire était diminuée dans les nerfs optiques atteints et augmentée dans certaines régions
médullaires démyélinisées. Cet anticorps anti-AQP4 a également été détecté dans le plasma
des rats malades dirigés contre différentes structures de l'AQP4. Ce modèle remplit donc les
critères actuels de NMO et est associé à la présence d’anticorps anti-AQP4. Ce modèle de
NMO induit par la MOG est ainsi un outil intéressant pour étudier le lien entre l’AQP4 et la
démyélinisation
et
évaluer
de
nouvelles
thérapeutiques
immunomodulatrices
ou
immunosuppressives.
Un autre exemple d’une maladie auto-immune qui atteint le système nerveux central est
le lupus érythémateux disséminé (LED) où il existe également des modèles animaux de
maladie spontanée. En effet si les souris de souche NZB sont croisées avec des souris NZW
alors la génération issue de ce croisement développera un LED spontanément. L’analyse des
modèles animaux murins (souris SCID déficientes en LT et LB) a permis de montrer que
l’injection d’autoanticorps anti-ADN double-brin provenant de patients lupiques provoquait
une protéinurie et des dépôts glomérulaires d’immunoglobulines chez certaines de ces souris.
L’un des premiers modèles de maladie auto-immune induite expérimentalement décrit a
été découvert par hasard en 1973 lorsque des lapins ont été immunisés avec des récepteurs
nicotiniques de l’acétylcholine isolés des anguilles électriques. Les animaux développaient
rapidement une faiblesse musculaire semblable à celle rencontrée dans la myasthénie. Les
150
auteurs ont montré que cette myasthénie auto-immune expérimentale se développait lorsque
les anticorps contre le récepteur à l’acétylcholine bloquaient la stimulation du muscle par
l’acétylcholine au niveau de la jonction neuro-musculaire. Dans l’année qui a suivi, ce modèle
a prouvé sa valeur lorsqu’on a découvert que les auto-anticorps dirigés contre ce récepteur
étaient la cause de la myasthénie chez l’homme.
L’EAE dont nous avons décrit les mécanismes d’induction et les similarités avec la SEP
dans le chapitre précédent est un autre modèle animal qui a considérablement augmenté la
compréhension de l’auto-immunité. L’immunisation de souris avec les protéines mineures de
la myéline du SNC injectées avec de l’adjuvant de Freund entraîne une affection
démyélinisante, apparentée à la SEP. Des souris transgéniques pour un récepteur T spécifique
d’un peptide de la myéline ont un développement quasi normal. Si on injecte le peptide MOG
spécifique à ces souris transgéniques, elles développent une maladie fulgurante
démyélinisante alors que les souris non transgéniques sont peu touchées. Les premières
souris ainsi transgéniques pour les gènes réarrangés du TCR (appelées souris TCR
transgéniques) ont été utilisées simultanément par deux groupes en 1988 (Kisielow,
Bluthmann et al. 1988). Différentes souris TCR transgéniques ont ensuite été développées
comme modèles de maladies auto-immunes. Ces différentes souris TCR transgéniques
expriment un TCR réarrangé spécifique d’un auto-antigène. Par exemple, les souris BDC2.5 et
NY4.1 ont servi à la compréhension des mécanismes impliqués dans le déclenchement du
diabète. Ces souris BDC2.5 et NY4.1 expriment chacune un TCR provenant d’un clone LTCD4+ spécifique d’un antigène inconnu des îlots de Langherans du pancréas, présenté dans le
contexte de la molécule du CMH I-Ag7 (Katz, Wang et al. 1993). Diverses souris TCR
transgéniques ont été établies dans le but d’offrir un modèle spontané d’EAE, afin de se
rapprocher des conditions conduisant au déclenchement de la SEP. Alors que le ou les autoantigènes reconnus dans les modèles transgéniques de diabète auto-immun ne sont pas
connus, les LT provenant des souris TCR transgéniques générés comme modèle de SEP
reconnaissent des antigènes du SNC bien définis. En effet, ces souris expriment chacune un
TCR différent provenant de clones LT CD4+ spécifiques d’épitopes immunodominants des
protéines associées à la gaine de myéline (MBP et PLP). En fonction du modèle, les souris
développent une maladie spontanée à partir de 6 semaines ou le plus souvent à partir de 4 à 5
mois. Les souris transgéniques pour un TCR spécifique de la MBP développent une maladie
avec une incidence de 0 à 14% (Goverman, Woods et al. 1993; Lafaille, Nagashima et al.
1994; Liu and Wraith 1995). Un plus grand pourcentage (40%) de souris transgéniques pour
un récepteur spécifique de la PLP développe spontanément l’EAE (Waldner, Whitters et al.
151
2000). La maladie se caractérise par l’infiltration des LT exprimant le transgène dans le SNC,
la formation de foyers inflammatoires et de plaques de démyélinisation. Lorsque ces souris
sont immunisées avec le peptide spécifique, elles développent une maladie plus sévère et plus
rapide que les souris non transgéniques.
Cependant, l’incidence de la maladie n’atteignant jamais les 100% dans tous ces
modèles, l’on peut suggérer, comme pour les maladies auto-immunes humaines, un rôle non
négligeable de l’environnement dans le déclenchement de la maladie. De plus, des études sur
des souris de fond génétique Rag déficiente, où tous les LT expriment le TCR transgénique
sans association avec des chaînes TCRα endogènes réarrangées, suggèrent que les LT ayant
d’autres spécificités peuvent contrebalancer le pouvoir pathogénique des LT réactives.
2 . Les différents modèles utilisés
a.
Souris TCR transgéniques
i. Souris CL4 – TCR Tg
Les souris CL4-TCR (Clone-4 TCR) sont transgéniques pour un récepteur à l’antigène
des LT spécifiques du peptide 512-520 de l’hémagglutinine (HA512-520) du virus influenza
restreint par la molécule de CMH de classe I, Kd (Morgan, Liblau et al. 1996). La chaîne β du
transgène résulte du réarrangement Vβ8.2 - Dβ1 - Jβ1.4 et la chaîne α du réarrangement
Vα10.3 - Jα34. Ce Clone-4 TCR a été obtenu via des clones CTL dérivés de souris B10.D2
préalablement immunisées avec le virus Influenza A/PR/8.
L’ADN complémentaire de ce
clone a été inséré dans des vecteurs TCR-α et TCR-β. Ces constructions ont ensuite été
microinjectées dans des oocytes de souris fertilisée H-2bxd (C57Bl/6 x Balb/c). Cette
coinjection, comme nous l’avons vu précedémment, des deux plasmides résultent en
l’incorporation des deux gènes. Ces souris sont désormais maintenues par croisement sur le
fond génétique BALB/c.
152
Chez ces souris, le rapport CD4/CD8 est inversé. On retrouve en effet 2 à 5 fois plus
de LT-CD8+ que de LT-CD4+ et environ 95% de ces CD8+ sont spécifiques du peptide 512520. Ces LT expriment des marqueurs d’activation après stimulation in vitro avec l’antigène
en présence de cellules présentatrices d’antigène et prolifèrent in vitro en réponse au peptide.
Ces souris ont été à l’origine de l’élaboration d’un modèle auto-immun spontané de
diabète néonatal (Morgan, Liblau et al. 1996). Plus récemment, elles ont, entre autres, permis
d’étudier le rôle des LT-CD8+ dans l’inflammation du SNC par transfert adoptif dans des
souris GFAP-HA (souris transgéniques qui expriment HA sous contrôle du promoteur
spécifique des astrocytes), LT-CD8+ qui peuvent induire une inflammation monophasique du
cerveau chez des souris immunocompétentes (Cabarrocas, Savidge et al. 2003).
ii. Souris 6.5 –TCR Tg
Les souris 6.5-TCR sont transgéniques pour un récepteur à l’antigène des LT
spécifiques du peptide 110-119 de l’hémagglutinine (HA110-119) du virus influenza restreint
par la molécule de CMH de classe II, I-Ed (Kirberg, Baron et al. 1994). La chaîne β du
transgène résulte du réarrangement Vβ8.2 - Jβ2.1 et la chaîne α du réarrangement Vα4 - Jα2.
Les gènes TCR-α et TCR-β réarrangés issus de l’hybridome 14.3.d spécifiques du peptide
110-119 de l’hémagglutinine du virus influenza ont été microinjectés dans des oocytes de
souris fertilisée C57Bl/6 x DBA/2J. Ces souris sont maintenues par croisement sur le fond
génétique BALB/c.
Chez ces souris, le TCR transgénique est exprimé à la surface des LT-CD4+ dont 20%
sont spécifiques du peptide 110-119. Mais il est aussi exprimé à la surface des LT-CD8+. Ces
LT expriment des marqueurs d’activation après stimulation in vitro avec l’antigène en
présence d’APC et prolifèrent in vitro en réponse au peptide.
Des études récentes avec ces souris ont contribué à la compréhension du mécanisme
régulateur induit par les LT, en montrant que ces souris 6.5-TCR Tg croisées avec des souris
GFAP-HA développaient des mécanismes tolérogènes qui protégeaient les souris doubles
transgéniques issus de ce croisement. En particulier le fait que les cellules T régulatrices
issues de la souris 6.5-TCR Tg inhibaient la sécrétion d’IFN-γ produit par les LT-CD8+
spécifiques du même antigène (Cabarrocas, Cassan et al. 2006).
153
b. Souris MOG-HA
Ces souris sont des souris doubles transgéniques permettant l’expression conditionnelle
de HA dans un type cellulaire spécifique, les oligodendrocytes. Elles sont issues du
croisement des souris MOG-Cre où la recombinase Cre est sous la dépendance d’un
promoteur spécifique (MOG) avec les souris Rosa26-HA dans lesquelles l’ADNc de HA est
inséré dans le locus Rosa 26 et encadré d’une cassette STOP. Ainsi à l’issue de ce croisement,
la recombinase Cre permet l’ablation de la cassette STOP au niveau des sites loxP et la souris
double transgénique Rosa26-HA/Cre appelée souris MOG-HA peut initier la transcription de
HA uniquement dans le type cellulaire particulier correspondant au promoteur permettant
l’expression de Cre, ici MOG [figure 27].
souris Knock In
Rosa 26 LoxP-STOP-LoxP-HA
–
–
–
souris MOG x - Cre :
promoteur MOG
CRE
X
STOP
pROSA26 loxP
HA
loxP
.
é
Expression de HA spécifique
aux oligodendrocytes
HA
pROSA26loxP
FIGURE 27 : souris MOG-HA : réalisation d’une souris double transgénique permettant
l’expression conditionnelle de HA spécifiquement dans les oligodendrocytes.
i. Souris MOG-Cre
La phase ouverte de lecture de Cre a été introduite dans le premier exon du gène MOG
suivi directement par un signal de polyadénylation de l’hormone de croissance humaine. Le
gène de résistance à la néomycine ainsi que le gène de la thymidine kinase ont été
sélectionnés comme marqueur de sélection positif et négatif respectivement. Ainsi, des
cellules souches embryonnaires (cellules ES) dérivées de souris C57Bl/6 ont été transfectées
154
avec le vecteur cible de manière classique. Les cellules ES qui portaient l’insertion ont été
injectées dans des blastocystes CB20 pour générer les souris MOG-Cre (Hovelmeyer, Hao et
al. 2005) [figure 28] . Ces souris ont été maintenues par croisement sur le fond génétique
BALB/c puis par accouplement croisé afin d’obtenir des souris MOG-Cre homozygotes.
Vecteur
Locus
Recombinaison homologue
Locus
FIGURE 28 : schéma de la construction de la souris transgénique MOG-Cre
La phase ouverte de lecture de Cre a été introduite dans le premier exon du gène
MOG suivi directement par un signal de polyadénylation de l’hormone de croissance
humaine. Le gène de résistance à la néomycine ainsi que le gène de la thymidine kinase
ont été sélectionnés comme marqueur de sélection positif et négatif respectivement. Ainsi,
des cellules souches embryonnaires (cellules ES) dérivés de souris C57Bl/6 ont été
transfectées avec le vecteur cible de manière classique. Les cellules ES qui portaient
l’insertion ont été injectées dans des blastocystes CB20 pour générer les souris MOGCre
ii. Souris Rosa26-HA
Une cassette d’expression conditionnelle, englobant la phase ouverte de lecture de HA
placée en 3’ d’une séquence STOP et contenant le gène de résistance à la néomycine et des
sites de polyadénylation du SV40 encadrée de site LoxP a été insérée dans les sites PacI-AscI
du vecteur pROSA26PA (Srinivas, Watanabe et al. 2001). Le vecteur cible a ensuite été
électroporé dans les cellules ES 129SV. Deux des cellules souches ayant une recombinaison
homologue correcte ont été injectées dans des blastocystes C57Bl/6. Ces souris knock-in
référées comme Rosa26tm(HA)1Lib ont été croisées sur plus de sept générations sur le fond
génétique Balb/c (Saxena, Bauer et al. 2008) [figure 29].
155
FIGURE 29 : : schéma de la construction de la souris transgénique RoSA26-HA .
Une cassette d’expression conditionnelle, englobant la phase ouverte de lecture de
HA placée en 3’ d’une séquence STOP et contenant le gène de résistance à la néomycine et
des sites de polyadénylation du SV40 encadrée de site LoxP a été insérée dans les sites PacIAscI du vecteur pROSA26PA (srinivas, costantini, 2001). Le vecteur cible a ensuite été
électroporé dans les cellules ES 129SV. Deux des cellules souches ayant une recombinaison
homologue correcte ont été injectées dans des blastocystes C57Bl/6. Ces souris knock-in
référées comme Rosa26tm(HA)1Lib ont été croisées sur plus de sept générations sur le fond
génétique Balb/c
iii. Souris MOG-HA
Des expériences antérieures réalisées au laboratoire ont montré chez ces souris des
résultats intéressants au niveau immunologique. En effet, lorsque ces souris sont croisées avec
les souris TCR transgéniques (CL4-TCR ou 6.5 TCR), une ignorance de l’antigène a été
observée. Ces animaux triples transgéniques ne développent aucun signe clinique
neurologique et leur profil thymique n’est pas modifié par rapport à des souris contrôles. En
effet, ces souris présentent le même pourcentage et nombre absolu de lymphocytes DN, DP et
SP que des souris MOG-HA.
Par contre, lorsque l’on procède à des transferts adoptifs de cellules T activées les
résultats sont tout autres. Lorsque ces souris MOG-HA reçoivent des LT-CD4+ activés
(culture cellulaire réalisée à partir des organes lymphoïdes des souris 6.5-TCR Tg), les
animaux présentent au niveau histologique des infiltrations T dans le SNC ainsi que quelques
zones d’inflammation. Lorsque ces souris reçoivent des LT-CD8+ activés (culture cellulaire
réalisée à partir des organes lymphoïdes des souris CL4-TCR Tg), l’on observe alors au
niveau histologique une inflammation du SNC avec une infiltration des LT et des zones de
démyélinisation. Dans 30% des cas les animaux développent aussi des signes cliniques
neurologiques avec une perte de poids (Saxena, Bauer et al. 2008).
156
OBJECTIFS
Dans ce contexte de l’immuno-pathologie de la SEP, ma thèse contribuera, à l’aide de
différents modèles murins, à la compréhension d’une maladie auto-immune du SNC induite
par les LT-CD8+.
Le modèle repose sur l’utilisation de souris transgéniques MOG-HA, souris permettant
l’expression de l’Hémagglutinine (HA) du virus Influenza comme néo-auto-antigène
uniquement par les oligodendrocytes et par l’utilisation de transfert adoptif de Tc1
reconnaissant spécifiquement un pepetide de HA. Ces LT-CD8+ acivés in vitro sont issus de
souris CL4-TCR transgéniques.
La SEP étant une maladie multifactorielle faisant intervenir de nombreuses cellules de
l’immunité tant innée qu’adaptative, mon travail de thèse s’intéresse aux influences d’autres
facteurs de l’immunité adaptative sur la maladie expérimentale induite par ces Tc1.
Mon premier objectif est donc d’analyser l’influence de la population Th1, LT-CD4+
issus de souris 6.5-TCR transgéniques et activés in vitro, sur cette maladie induite par les Tc1.
Cette analyse se fera tant au niveau clinique (suivi des animaux au niveau pondéral et
moteur), histologique (coupes de cerveaux, moelle épinière et nerf optique) que fonctionnel
(analyse en cytométrie de flux des populations infiltrantes du SNC) à différents temps de la
maladie.
Mon second objectif est d’analyser l’influence des anticorps démyélinisants sur la
maladie induite par les Tc1. Cette analyse se basera sur des observations histologiques à
différents temps.
157
MATERIELS
ET
METHODES
158
MATERIELS ET METHODES
Les souris
Les souris Balb/c sauvages :
Elles sont achetées à l’âge de 8 semaines chez Janvier (Le genest-Saint-Isle, France).
Les souris Balb/c CL4-TCR transgéniques :
Elles ont été générées par Sherman (J Immunol. 1996 Aug 1;157(3):978-83. Sherman
LA. Californie). L’élevage est maintenu par croisements de souris CL4-TCR avec des souris
Balb/c sauvages. Les descendants sont phénotypés par marquage en cytométrie en flux des
lymphocytes sanguins avec des anticorps anti-CD8 PE et anti-Vβ8 FITC. Les animaux
transgéniques seront ainsi CD8+ et Vβ8+.
Les souris Balb/c 6.5-TCR transgéniques :
Elles ont été générées par Von Boehmer (J Exp Med. 1994 Jul 1;180(1):25-34.Suisses).
L’élevage est maintenu par croisements de souris 6.5-TCR avec des souris Balb/c sauvages.
Les descendants sont phénotypés par marquage en cytométrie en flux des lymphocytes
sanguins avec des anticorps anti-CD4 PE et anti-Vβ8 FITC. Les animaux transgéniques seront
ainsi CD4+ et Vβ8+.
Les souris Balb/c MOG-Cre transgéniques :
Elles ont été générées par Waisman (J Immunol. 2005 Nov 1;175(9):5875-84.). Elles
ont été accouplées avec des souris Balb/c sauvages ; les F1 MOG-Cre+/- sont accouplés entre
eux afin d’obtenir des descendants homozygotes MOG-Cre+/+. L’élevage est ainsi maintenu
par croisements de souris MOG-Cre+/+ avec des souris MOG-Cre+/+. Les descendants sont
génotypés par deux PCR sur de l’ADN extrait de fragment de queue. L’amplification du
fragment du gène MOG : sens : 5’-GACAATTCAGAGTGATAGGACCAGGGTATC–3’,
antisens : 5’- GGTCAATCTACCTACAGGTCATTTGA- 3’ ; amplification du fragment du
gène
Cre :
sens :
5’
–
TCCAATTTACTGACCGTACAC-3’,
antisens :
5’-
CATCAGCTACACCAGAGACGGAAATC–3’ ; 94°C 2min, 94°C 30 sec, 55°C 30sec, 72°C
35sec, 35 cycles, 72°C 10min.
159
Les souris Balb/c Rosa26-HA :
Elles ont été générées par le laboratoire. Elles sont maintenues par croisements avec des
souris Balb/c sauvages. Les descendants sont génotypés par une PCR détectant le gène HA
sur de l’ADN extrait de fragment de queue. L’amplification du fragment du gène HA : sens :
5’-
TGAAAGGACTCTGGATTTCCATGAC-3’,
antisens
:
5’
–
CAGAAACTGATTGCCCCCAGG-3’ ; 94°C 2min, 94°C 30 sec, 55°C 30sec, 72°C 35sec, 35
cycles, 72°C 10min.
Les souris Balb/c MOG-HA :
Elles sont issues du croisement des souris Balb/c Rosa26-HA transgéniques par des
souris Balb/c MOG-Cre+/+ transgéniques. Les descendants sont génotypés par une PCR HA
sur de l’ADN extrait de fragment de queue.
Les élevages, les croisements décrits ci-dessus, et l’expérimentation, sont réalisés au
sein de l’animalerie EOPS de l’IFR30, dirigées par Mme Calise. Les souris sont manipulées
entre 7 et 16 semaines. Nos protocoles sont validés par le comité régional d’éthique sur
l’expérimentation animale de Midi-Pyrénées.
Extraction d’ADN pour le génotypage des souris :
Les prélèvements de queues de souris sont incubés dans du tampon de lyse contenant
50mM de TRIS HCL pH=8, 50mM d’EDTA et 0,5% de SDS avec de la protéinase K à 55°C
toute la nuit.
L’ADN du lysat est ensuite extrait avec un mélange volume à volume de
phénol/chloroforme et précipité avec de l’acétate d’ammonium 10M (0,2 volume) et de
l’EtOH 100% (2 volumes). Les culots sont alors ressuspendus dans du TRIS 5mM pH=8 et
conservés à 4°C durant 24H puis à –20°C.
Les milieux de cultures :
Les milieux dit « complets » sont :
-
du RPMI 1640 (Invitrogen, Cergy Pontoise, France) additionné de 10% SVF (Serum
de Veau Fœtal, Invitrogen) décomplémenté par la chaleur, de glutamax 1X (Invitrogen), de
100U/mL Penicilline-Streptomycine (Eurobio, Courtaboeuf, France), de 10mM Hépès
(Invitrogen), de 1mM pyruvate de sodium (Invitrogen) et de
(Sigma-Aldrich Chimie).
160
50µM β-mercaptoéthanol
-
du DMEM + GlutaMAXTM-I (Invitrogen, Cergy Pontoise, France) additionné de
10% SVF (Serum de Veau Fœtal, Invitrogen) décomplémenté par la chaleur, de 100U/mL
Penicilline-Streptomycine (Eurobio, Courtaboeuf, France), de 10mM Hépès (Invitrogen), de
1mM pyruvate de sodium (Invitrogen) et de
50µM β-mercaptoéthanol (Sigma-Aldrich
Chimie).
Les anticorps :
Marquage :
Les anticorps utilisés au 1/200 pour le marquage en cytométrie en flux proviennent de :
-
BD Pharmingen (San Diego, California, USA) : Vβ8-FITC (F23.1), CD69-PE
(H1.2F3), CD107a-PE (1D4B), IFNγ-PE, IFNγ-APC, TNFα-APC, CD8-APC (53-6.7), CD4PercpCy5.5 (RMA4-5), CD8-PercpCy5.5 (53-6.7), CD45-PercpCy5.5 (30-F11), CD4-Pacific
Blue (RMA4-5), CD19-APCCy7 (1D3), Thy1.2-biotinylé (53-2.1), CD11b-biotinylé (M1/70),
CD69-biotinylé (H1.2F3), streptavidine-PercpCy5.5, streptavidine-PeCy7, streptavidinePeCy5, streptavidine-APC.
-
eBioscience (San Diego, California, USA) : Granzyme B PE (16G6), CD11b-FITC
(M1/70), CD11c-PE (N418), anti-CMH-II-APC (M5/114.15.2), Thy1.2-FITC (53-2.1), CD3APC (145-2C11), CD69-PerCpCy5.5 (H1.2F3), CD8-alexa700 (53-6.7), CD107a-Alexa647
(eBio1D4B).
-
Certains anticorps ont été produits par la méthode des ascites au sein du laboratoire :
CD8 (53-6.72), CD4 (GK1.5), 6.5 (anticorps anti-TCR spécifique du complexe I-Ed-HA111119).
Cet anticorps a été biotinylé au sein du laboratoire.
Injections :
Les anticorps utilisés pour l’injection en synergie avec les Tc1 sont :
-
IgG2a (clone UPC 10, Sigma)
-
Z2 (IgG2a) provenant de l’équipe de Linington à Glasgow (American Journal of
pathology, vol 143, no2, 1993)
Ces anticorps sont injectés par voie intrapéritonéale à une dose unitaire de 0,5µg par souris.
Pour les souris sacrifiée à J9, les Ac ont été injectés à J4, J6 et J8 après transfert de Tc1.
Pour les souris sacrifiée à J28, les Ac ont été injectés à J5, J8, J12 et J16 après transfert de
Tc1.
161
Les réactifs :
L’interleukine 2 (IL-2) et l’IL-12 (R&D system, Lille, France)
La ionomycine et la PMA (Sigma Aldrich Chimie, St Quentin Fallavier, France)
Peptide CL4 et peptide SFE (NeOMPS, Strasbourg, France)
Golgi Plug (BD Pharmingen (San Diego, California, USA)
Billes magnétiques Goat anti rat IgG (Miltenyi biotec, Auburn, California, USA)
G418 (Sigma Aldrich Chimie, St Quentin Fallavier, France, A1720-5G)
Culture Th1 :
Préparation des suspensions cellulaires :
Les rates et les ganglions lymphatiques périphériques sont prélevés des souris 6.5-TCR
Tg dans du milieu RPMI simple. Les organes sont dissociés mécaniquement avec un potter et
la suspension cellulaire, après lavage par centrifugation 5 minutes à 1500rpm dans du RPMI
simple, est lysée dans 10mL de solution de 0,15M de NH4Cl pendant 5 minutes à température
ambiante. Après avoir été filtré à l’aide de seringues cotonnées, le lysat est lavé par
centrifugation dans du RPMI simple puis les cellules sont comptées avec du bleu trypan à
l’aide d’une cellule de Kovacs.
Culture cellulaire (37°C – 5% CO2) :
JOUR 0 : 5 000 000 cellules/mL de milieu complet sont mis en présence de peptide
SFE (10µg/mL), d’IL2 (1ng/mL ) et d’IL12 (20ng/mL)
JOUR 2 à 5 : la confluence des cellules ainsi que leur prolifération sont vérifiées et
les cultures sont ajustées avec du milieu complet supplémenté en IL2 (1ng/mL)
JOUR 6 : Après un Ficoll (séparation des lymphocytes par gradient de densité,
centrifugation de 20 minutes à 2000rpm à 20°C sans frein, récupération de l’interface), les
cellules sont comptées et purifiées.
Sélection positive de CD4+ :
Les cellules sont alors ressuspendues à 25.106cellules/mL dans du milieu complet en
présence de l’anticorps monoclonal IgG2b de rat anti–souris CD4 biotinylé (clone GK1.5) au
1/500 durant 30 minutes à 4°C (sur un agitateur). Après lavage par centrifugation dans du
Tampon MACS (500mL PBS1X + 2% de SVF + 2mM EDTA) durant 5 minutes à 1500rpm,
les cellules sont ressuspendues à 100.106cellules/mL dans du Tampon MACS en présence de
162
billes magnétiques IgG de chèvre anti-rat couplées à la streptavidine au 1/7 durant 30minutes
à 4°C (sur un agitateur).
Séparation magnétique :
Après lavages par centrifugation des cellules et équilibrage des colonnes LS (Miltenyi
biotec) avec du tampon MACS, les cellules marquées sont purifiées sur ces colonnes. Après
cette étape d’enrichissement, les cellules sont marquées avec un anticorps anti-CD4-APC et
un anticorps anit-Vβ8-FITC pour vérifier la purification au FacsCalibur (Becton Dickinson)
du plateau technique de cytométrie de l’IFR30, dirigé par Fatima L’Faqihi Olive. La pureté
obtenue est >97% pour les LT-CD4+Vβ8+.
Préparation des APC irradiées (1 LT-CD4 pour 10 APC) :
Les APC sont préparées de la même manière que la suspension de LT à partir de
souris sauvages Balb/c. Après comptage, elles sont irradiées (irradiateur γ, 3500Rads).
Culture cellulaire (37°C – 5% CO2) :
JOUR 6 : 500 000 LT-CD4+/mL de milieu complet sont mis en présence de 5 000 000
APC/mL supplémenté en peptide SFE (10µg/mL), d’IL2 (1ng/mL ) et d’IL12 (20ng/mL)
JOUR 7 et 8: la confluence des cellules ainsi que leur prolifération est vérifiées et
les cultures sont ajustées avec du milieu complet supplémenté en IL2 (1ng/mL)
JOUR 9 : Après un Ficoll (séparation des lymphocytes par gradient de densité,
centrifugation de 20 minutes à 2000rpm à 20°C sans frein, récupération de l’interface), les
LT-CD4+ sont comptés et ressuspendus dans du PBS 1X pour injection. Une partie de ces
lymphocytes est gardée également pour vérifier l’état d’activation de ces cellules par un
marquage intracellulaire.
Culture Tc1 :
Préparation des suspensions cellulaires :
Les rates et les ganglions lymphatiques périphériques sont prélevés des souris CL4-TCR
Tg dans du milieu DMEM simple et préparés comme décrit ci-dessus.
163
Sélection positive de CD8+ :
Les cellules sont alors ressuspendues à 25.106cellules/mL dans du milieu complet en
présence de l’anticorps monoclonal IgG2a de rat anti –souris CD8 biotinylé (clone 53-6.72)
au 1/500 durant 30minutes à 4°C (sur un agitateur) puis isolées comme décrit ci-dessus.
Préparation des APC irradiées (1 LT-CD8 pour 10 APC) :
Les APC sont préparées de la même manière que la suspension de LT à partir de
souris Balb/c sauvages. Après comptage, elles sont irradiées (irradiateur γ, 3500Rads).
Culture cellulaire (37°C – 5% CO2) :
JOUR 0 : 500 000 LT-CD8+/mL de milieu complet sont mis en présence de 5 000 000
APC/mL supplémenté en peptide CL4-HA (1µg/mL), d’IL2 (1ng/mL ) et d’IL12 (20ng/mL)
JOUR 2 à 5 : la confluence des cellules ainsi que leur prolifération sont vérifiées et
les cultures sont ajustées avec du milieu complet supplémenté en IL2 (1ng/mL)
JOUR 6 : Après un Ficoll (séparation des lymphocytes par gradient de densité,
centrifugation de 20 minutes à 2000rpm à 20°C sans frein, récupération de l’interface), les
LT-CD8+ sont comptés et ressuspendus dans du PBS 1X pour injection. Une partie de ces
lymphocytes sont gardés également pour vérifier l’état d’activation de ces cellules par un
marquage intracellulaire.
Transfert adoptif des lymphocytes :
Les LT-CD8+ (Tc1) et LT-CD4+ (Th1) sont injectés par voie intraveineuse dans le sinus
veineux oculaire à une concentration de 30.106 dans 200µL de PBS1X. Lors des doubles
transferts, les souris reçoivent en premier les Th1 et les Tc1 ne sont injectés qu’au minimum
4H après.
Suivi des souris :
Evaluation des scores cliniques classiques d’EAE :
Les scores cliniques sont déterminés de façon quotidienne selon l’échelle suivant : 0 :
souris non malade ; 0,5 : faiblesse de la queue ; 1 : paralysie de la queue ; 2 : faiblesse des
pattes arrières ; 3 : paralysie des pattes arrières ; 4 : faiblesse des pattes avant ; 5 : animal
décédé ou moribond et donc euthanasié.
164
Evaluation du poids :
Les animaux sont suivis quotidiennement à la même heure et avec la même balance.
Evaluation en ROTA-ROD :
Ces souris ne développant pas systématiquement des signes classiques d’EAE, leur
performance motrice est évaluée par des tests avec une ROTA-ROD (Bioseb, Vitrolles,
France). Ces tests consistent à analyser la coordination motrice des animaux qui sont posés
sur une roue. Chaque roue voit sa vitesse de rotation augmentée de 4 à 40 rpm en 10 minutes.
Après un entraînement de 3 jours précédant les transferts adoptifs de Tc1, Th1, Tc1 et Th1 ou
de Tc1 et Ac, chaque souris s’exerce quotidiennement sur la rotarod. Chaque animal subit 4
essais, avec une pause de 20 minutes entre le deuxième et le troisième essai. Pour chaque
essai, le temps de latence avant de tomber est mesuré par un chronomètre intégré dans la
machine puis enregistré.
Histologie :
Marquage en PFA 4% :
Les souris transférées sont sacrifiées par injection IV d’une dose létale d’anesthésiques
(mélange de Rompun et kétamine 1:2), et subissent une perfusion intracardiaque de 20mL de
PBS-4%
paraformaldéhyde.
Après
fixation
par
submersion
dans
du
PBS-4%
paraformaldéhyde, les souris sont conservées dans de l’éthanol 70% à 4°C. Suivant les
expériences, les souris ont été sacrifiées à différents temps : J9, J11, J18 out J28.
Marquage en OCT :
Les souris transférées sont sacrifiées par injection IV d’une dose létale d’anesthésiques
(mélange de Rompun et kétamine 1:2), et subissent une perfusion intracardiaque de 20mL de
PBS. Les cerveaux, moelles épinières et nerfs optiques sont ensuite collectés et congelés dans
de l’OCT. Suivant les expériences, les souris ont été sacrifiées à différents temps : J9 et J28.
Les analyses histologiques ont été réalisées par l’équipe du Pr H. Lassmann (Brain
Research Institute, Université de Vienne) dans le cadre d’un réseau européen (Neuropromise).
165
Préparation de lymphocytes du cerveau :
Après une perfusion intracardiaque des animaux avec du PBS 1X, le système nerveux
central des animaux est extrait. Les cerveaux ainsi que les moelles épinières sont passés
délicatement à travers des tamis cellulaires de 100µm puis 70µm. Les cellules sont ensuite
ressuspendues dans 5mL de mélange RPMI-30% Percoll (Amersham Biosciences, Orsay,
France). Ce milieu est déposé sur 6,25mL de RPMI-70% Percoll. Après 20 minutes de
centrifugation à 3000rpm, les cellules mononucléées sont récupérées à l’interface.
Les lymphocytes infiltrants le cerveau étant peu nombreux chez les souris, les cerveaux
de plusieurs souris sont généralement préparés de façon groupée afin d’obtenir un nombre de
cellules exploitables pour les expériences.
Analyses en cytométrie de flux :
Marquage de surface
Les suspensions cellulaires sont incubées à raison de 0,5 à 3.106 cellules par tube avec
les anticorps couplés à des fluorochromes dans 50µL de tampon Facs (PBS-10g/L albumine
sérique de bœuf – 0,2g/L NaN3) pendant 30 minutes sur de la glace à l’obscurité. Après une
étape de lavage dans du tampon Facs, les cellules marquées sont fixées dans du PBS-2%
paraformaldéhyde puis analysées au FacsCalibur ou au LSRII.
Marquage intracellulaire
Les cellules à raison de 4.106/mL sont incubées avec soit du Golgi plug soit du Golgi
plug additionné de PMA et de ionomicyne. Les cellules sont ainsi restimulées durant 4H à
37°C. Les cellules sont alors lavées. L’on procède ensuite au marquage de surface avec les
anticorps anti-CD8-PerCpCy5.5 (pour verification de la culture Tc1) ou anti-CD4PerCpCy5.5 (pour verification de la culture Th1) au 1/100 combiné avec l’anticorps anti-Vβ8FITC au 1/100. Après lavage dans du PBS 1X, les cellules sont permabilisées avec le kit BD
Cytofix/CytopermTM Plus (Fixation/perméabilisation Kit with BD Golgi PlugTM, BD
Pharmingen) durant 20 minutes à 4°C. Les cellules sont ensuite lavées avec du Perm/WashTM
deux fois. Les suspensions cellulaires sont incubées avec les anticorps couplés à des
fluorochromes dans 100µL de Perm/WashTM pendant 30 minutes à température ambiante dans
l’obscurité. Après une étape de lavage dans du PBS 1X, les cellules marquées sont fixées dans
du PBS-2% paraformaldéhyde puis analysées au FacsCalibur ou au LSRII.
166
RESULT
LTATS
LTATS
RESU
167
RESULTATS
Comme nous l’avons mentionné en introduction, la SEP est une maladie chronique
inflammatoire du SNC où des nombreux facteurs immunologiques et environnementaux
interviennent. En effet, il existe au niveau immunologique une contribution des facteurs
humoraux, des sous-populations de lymphocytes, des macrophages et de la microglie activés
qui sont présents dans les lésions actives de SEP. Au cours de ma thèse, je me suis plus
particulièrement intéressée à la contribution relative des sous-populations de lymphocytes T,
isolément ou en association, en utilisant un système de transfert adoptif de ces populations
dans un modèle murin de SEP : les souris transgéniques MOG-HA.
Dans une première partie, je me suis intéressée à la contribution relative des LT-CD8+
et LT-CD4+ reconnaissant un antigène oligodendroglial dans l’auto-immunité du SNC. En
effet, la coopération entre ces deux populations n’a pas été directement investiguée. Pour cela,
j’ai utilisé les souris double transgéniques MOG-HA (cf § Matériels et Méthodes) qui
expriment HA spécifiquement dans les oligodendrocytes, dans lesquelles j’ai transféré 30.106
de Tc1 spécifiques de HA ou 30.106 de Th1 spécifiques de HA ou 30.106 de chaque
population. Pour chaque groupe, j’ai analysé les conséquences cliniques et pathologiques de
l’inflammation du SNC et la destruction des cellules exprimant HA soit au niveau
histologique soit au niveau analytique (cytométrie de flux) à différents temps. Des résultats
antérieurs de l’équipe avaient montré, en collaboration avec l’équipe du professeur H.
Lassmann, que le transfert de cellules Tc1 spécifiques de HA dans ces souris MOG-HA
donnait des manifestations cliniques inconstantes et modérées (perte de poids, mobilité
réduite et perte d’équilibre) et induisait une inflammation constante mais locale du SNC
associée à des zones focales de démyélinisation (inflammation qui n’était pas retrouvée chez
les souris simple transgénique MOG-Cre).
Dans une seconde partie, je me suis focalisée sur la possible synergie entre des LTCD8+ et un anticorps anti-MOG démyélinisant (Z2) dans l’auto-immunité du SNC. Pour
répondre à cette question, les souris MOG-HA ont tout d’abord été transférées avec 30.106 de
Tc1 spécifiques de HA puis ont reçu soit l’anticorps Z2 soit un anticorps contrôle de même
isotype. Pour chaque groupe, j’ai analysé les conséquences cliniques et pathologiques de
l’inflammation du SNC et étudié les paramètres histologiques de cette coopération. Des
168
études antérieures avaient montré que le potentiel démyélinisant des anticorps dirigés contre
MOG était corrélé à leur habilité à fixer le complément (Piddlesden, Lassmann et al. 1993).
Pour ma thèse, je me suis plus particulièrement focalisée sur l’anticorps Z2, hautement
pathogène dans un modèle d’EAE chez le rat. Cet Ac a été obtenu par l’équipe de Linington
(Piddlesden, Lassmann et al. 1993). Après purification, l’effet de l’Ac Z2 a été investigué
dans des rats Lewis injectés préalablement avec les LT spécifiques de la MBP. Les résultats
histologiques de l’analyse de ces rats ont montré une forte démyélinisation avec un dépôt
important de la molécule C9 et une activation à 90% du complément (Piddlesden, Lassmann
et al. 1993; Goverman 2009)qui exacerbait les dommages sur la gaine de myéline.
1. Coopération des Tc1 et des Th1 ?
Afin de comprendre le rôle respectif des populations Th1 et Tc1, des souris MOG-HA
ont été transférées avec soit :
-
30.106 de Tc1 spécifiques de HA
-
30.106 de Th1 spécifiques de HA
-
30.106 de Tc1 spécifiques de HA + 30.106 de Th1 spécifiques de HA
Tc1
Th1
Tc1 +Th1
J9-J11
3
3
5
PFA4%
J18
4
1
9
OCT
J28
3
4
7
J9
2
4
2
J18
3
3
3
Cytométrie
J5
J9
1
9
1
11
1
11
n
25
27
38
Figure 1 : récapitulatif des transferts adoptifs de Tc1 et/ou Th1 dans les souris MOG-HA
Au total, 24 souris MOG-HA ont été tranférées avec des Tc1, 28 avec des Th1 et 38 avec des
Tc1 et des Th1. La répartition en fonction des jours de sacrifice est présentée dans le tableau.
Plusieurs méthodes ont été utilisées pour l’analyse de ces souris : soit une analyse
histologique après fixation dans de la PFA 4%, soit une analyse histologique après
congélation du SNC dans de l’OCT soit une analyse des cellules infiltrant le SNC en
cytométrie de flux.
a. Pureté des cellules mises en culture
Comme nous l’avons mentionné dans le chapitre Matériels et Méthodes, lors des
cultures Th1 ou Tc1, nous procédons à une purification des LT sur colonnes magnétiques. Les
cellules isolées des organes lymphoïdes des souris 6.5-TCR transgéniques ou CL4-TCR
transgéniques sont marquées par un anticorps biotinylé spécifiques. Ces cellules sont ensuite
incubées avec des billes magnétiques couplées à la streptavidine qui permettront de retenir les
169
LT du phénotype souhaité sur la colonne. Afin de vérifier la pureté des cellules mises en
culture, nous faisons une analyse en cytométrie de flux des fractions positives (fraction
cellulaire retenue sur la colonne) de la sélection. Les figures 2 et 3 représentent un exemple
d’analyse de pureté des lymphocytes T avant mise en culture.
Pureté des LT-CD4+ :
1,37 %
CD8
90,07 %
CD4
94,78 %
Vβ8
Figure 2 : Analyse de la pureté des LT avant mise en culture.
Marquage en cytométrie de flux de la fraction cellulaire de la sélection positive par billes
magnétiques avec les Ac anti-CD8-APC, anti-CD4-PE et anti-Vβ8-FITC.
Les LT mis en culture Th1 sont à 90% des CD4+, spécifiques de HA (94,78% Vβ8+).
La proportion de CD8+ est très faible (1,37%).
Pureté des LT-CD8+ :
91,44 %
CD8
7,91 %
CD4
98 %
Vβ8
Figure 3 : Analyse de la pureté des LT avant mise en culture.
Marquage en cytométrie de flux de la fraction cellulaire de la sélection positive par billes
magnétiques avec les Ac anti-CD8-APC, anti-CD4-PE et anti-Vβ8-FITC.
170
Les LT mis en culture Tc1 sont à 92% des CD8+, spécifiques de HA (98% Vβ8+). La
proportion de CD4+ est de 7%.
b. Activation des LT transférés
Avant chaque transfert, les LT des diverses cultures sont analysés par cytométrie de
flux pour évaluer leur état d’activation. Pour cela, les cellules, après culture, sont restimulées
in vitro avec l’association PMA/ionomycine pendant 4H. Un marquage intracellulaire est
ensuite réalisé pour analyser la production d’IFN-γ, de TNF-α et de granzyme B par ces LT.
Les figures 4 et 5 montrent un exemple représentatif de résultats obtenus après le marquage
intracellulaire des cellules provenant respectivement de cultures Tc1 et Th1. Ces figures nous
donnent également un renseignement sur la pureté des cellules injectées. En effet, un
marquage de surface CD4 ou CD8 combiné avec un marquage de surface Vβ8 nous permet de
discriminer nos cellules d’intérêt spécifiques de HA.
37,69
19,91
36,66
5,75
2,21
81,67
7,37
8,75
0,11
15,78
1,22
1,25
IFNγγ - APC
87,76
Vβ
β 8 - FITC
9,77
TNFα
α - APC
Non stimulé
4,43
79,68
1,21
87,33
0,54
10,91
Stimulé
CD8 - PerCp-Cy5.5
Granzyme B - PE
Isotype - APC
IFNγγ - PE
Isotype - PE
Figure 4 : Activation des Tc1.
Marquage en cytométrie de flux des LT isolés des cultures Tc1 après restimulation in vitro avec de la
PMA-Ionomycine durant 4H. Les marquages de surface sont réalisés avec les Ac anti-CD8-PerCP- Cy5.5,
Ac anti-Vβ8-FITC et le marquage intracellulaire avec les anticorps anti-IFNγ, anti-TNFα et antigranzyme B.
171
Ainsi comme le montre la figures 4, les LT issus des cultures Tc1 qui sont stimulés
sont bien des cellules activées productrices d’IFN-γ et/ou de TNF-α (92%) et d’IFN-γ et/ou de
Granzyme B (99,5%). On peut remarquer que les cellules non stimulées in vitro avec la
PMA/ionomycine expriment granzyme B, TNF-α et à moindre niveau l’IFN-γ traduisant leur
engagement dans une voie de différenciation en CTL. En effet, ces Tc1 sont producteurs
d’IFN-γ et/ou de TNF-α (64%) et d’IFN-γ et/ou de Granzyme B (80%). De plus, ces cellules
présentent un marquage de surface CD8+/Vβ8+ (88%) montrant que ces cellules sont
principalement des Tc1 spécifiques de HA. Les cellules transférées issues des cultures Tc1
sont donc bien des Tc1 activés et spécifiques de notre antigène d’intérêt.
0,08
1,29
84,76
13,86
2,38
7,78
51,81
38,03
1,21
21,69
87,33
51,65
6,82
72,71
14,12
6,34
IFNγγ - APC
79,5
Vβ
β8 - FITC
7,1
TNFα
α - APC
Non stimulé
Stimulé
8,3
5,1
CD4 - PerCp-Cy5.5
13,40
10,91
Granzyme B - PE
Isotype - APC
IFNγγ - PE
13,25
0,54
Isotype - PE
Figure 5 : Activation des Th1.
Marquage en cytométrie de flux des LT isolés des cultures Th1 après restimulation in vitro avec de la
PMA-Ionomycine durant 4H. Les marquages de surface sont réalisés avec les Ac anti-CD8-PerCPCy5.5, Ac anti-Vβ8-FITC et le marquage intracellulaire avec les anticorps anti-IFNγ, anti-TNFα et
anti- granzyme B.
172
Il en est de même pour les cellules transférées issues des cultures Th1 [figure 5]. En
effet, ces LT, après stimulation sont bien des cellules activées productrices d’IFN-γ et/ou de
TNF-α (86%) et d’IFN-γ et/ou de Granzyme B (87%). On peut également remarquer que les
cellules non stimulées in vitro par la PMA/Ionomycine ont un faible profil d’activation
montrant que ces cellules expriment un phénotype effecteur à la fin de la culture. En effet, ces
Th1 sont producteurs d’IFN-γ et/ou de TNF-α (14%) et de Granzyme B (49%). De plus, ces
cellules présentent un marquage de surface CD4+/Vβ8+ (75%) montrant que ces cellules sont
principalement des Th1 spécifiques de HA. Nous pouvons ici mentionner l’expression
inattendue de la molécule granzyme B par ces cellules Th1. En effet, cette molécule est
connue pour être exprimée par les LT activés de type Tc1 ou par les cellules NK activées. Or,
il y a quelques années, une étude surprenante avait montré que les LT-CD4+ de type
régulateur pouvaient également synthétiser cette molécule et avoir un effet protecteur antitumoral par la voie perforine/granzyme (Ley, 2007). Mais une étude très récente démontre
que les LT-CD4+ murins peuvent à leur tour synthétiser les molécules de granzymes suite à
une activation par des billes CD3/CD28 ou en MLR (Ley, 2009). Ceci pourrait donc expliquer
l’expression de granzyme par les Th1 dans notre modèle, où ces Th1 sont très fortement
stimulés par la PMA/ionomycine.
Des contrôles du potentiel pathogène in vivo de ces LT-CD4 ou CD8 spécifiques de
HA sont également effectués. Pour cela, 5.106 de Tc1 ou de Th1 sont transférés dans des
souris INS-HA (souris exprimant l’antigène HA sous contrôle d’un promoteur pancréatique).
Ces souris développent un diabète, 5-6 jours après le transfert de Tc1 et 8-9 jours après le
transfert de Th1. Les souris INS-HA malades sont euthanasiées après estimation du taux de
glucose dans l’urine.
Ainsi pour nos analyses, seules les souris ayant reçu des Tc1 et/ou Th1 avec un profil
activé in vitro et ayant induit un diabète de type 1 in vivo ont été prises en considération.
173
c. Suivi clinique
Chaque groupe de souris a été suivi quotidiennement pour leur évolution pondérale.
Evolution du poids
115
Tc1
Tc1 + Th1
Th1
110
105
100
95
90
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28
Tem ps après transfert adoptif des LT (jours)
Figure 6 : Evolution pondérale des animaux après transfert adoptif de LT.
Les animaux ont été suivis individuellement tous les jours. Les courbes ci-dessus montrent
l’évolution du poids au cours du temps en faisant une moyenne du poids de chacun des
groupes. Il existe 3 groupes : les souris MOG-HA transférées avec 30.106 de Tc1 spécifiques
de HA (courbe bleue, période 0-9 jours : n=25, période 9-11 jours : n=11, période 11-18
jours : n=9, période 18-28 jours : n=2), les souris MOG-HA transférées avec 30.106 de Th1
spécifiques de HA (courbe rouge, période 0-9 jours : n=27, période 9-11 jours : n=11,
période 11-18 jours : n=9, période 18-28 jours : n=5) et les souris MOG-HA co-transféreés
avec 30.106 de Tc1 spécifiques de HA et 30.106 de Th1 spécifiques de HA (courbe verte,
période 0-9 jours : n=38, période 9-11 jours : n=22, période 11-18 jours : n=19, période 1828 jours : n=7). Les barres d’erreurs correspondent au SEM.
Comme le montre la figure 6, les différents groupes ont une évolution pondérale
différente dans le temps. En effet, en ce qui concerne les animaux transférés avec 30.106 de
Tc1 spécifiques de HA nous observons une perte de poids relative (3%) entre 9 et 18 jours
alors que pour les animaux transférés avec 30.106 de Th1 spécifiques de HA, la perte de poids
est beaucoup plus tardive (à partir du jour 18). Par contre, il est intéressant de souligner le fait
que les animaux ayant reçu les deux populations T (Tc1 + Th1) perdent du poids plus
précocement (entre le jour 5 et le jour 11) et que cette perte est en moyenne plus importante
(6%). Afin d’approfondir l’interprétation de ces résultats, nous avons analysé plus
particulièrement les périodes entre 0 et 9 jours et 9 et 18 jours après transfert. Pour cela, nous
174
avons comparé la perte maximale de poids des animaux par rapport au jour 0 entre les
groupes comme représenté en figure 7.
A
B
ns
ns
(p = 0,4775)
ns
(p = 0,38)
(p = 0,97 4 )
ns
(p = 0,07)
115
Variation du poids (%)
105
100
95
90
85
80
Th1
***
(p = 0 ,0 0 01 )
110
105
100
95
90
85
75
Tc1
**
(p = 0 ,0 1 9 )
Tc1 +Th1
Tc1
Th1
Tc1 + Th1
Figure 7 : Différence pondérale des différents groupes d’animaux après transferts
adoptifs de LT.
Pour chaque groupe, le poids minimal de chaque animal (en % de la valeur basale) durant la
période 0-9 jours (A) ou la période 9-18 jours (B) est représenté. Chaque point représente un
animal. Pour la période 0-9 jours : n=25 pour le groupe Tc1, n=27 pour le groupe Th1,
n=38 pour le groupe Tc1 + Th1. Pour la période 9-18 jours : n=11 pour le groupe Tc1, n=11
pour le groupe Th1, n=22 pour le groupe Tc1 + Th1. Les moyennes des groupes sont
comparées statistiquement par un Student T test non apparié.
Ainsi nous confirmons les résultats précédemment obtenus par l’équipe selon lesquels
un transfert de Tc1 dans les souris MOG-HA provoque une perte de poids chez ces animaux à
partir du jour 9. Cette perte de poids n’est pas retrouvée chez les souris MOG-HA transférées
avec les Th1 durant les mêmes périodes. Elle semble plus tardive mais le faible nombre
d’animaux analysés à cette période (18-28 jours) ne nous permet pas de conclure sur la perte
de poids induite par les Th1 après 18 jours. En ce qui concerne les animaux ayant reçu le cotransfert Tc1 + Th1, comme attendu, ils perdent également du poids. Mais il ne semble pas
que ce co-transfert des Tc1 et Th1 aggrave la perte de poids induite seulement par les Tc1
(non significativité de la comparaison entre les groupes Tc1 seuls et Tc1 + Th1). Sur la base
de cette analyse pondérale, nous ne pouvons donc pas révéler la coopération entre les deux
populations Tc1 et Th1.
En l’absence de signe neurologique déficitaire patent, j’ai analysé de façon fine les
performances motrices des souris receveuses de Tc1, Th1 ou Tc1 + Th1. Pour cela j’ai réalisé
des tests avec une ROTaRod qui permet de tester la résistance motrice et l’équilibre de chaque
175
souris. Les tests ont été réalisés comme précisé dans le Matériels et Méthodes
quotidiennement.
Tc1
Tc1 + Th1
Evolution de la résistance
Th1
240
220
200
180
160
140
120
100
80
60
40
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
temps après transfert adoptif de LT (jours)
Figure 8 : Evolution de la résistance motrice des animaux après transfert adoptif de LT.
Chaque animal a été suivi individuellement tous les jours. Les courbes ci-dessus montrent
l’évolution de la résistance motrice au cours du temps en faisant une moyenne de la
résistance de chaque animal à chaque jour en tenant compte du groupe auquel il appartient.
Il existe 3 groupes : les souris MOG-HA transférées avec 30.106 de Tc1 spécifiques de HA
(courbe bleue, période 0-9 jours : n=11, période 9-18 jours : n=6, période 18-28 jours :
n=2), les souris MOG-HA transférées avec 30.106 de Th1 spécifiques de HA (courbe rouge,
période 0-9 jours : n=8, période 9--18 jours : n=4, période 18-28 jours : n=4) et les souris
MOG-HA co-transféreés avec 30.106 de Tc1 spécifiques de HA et 30.106 de Th1 spécifiques
de HA (courbe verte, période 0-9 jours : n=35, période 9-18 jours : n=12, période 18-28
jours : n=7). Les barres d’erreurs correspondent au SEM.
Les résultats présentés en figure 8, montrent que les LT, quels qu’ils soient, peuvent
induire une pathologie neurologique car chaque groupe de souris présente une période de
baisse des performances au test de ROTaRod alors que des souris contrôles non transgéniques
ne présentent, quant à elles, une stabilité de leur performance.
Comme pour la perte de poids, le groupe transféré avec les Th1 développe des troubles
plus tardifs. Il semblerait donc que les Th1 seuls induisent des lésions neurologiques de façon
retardée. Par contre pour les groupes Tc1 et Tc1+ Th1, la perte de coordination motrice est
similaire en intensité et dans le temps. Ceci pourrait signifier que les Tc1, comme l’équipe
l’avait montré précédemment, engendrent des dommages tissulaires au niveau du SNC ayant
ici pour traduction une faiblesse des souris au niveau moteur. Cet état est cependant réversible
puisque chaque groupe récupère sa motricité à partir du jour 18. Comme pour l’analyse
176
pondérale, j’ai affiné l’interprétation de ces résultats par une analyse comparant les baisses
maximales des performances motrices par rapport au jour 0 de chaque animal durant les
périodes 0-9 jours [figure 9-A] et 9-18 jours [figure 9-B]. Ces résultats montrent que les
différences observées ne sont pas significatives et ne permettent donc pas de conclure à un
effet synergique des populations Tc1 et Th1.
A
B
ns
(p = 0,1027)
ns
(p = 0,0954)
Variation de la résistance (%)
Variation de la résistance (%)
ns
(p = 0,9774)
ns
(p = 0,1979)
200
150
100
50
250
ns
(p = 0,2944)
ns
(p = 0,85)
200
150
100
50
0
0
Tc1
Th1
Tc1 + Th1
Tc1
Th1
Tc1 + Th1
Figure 9 : Résistance motrice des différents groupes d’animaux après transfert adoptif de
LT.
Chaque animal a été suivi quotidiennement. Pour chaque groupe, le plus faible temps de
résistance de chaque animal (en % de la valeur basale) durant la période 0-9 jours (A) ou la
période 9-18 jours (B) a été représenté. Chaque point représente un animal. Pour la période
0-9 jours : n=11 pour le groupe Tc1, n=8 pour le groupe Th1, n=35 pour le groupe Tc1 +
Th1. Pour la période 9-18 jours : n=6 pour le groupe Tc1, n=4 pour le groupe Th1, n=12
pour le groupe Tc1 + Th1. Les moyennes des groupes sont comparées statistiquement par un
Student T test non apparié.
Outre ces observations de pertes pondérales et de pertes motrices en ROTaRod, les
animaux n’ont montré aucune des manifestations cliniques observées lors d’une EAE
classique. En effet, nous n’avons pas observé de paralysie des pattes, ni d’atonie de la queue,
ni d’ataxie franche.
177
d. Histologie
Au niveau histologique, les analyses ont été faites sur des coupes de cerveau, moelle
épinière et nerfs optiques. Pour réaliser ces coupes, deux techniques ont été utilisées : soit à
partir d’animaux fixés en PFA4% (après perfusion intra-cardiaque au PBS, les animaux sont
perfusés en PFA4% puis conservés pendant 24H dans de la PFA4% pour être ensuite
conservé dans de l’éthanol à 70%), soit à partir d’organes congelés (après perfusion intracardiaque au PBS, les organes d’intérêts sont prélevés et congelés à -80°C dans de l’OCT). Le
tableau 1 montre les groupes analysés en fonction de la modalité de la technique et du temps
de sacrifice.
Ces résultats histologiques montrent une infiltration des cellules transférées dans le
SNC, quelles soient Tc1 ou Th1. Par contre, l’intensité de l’inflammation induite par ces
cellules est différente selon qu’il sagisse de Tc1 ou de Th1.
En effet, les Th1 provoque une faible inflammation du SNC sans apparition de
démyélinsation de la gaine de myéline [figures 10 et 11]. Cette inflammation est présente
dans la moelle épinière dès le 9ème jour après transfert de Th1 mais absente du cerveau. Au
18ème jour après transfert, l’inflammatoin disparaît au niveau du nerf optique mais est présente
chez 100% des animaux dans la moelle épinière et dans le cerveau. Cette inflmmation
disparaît totalement 28 jours après transfert.
L’inflammation induite par les Tc1 est plus importante et précoce. En effet, dès le J9,
100% des animaux ont des signes inflammatoires au niveau de la moelle épinière et la
majorité d’entre eux présentent également ces signes inflammatoires au niveau du cerveau et
du nerf optique. Au 18ème jour après transfert, 100% des animaux ont des infiltrats
inflammatoires que ce soit dans la moelle épinière, dans le cerveau ou dans le nerf optique.
Cette inflammation est totalement reversée au 28ème jour après transfert. On observe
également, suite à ce transfert, des zones de démyélinisation de la gaine de myéline dès le 9 ème
jour au niveau du nerf optique [figures 10 et 11].
Suite au co-transfert de Tc1 et de Th1, l’inflammation est beaucoup plus sévère et plus
persistante. En effet, l’inflammation dès le 9ème jour touche la quasi-totalité des animaux. Au
niveau du cerveau alors que seulement 50% des animaux présentent des signes
inflammatoires au niveau du nerf optique. Au 18ème jour après transfert, 100% des animaux
montrent des signes inflammatoires au niveau du cerveau, de la moelle épinière et du nerf
optique avec des zones de démyélinisation au niveau de ces nerfs optiques. Les zones
178
inflammées du cerveau sont également beaucoup plus nombreuses touchant non seulement les
méninges comme pour les simples transferts mais également le cortex, l’hypothalamus, le
cervelet et l’hyppocampe .Ces signes inflammatoires perdurent au 28ème jour après transfert
dans la majorité des animaux. Des zones de démyélinisation sont également présentes à ce
jour là avec cependant des phénomènes de réversion et de rémyélinisation [figures 10 et 11].
.
Ces observations qualitatives sont confirmées par des analyses quantitatives des
infiltrats de LT au niveau de la moelle épinière et du nerf optique où nous observons des
infiltrats cellulaires beaucoup plus nombreux lorsque les deux populations lymphocytaires
(Tc1 et Th1) sont co-transférés [figure 10B].
A
Cerveau
Jour de sacrifice
9/11
18
28
inflammation
Tc1 Th1 Tc1 + Th1
2/3 0/2
10/12
3/4 2/2
8/8
1/4 0/2
5/8
Moelle Epinière
Tc1
3/3
4/4
0/4
inflammation
Th1 Tc1 + Th1
2/2
9/12
2/2
8/8
0/2
6/8
Nerf Optique
inflammation
Tc1 Th1 Tc1 + Th1
1/3 1/2
6/12
3/3 0/2
7/8
0/4 0/2
4/8
démyélinisation
Tc1 Th1 Tc1 + Th1
1/1 1/2
3/8
ND 0/2
1/1
0/4 0/2
4/8
B
Tc1
Tc1 + Th1
Moelle Epinière 2,76 ± 3,11 13,83 ± 17
Nerf Optique
32,95 ± 28 76,46 ± 69
Figure 10 : récapitulatif des signes histologiques suite aux transferts de LT.
A. Le cerveau, la moelle épinière et les nerfs optiques ont été analysés à différent temps de
sacrifice (9/11 jours, 18 jours et 28 jours. Dans ce tableau sont représentés les résultats selon
l’inflammation induite par les LT dans le SNC en fonction des transferts effectués (Tc1 seuls,
Th1 seuls ou co-transfert Tc1 + Th1). Pour le nerf optique des données supplémentaires
concernant la démyélinisation aux différents temps ont également été mentionnées. Les
fractions représentent le nombre de souris présentant des signes inflammatoires sur le
nombre de souris total analysé. B. Analyse quantitative du nombre moyen de LT infiltrant le
SNC au niveau de la moelle épinière et du nerf optique suite aux transferts de Tc1 seuls ou de
Tc1 + Th1 à J18. Pour le transfert Tc1, n=4, pour le co-transfert Tc1+Th1, n=7. ND=non
déterminé.
179
A
Tc1
CV
Tc1 + Th1
Infiltration de LT dans les
méninges et le parenchyme
Infiltration massive de LT dans les
méninges, l’hypothalamus et le thalamus
CD3+
CD3+
ME
(x5)
(x20)
(x5)
(x20)
CD3+
CD3+
NO
(x10)
(x20)
Infiltration de LT dans le NO
sans démyélinisation
(x10)
(x20)
B
Th1
Tc1
Tc1 + Th1
(x5)
(x5)
(x5)
ME
CD3
CD3
(x20)
CD3
(x20)
(x20)
CD3
CD3
CD3
NO
(x10)
(x10)
(x10)
Figure 11 : coupes histologiques de moelle épinière, nerf optique et cerveau suite aux
différents transferts de LT.
A. Coupes histologiques de ME et du NO à J18 après transferts de Tc1 ou de
Tc1+Th1. B. Coupes histologiques de ME et du NO à J28 après transferts de Tc1 ou de Th1
ou de Tc1+Th1. ME : Moelle Epinière ; NO : Nerf Optique ; CV : cerveau.
180
Ainsi, il semblerait que le co-transfert Tc1+Th1 aggrave l’inflammation du SNC que
ce soit au niveau du cerveau, de la moelle épinière ou du nerf optique suggérant une
coopération des deux populations lymphocytaires Tc1 et Th1.
e. Etude des cellules inflammatoires par cytométrie en flux.
Afin de comprendre le rôle de chaque population (Tc1 et Th1), des souris MOG-HA
ont été transférées comme précédemment avec soit 30.106 de Tc1 spécifiques de HA, soit
30.106 de Th1 spécifiques de HA, soit 30.106 de Tc1 spécifiques de HA + 30.106 de Th1
spécifiques de HA. Les souris ont ensuite été sacrifiées 9 jours après transfert. Les cellules
inflammatoires ont été purifiées des cerveaux et moelles épinières puis analysées en
cytométrie de flux. Cela a eu pour but de quantifier l’infiltration des LT transférés et des
cellules inflammatoires recrutées (macrophages, CD mais aussi cellules microgliales).
D’autres expériences ont donc été réalisées afin de mieux appréhender ce phénomène et
d’analyser l’infiltration des cellules T lors des différents transferts et leurs conséquences sur la
microglie, les macrophages et les cellules dendritiques au sein du SNC.
A
B
C
Figure 12 : caractérisation des cellules analysées.
Les LT sont les cellules exprimant les marqueurs Thy1.2+ et CD45hi(A). Les cellules
macrophagiques et microgliales sont sélectionnées parmi des cellules totales n’exprimant pas
le CD11c. Parmi cette population CD11c-, on distingue les macrophages -CD11bint-CD45hi
(B) et la microglie -CD11bint-CD45int (B). Les cellules dendritiques sont les cellules CD45hiCD11c+ (C).
181
Les populations de cellules inflammatoires ont été analysées grâce à des marqueurs de
surface. La figure 12 montre un exemple représentatif des modalités retenues pour la
discrimination des différentes populations. Ainsi, les cellules T ont été identifiées comme
étant les cellules exprimant les molécules Thy1.2 et CD45hi. Les CD sont les cellules CD45hiCD11c+, les cellules macrophagiques sont les cellules CD11c--CD11bint-CD45hi et les cellules
microgliales sont les cellules CD11c--CD11bint-CD45int.
A
Nombre absolu de cellules
Dendritiques infiltrant
le SNC par souris
Nombre absolu de cellules
Thy1.2+ CD45+ infiltrant
le SNC par souris
*
Cellules(pdendritiques
= 0,02)
*
(p = 0,028)
250000
200000
150000
100000
ns
(p = 0,17)
B
*
(p = 0,04)
ns
(p = 0,73)
50000
0
Tc1
C
Th1
Tc1 + Th1
200000
100000
Tc1
D
Th1
Tc1 + Th1
Balb/c
ns
(p = 0,35)
ns
(p = 0,16)
ns
(p = 0,43)
ns
(p = 0,97)
Nombre absolu de
Macrophages infiltrant
Le SNC par souris
Nombre absolu de cellules
Microgliales infiltrant
Le SNC par souris
ns
(p = 0,35)
0
Balb/c
ns
(p = 0,43)
300000
300000
200000
100000
100000
ns
(p = 0,5)
75000
50000
25000
0
0
Tc1
Th1
Tc1
Tc1 + Th1 Balb/c
Th1
Tc1 + Th1
Balb/c
Figure 13 : cellules infiltrant le SNC après transferts adoptifs de LT.
Les souris MOG-HA ont été transférées soit avec 30.106 de Tc1 spécifiques de HA, soit avec
30.106 de Th1 spécifiques de HA, soit avec 30.106 de chaque population. Les animaux ont été
sacrifiés à J9 puis leur SNC (cerveau + moelle épinière) a été analysé en cytométrie de flux.
A. Nombre absolu de cellules T ( Thy1.2+-CD45hi) infiltrant le SNC par animal. B. Nombre
absolu de CD (CD45hi-CD11c+) par animal. C. Nombre absolu de macrophages (CD11c-CD11bint-CD45hi)par animal. D. Nombre absolu de cellules microgliales (CD11c--CD11bintCD45int) par animal. Le groupe Tc1 : n=4, le groupe Th1 : n=6, le groupe Tc1+Th1 : n=6,
le groupe Balb/c : n=3. Nombre d’expérience indépendante : n=2. Les groupes sont
comparés statistiquement par un Student T test non apparié. Les barres d’erreurs
représentent les SEM.
Ces différentes populations ont donc été analysées après les différents transferts de LT
dans les souris MOG-HA [figure 13]. Comme le montre la figure 11-A, les cellules
182
transférées, qu’elles soient Tc1 ou Th1 traversent la barrière hémato-encéphalique et
pénètrent dans le SNC. Aucune différence n’est notable quant à l’efficacité de pénétration de
chaque population T isolément au temps choisi de J9. Par contre, le co-transfert des deux
populations augmente significativement le nombre de LT infiltrant le SNC. Le nombre de LT
par animal dans le groupe ayant reçu les Tc1 + Th1 est supérieur à la somme arithmétique
des valeurs des groupes Th1 seuls et Tc1 seuls. Ceci suggère une coopération des deux
populations qui pourraient agir en synergie pour faciliter la transmigration des LT vers le
SNC.
En ce qui concerne la présence de cellule de l’immunité innée, aucune différence n’est
notée pour le nombre absolu de cellules microgliales présentes dans le SNC suite à un
transfert de Tc1, Th1 ou co-transfert Tc1 et Th1 (figure 13-C). La présence de ces populations
ne semble pas influencer celle de la microglie. Il en est de même pour les macrophages
présents ou infiltrants le SNC (figure 13-D). Leur nombre ne varie pas en fonction de la
présence des Tc1 ou Th1 ou des deux populations. Par contre, une différence significative
s’observe lors du co-transfert des Tc1 avec les Th1 sur le nombre absolu de CD infiltrant le
SNC (figure 13-B). En effet, ce nombre de CD est trois fois supérieur lorsque les souris ont
été transférées avec les Tc1 + Th1 comparé aux souris simplement transférées avec les Th1.
Par contre, cette différence est moindre pour la comparaison avec les simples transferts Tc1.
Cela suggère que la présence des Tc1 favorise le recrutement des CD au sein du SNC lors
d’une inflammation. Cela expliquerait pourquoi les animaux co-transférés perdent
significativement plus de poids que les animaux simplement transférés avec les Th1. La
présence des Tc1 aggraverait donc la maladie induite par les Th1 seuls. Cependant, il est
intéressant de noter que ces cellules infiltrant le SNC semblent avoir un phénotype activé. En
effet, les cellules de l’immunité innée présentes dans le SNC lors de ces transferts de LT
surexpriment les molécules de CMH de classe II. Ce microenvironnement est donc apte à
provoquer une inflammation (phagocytose par les macrophages, présentation antigénique par
les CD et microgliale) dont l’intensité varie en fonction des LT transférés [figure 14].
.
183
Figure 14 : expression de molécules de CMH de classe II par les cellules du SNC après
transfert adoptif de LT.
f. conclusion
En conclusion de cette première partie sur notre modèle, les LT, soit Tc1 soit Th1,
sont capables de pénétrer dans le SNC et d’induire une inflammation. Les résultats combinés
des diverses analyses (cliniques, histologiques et fonctionnelles) permettent de conclure à une
action synergique des Tc1 et des Th1 induisant ainsi une maladie plus intense lorsqu’ils sont
présents simultanément. En effet, le nombre de LT infiltrant le SNC lors du double transfert
Tc1 + Th1 est significativement plus important que la somme arithmétique des LT infiltrant le
SNC lors des simples transferts Tc1 ou Th1 (figure 11-A). Chaque population Tc1 et Th1
agirait donc en synergie pour pénétrer dans le SNC et provoquer ainsi des lésions plus
importantes au niveau de la gaine de myéline induisant une aggravation de la maladie.
Cependant cette synergie n’a pas de conséquence significative sur la microglie environnante
ainsi que sur le recrutement de macrophages dans le SNC.
184
2.
Coopération des Tc1 et des anticorps ?
Afin d’analyser la coopération potentielle des Tc1 avec un anticorps démyélinisant
(l’anticorps Z2 reconnaissant un épitope conformationnel de MOG), des souris MOG-HA ont
été transférées avec 30.106 de Tc1 spécifiques de HA. Deux conditions ont alors été testées :
l’effet de l’Ac Z2 sur une période de 9 jours ou sur une période de 28 jours. Les animaux
ayant été sacrifié au 9ème jour ont reçu 3 doses d’Ac (=0,5mg) à 4, 6 et 8 jours après transferts
des Tc1. Les animaux ayant été sacrifiés au 28ème jour ont reçu 4 doses d’Ac à 5, 8, 12 et 16
jours après transfert. Pour toutes ces expériences, des groupes contrôles ont évidemment été
analysés suite à l’injection d’un anticorps témoin de même isotype, dans les mêmes
conditions. Durant toute la durée de l’expérience les animaux ont été suivis cliniquement
(poids et résistance motrice à l’effort). La figure 15 montre la répartition des animaux étudiés
selon leur sexe, la durée de l’expérience et l’Ac reçu.
J9
Z2
Isotype contrôle
Femelle
3
2
J28
Male
2
2
Femelle
3
3
Male
2
2
Figure 15 : récapitulatif des animaux étudiés lors d’un transfert Tc1 et d’Ac
Les souris MOG-HA ont été transférées soit avec 30.106 de Tc1 spécifiques de HA puis avec
soit un anticorps démyélinisant Z2 soit un anticorps contrôle de même isotype. Le nombre
de souris analysées et les temps de sacrifices sont indiqués dans le tableau.
a.
Suivi clinique
Les souris MOG-HA ont donc été suivies quotidiennement au niveau de leur évolution
pondérale.
La figure 16 confirme les résultats obtenus dans la première partie sur la coopération
Tc1/Th1 selon lesquels les souris MOG-HA perdent du poids entre 9 et 18 jours après un
transfert de Tc1. Dans ces expériences, nous pouvons observer que des injections
supplémentaires d’un anticorps démyélinisant semblent augmenter cette perte de poids, que ce
soit chez les males ou chez les femelles, à 28 jours.
185
B
Poids (%)
Poids (%)
A
Tc1 + Z2
Tc1 + anticorps témoin
Temps après transfert adoptif de LT (jours)
Temps après transfert adoptif de LT (jours)
Figure 16 : Evolution pondérale des animaux après transferts adoptifs de LT et
co-injections d’Ac.
Chaque animal est suivi quotidiennement. Les courbes ci-dessus montrent l’évolution du
poids au cours du temps en faisant une moyenne du poids des animaux de chaque groupe. Il
existe 2 groupes : les souris MOG-HA transférées avec 30.106 de Tc1 spécifiques de HA ayant
reçu 3 ou 4 doses d’Ac (courbe rouge) ou 3 ou 4 doses danticorps témoin de même isotype
(courbe bleu). A. Souris sacrifieés à J9 ayant reçu 3 doses de Z2 (n = 5) ou d’anticorps
témoin (n = 4). B. Souris sacrifiées à J28 ayant reçu 4 doses de Z2 (n = 5) ou d’anticorps
témoin (n = 5). Les flèches noires représentent les injections de 0,5mg d’anticorps ou
d’isotype. Les barres d’erreurs correspondent au SEM.
Afin d’interpréter statistiquement ces observations, j’ai analysé ces différences en
combinant les résultats des males et des femelles (puisque les tendances étaient les mêmes
quelque soit le sexe dans la figure 16) et en prenant pour chaque jour la valeur maximale de
variation de poids de chaque animal [figure 17].
A
ns
B
ns
p = 0,58
p = 0,58
105
97.5
100
95.0
95
92.5
90
90.0
85
87.5
80
85.0
75
82.5
70
Tc1 + Z2
80.0
Tc1 + Ac témoin
Tc1 + Z2
Tc1 + Ac tém oin
Figure 17 : Différence pondérale des différents groupes d’animaux après transferts
adoptifs de LT et co-injections d’Ac.
Pour chaque groupe, le poids minimum de chaque animal (en % de la valeur basale) pour
l’expérience à J9 (A) ou à J28 (B) a été representé. Chaque point représente un animal. Les
moyennes des groupes sont comparées statistiquement par un Student T test non apparié.
186
Par cette analyse, je confirme bien que sur une période de 28 jours, la présence de l’Ac
Z2 aggrave la perte de poids induite par les Tc1 dans les souris MOG-HA. Par ces résultats,
nous pouvons donc suggérer une coopération entre les Tc1 et les anticorps démyélinisants.
Cette coopération semble toutefois nécessiter du temps puisque à jour 9, aucune différence
n’est notable entre les deux groupes Tc1 + Z2 et Tc1 + Ac témoin.
Des tests de résistance motrice à l’effort ont également été réalisés par des analyses de
résultat en ROTaRod pour chaque souris. Les tests ont été réalisés quotidiennement comme
précisé dans le chapitre Matériels et Méthodes.
Les résultats présentés en figure 18 confirment que les Tc1 pénètrent bien dans le SNC
provoquant des désordres moteurs chez la souris MOG-HA ayant pour conséquence une
moindre résistance à l’effort physique. Par contre, ces conséquences motrices ne semblent pas
être aggravées suite aux injections de l’Ac démyélinisant Z2, que les souris soient males ou
femelles ou que la période de traitement soit de 9 ou 28 jours.
B
Résistance
(%)
Résistance
(%)
A
Temps après transfert adoptif de LT (jours)
Temps après transfert adoptif de LT (jours)
Figure 18 : Evolution de la résistance motrice des animaux après transferts adoptifs
de LT et co-injections d’Ac.
Chaque animal a été suivi quotidiennement. Les courbes ci-dessus montrent la résistance
motrice au cours du temps en faisant une moyenne pour chaque animal de chaque groupe. Il
existe 2 groupes : les souris MOG-HA transférées avec 30.106 de Tc1 spécifiques de HA
ayant reçu 3 ou 4 doses de Z2 (courbe rouge) ou 3 ou 4 doses d’anticorps témoin de même
isotype (courbe bleu). A. Souris sacrifiées à J9 ayant reçu 3 doses de Z2 (n = 5) ou d’Ac
témoin (n = 4). B. Souris sacrifiées à J28 ayant reçu 4 doses de Z2 (n = 5) ou d’Ac témoin (n
= 5). Les flèches noires représentent les injections de 0,5mg d’anticorps ou d’isotype. Les
barres d’erreurs correspondent au SEM.
187
Comme précédemment pour le poids, afin d’affiner ces résultats, j’ai combiné les
résultats des males et des femelles en prenant pour chaque jour la valeur maximale de
variation de résistance de chaque animal [figure 19].
Si les résultats au niveau pondéral suggéraient une coopération entre les Ac et LT, les
résultats de résistance motrice ne révèlent pas de coopération entre les deux populations
puisque les différences entre les deux groupes quelques soient le temps de l’expérience ne
sont pas significatives.
Outre ces observations, les animaux n’ont montré aucune autre manifestation clinique
observée lors d’une EAE classique
A
B
ns
p = 0,4875
p = 0,48
120
110
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
Tc1 + Z2
ns
pp==0,2326
0,23
120
110
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
Tc1 + Ac témoin
Tc1 + Z2
Tc1 + Ac témoin
Figure 19 : Résistance motrice des différents groupes d’animaux après transferts adoptifs
de LT et co-injections d’Ac.
Chaque groupe d’animaux a été suivi individuellement tous les jours. Pour chaque groupe,
les valeurs maximales de variation de résistance de chaque animal durant la période 0-9
jours (A) ou la période 9-18 jours (B) ont été gardées. Chaque point représente un animal.
Pour la période 0-9 jours : n=11 pour le groupe Tc1, n=8 pour le groupe Th1, n=35 pour le
groupe Tc1 + Th1. Pour la période 9-18 jours : n=6 pour le groupe Tc1, n=48 pour le
groupe Th1, n=12 pour le groupe Tc1 + Th1. Les moyennes des groupes sont comparées
statistiquement par un Student T test non apparié.
188
b. Histologie
Au niveau histologique, les analyses ont été faites sur des coupes de cerveau, moelle
épinière et nerfs optiques à partir d’animaux fixés en PFA4% (après perfusion intra-cardiaque
au PBS, les animaux sont perfusés en PFA4% puis conservés pendant 24H dans de la PFA4%
pour être ensuite conservé dans de l’éthanol à 70%). La figure 15 montre les groupes analysés
en fonction du temps de sacrifice (9 ou 28 jours).
Ces résultats histologiques montrent, comme présenté en figure 20, que les Tc1
induisent, comme attendu, une inflammation et une démyélinisation au niveau de la moelle
épinière dès le jour 9. Cette inflammation est largement diminuée au 28ème jour après transfert
de ces Tc1. Malgrè cette inflammation et un marquage Ig présent seulement au jour 9 au
niveau de la moelle épinière, du cerveau et parfois du nerf optique, aucun dépôt de
complément (molécule C9) n’est visible au niveau de ces organes. Ces observations sont
potentialisées par l’injection de l’Ac Z2 qui provoque une plus grande inflammation avec des
dépots d’Ig plus nombreux. La démyélinisation est également plus importante et peut être la
conséquence d’un dépôt du complément au niveau de la moelle épinière et du cerveau,
seulement au jour 9. Cette démyélinisation est plus persistante en présence de l’Ac tant au
niveau de la moelle épinière que du nerf optique. Il est à noter également que le marquage Ig
est visible au niveau de la microglie en présence ou non de l’Ac Z2 mais par contre la
présence de ce dernier induit un marquage spécifique au niveau de la myéline.
J9
J28
Tc1 + Ac
Tc1 + Ac
Tc1 + Z2
Témoin
Témoin
3,73 ± 1,5
3,1 ± 0,4
0,6 ± 0,4
0,15 ± 0,07
Index d'inflammation
3/3
2/2
1/2
0/2
Démyélinisation de la ME
12,3% ± 9,3% 2,5% ± 3,5% 48,5% ± 30% 38,5% ± 37%
Démyélinisation du NO
3/3
0/2
2/2
0/2
Dépôt Ig
3/3
0/2
0/2
0/2
Dépôt C9
Figure 20 : récapitulatif des signes histologiques suite aux transferts de LT et d’Ac.
Le cerveau, la moelle épinière et les nefs optiques ont été analysés à différent temps de
sacrifice (9 jours et 28 jours). Dans ce tableau sont représentés les résultats selon
l’inflammation induite par les LT +/- l’anticorps démyélinisant Z2 dans le SNC. Les fractions
représentent le nombre de souris présentant des signes inflammatoires sur le nombre de
souris total analysé.
Tc1 + Z2
189
Ces résultats montrent ainsi une aggravation des signes cliniques lorsque les animaux
sont transférés avec des Tc1 et coinjectés avec un Ac démyélinisant. Ceci suggère donc une
collaboration de ces deux populations dans l’aggravation de la pathologie.
A
Ac Témoin + Tc1
Z2 + Tc1
B
Cervelet
Moelle épinière
C9néo
Ig
Nerf Optique
Figure 21 : coupes histologiques de moelle épinière, nerf optique et cerveau suite aux
différents transferts de LT et d’Ac.
A. Coupes de moelle épinière d’animaux traités avec des Tc1 et l’Ac témoin (à gauche) ou
avec des Tc1 et l’Ac Z2 (à droite). Le marquage CD3 représente l’infiltration des LT 9 jours
après transfert de Tc1. B. Coupes histologiques de nerf optique, moelle épinière et cervelet,
analysées 9 jours après transfert de Tc1. Les marquages représentés ici sont le dépôt d’Ig et
de C9néo dans les différentes sections.
190
DISCUSSION
ET
PERS
PERSPECTIVES
191
DISCUSSION ET PERSPECTIVES
Les premières données de la littérature sur l’implication du système immunitaire dans
la pathologie de la SEP suggéraient un rôle majeur des LT-CD4+. Les premières expériences
montrant le rôle des LT dans l’EAE ont été apportées dans les années 1970 où des rats
déplétés en LT par thymectomie et irradiation devenaient résistants à l’EAE (Gonatas and
Howard 1974; Ortiz-Ortiz and Weigle 1976). Plusieurs données de la littérature suggéraient
ainsi un rôle important de ces LT dans le déclenchement de la pathologie. Plus
particulièrement, les cellules effectrices impliquées dans la SEP et l’EAE ont été longtemps
décrites comme de type Th1. En effet, chez des patients atteints de SEP, les LT auto-réactifs
présentent une différenciation Th1 (Bielekova, Sung et al. 2004) et la production de cytokines
comme le TNF-α, l’IFN-γ et l’IL-2 est très largement augmenté dans le CNS et LCR (Gutcher
and Becher 2007). Mais durant la dernière décennie, une autre population de LT, les LTCD8+, a été mise en cause dans la SEP. Ce postulat a été bâti sur l’observation qu’une
déplétion en LT-CD4+ chez des patients atteints de SEP n’améliorait pas la maladie alors que
la déplétion des populations CD4 et CD8 semblait être bénéfique. Plusieurs études ont ensuite
renforcé le rôle des LT-CD8+ dans la pathologie de la SEP et de l’EAE (Liblau, Wong et al.
2002; Neumann, Medana et al. 2002; Friese and Fugger 2005; Goverman, Perchellet et al.
2005).
Dans ce contexte, nous nous sommes donc interrogés sur la possible coopération de
ces deux populations lymphocytaires, LT-CD8+ et LT-CD4+, plus particulièrement Tc1 et
Th1, et le rôle de chaque population isolément ou en synergie dans l’induction et le maintient
de la pathologie. Pour cela, j’ai utilisé un modèle murin de SEP préalablement validé au
laboratoire : les souris MOG-HA. Ces souris permettent une expression conditionnelle de HA
dans un type cellulaire spécifique, les oligodendrocytes.
1. Implication des Tc1
a. Dans la SEP et l’EAE
Des expériences de croisement entre ces souris MOG-HA et des souris transgéniques
pour un TCR spécifique de HA (souris CL4-TCR transgénique pour un TCR spécifique de
192
HA512-520 restreint par la molécule de CMH de classe I, Kd ) ont montré des résultats
immunologiques intéressants mais non exploitables pour répondre à notre question. En effet,
les souris issues de ces croisements n’ont développé aucun signe clinique neurologique (pas
de perte de poids, pas de baisse de performance au test ROTaRod) et leur profil thymique
n’était pas modifié par rapport aux souris parents TCR transgéniques (même pourcentage et
nombre absolu de cellules DN, DP et SP). Cette absence de phénotype immunologique a
également été retrouvée en périphérie (rate et ganglions drainants). De ces expériences, nous
en avons déduits une ignorance de l’antigène HA par ces LT spécifiques de HA. Ceci peut
s’expliquer par la faible expression de HA dans le SNC. En effet des études ont montré qu’en
dessous d’un certaine dose d’antigène, les LT ne pouvaient pas répondre à l’auto-antigène
tissulaire (Kurts, Sutherland et al. 1999). Cet argument est renforcé par le fait que les LTCD8+ naïfs issus des souris CL4-TCR transgéniques marqués au CFSE ne prolifèrent pas
après transfert adoptif aux souris MOG-HA. Néanmoins, ce système pourrait être exploité par
des expériences d’infection par le virus Influenza des souris MOG-HA afin de réactiver en
périphérie les LT qui pourraient migrer alors dans le SNC. Cette absence de réponse des LTCD8+ en présence de l’auto-antigène pourrait aussi être expliqué par une faible avidité
fonctionnelle de ces LT-CD8+ spécifiques. En effet, l’équipe de Hengartner (Gallimore,
Hengartner et al. 1998) avait démontré que les LT-CD8+ auto-réactifs spécifiques de MOG
répondaient à leur antigène à une concentration beaucoup plus élevée comparés aux LT-CD8+
répondant à un peptide étranger. Ceci est une caractéristique des cellules auto-réactives
pathogènes qui échappent à la sélection négative dans le thymus (Zehn and Bevan 2006).
Enfin, cette absence de réponse des LT auto-réactifs peut s’expliquer par une instabilité du
complexe CMH/peptide qui permet également un échappement à la tolérance centrale des LT
auto-réactifs (Liu and Wraith 1995) résultant à une ignorance de l’antigène par ces LT-CD8+.
Les LT-CD8+ présents dans ces souris transgéniques ne peuvent donc pas s’activer et créer de
dommages dans le SNC malgré la présence de l’antigène, résultant à une absence totale de
signe clinique neurologique.
Une question restait donc en suspend sur la possibilité réelle de ces lymphocytes à
passer la barrière hémato-encéphalique dans ce modèle murin. Cependant, une étude en 2003
avait montré que des LT-CD8+ spécifiques de HA, activés in vitro, pouvaient traverser la
barrière hémato-encéphalique après transfert adoptif dans des souris GFAP-HA (souris
transgéniques exprimant HA dans les astrocytes) (Cabarrocas, Bauer et al. 2003). Une étude
plus récente a montré que ces LT-CD8+ spécifiques de HA, activés in vitro, pouvaient induire
193
une démyélinisation chez des souris receveuses MOG-HA (Saxena, Bauer et al. 2008). Le
rôle des LT-CD8+ est donc bien établi dans ces modèles murins : ils peuvent passer la
barrière hémato-encéphalique après transfert adoptif et induire une démyélinisation de la
gaine de myéline par interaction directe avec les oligodendrocytes.
b. Dans d’autres maladies auto-immunes
Tout comme la SEP, le diabète auto-immun de type 1 a longtemps été considéré
comme une maladie auto-immune spécifique d’organe causé exclusivement par les LT-CD4+.
En effet, pendant très longtemps, des équipes ont montré l’importance des LT-CD4+ dans la
pathogenèse de la maladie : présence en abondance de ces LT dans les îlots pancréatiques
d’animaux malades, implication de la région génétique du CMH de classe II, défaut de
sélection positive des LT-CD4+ auto-réactifs.
Cependant, depuis quelques années, l’implication de ces LT-CD8+ dans les maladies
auto-immune n’a cessé de croître. Plusieurs études ont ainsi démontré les rôles délétères ou
protecteurs des
LT-CD8+ dans le diabète de type 1 (Mallone and van Endert 2008;
Santamaria 2008) ; (Mallone, Martinuzzi et al. 2007; Severe, Gauvrit et al. 2007) ; (Karges,
Rajasalu et al. 2007), dans la néphrite intestinale (Meyers and Kelly 1991), dans l’arthrite
rhumatoïde(Hatachi, Kunitomi et al.; Zhou, Xiao et al. 2006)
2. Implication des Th1
a. Dans la SEP et l’EAE
Suite à ces postulats, nous nous sommes donc intéressés en premier lieu au rôle que
pouvaient avoir les LT-CD4+ dans ce modèle murin de SEP. Nous avons tout d’abord, comme
pour les LT-CD8+, croisé les souris MOG-HA avec des souris transgéniques pour un TCR
spécifique de HA (souris 6.5-TCR transgénique pour un TCR spécifique de HA110-119 restreint
par la molécule de CMH de classe II, I-Ed). Les résultats ont été les mêmes que pour les
croisement des MOG-HA avec les souris CL4-TCR transgéniques, à savoir une ignorance de
l’antigène par les LT-CD4+ (aucun signe clinique neurologique et profils thymique et
périphérique similaires aux souris parentales TCR transgéniques).
194
La question restait donc de savoir, pour notre modèle, si cette absence de réponse des
LT-CD4+ envers leur antigène auto-réactif était dû à une ignorance et donc une inactivation
de ces LT auto-réactifs ou si cette population de LT ne pouvait pas pénétrer dans le SNC des
ces souris MOG-HA. Pour répondre à cela, nous avons procédé à des transferts adoptifs de
LT-CD4+ activés in vitro puis analysé à différents temps les souris receveuses. Nos résultats
histologiques ont montré une faible inflammation au niveau du SNC démontrant de fait que
ces LT-CD4+ pouvaient pénétrer dans le SNC. Cependant ces cellules ne sont pas capables
seules d’induire des dommages tissulaires au niveau de la gaine de myéline. Ces résultats ont
été retrouvés également lors des analyses de caractérisation en cytométrie de flux où nous
observons une réelle infiltration de LT-CD4+ dans le SNC, infiltration similaire en terme de
nombre absolu à celle obtenue lors d’un transfert de LT-CD8+. De plus, comme les LT-CD8+,
la présence de ces LT-CD4+ dans le SNC a pour conséquence une activation de la microglie et
un recrutement de macrophages et CD montrant un rôle activateur des Th1 sur ces cellules.
Des observations cliniques de ces souris ont permis également d’analyser une
cinétique d’action de ces Th1 et de la comparer à ce qui était déjà connu sur le transfert de
Tc1 dans ce même modèle. En effet, après un transfert adoptif de Tc1 dans les souris MOGHA, les souris perdent du poids dans 30% des cas vers le 8ème jour après transfert puis le
regagnent après le 18ème jour. Nous avons démontré ici que les Th1 seuls induisaient une
perte de poids des souris MOG-HA mais que cette perte était plus tardive (à partir du jour 18).
Ce délai a été confirmé lors de test évaluant les performances motrices et l’équilibre des
souris sur une ROTaRod. En effet, alors que les souris ayant reçu les Tc1 commencent à
montrer des faiblesses motrices au jour 5 après transfert, les souris ayant reçu les Th1
montrent ces faiblesses qu’à partir du jour 10. Ainsi on pourrait suggérer que les Th1 peuvent
agir seuls en créant des dommages dans le SNC responsables des pertes de poids et des
baisses de performances physiques mais qu’ils ont cependant un effet moins rapide que les
Tc1 seuls mais ces Th1 semblent également moins délétères aux vues des résultats
histologiques comparés à ceux des souris ayant reçu des Tc1. En effet, il a été montré que
l’inflammation du SNC des souris MOG-HA transférées avec des Tc1 commençait au jour 5.
La démyélinisation apparaissait quant à elle au jour 8 au niveau du nerf optique et au jour 18
au niveau de la moelle épinière. Cette inflammation et démyélinisation était maintenue
jusqu’au jour 28. Par contre, 56 jours après le transfert de Tc1, tous les signes inflammatoires
avaient disparu et des signes de remyélinisation apparaissaient. Les analyses histologiques des
souris MOG-HA transférées avec les Th1 ont révélé une faible infiltration des Th1 dans le
195
SNC ainsi qu’une faible inflammation sans toutefois provoquer de démyélinisation de la gaine
de myéline.
Nous pouvons donc conclure que les Th1 sont capables de pénétrer dans le SNC des
souris MOG-HA après avoir été activés in vitro, de recruter des cellules de l’immunité innée
(macrophages et CD), d’activer les cellules résidantes du SNC comme la microglie et
d’induire ainsi à elles seules une inflammation de ce SNC, sans toutefois provoquer des
dommages tissulaires neurologiques responsables de la maladie. Ces données confirment donc
les pensées actuelles sur le rôle des LT dans la SEP et l’EAE. En effet, longtemps considéré
comme seuls responsables de la maladie, les LT-CD4+ se voient ici attribuer un rôle non
exclusif dans la pathogenèse de la maladie puisque dans notre modèle, ils ne permettent pas à
eux seuls de déclencher la maladie.
b. Dans d’autres maladies auto-immunes
De la même manière, l’équipe de Vignali a récemment bousculé les connaissances sur
le diabète de type 1 en démontrant via l’utilisation de souris rétrogéniques que les LT-CD4+
auto-réactifs s’accumulaient bien dans les îlots pancréatiques mais ne causaient pas à eux
seuls la maladie(Lennon, Bettini et al. 2009). Par contre, il a été récemment montré un rôle
crucial des LT-CD4+ (Th1) dans les phases précoces de l’arthrite rhumatoïde alors que
d’autres LT-CD4+ (Th17) joueraient un rôle plus tardif dans la maladie (van den Berg 2009).
Les conditions de l’exposition antigénique (incluant la qualité et la quantité de TCR stimulés)
détermineraient le phénotype effecteur dominant (Luger, Silver et al. 2008).
3. Une possible collaboration Tc1/Th1 ?
a. Dans la SEP et l’EAE
Il est aujourd’hui admis que les LT-CD8+ et les LT-CD4+ effecteurs jouent un rôle
important dans la pathologie de la SEP. Cependant, très peu d’études se sont intéressées à leur
coopération et possible synergie d’action dans la maladie. Une première suggestion de
coopération avait été mise en évidence suite à des expériences sur un modèle animal
humanisé où il a été démontré que l’initiation de la maladie était due aux LT-CD8+ alors que
le devenir de cette maladie dépendait principalement des LT-CD4+. Il a également été montré
196
que des LT-CD8+ spécifiques d’un peptide myélinique (PLP) pouvaient jouer un rôle dans el
recrutement et le maintien des LT-CD4+spécifiques de ce peptide (Turner 1998). Un autre
groupe a démontré cette coopération mais dans des conditions particulières de lymphopénie
où l’action des deux populations s’alliait pour rompre la tolérance périphérique et induire une
auto-immunité (Le Saout, Mennechet et al. 2008). D’autres études ont montré également que
ces deux populations CD4 et CD8 étaient respectivement présentes à différents stades de la
maladie. En effet des changements chronologiques de ces deux populations sont observés
durant l’évolution de la maladie (Tohoku 2007). De plus, il a été montré que les LT-CD8+
avaient besoin des LT-CD4+ pour soutenir l’inflammation du SNC au cours d’une EAE
chronique (Bettini, Rosenthal et al. 2009).
Sur ces bases expérimentales, je me suis donc intéressée, dans le modèle MOG-HA,
au rôle des LT-CD4+ spécifiques de HA, activés in vitro (Th1) en coopération avec les LTCD8+ spécifiques de HA, activés in vitro (Tc1).
Pour cela, 30.106 de Tc1 spécifiques de HA ou 30.106 de Th1 spécifiques de HA ou
30.106 de Tc1 spécifiques de HA + 30.106 de Th1 spécifiques de HA ont été transférés aux
souris MOG-HA. Ces dernières ont été analysées selon trois critères : l’analyse clinique,
l’analyse histologique et la caractérisation des cellules infiltrant leur SNC.
Au niveau clinique, ces animaux perdent du poids plus précocement que lorsque
chaque population est transférée isolément (entre jour 5 et 11) et de façon plus importante.
Cependant les différences de poids entre les différents groupes ne permettent pas de révéler
une différence significative induite par le double transfert, n’impliquant donc pas une
coopération, à ce niveau là, entre les deux populations Tc1 et Th1. Ces résultats sont
confirmés par les tests de ROTaRod qui ne révèlent aucune amplification des conséquences
motrices sur les souris doublement transférées.
Au niveau histologique par contre, les analyses montrent une forte inflammation du
SNC lorsque les souris reçoivent les deux types de populations ainsi qu’une démyélinisation
de certaines zones. Ainsi le co-transfert Tc1 + Th1 aggrave les signes neurologiques de la
maladie révélant une coopération entre les deux populations.
Cette coopération est confirmée avec l’étude en cytométrie de flux des cellules
inflammatoires des souris MOG-HA transférées. En effet, les lymphocytes sont en nombre
absolu beaucoup plus nombreuses lorsque la souris a reçu les deux populations comparé aux
souris ayant reçu les Tc1 seuls ou les Th1 seuls. Par contre, la présence de ces populations ne
semble pas influencer les cellules de la microglie ou les cellules macrophagiques qui se
197
retrouvent en quantité similaire dans le SNC quelque soit le transfert effectué. Néanmoins, il
semble que ce co-transfert ait un effet sur les CD en favorisant leur recrutement au sein du
SNC. En effet, lors de ce co-transfert, le nombre absolu de CD a triplé comparé au nombre de
CD infiltrant le SNC lors des simples transferts. La présence des deux populations favoriserait
donc la présentation antigénique au sein du SNC par les CD et ceci expliquerait pourquoi les
conséquences cliniques et histologiques sont plus importantes dans les souris doublement
transférées par rapport aux souris ayant reçu qu’une des deux populations.
Cependant, au cours de ces travaux, l’analyse a été réalisée sur des LT discriminés sur
la base de l’expression des molécules CD45 et Thy1.2, molécules de surface exprimées tant
sur les LT-CD4+ que sur les LT-CD8+. Ainsi nous ne pouvons pas conclure sur l’effet réel de
synergie des deux populations. Est –ce par un contact direct que les LT-CD8+ et les LT-CD4+
agissent en synergie (contact CD40/CD40L, expression de récepteur particuliers) ? Est–ce par
aide réciproque sur l’environnement (sécrétion de cytokine, recrutement de différentes
cellules de l’immunité) que ces LT infiltrent le SNC ? Est-ce une population particulière qui
pénètre majoritairement dans le SNC, l’autre aidant à la rupture de la barrière hématoencéphalique ?
Nous pourrions répondre à ces questions en discriminant chaque population isolément
afin de connaître l’implication de chacune d’elles dans les différentes étapes de la maladie. Il
serait ainsi intéressant de pouvoir tracer in vivo le devenir de chaque population. Pour cela,
l’idée serait de marquer par deux protéines fluorescentes différentes les Tc1 et les Th1 durant
leur culture et de les transférer aux souris MOG-HA. Des expériences préliminaires ont déjà
été réalisées pour les Tc1. Pour cela, les cultures cellulaires de LT sont mises en présence de
cellules qui contiennent un rétrovirus contenant la GFP permettant ainsi de transduire les LT
en culture. Ainsi, à la fin de la culture, 90% des Tc1 sont marqués à la GFP. Ce marquage est
retrouvé 9 jours après transfert dans le SNC des souris receveuses et permet une analyse
précise des LT transférés. L’élaboration des cellules contenant un virus exprimant le DsRed
est en cours de réalisation. Grâce à ces deux nouveaux outils, les Tc1 et Th1 pourront être
ainsi différenciés par leur marquage fluorescent et être étudiés plus précisément. L’utilisation
de souris congéniques pourrait également faciliter l’interprétation des résultats. Une technique
récente pourrait également améliorer l’analyse des résultats : l’utilisation du microscope biphotonique. Cela permettrait ainsi non seulement de tracer les populations lymphocytaires
transférées mais également de faire une cinétique d’action de ces populations au cours de la
maladie. En effet, l’utilisation du bi-photon nous permettrait d’analyser en temps réel sur une
198
souris vivante le trajet des différentes populations CD4 et CD8 ainsi que leur interaction entre
elles ou avec le milieu environnant et ceci sur plusieurs temps (ce qu’il est impossible de faire
au niveau histologique puisque les souris étaient sacrifiées au jour d’analyse).
Une fois ces populations identifiées, il sera intéressant de comprendre comment
agissent ces cellules. Nous pourrons alors envisager des expériences de prolifération de ces
populations pour savoir si ce sont les LT qui prolifèrent suite à leur activation et pénétration
dans le SNC ou si l’infiltration abondante de LT dans le SNC observée est du à un
recrutement beaucoup plus important de LT qui peuvent davantage passer la barrière hématoencéphalique. Il serait donc intéressant de marquer les Tc1 avec du CFSE et les Th1 avec du
CMTMR par exemple afin d’analyser leur prolifération in vivo. Des tests in vitro pourront
également venir compléter ces données par des cultures de Tc1 ou Th1 ou Tc1+Th1 marquées
en thymidine tritiée.
Afin de mieux caractériser ces cellules infiltrantes, des analyses fonctionnelles
pourraient être envisagées pour connaître les chimiokines nécessaires à leur recrutement dans
les SNC, l’expression des récepteurs qu’elles expriment à leur surface ainsi que le milieu
cytokinique dans lequel elles évoluent dans ce contexte inflammatoire. Cela permettrait de
savoir si les LT agissent par interaction directe ou via une action indirecte (cytokine,
changement de récepteurs à leur surface…) d’une population sur l’autre. L’équipe de
Hernandez avait déjà démontré que l’aide apportée par les LT-CD4+ permettait la conversion
d’un signal tolérogène en un signal d’activation pour le LT-CD8+, induisant non seulement
une augmentation de la prolifération mais également une différenciation en cellules effectrices
(Le Saout, Mennechet et al. 2008). Ceci suggérant fortement une implication de la
présentation croisée par les CPA. Pour vérifier dans notre modèle cette hypothèse, nous
pourrions tester l’effet d’un anticorps dirigé contre le CD40 ou le CD40L qui empêcherait
ainsi le contact entre les LT-CD8+ et les LT-CD4+. Ainsi on pourrait envisager dans ce
modèle des souris MOG-HA transférées avec les LT-CD8+ naïfs et des Th1 et traité les
animaux receveurs avec cet anticorps bloquant le CD40 ou le CD40L où le LT-CD4+ activé
ne pourrait plus activer le LT-CD8+ et induirait donc chez ces souris une maladie moins
sévère, si la synergie d’action de ces deux populations passent par une voie directe.
Des études avec des anticorps bloquant différentes molécules impliquées dans le
recrutement et la passage de ces deux populations à travers la barrière hémato-encéphalique
pourraient également être intéressante pour savoir si une population joue un rôle précoce et
l’autre tardif ou si une population est impliquée dans l’initiation de la maladie et l’autre dans
199
l’entretien de la pathologie comme l’avait montré l’équipe d’Evavold dans leur modèle
(Bettini, Rosenthal et al. 2009).
De plus, les analyses de caractérisation ont été réalisées au jour 9 après transfert des
LT, en accord avec les résultats précédemment obtenus par l’équipe pour les Tc1. Des
analyses au jour 5 ont été également réalisées mais elles ne révélaient que trop peu de cellules
infiltrant le SNC pour être interprétables. Il serait par la suite intéressant de refaire ces
expériences à des jours ultérieurs comme jour 18 pour mesurer dans ce contexte d’analyse les
différences notables en histologie. Des cinétiques pourraient également être envisagées pour
analyser la production de cytokine et le profil d’expression génique des différents LT isolés
du SNC des souris MOG-HA transférées soit qu’avec Tc1 soit qu’avec Th1 soit avec les
deux. Ainsi à différent temps, les LT isolés du SNC de ces souris pourraient être discriminé
selon l’expression de leur CD4 ou CD8 et chaque population pourrait être analysée en Elisa
ou en luminex pour leur production cytokinique ou en multiplex pour l’expression génique de
ces différentes populations.
Précedemment en introduction, nous avons vu que le système immunitaire est capable
de discerner avec une grande exactitude les molécules du Soi et du non-Soi. Une défaillance
dans cette discrimination conduit à une susceptibilité accrue aux réactions auto-immune. Cette
hypothèse est très largement discutée aujourd’hui pour la SEP où il semble que l’infection
virale soit un déterminant très important dans le déclenchement de la maladie, en combinaison
bien évidemment avec d’autres facteurs environnementaux et génétiques. De plus, chez les
patients atteints de SEP, une dérégulation de la réponse immune contre le virus Epstein-Barr a
été identifiée, impliquant une fois de plus l’infection virale dans la physiopathologie de la
maladie (Munz, Lunemann et al. 2009). Des modèles murins ont permis de montrer que
l’inflammation auto-immune dans le SNC pouvait être déclenchée par l’infection avec le virus
de Theiler.
Plusieurs mécanismes sont aujourd’hui suggérés pour expliquer cette influence virale
comme le mimétisme moléculaire, la diversification épitopique et l’activation bystander
(Munz, Lunemann et al. 2009). Mais il a été montré récemment que d’autres mécanismes
émergents pouvaient être impliqué dans les maladies auto-immunes comme la persistance du
virus de Theiler au niveau de la microglie des animaux infectés qui permettait une
surexpression des molécules de CMH de classe II au niveau de ces cellules et qui par
conséquent augmentait la capacité de ces cellules à présenter des antigènes, notamment des
200
auto-antigènes. Ainsi les agents infectieux pourraient jouer le rôle d’adjuvant pour l’activation
et la potentialisation de la maladie.
Dans notre contexte il serait donc intéressant de procéder à des infections virales par
le virus influenza à des animaux ayant reçu soit des transferts Tc1, soit des transfert Th1 soit
des co-transferts afin d’analyser les différentes populations T infiltrants le SNC suite à ces
infections. Ainsi l’on pourrait savoir si l’infection favorise une réponse Tc1 ou Th1, si les
deux populations sont réactivées de la même manière suite à cette infection et qu’elle est la
synergie d’action des différentes cellules immunes intervenants dans la physiopathologie de la
maladie.
b. Dans d’autres maladies auto-immunes
Les hypothèses sur l’origine des maladies auto-immunes impliquaient, comme nous
l’avons vu dans les paragraphes précédents, principalement les LT-CD4+. Mais les avancés
technologiques et scientifiques ont permis de montrer un rôle tout aussi important des LTCD8+. Ce n’est donc pas surprenant que plusieurs équipes se soient intéressées à une
collaboration potentielle des populations CD4 et CD8 dans des maladies auto-immunes
spécifiques d’organe autres que la SEP. Ainsi une synergie ou collaboration directe de ces
deux populations ont pu être démontrées pour le diabète de type 1 après transfert de CD4 et de
CD8 dans des souris NOD. En effet, les deux populations sont nécessaires pour l’induction de
la maladie. De plus, l’équipe de Xiang a démontré dans le diabète de type 1 que la population
lymphocytaire T-CD4+ auxiliaire pouvait directement stimuler les LT-CD8+ cytotoxiques en
acquiérant à leur surface des molécules spécifiques des CD (notamment le CD80) et jouant
ainsi le rôle de Th-CPA pour activer les CTL. Le LT-CD4+ ne joue plus son rôle de LT
producteur de cytokines pro-inflammatoires mais un rôle de CPA nécessaire à l’activation des
LT-CD8+ cytotoxiques (Ye, Ahmed et al. 2008). Beaucoup d’autres études sur le diabète de
type 1 ont cependant montré le rôle indépendant des deux populations, les impliquant dans la
pathogenèse de la maladie (Duffy 2007; James and Kwok 2007; Hedman, Faresjo et al. 2008).
Des études ont également été faite sur l’arthrite rhumatoïde où la collaboration des deux
populations n’ a pu être démontrée mais comme pour le diabètes de type 1, ces études ont
montré l’importance des deux populations dans la pathogénèse de la maladie (Haworth,
Hardie et al. 2008; Hussein, Fathi et al. 2008).
201
4. Une hypothétique synergie d’action entre Tc1 et anticorps ?
Comme pour les LT, le rôle des anticorps dans la SEP est actuellement bien démontré
tant pour la maladie murine qu’humaine. Il est en effet suggéré que suite à l’infiltration de LT
spécifiques d’antigènes myéliniques dans le SNC et initiation de l’inflammation, les autoanticorps dirigés contre les protéines myéliniques peuvent traverser la BHE endommagée et
créer une démyélinisation. Différents mécanismes ont été impliqués pour expliquer cette
démyélinisation. Certains auteurs ont démontré le rôle du complément dans ce phénomène
(Linington and Lassmann 1987; Linington, Morgan et al. 1989; Piddlesden, Lassmann et al.
1993), ce qui permettrait une attraction des macrophages à effet cytopathique direct. D’autres
auteurs ont montré que les LB pouvaient agir comme source d’anticorps reconnaissant les
composants de la myéline ou des axones ou des neurones, contribuant ainsi à la
démyélinisation. Néanmoins, certaines équipes ont au contraire démontré un rôle protecteur
de ces anticorps (Saoudi, Simmonds et al. 1995). Chez les patients atteints de SEP, il est
incontestable que la présence oligoclonale d’IgG dans le LCR ou au niveau des lésions
demeure une caractéristique de cette pathologie (Owens, Ritchie et al. 2003; Dalakas 2008;
Dalakas 2008), faisant de ces Ac des marqueurs de diagnostic de la maladie.
Dans ce contexte là, il a été interessant de s’interesser aux rôles potentiellement
synergiques des Tc1 et de ces anticorps démyélinisants dans la maladie. Pour cela, au cours de
ma thèse, j’ai pu, par des expériences de transfert adoptif de LT et d’injection d’Ac, aborder
cette problématique. Les résultats ont confirmé les données de Prinéas et Graham montrant un
dépôt de d’Ac et de complément au niveau des lésions sur la gaine de myéline. Plus
particulièrement, il a été retrouvé au niveau des lésions actives des dépots du complexe
terminal du complément C9néo contenant des IgG. Ainsi ces données vont dans le sens d’une
coopération Tc1/Ac puisque les lésions et l’inflammation sont plus importantes lorsque les
deux acteurs sont en jeu. Le dépôt du complément, l’action lytique des Tc1, ainsi que la
production de cytokines pourraient ainsi jouer un rôle dans l’aggration de la maladie comparé
aux simples transferts Tc1. Dans un modèle hypothétique, l’on pourrait imaginer que les LT
pénétrent la BHE, induisent une inflammation conduisant à une démyélinisation via la
production de cytokine ou une lyse directe. Cet environnement nouvellement inflammatoire
activerait la microglie présente et permettrait un recrutement massif de cellules de
l’immunnité innée comme les cellules dendritiques et permettrait également le passage des
202
LB producteurs d’Ac qui aggraveraient ainsi les conséquences physiques sur la gaine de
myéline en recrutant entre autre les molécules du complément.
Récemment, il a été démontré que la persistance virale de l’EBV au sein du SNC de
patients atteints de SEP permettait l’activation de cellules B (Aloisi, Serafini et al.). De plus,
plusieurs équipes (Sargsyan, Shearer et al.; Willis, Stadelmann et al. 2009) proposent qu’un
mécanisme impliqué dans la pathologie de la SEP puisse être lié à une infection par l’EBV. Il
est ainsi suggéré que l’infection dans le SNC par l’EBV peut contribuer tant aux phases
précoces que tardives de la SEP. Basée sur ces observations, l’équipe de F. Aloisi a détecté
que les LB infectés par l’EBV pouvaient être détectés dans le cerveau des patients atteints de
SEP. De plus, ces LB infectés semblent être la cible de LT-CD8+ cytotoxiques (Serafini,
Rosicarelli et al. 2007). Ces données ont été soutenues par des études récentes montrant en
effet une accumulation de LT-CD8+ cytotoxiques et du virus dans le LCR de patients atteints
de SEP (Serafini, Rosicarelli et al. 2007).
Dans ce contexte, il serait intéressant de poursuivre les expériences de co-transfert
Ac/Tc1 chez des souris préalablement infectées par le virus Influenza. Ainsi, une
collaboration plus étroite pourrait être envisagée entre les différents facteurs de la réponse
immune au cours de la maladie.
203
BIBLIOGRAPHIE
204
BIBLIOGRAPHIE
Abi-Hanna, D., D. Wakefield, et al. (1988). "HLA antigens in ocular tissues. I. In vivo
expression in human eyes." Transplantation 45(3): 610-3.
Ackerman, A. L. and P. Cresswell (2004). "Cellular mechanisms governing cross-presentation
of exogenous antigens." Nat Immunol 5(7): 678-84.
Adelmann, M., J. Wood, et al. (1995). "The N-terminal domain of the myelin oligodendrocyte
glycoprotein (MOG) induces acute demyelinating experimental autoimmune
encephalomyelitis in the Lewis rat." J Neuroimmunol 63(1): 17-27.
Akbari, O., G. J. Freeman, et al. (2002). "Antigen-specific regulatory T cells develop via the
ICOS-ICOS-ligand pathway and inhibit allergen-induced airway hyperreactivity." Nat
Med 8(9): 1024-32.
Alarcon, R., C. Fuenzalida, et al. (2005). "Expression of scavenger receptors in glial cells.
Comparing the adhesion of astrocytes and microglia from neonatal rats to surfacebound beta-amyloid." J Biol Chem 280(34): 30406-15.
Albert, L. J. and R. D. Inman (1999). "Molecular mimicry and autoimmunity." N Engl J Med
341(27): 2068-74.
Alegre, M. L., K. A. Frauwirth, et al. (2001). "T-cell regulation by CD28 and CTLA-4." Nat
Rev Immunol 1(3): 220-8.
Allavena, R., S. Noy, et al. "CNS elevation of vascular and not mucosal addressin cell
adhesion molecules in patients with multiple sclerosis." Am J Pathol 176(2): 556-62.
Aloisi, F., F. Ria, et al. (2000). "Regulation of T-cell responses by CNS antigen-presenting
cells: different roles for microglia and astrocytes." Immunol Today 21(3): 141-7.
Aloisi, F., B. Serafini, et al. "Detection of Epstein-Barr virus and B-cell follicles in the
multiple sclerosis brain: what you find depends on how and where you look." Brain.
Anderson, A. C., L. B. Nicholson, et al. (2000). "High frequency of autoreactive myelin
proteolipid protein-specific T cells in the periphery of naive mice: mechanisms of
selection of the self-reactive repertoire." J Exp Med 191(5): 761-70.
Anderson, A. C., J. Reddy, et al. (2004). "IL-10 plays an important role in the homeostatic
regulation of the autoreactive repertoire in naive mice." J Immunol 173(2): 828-34.
Anderson, A. C., H. Waldner, et al. (2000). "Autoantigen-responsive T cell clones
demonstrate unfocused TCR cross-reactivity toward multiple related ligands:
implications for autoimmunity." Cell Immunol 202(2): 88-96.
Anderson, G. and E. J. Jenkinson (2001). "Lymphostromal interactions in thymic
development and function." Nat Rev Immunol 1(1): 31-40.
Andersson, J., D. Q. Tran, et al. (2008). "CD4+ FoxP3+ regulatory T cells confer infectious
tolerance in a TGF-beta-dependent manner." J Exp Med 205(9): 1975-81.
Anderton, S. M. and D. C. Wraith (2002). "Selection and fine-tuning of the autoimmune Tcell repertoire." Nat Rev Immunol 2(7): 487-98.
Apostolou, I., A. Sarukhan, et al. (2002). "Origin of regulatory T cells with known specificity
for antigen." Nat Immunol 3(8): 756-63.
Archelos, J. J. and H. P. Hartung (2000). "Pathogenetic role of autoantibodies in neurological
diseases." Trends Neurosci 23(7): 317-27.
Ascherio, A. and K. L. Munger (2007). "Environmental risk factors for multiple sclerosis.
Part I: the role of infection." Ann Neurol 61(4): 288-99.
Ashton-Rickardt, P. G. (1993). "The role of peptide in the positive selection of CD8+ T cells
in the thymus." Thymus 22(2): 111-5.
205
Ashton-Rickardt, P. G., L. Van Kaer, et al. (1993). "Repertoire-determining role of peptide in
the positive selection of CD8+ T cells." Immunol Rev 135: 157-82.
Asseman, C., S. Mauze, et al. (1999). "An essential role for interleukin 10 in the function of
regulatory T cells that inhibit intestinal inflammation." J Exp Med 190(7): 995-1004.
Azuma, M., D. Ito, et al. (1993). "B70 antigen is a second ligand for CTLA-4 and CD28."
Nature 366(6450): 76-9.
Azuma, T., T. Takahashi, et al. (2003). "Human CD4+ CD25+ regulatory T cells suppress
NKT cell functions." Cancer Res 63(15): 4516-20.
Baas, D., K. Prufer, et al. (2000). "Rat oligodendrocytes express the vitamin D(3) receptor
and respond to 1,25-dihydroxyvitamin D(3)." Glia 31(1): 59-68.
Babbe, H., A. Roers, et al. (2000). "Clonal expansions of CD8(+) T cells dominate the T cell
infiltrate in active multiple sclerosis lesions as shown by micromanipulation and single
cell polymerase chain reaction." J Exp Med 192(3): 393-404.
Bachmaier, K., C. Krawczyk, et al. (2000). "Negative regulation of lymphocyte activation and
autoimmunity by the molecular adaptor Cbl-b." Nature 403(6766): 211-6.
Baecher-Allan, C., J. A. Brown, et al. (2001). "CD4+CD25high regulatory cells in human
peripheral blood." J Immunol 167(3): 1245-53.
Baghdassarian, D., D. Toru-Delbauffe, et al. (1993). "Effects of transforming growth factorbeta 1 on the extracellular matrix and cytoskeleton of cultured astrocytes." Glia 7(3):
193-202.
Bailey, S. L., B. Schreiner, et al. (2007). "CNS myeloid DCs presenting endogenous myelin
peptides 'preferentially' polarize CD4+ T(H)-17 cells in relapsing EAE." Nat Immunol
8(2): 172-80.
Bain, P. and J. E. Toublanc (2002). "Adult height in congenital hypothyroidism: prognostic
factors and the importance of compliance with treatment." Horm Res 58(3): 136-42.
Baker, D., O. A. Rosenwasser, et al. (1995). "Genetic analysis of experimental allergic
encephalomyelitis in mice." J Immunol 155(8): 4046-51.
Ban, M., A. Goris, et al. (2009). "Replication analysis identifies TYK2 as a multiple sclerosis
susceptibility factor." Eur J Hum Genet 17(10): 1309-13.
Banchereau, J. and R. M. Steinman (1998). "Dendritic cells and the control of immunity."
Nature 392(6673): 245-52.
Barker, C. F. and R. E. Billingham (1977). "Immunologically privileged sites." Adv Immunol
25: 1-54.
Barnett, M. H., A. P. Henderson, et al. (2006). "The macrophage in MS: just a scavenger after
all? Pathology and pathogenesis of the acute MS lesion." Mult Scler 12(2): 121-32.
Baron, J. L., J. A. Madri, et al. (1993). "Surface expression of alpha 4 integrin by CD4 T cells
is required for their entry into brain parenchyma." J Exp Med 177(1): 57-68.
Barouki, R. (2006). "[Ageing free radicals and cellular stress]." Med Sci (Paris) 22(3): 26672.
Battistini, L., L. Piccio, et al. (2003). "CD8+ T cells from patients with acute multiple
sclerosis display selective increase of adhesiveness in brain venules: a critical role for
P-selectin glycoprotein ligand-1." Blood 101(12): 4775-82.
Bauer, M., C. Brakebusch, et al. (2009). "Beta1 integrins differentially control extravasation
of inflammatory cell subsets into the CNS during autoimmunity." Proc Natl Acad Sci
U S A 106(6): 1920-5.
Baumeister, W., J. Walz, et al. (1998). "The proteasome: paradigm of a selfcompartmentalizing protease." Cell 92(3): 367-80.
Beauvillain, C., S. Donnou, et al. (2008). "Neonatal and adult microglia cross-present
exogenous antigens." Glia 56(1): 69-77.
206
Becher, B., A. Prat, et al. (2000). "Brain-immune connection: immuno-regulatory properties
of CNS-resident cells." Glia 29(4): 293-304.
Bechmann, I., G. Mor, et al. (1999). "FasL (CD95L, Apo1L) is expressed in the normal rat
and human brain: evidence for the existence of an immunological brain barrier." Glia
27(1): 62-74.
Bechmann, I., J. Priller, et al. (2001). "Immune surveillance of mouse brain perivascular
spaces by blood-borne macrophages." Eur J Neurosci 14(10): 1651-8.
Beck, S. and J. Trowsdale (1999). "Sequence organisation of the class II region of the human
MHC." Immunol Rev 167: 201-10.
Begolka, W. S. and S. D. Miller (1998). "Cytokines as intrinsic and exogenous regulators of
pathogenesis in experimental autoimmune encephalomyelitis." Res Immunol 149(9):
771-81; discussion 843-4, 855-60.
Belkaid, Y., C. A. Piccirillo, et al. (2002). "CD4+CD25+ regulatory T cells control
Leishmania major persistence and immunity." Nature 420(6915): 502-7.
Ben-Nun, A. and I. R. Cohen (1982). "Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE)
mediated by T cell lines: process of selection of lines and characterization of the
cells." J Immunol 129(1): 303-8.
Bensinger, S. J., A. Bandeira, et al. (2001). "Major histocompatibility complex class IIpositive cortical epithelium mediates the selection of CD4(+)25(+) immunoregulatory
T cells." J Exp Med 194(4): 427-38.
Beresford, P. J., D. Zhang, et al. (2001). "Granzyme A activates an endoplasmic reticulumassociated caspase-independent nuclease to induce single-stranded DNA nicks." J Biol
Chem 276(46): 43285-93.
Berger, T., P. Rubner, et al. (2003). "Antimyelin antibodies as a predictor of clinically definite
multiple sclerosis after a first demyelinating event." N Engl J Med 349(2): 139-45.
Bergmann, C., L. Strauss, et al. (2007). "Expansion and characteristics of human T regulatory
type 1 cells in co-cultures simulating tumor microenvironment." Cancer Immunol
Immunother 56(9): 1429-42.
Bettelli, E., Y. Carrier, et al. (2006). "Reciprocal developmental pathways for the generation
of pathogenic effector TH17 and regulatory T cells." Nature 441(7090): 235-8.
Bettelli, E., M. P. Das, et al. (1998). "IL-10 is critical in the regulation of autoimmune
encephalomyelitis as demonstrated by studies of IL-10- and IL-4-deficient and
transgenic mice." J Immunol 161(7): 3299-306.
Bettelli, E., M. Pagany, et al. (2003). "Myelin oligodendrocyte glycoprotein-specific T cell
receptor transgenic mice develop spontaneous autoimmune optic neuritis." J Exp Med
197(9): 1073-81.
Bettini, M., K. Rosenthal, et al. (2009). "Pathogenic MOG-reactive CD8+ T cells require
MOG-reactive CD4+ T cells for sustained CNS inflammation during chronic EAE." J
Neuroimmunol 213(1-2): 60-8.
Bielekova, B., M. H. Sung, et al. (2004). "Expansion and functional relevance of high-avidity
myelin-specific CD4+ T cells in multiple sclerosis." J Immunol 172(6): 3893-904.
Billiau, A., H. Heremans, et al. (1988). "Enhancement of experimental allergic
encephalomyelitis in mice by antibodies against IFN-gamma." J Immunol 140(5):
1506-10.
Bitsch, A., T. Kuhlmann, et al. (2001). "A longitudinal MRI study of histopathologically
defined hypointense multiple sclerosis lesions." Ann Neurol 49(6): 793-6.
Bitsch, A., J. Schuchardt, et al. (2000). "Acute axonal injury in multiple sclerosis. Correlation
with demyelination and inflammation." Brain 123 (Pt 6): 1174-83.
Bixel, G., S. Kloep, et al. (2004). "Mouse CD99 participates in T-cell recruitment into
inflamed skin." Blood 104(10): 3205-13.
207
Blink, S. E. and S. D. Miller (2009). "The contribution of gammadelta T cells to the
pathogenesis of EAE and MS." Curr Mol Med 9(1): 15-22.
Bluestone, J. A. and Q. Tang (2005). "How do CD4+CD25+ regulatory T cells control
autoimmunity?" Curr Opin Immunol 17(6): 638-42.
Boismenu, R. and W. L. Havran (1994). "Modulation of epithelial cell growth by
intraepithelial gamma delta T cells." Science 266(5188): 1253-5.
Boissonnas, A., L. Fetler, et al. (2007). "In vivo imaging of cytotoxic T cell infiltration and
elimination of a solid tumor." J Exp Med 204(2): 345-56.
Boissonnas, A., A. Scholer-Dahirel, et al. "Foxp3+ T cells induce perforin-dependent
dendritic cell death in tumor-draining lymph nodes." Immunity 32(2): 266-78.
Bopp, T., C. Becker, et al. (2007). "Cyclic adenosine monophosphate is a key component of
regulatory T cell-mediated suppression." J Exp Med 204(6): 1303-10.
Borsellino, G., M. Kleinewietfeld, et al. (2007). "Expression of ectonucleotidase CD39 by
Foxp3+ Treg cells: hydrolysis of extracellular ATP and immune suppression." Blood
110(4): 1225-32.
Bourgeois, C., B. Rocha, et al. (2002). "A role for CD40 expression on CD8+ T cells in the
generation of CD8+ T cell memory." Science 297(5589): 2060-3.
Brabb, T., A. W. Goldrath, et al. (1997). "Triggers of autoimmune disease in a murine TCRtransgenic model for multiple sclerosis." J Immunol 159(1): 497-507.
Brabb, T., P. von Dassow, et al. (2000). "In situ tolerance within the central nervous system as
a mechanism for preventing autoimmunity." J Exp Med 192(6): 871-80.
Brady, R. L. and A. N. Barclay (1996). "The structure of CD4." Curr Top Microbiol Immunol
205: 1-18.
Breithaupt, C., A. Schubart, et al. (2003). "Structural insights into the antigenicity of myelin
oligodendrocyte glycoprotein." Proc Natl Acad Sci U S A 100(16): 9446-51.
Brenner, T., D. Soffer, et al. (1994). "Mast cells in experimental allergic encephalomyelitis:
characterization, distribution in the CNS and in vitro activation by myelin basic
protein and neuropeptides." J Neurol Sci 122(2): 210-3.
Brigl, M., L. Bry, et al. (2003). "Mechanism of CD1d-restricted natural killer T cell activation
during microbial infection." Nat Immunol 4(12): 1230-7.
Brodsky, F. M. and L. E. Guagliardi (1991). "The cell biology of antigen processing and
presentation." Annu Rev Immunol 9: 707-44.
Brostoff, S. W. and D. W. Mason (1984). "Experimental allergic encephalomyelitis:
successful treatment in vivo with a monoclonal antibody that recognizes T helper
cells." J Immunol 133(4): 1938-42.
Brunet, J. F., F. Denizot, et al. (1987). "A new member of the immunoglobulin superfamily-CTLA-4." Nature 328(6127): 267-70.
Brunner, C., H. Lassmann, et al. (1989). "Differential ultrastructural localization of myelin
basic protein, myelin/oligodendroglial glycoprotein, and 2',3'-cyclic nucleotide 3'phosphodiesterase in the CNS of adult rats." J Neurochem 52(1): 296-304.
Brunner, T., R. J. Mogil, et al. (1995). "Cell-autonomous Fas (CD95)/Fas-ligand interaction
mediates activation-induced apoptosis in T-cell hybridomas." Nature 373(6513): 4414.
Bruno, R., L. Sabater, et al. (2002). "Multiple sclerosis candidate autoantigens except myelin
oligodendrocyte glycoprotein are transcribed in human thymus." Eur J Immunol
32(10): 2737-47.
Brynedal, B., K. Duvefelt, et al. (2007). "HLA-A confers an HLA-DRB1 independent
influence on the risk of multiple sclerosis." PLoS One 2(7): e664.
208
Bullock, T. N. and H. Yagita (2005). "Induction of CD70 on dendritic cells through CD40 or
TLR stimulation contributes to the development of CD8+ T cell responses in the
absence of CD4+ T cells." J Immunol 174(2): 710-7.
Bunt, S. K., P. Sinha, et al. (2006). "Inflammation induces myeloid-derived suppressor cells
that facilitate tumor progression." J Immunol 176(1): 284-90.
Burfoot, R. K., C. J. Jensen, et al. (2008). "SNP mapping and candidate gene sequencing in
the class I region of the HLA complex: searching for multiple sclerosis susceptibility
genes in Tasmanians." Tissue Antigens 71(1): 42-50.
Burkhart, C., G. Y. Liu, et al. (1999). "Peptide-induced T cell regulation of experimental
autoimmune encephalomyelitis: a role for IL-10." Int Immunol 11(10): 1625-34.
Butterfield, R. J., E. P. Blankenhorn, et al. (1999). "Genetic analysis of disease subtypes and
sexual dimorphisms in mouse experimental allergic encephalomyelitis (EAE):
relapsing/remitting and monophasic remitting/nonrelapsing EAE are
immunogenetically distinct." J Immunol 162(5): 3096-102.
Cabarrocas, J., J. Bauer, et al. (2003). "Effective and selective immune surveillance of the
brain by MHC class I-restricted cytotoxic T lymphocytes." Eur J Immunol 33(5):
1174-82.
Cabarrocas, J., C. Cassan, et al. (2006). "Foxp3+ CD25+ regulatory T cells specific for a neoself-antigen develop at the double-positive thymic stage." Proc Natl Acad Sci U S A
103(22): 8453-8.
Cabarrocas, J., T. C. Savidge, et al. (2003). "Role of enteric glial cells in inflammatory bowel
disease." Glia 41(1): 81-93.
Cai, Z. and J. Sprent (1994). "Resting and activated T cells display different requirements for
CD8 molecules." J Exp Med 179(6): 2005-15.
Calzascia, T., M. Pellegrini, et al. (2008). "CD4 T cells, lymphopenia, and IL-7 in a multistep
pathway to autoimmunity." Proc Natl Acad Sci U S A 105(8): 2999-3004.
Campbell, R. D. and C. M. Milner (1993). "MHC genes in autoimmunity." Curr Opin
Immunol 5(6): 887-93.
Cannella, B. and C. S. Raine (1995). "The adhesion molecule and cytokine profile of multiple
sclerosis lesions." Ann Neurol 37(4): 424-35.
Cantorna, M. T., C. E. Hayes, et al. (1996). "1,25-Dihydroxyvitamin D3 reversibly blocks the
progression of relapsing encephalomyelitis, a model of multiple sclerosis." Proc Natl
Acad Sci U S A 93(15): 7861-4.
Carrizosa, A. M., L. B. Nicholson, et al. (1998). "Expansion by self antigen is necessary for
the induction of experimental autoimmune encephalomyelitis by T cells primed with a
cross-reactive environmental antigen." J Immunol 161(7): 3307-14.
Carson, M. J. (2002). "Microglia as liaisons between the immune and central nervous
systems: functional implications for multiple sclerosis." Glia 40(2): 218-31.
Carson, M. J., J. M. Doose, et al. (2006). "CNS immune privilege: hiding in plain sight."
Immunol Rev 213: 48-65.
Cayrol, R., K. Wosik, et al. (2008). "Activated leukocyte cell adhesion molecule promotes
leukocyte trafficking into the central nervous system." Nat Immunol 9(2): 137-45.
Cederbom, L., H. Hall, et al. (2000). "CD4+CD25+ regulatory T cells down-regulate costimulatory molecules on antigen-presenting cells." Eur J Immunol 30(6): 1538-43.
Celie, J. W., R. H. Beelen, et al. (2009). "Heparan sulfate proteoglycans in extravasation:
assisting leukocyte guidance." Front Biosci 14: 4932-49.
Ceredig, R., H. R. MacDonald, et al. (1983). "Flow microfluorometric analysis of mouse
thymus development in vivo and in vitro." Eur J Immunol 13(3): 185-90.
209
Chambers, C. A., M. S. Kuhns, et al. (2001). "CTLA-4-mediated inhibition in regulation of T
cell responses: mechanisms and manipulation in tumor immunotherapy." Annu Rev
Immunol 19: 565-94.
Chang, S. C., F. Momburg, et al. (2005). "The ER aminopeptidase, ERAP1, trims precursors
to lengths of MHC class I peptides by a "molecular ruler" mechanism." Proc Natl
Acad Sci U S A 102(47): 17107-12.
Chao, C. C., S. Hu, et al. (1995). "Tumor necrosis factor-alpha mediates the release of
bioactive transforming growth factor-beta in murine microglial cell cultures." Clin
Immunol Immunopathol 77(3): 358-65.
Chen, Y., C. L. Langrish, et al. (2006). "Anti-IL-23 therapy inhibits multiple inflammatory
pathways and ameliorates autoimmune encephalomyelitis." J Clin Invest 116(5):
1317-26.
Chiba, A., S. Oki, et al. (2004). "Suppression of collagen-induced arthritis by natural killer T
cell activation with OCH, a sphingosine-truncated analog of alphagalactosylceramide." Arthritis Rheum 50(1): 305-13.
Chien, Y. H. and M. M. Davis (1993). "How alpha beta T-cell receptors 'see' peptide/MHC
complexes." Immunol Today 14(12): 597-602.
Chikuma, S. and J. A. Bluestone (2003). "CTLA-4 and tolerance: the biochemical point of
view." Immunol Res 28(3): 241-53.
Chitnis, T. (2007). "The role of CD4 T cells in the pathogenesis of multiple sclerosis." Int Rev
Neurobiol 79: 43-72.
Chowdhury, D. and J. Lieberman (2008). "Death by a thousand cuts: granzyme pathways of
programmed cell death." Annu Rev Immunol 26: 389-420.
Collawn, J. F. and E. N. Benveniste (1999). "Regulation of MHC class II expression in the
central nervous system." Microbes Infect 1(11): 893-902.
Collison, L. W., C. J. Workman, et al. (2007). "The inhibitory cytokine IL-35 contributes to
regulatory T-cell function." Nature 450(7169): 566-9.
Compston, A. and A. Coles (2008). "Multiple sclerosis." Lancet 372(9648): 1502-17.
Constam, D. B., J. Philipp, et al. (1992). "Differential expression of transforming growth
factor-beta 1, -beta 2, and -beta 3 by glioblastoma cells, astrocytes, and microglia." J
Immunol 148(5): 1404-10.
Constant, S. L. and K. Bottomly (1997). "Induction of Th1 and Th2 CD4+ T cell responses:
the alternative approaches." Annu Rev Immunol 15: 297-322.
Corbella, P., D. Moskophidis, et al. (1994). "Functional commitment to helper T cell lineage
precedes positive selection and is independent of T cell receptor MHC specificity."
Immunity 1(4): 269-76.
Correale, J., M. C. Ysrraelit, et al. (2009). "Immunomodulatory effects of Vitamin D in
multiple sclerosis." Brain 132(Pt 5): 1146-60.
Cose, S., C. Brammer, et al. (2006). "Evidence that a significant number of naive T cells enter
non-lymphoid organs as part of a normal migratory pathway." Eur J Immunol 36(6):
1423-33.
Cosgrove, D., S. H. Chan, et al. (1992). "The thymic compartment responsible for positive
selection of CD4+ T cells." Int Immunol 4(6): 707-10.
Coutinho, A., I. Caramalho, et al. (2005). "Thymic commitment of regulatory T cells is a
pathway of TCR-dependent selection that isolates repertoires undergoing positive or
negative selection." Curr Top Microbiol Immunol 293: 43-71.
Crabtree, G. R. (1989). "Contingent genetic regulatory events in T lymphocyte activation."
Science 243(4889): 355-61.
210
Crawford, M. P., S. X. Yan, et al. (2004). "High prevalence of autoreactive, neuroantigenspecific CD8+ T cells in multiple sclerosis revealed by novel flow cytometric assay."
Blood 103(11): 4222-31.
Cresswell, P., N. Bangia, et al. (1999). "The nature of the MHC class I peptide loading
complex." Immunol Rev 172: 21-8.
Crome, S. Q., A. Y. Wang, et al. "Translational mini-review series on Th17 cells: function
and regulation of human T helper 17 cells in health and disease." Clin Exp Immunol
159(2): 109-19.
Croxford, J. L., J. K. O'Neill, et al. (1997). "Polygenic control of experimental allergic
encephalomyelitis in Biozzi ABH and BALB/c mice." J Neuroimmunol 74(1-2): 20511.
Cua, D. J., H. Groux, et al. (1999). "Transgenic interleukin 10 prevents induction of
experimental autoimmune encephalomyelitis." J Exp Med 189(6): 1005-10.
Cua, D. J., J. Sherlock, et al. (2003). "Interleukin-23 rather than interleukin-12 is the critical
cytokine for autoimmune inflammation of the brain." Nature 421(6924): 744-8.
Dalakas, M. C. (2008). "B cells as therapeutic targets in autoimmune neurological disorders."
Nat Clin Pract Neurol 4(10): 557-67.
Dalakas, M. C. (2008). "Invited article: inhibition of B cell functions: implications for
neurology." Neurology 70(23): 2252-60.
Danton, G. H. and W. D. Dietrich (2003). "Inflammatory mechanisms after ischemia and
stroke." J Neuropathol Exp Neurol 62(2): 127-36.
Dariavach, P., M. G. Mattei, et al. (1988). "Human Ig superfamily CTLA-4 gene:
chromosomal localization and identity of protein sequence between murine and human
CTLA-4 cytoplasmic domains." Eur J Immunol 18(12): 1901-5.
Davidson, A. and C. Aranow (2006). "Pathogenesis and treatment of systemic lupus
erythematosus nephritis." Curr Opin Rheumatol 18(5): 468-75.
Davignon, D., E. Martz, et al. (1981). "Lymphocyte function-associated antigen 1 (LFA-1): a
surface antigen distinct from Lyt-2,3 that participates in T lymphocyte-mediated
killing." Proc Natl Acad Sci U S A 78(7): 4535-9.
Davignon, D., E. Martz, et al. (1981). "Monoclonal antibody to a novel lymphocyte functionassociated antigen (LFA-1): mechanism of blockade of T lymphocyte-mediated killing
and effects on other T and B lymphocyte functions." J Immunol 127(2): 590-5.
Davis, M. M. and P. J. Bjorkman (1988). "T-cell antigen receptor genes and T-cell
recognition." Nature 334(6181): 395-402.
Davis, M. M., J. J. Boniface, et al. (1998). "Ligand recognition by alpha beta T cell
receptors." Annu Rev Immunol 16: 523-44.
De Becker, G., V. Moulin, et al. (1998). "Regulation of T helper cell differentiation in vivo by
soluble and membrane proteins provided by antigen-presenting cells." Eur J Immunol
28(10): 3161-71.
De Jager, P. L., C. Baecher-Allan, et al. (2009). "The role of the CD58 locus in multiple
sclerosis." Proc Natl Acad Sci U S A 106(13): 5264-9.
de Saint-Vis, B., J. Vincent, et al. (1998). "A novel lysosome-associated membrane
glycoprotein, DC-LAMP, induced upon DC maturation, is transiently expressed in
MHC class II compartment." Immunity 9(3): 325-36.
De Smedt, T., M. Van Mechelen, et al. (1997). "Effect of interleukin-10 on dendritic cell
maturation and function." Eur J Immunol 27(5): 1229-35.
Deaglio, S., K. M. Dwyer, et al. (2007). "Adenosine generation catalyzed by CD39 and CD73
expressed on regulatory T cells mediates immune suppression." J Exp Med 204(6):
1257-65.
211
Delarasse, C., P. Daubas, et al. (2003). "Myelin/oligodendrocyte glycoprotein-deficient
(MOG-deficient) mice reveal lack of immune tolerance to MOG in wild-type mice." J
Clin Invest 112(4): 544-53.
Delgado, M., C. Abad, et al. (2002). "Vasoactive intestinal peptide in the immune system:
potential therapeutic role in inflammatory and autoimmune diseases." J Mol Med
80(1): 16-24.
Delgado, M. and D. Ganea (2003). "Vasoactive intestinal peptide inhibits IL-8 production in
human monocytes by downregulating nuclear factor kappaB-dependent transcriptional
activity." Biochem Biophys Res Commun 302(2): 275-83.
Dembic, Z., W. Haas, et al. (1986). "Transfer of specificity by murine alpha and beta T-cell
receptor genes." Nature 320(6059): 232-8.
Derbinski, J., J. Gabler, et al. (2005). "Promiscuous gene expression in thymic epithelial cells
is regulated at multiple levels." J Exp Med 202(1): 33-45.
Derbinski, J., A. Schulte, et al. (2001). "Promiscuous gene expression in medullary thymic
epithelial cells mirrors the peripheral self." Nat Immunol 2(11): 1032-9.
Dhein, J., H. Walczak, et al. (1995). "Autocrine T-cell suicide mediated by APO1/(Fas/CD95)." Nature 373(6513): 438-41.
Diehl, L., G. J. van Mierlo, et al. (2002). "In vivo triggering through 4-1BB enables Thindependent priming of CTL in the presence of an intact CD28 costimulatory
pathway." J Immunol 168(8): 3755-62.
Dobbertin, A., P. Schmid, et al. (1997). "Neurons promote macrophage proliferation by
producing transforming growth factor-beta2." J Neurosci 17(14): 5305-15.
Dore-Duffy, P., R. Balabanov, et al. (1996). "Recovery phase of acute experimental
autoimmune encephalomyelitis in rats corresponds to development of endothelial cell
unresponsiveness to interferon gamma activation." J Neurosci Res 44(3): 223-34.
Dorner, T. and P. E. Lipsky (2004). "Correlation of circulating CD27high plasma cells and
disease activity in systemic lupus erythematosus." Lupus 13(5): 283-9.
Duddy, M., M. Niino, et al. (2007). "Distinct effector cytokine profiles of memory and naive
human B cell subsets and implication in multiple sclerosis." J Immunol 178(10): 60929.
Duffy, D. L. (2007). "Genetic determinants of diabetes are similarly associated with other
immune-mediated diseases." Curr Opin Allergy Clin Immunol 7(6): 468-74.
Duhen, T., R. Geiger, et al. (2009). "Production of interleukin 22 but not interleukin 17 by a
subset of human skin-homing memory T cells." Nat Immunol 10(8): 857-63.
Dunon, D. and B. A. Imhof (2000). "The role of cell traffic in the emergence of the T
lymphoid system." Semin Immunol 12(5): 429-33.
Duong, T. T., F. D. Finkelman, et al. (1994). "Effect of anti-interferon-gamma monoclonal
antibody treatment on the development of experimental allergic encephalomyelitis in
resistant mouse strains." J Neuroimmunol 53(1): 101-7.
Duong, T. T., J. St Louis, et al. (1992). "Effect of anti-interferon-gamma and anti-interleukin2 monoclonal antibody treatment on the development of actively and passively
induced experimental allergic encephalomyelitis in the SJL/J mouse." J
Neuroimmunol 36(2-3): 105-15.
Dustin, M. L. (2009). "Multiscale analysis of T cell activation: correlating in vitro and in vivo
analysis of the immunological synapse." Curr Top Microbiol Immunol 334: 47-70.
Dustin, M. L. and T. A. Springer (1989). "T-cell receptor cross-linking transiently stimulates
adhesiveness through LFA-1." Nature 341(6243): 619-24.
Dyment, D. A., G. C. Ebers, et al. (2004). "Genetics of multiple sclerosis." Lancet Neurol
3(2): 104-10.
212
Earle, K. E., Q. Tang, et al. (2005). "In vitro expanded human CD4+CD25+ regulatory T cells
suppress effector T cell proliferation." Clin Immunol 115(1): 3-9.
Ebers, G. C., I. M. Yee, et al. (2000). "Conjugal multiple sclerosis: population-based
prevalence and recurrence risks in offspring. Canadian Collaborative Study Group."
Ann Neurol 48(6): 927-31.
Eikelenboom, M. J., J. Killestein, et al. (2002). "Chemokine receptor expression on T cells is
related to new lesion development in multiple sclerosis." J Neuroimmunol 133(1-2):
225-32.
Einstein, E. R., D. M. Robertson, et al. (1962). "The isolation from bovine spinal cord of a
homogeneous protein with encephalitogenic activity." J Neurochem 9: 353-61.
Elson, C. J. and R. N. Barker (2000). "Helper T cells in antibody-mediated, organ-specific
autoimmunity." Curr Opin Immunol 12(6): 664-9.
Encinas, J. A. and V. K. Kuchroo (1999). "Genetics of experimental autoimmune
encephalomyelitis." Curr Dir Autoimmun 1: 247-72.
Encinas, J. A., M. B. Lees, et al. (1996). "Genetic analysis of susceptibility to experimental
autoimmune encephalomyelitis in a cross between SJL/J and B10.S mice." J Immunol
157(5): 2186-92.
Engelhardt, B. (2008). "Immune cell entry into the central nervous system: involvement of
adhesion molecules and chemokines." J Neurol Sci 274(1-2): 23-6.
Engelhardt, B. and L. Sorokin (2009). "The blood-brain and the blood-cerebrospinal fluid
barriers: function and dysfunction." Semin Immunopathol.
Epplen, C., S. Jackel, et al. (1997). "Genetic predisposition to multiple sclerosis as revealed
by immunoprinting." Ann Neurol 41(3): 341-52.
Ercolini, A. M. and S. D. Miller (2006). "Mechanisms of immunopathology in murine models
of central nervous system demyelinating disease." J Immunol 176(6): 3293-8.
Erhardt, A., M. Biburger, et al. (2007). "IL-10, regulatory T cells, and Kupffer cells mediate
tolerance in concanavalin A-induced liver injury in mice." Hepatology 45(2): 475-85.
Espevik, T., I. S. Figari, et al. (1987). "Inhibition of cytokine production by cyclosporin A and
transforming growth factor beta." J Exp Med 166(2): 571-6.
Ezernitchi, A. V., I. Vaknin, et al. (2006). "TCR zeta down-regulation under chronic
inflammation is mediated by myeloid suppressor cells differentially distributed
between various lymphatic organs." J Immunol 177(7): 4763-72.
Fallarino, F., U. Grohmann, et al. (2003). "Modulation of tryptophan catabolism by regulatory
T cells." Nat Immunol 4(12): 1206-12.
Fan, Z., P. J. Beresford, et al. (2002). "HMG2 interacts with the nucleosome assembly protein
SET and is a target of the cytotoxic T-lymphocyte protease granzyme A." Mol Cell
Biol 22(8): 2810-20.
Faroudi, M., C. Utzny, et al. (2003). "Lytic versus stimulatory synapse in cytotoxic T
lymphocyte/target cell interaction: manifestation of a dual activation threshold." Proc
Natl Acad Sci U S A 100(24): 14145-50.
Fazilleau, N., C. Delarasse, et al. (2007). "T cell repertoire diversity is required for relapses in
myelin oligodendrocyte glycoprotein-induced experimental autoimmune
encephalomyelitis." J Immunol 178(8): 4865-75.
Feger, U., C. Luther, et al. (2007). "Increased frequency of CD4+ CD25+ regulatory T cells in
the cerebrospinal fluid but not in the blood of multiple sclerosis patients." Clin Exp
Immunol 147(3): 412-8.
Fehervari, Z. and S. Sakaguchi (2004). "CD4+ Tregs and immune control." J Clin Invest
114(9): 1209-17.
213
Feng, J. M., I. M. Givogri, et al. (2000). "Thymocytes express the golli products of the myelin
basic protein gene and levels of expression are stage dependent." J Immunol 165(10):
5443-50.
Ferber, I. A., S. Brocke, et al. (1996). "Mice with a disrupted IFN-gamma gene are
susceptible to the induction of experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE)." J
Immunol 156(1): 5-7.
Ferrone, C. R., M. A. Perales, et al. (2006). "Adjuvanticity of plasmid DNA encoding
cytokines fused to immunoglobulin Fc domains." Clin Cancer Res 12(18): 5511-9.
Filaci, G., M. Fravega, et al. (2004). "Nonantigen specific CD8+ T suppressor lymphocytes
originate from CD8+CD28- T cells and inhibit both T-cell proliferation and CTL
function." Hum Immunol 65(2): 142-56.
Fillatreau, S., C. H. Sweenie, et al. (2002). "B cells regulate autoimmunity by provision of IL10." Nat Immunol 3(10): 944-50.
Fischer, H. G. and G. Reichmann (2001). "Brain dendritic cells and macrophages/microglia in
central nervous system inflammation." J Immunol 166(4): 2717-26.
Flanders, K. C., G. Ludecke, et al. (1991). "Localization and actions of transforming growth
factor-beta s in the embryonic nervous system." Development 113(1): 183-91.
Folch, J. and M. Lees (1951). "Proteolipides, a new type of tissue lipoproteins; their isolation
from brain." J Biol Chem 191(2): 807-17.
Fontenot, J. D., M. A. Gavin, et al. (2003). "Foxp3 programs the development and function of
CD4+CD25+ regulatory T cells." Nat Immunol 4(4): 330-6.
Ford, A. L., E. Foulcher, et al. (1996). "Microglia induce CD4 T lymphocyte final effector
function and death." J Exp Med 184(5): 1737-45.
Freedman, A. S., G. J. Freeman, et al. (1991). "Selective induction of B7/BB-1 on interferongamma stimulated monocytes: a potential mechanism for amplification of T cell
activation through the CD28 pathway." Cell Immunol 137(2): 429-37.
Freeman, G. J., F. Borriello, et al. (1993). "Murine B7-2, an alternative CTLA4 counterreceptor that costimulates T cell proliferation and interleukin 2 production." J Exp
Med 178(6): 2185-92.
Freeman, G. J., A. S. Freedman, et al. (1989). "B7, a new member of the Ig superfamily with
unique expression on activated and neoplastic B cells." J Immunol 143(8): 2714-22.
Fremont, D. H., M. Matsumura, et al. (1992). "Crystal structures of two viral peptides in
complex with murine MHC class I H-2Kb." Science 257(5072): 919-27.
Friese, M. A. and L. Fugger (2005). "Autoreactive CD8+ T cells in multiple sclerosis: a new
target for therapy?" Brain 128(Pt 8): 1747-63.
Friese, M. A., K. B. Jakobsen, et al. (2008). "Opposing effects of HLA class I molecules in
tuning autoreactive CD8+ T cells in multiple sclerosis." Nat Med 14(11): 1227-35.
Fritz, R. B. and M. L. Zhao (1996). "Thymic expression of myelin basic protein (MBP).
Activation of MBP-specific T cells by thymic cells in the absence of exogenous
MBP." J Immunol 157(12): 5249-53.
Fu, G., S. Vallee, et al. (2009). "Themis controls thymocyte selection through regulation of T
cell antigen receptor-mediated signaling." Nat Immunol 10(8): 848-56.
Fugger, L., M. A. Friese, et al. (2009). "From genes to function: the next challenge to
understanding multiple sclerosis." Nat Rev Immunol.
Furlan, R., A. Bergami, et al. (2003). "Activation of invariant NKT cells by alphaGalCer
administration protects mice from MOG35-55-induced EAE: critical roles for
administration route and IFN-gamma." Eur J Immunol 33(7): 1830-8.
Gallimore, A., H. Hengartner, et al. (1998). "Hierarchies of antigen-specific cytotoxic T-cell
responses." Immunol Rev 164: 29-36.
214
Garcion, E., L. Sindji, et al. (2003). "Treatment of experimental autoimmune
encephalomyelitis in rat by 1,25-dihydroxyvitamin D3 leads to early effects within the
central nervous system." Acta Neuropathol 105(5): 438-48.
Garin, M. I., C. C. Chu, et al. (2007). "Galectin-1: a key effector of regulation mediated by
CD4+CD25+ T cells." Blood 109(5): 2058-65.
Gartner, D., H. Hoff, et al. (2006). "CD25 regulatory T cells determine secondary but not
primary remission in EAE: impact on long-term disease progression." J
Neuroimmunol 172(1-2): 73-84.
Gasser, D. L., C. M. Newlin, et al. (1973). "Genetic control of susceptibility to experimental
allergic encephalomyelitis in rats." Science 181(102): 872-3.
Gasser, D. L., J. Palm, et al. (1975). "Genetic control of susceptibility to experimental allergic
encephalomyelitis and the Ag-B locus of rats." J Immunol 115(2): 431-3.
Gavanescu, I., C. Benoist, et al. (2008). "B cells are required for Aire-deficient mice to
develop multi-organ autoinflammation: A therapeutic approach for APECED
patients." Proc Natl Acad Sci U S A 105(35): 13009-14.
Gay, D., P. Maddon, et al. (1987). "Functional interaction between human T-cell protein CD4
and the major histocompatibility complex HLA-DR antigen." Nature 328(6131): 6269.
Genain, C. P., B. Cannella, et al. (1999). "Identification of autoantibodies associated with
myelin damage in multiple sclerosis." Nat Med 5(2): 170-5.
Germain, R. N. and D. H. Margulies (1993). "The biochemistry and cell biology of antigen
processing and presentation." Annu Rev Immunol 11: 403-50.
gHafler, D. A., A. Compston, et al. (2007). "Risk alleles for multiple sclerosis identified by a
genomewide study." N Engl J Med 357(9): 851-62.
Ghiringhelli, F., C. Menard, et al. (2005). "CD4+CD25+ regulatory T cells inhibit natural
killer cell functions in a transforming growth factor-beta-dependent manner." J Exp
Med 202(8): 1075-85.
Gimenez, M. A., J. Sim, et al. (2006). "A tumor necrosis factor receptor 1-dependent
conversation between central nervous system-specific T cells and the central nervous
system is required for inflammatory infiltration of the spinal cord." Am J Pathol
168(4): 1200-9.
Glinka, Y. and G. J. Prud'homme (2008). "Neuropilin-1 is a receptor for transforming growth
factor beta-1, activates its latent form, and promotes regulatory T cell activity." J
Leukoc Biol 84(1): 302-10.
Gobel, K., N. Melzer, et al. "Collateral neuronal apoptosis in CNS gray matter during an
oligodendrocyte-directed CD8(+) T cell attack." Glia 58(4): 469-80.
Gomes, F. C., O. Sousa Vde, et al. (2005). "Emerging roles for TGF-beta1 in nervous system
development." Int J Dev Neurosci 23(5): 413-24.
Gonatas, N. K. and J. C. Howard (1974). "Inhibition of experimental allergic
encephalomyelitis in rats severely depleted of T cells." Science 186(4166): 839-41.
Gonnella, P. A., H. P. Waldner, et al. (2001). "B cell-deficient (mu MT) mice have alterations
in the cytokine microenvironment of the gut-associated lymphoid tissue (GALT) and a
defect in the low dose mechanism of oral tolerance." J Immunol 166(7): 4456-64.
Gordon, S. (2003). "Alternative activation of macrophages." Nat Rev Immunol 3(1): 23-35.
Gotter, J., B. Brors, et al. (2004). "Medullary epithelial cells of the human thymus express a
highly diverse selection of tissue-specific genes colocalized in chromosomal clusters."
J Exp Med 199(2): 155-66.
Goverman, J. (2009). "Autoimmune T cell responses in the central nervous system." Nat Rev
Immunol 9(6): 393-407.
215
Goverman, J., A. Perchellet, et al. (2005). "The role of CD8(+) T cells in multiple sclerosis
and its animal models." Curr Drug Targets Inflamm Allergy 4(2): 239-45.
Goverman, J., A. Woods, et al. (1993). "Transgenic mice that express a myelin basic proteinspecific T cell receptor develop spontaneous autoimmunity." Cell 72(4): 551-60.
Grakoui, A., S. K. Bromley, et al. (1999). "The immunological synapse: a molecular machine
controlling T cell activation." Science 285(5425): 221-7.
Gray, H. L., E. L. Sorensen, et al. (2001). "Three polymorphisms in the 3' UTR of the TRAIL
(TNF-related apoptosis-inducing ligand) gene." Genes Immun 2(8): 469-70.
Greter, M., F. L. Heppner, et al. (2005). "Dendritic cells permit immune invasion of the CNS
in an animal model of multiple sclerosis." Nat Med 11(3): 328-34.
Gross, J. A., E. Callas, et al. (1992). "Identification and distribution of the costimulatory
receptor CD28 in the mouse." J Immunol 149(2): 380-8.
Gross, J. A., J. Johnston, et al. (2000). "TACI and BCMA are receptors for a TNF homologue
implicated in B-cell autoimmune disease." Nature 404(6781): 995-9.
Guidos, C. J., J. S. Danska, et al. (1990). "T cell receptor-mediated negative selection of
autoreactive T lymphocyte precursors occurs after commitment to the CD4 or CD8
lineages." J Exp Med 172(3): 835-45.
Gutcher, I. and B. Becher (2007). "APC-derived cytokines and T cell polarization in
autoimmune inflammation." J Clin Invest 117(5): 1119-27.
Haas, J., A. Hug, et al. (2005). "Reduced suppressive effect of CD4+CD25high regulatory T
cells on the T cell immune response against myelin oligodendrocyte glycoprotein in
patients with multiple sclerosis." Eur J Immunol 35(11): 3343-52.
Habu, S., M. Kimura, et al. (1987). "Correlation of T cell receptor gene rearrangements to T
cell surface antigen expression and to serum immunoglobulin level in scid mice." Eur
J Immunol 17(10): 1467-71.
Hahn, M., M. J. Nicholson, et al. (2005). "Unconventional topology of self peptide-major
histocompatibility complex binding by a human autoimmune T cell receptor." Nat
Immunol 6(5): 490-6.
Hamerman, J. A., K. Ogasawara, et al. (2005). "NK cells in innate immunity." Curr Opin
Immunol 17(1): 29-35.
Hansen, T. H. and M. Bouvier (2009). "MHC class I antigen presentation: learning from viral
evasion strategies." Nat Rev Immunol 9(7): 503-13.
Happ, M. P., P. Wettstein, et al. (1988). "Genetic control of the development of experimental
allergic encephalomyelitis in rats. Separation of MHC and non-MHC gene effects." J
Immunol 141(5): 1489-94.
Hardy, R. R. and K. Hayakawa (2001). "B cell development pathways." Annu Rev Immunol
19: 595-621.
Harkiolaki, M., S. L. Holmes, et al. (2009). "T cell-mediated autoimmune disease due to lowaffinity crossreactivity to common microbial peptides." Immunity 30(3): 348-57.
Harris, D. P., L. Haynes, et al. (2000). "Reciprocal regulation of polarized cytokine
production by effector B and T cells." Nat Immunol 1(6): 475-82.
Hatachi, S., A. Kunitomi, et al. "CD8(+) T-cell lymphoproliferative disorder associated with
Epstein-Barr virus in a patient with rheumatoid arthritis during methotrexate therapy."
Mod Rheumatol.
Hatterer, E., M. Touret, et al. (2008). "Cerebrospinal fluid dendritic cells infiltrate the brain
parenchyma and target the cervical lymph nodes under neuroinflammatory
conditions." PLoS One 3(10): e3321.
Hauser, S. L., E. Waubant, et al. (2008). "B-cell depletion with rituximab in relapsingremitting multiple sclerosis." N Engl J Med 358(7): 676-88.
216
Havenith, C. E., D. Askew, et al. (1998). "Mouse resident microglia: isolation and
characterization of immunoregulatory properties with naive CD4+ and CD8+ T-cells."
Glia 22(4): 348-59.
Haworth, O., D. L. Hardie, et al. (2008). "A role for the integrin alpha6beta1 in the
differential distribution of CD4 and CD8 T-cell subsets within the rheumatoid
synovium." Rheumatology (Oxford) 47(9): 1329-34.
Heath, V. L., N. C. Moore, et al. (1998). "Intrathymic expression of genes involved in organ
specific autoimmune disease." J Autoimmun 11(4): 309-18.
Hedman, M., M. Faresjo, et al. (2008). "Impaired CD4 and CD8 T cell phenotype and reduced
chemokine secretion in recent-onset type 1 diabetic children." Clin Exp Immunol
153(3): 360-8.
Heissmeyer, V. and A. Rao (2004). "E3 ligases in T cell anergy--turning immune responses
into tolerance." Sci STKE 2004(241): pe29.
Helander, T. S., O. Carpen, et al. (1996). "ICAM-2 redistributed by ezrin as a target for killer
cells." Nature 382(6588): 265-8.
Hemmer, B., J. J. Archelos, et al. (2002). "New concepts in the immunopathogenesis of
multiple sclerosis." Nat Rev Neurosci 3(4): 291-301.
Hemmer, B., S. Cepok, et al. (2002). "Pathogenesis of multiple sclerosis: an update on
immunology." Curr Opin Neurol 15(3): 227-31.
Heppner, F. L., M. Greter, et al. (2005). "Experimental autoimmune encephalomyelitis
repressed by microglial paralysis." Nat Med 11(2): 146-52.
Hernandez, M. G., L. Shen, et al. (2008). "CD40 on APCs is needed for optimal
programming, maintenance, and recall of CD8+ T cell memory even in the absence of
CD4+ T cell help." J Immunol 180(7): 4382-90.
Heydtmann, M. and D. H. Adams (2002). "Understanding selective trafficking of lymphocyte
subsets." Gut 50(2): 150-2.
Hochmeister, S., R. Grundtner, et al. (2006). "Dysferlin is a new marker for leaky brain blood
vessels in multiple sclerosis." J Neuropathol Exp Neurol 65(9): 855-65.
Hofstetter, H. H., S. M. Ibrahim, et al. (2005). "Therapeutic efficacy of IL-17 neutralization in
murine experimental autoimmune encephalomyelitis." Cell Immunol 237(2): 123-30.
Hori, S., T. L. Carvalho, et al. (2002). "CD25+CD4+ regulatory T cells suppress CD4+ T cellmediated pulmonary hyperinflammation driven by Pneumocystis carinii in
immunodeficient mice." Eur J Immunol 32(5): 1282-91.
Hori, S., T. Nomura, et al. (2003). "Control of regulatory T cell development by the
transcription factor Foxp3." Science 299(5609): 1057-61.
Houot, R., I. Perrot, et al. (2006). "Human CD4+CD25high regulatory T cells modulate
myeloid but not plasmacytoid dendritic cells activation." J Immunol 176(9): 5293-8.
Hovelmeyer, N., Z. Hao, et al. (2005). "Apoptosis of oligodendrocytes via Fas and TNF-R1 is
a key event in the induction of experimental autoimmune encephalomyelitis." J
Immunol 175(9): 5875-84.
Howard, T. A., J. M. Rochelle, et al. (1991). "Cd28 and Ctla-4, two related members of the Ig
supergene family, are tightly linked on proximal mouse chromosome 1."
Immunogenetics 33(1): 74-6.
Hsieh, C. S., Y. Liang, et al. (2004). "Recognition of the peripheral self by naturally arising
CD25+ CD4+ T cell receptors." Immunity 21(2): 267-77.
Huan, J., N. Culbertson, et al. (2005). "Decreased FOXP3 levels in multiple sclerosis
patients." J Neurosci Res 81(1): 45-52.
Huang, Y., F. Rezzoug, et al. (2004). "Matching at the MHC class I K locus is essential for
long-term engraftment of purified hematopoietic stem cells: a role for host NK cells in
regulating HSC engraftment." Blood 104(3): 873-80.
217
Huseby, E. S., D. Liggitt, et al. (2001). "A pathogenic role for myelin-specific CD8(+) T cells
in a model for multiple sclerosis." J Exp Med 194(5): 669-76.
Huseby, E. S., C. Ohlen, et al. (1999). "Cutting edge: myelin basic protein-specific cytotoxic
T cell tolerance is maintained in vivo by a single dominant epitope in H-2k mice." J
Immunol 163(3): 1115-8.
Huseby, E. S., J. White, et al. (2005). "How the T cell repertoire becomes peptide and MHC
specific." Cell 122(2): 247-60.
Husemann, J., J. D. Loike, et al. (2002). "Scavenger receptors in neurobiology and
neuropathology: their role on microglia and other cells of the nervous system." Glia
40(2): 195-205.
Hussein, M. R., N. A. Fathi, et al. (2008). "Alterations of the CD4(+), CD8 (+) T cell subsets,
interleukins-1beta, IL-10, IL-17, tumor necrosis factor-alpha and soluble intercellular
adhesion molecule-1 in rheumatoid arthritis and osteoarthritis: preliminary
observations." Pathol Oncol Res 14(3): 321-8.
Inaba, K., M. Witmer-Pack, et al. (1994). "The tissue distribution of the B7-2 costimulator in
mice: abundant expression on dendritic cells in situ and during maturation in vitro." J
Exp Med 180(5): 1849-60.
Irvine, K. A. and W. F. Blakemore (2008). "Remyelination protects axons from
demyelination-associated axon degeneration." Brain 131(Pt 6): 1464-77.
Issazadeh, S., A. Ljungdahl, et al. (1995). "Cytokine production in the central nervous system
of Lewis rats with experimental autoimmune encephalomyelitis: dynamics of mRNA
expression for interleukin-10, interleukin-12, cytolysin, tumor necrosis factor alpha
and tumor necrosis factor beta." J Neuroimmunol 61(2): 205-12.
Issazadeh, S., V. Navikas, et al. (1998). "Kinetics of expression of costimulatory molecules
and their ligands in murine relapsing experimental autoimmune encephalomyelitis in
vivo." J Immunol 161(3): 1104-12.
Itoh, M., T. Takahashi, et al. (1999). "Thymus and autoimmunity: production of CD25+CD4+
naturally anergic and suppressive T cells as a key function of the thymus in
maintaining immunologic self-tolerance." J Immunol 162(9): 5317-26.
Jack, C. S., N. Arbour, et al. (2005). "TLR signaling tailors innate immune responses in
human microglia and astrocytes." J Immunol 175(7): 4320-30.
James, E. A. and W. W. Kwok (2007). "CD8+ suppressor-mediated regulation of human
CD4+ T cell responses to glutamic acid decarboxylase 65." Eur J Immunol 37(1): 7886.
Jiang, H., N. S. Braunstein, et al. (2001). "CD8+ T cells control the TH phenotype of MBPreactive CD4+ T cells in EAE mice." Proc Natl Acad Sci U S A 98(11): 6301-6.
Jiang, H., S. I. Zhang, et al. (1992). "Role of CD8+ T cells in murine experimental allergic
encephalomyelitis." Science 256(5060): 1213-5.
Jiang, W., M. S. Anderson, et al. (2005). "Modifier loci condition autoimmunity provoked by
Aire deficiency." J Exp Med 202(6): 805-15.
Joffre, O., N. Gorsse, et al. (2004). "Induction of antigen-specific tolerance to bone marrow
allografts with CD4+CD25+ T lymphocytes." Blood 103(11): 4216-21.
Johnson, A. L., L. Aravind, et al. (2009). "Themis is a member of a new metazoan gene
family and is required for the completion of thymocyte positive selection." Nat
Immunol 10(8): 831-9.
Jolicoeur, C., D. Hanahan, et al. (1994). "T-cell tolerance toward a transgenic beta-cell
antigen and transcription of endogenous pancreatic genes in thymus." Proc Natl Acad
Sci U S A 91(14): 6707-11.
Joly, E., L. Mucke, et al. (1991). "Viral persistence in neurons explained by lack of major
histocompatibility class I expression." Science 253(5025): 1283-5.
218
Jones, E., M. Dahm-Vicker, et al. (2002). "Depletion of CD25+ regulatory cells results in
suppression of melanoma growth and induction of autoreactivity in mice." Cancer
Immun 2: 1.
Jordan, M. S., A. Boesteanu, et al. (2001). "Thymic selection of CD4+CD25+ regulatory T
cells induced by an agonist self-peptide." Nat Immunol 2(4): 301-6.
Juedes, A. E. and N. H. Ruddle (2001). "Resident and infiltrating central nervous system
APCs regulate the emergence and resolution of experimental autoimmune
encephalomyelitis." J Immunol 166(8): 5168-75.
Jurewicz, A., W. E. Biddison, et al. (1998). "MHC class I-restricted lysis of human
oligodendrocytes by myelin basic protein peptide-specific CD8 T lymphocytes." J
Immunol 160(6): 3056-9.
Kabat, H. (1947). "Studies on neuromuscular dysfunction; new principles of neuromuscular
reeducation." Perm Found Med Bull 5(3): 111-23.
Kalinski, P. and M. Moser (2005). "Consensual immunity: success-driven development of Thelper-1 and T-helper-2 responses." Nat Rev Immunol 5(3): 251-60.
Kanner, S. B., L. S. Grosmaire, et al. (1993). "Beta 2-integrin LFA-1 signaling through
phospholipase C-gamma 1 activation." Proc Natl Acad Sci U S A 90(15): 7099-103.
Karandikar, N. J., C. L. Vanderlugt, et al. (1998). "Tissue-specific up-regulation of B7-1
expression and function during the course of murine relapsing experimental
autoimmune encephalomyelitis." J Immunol 161(1): 192-9.
Karges, W., T. Rajasalu, et al. (2007). "The diabetogenic, insulin-specific CD8 T cell
response primed in the experimental autoimmune diabetes model in RIP-B7.1 mice."
Eur J Immunol 37(8): 2097-103.
Katz, J. D., B. Wang, et al. (1993). "Following a diabetogenic T cell from genesis through
pathogenesis." Cell 74(6): 1089-100.
Kaufmann, S. H., C. Blum, et al. (1993). "Crosstalk between alpha/beta T cells and
gamma/delta T cells in vivo: activation of alpha/beta T-cell responses after
gamma/delta T-cell modulation with the monoclonal antibody GL3." Proc Natl Acad
Sci U S A 90(20): 9620-4.
Kearney, E. R., K. A. Pape, et al. (1994). "Visualization of peptide-specific T cell immunity
and peripheral tolerance induction in vivo." Immunity 1(4): 327-39.
Kebir, H., K. Kreymborg, et al. (2007). "Human TH17 lymphocytes promote blood-brain
barrier disruption and central nervous system inflammation." Nat Med 13(10): 1173-5.
Kehrl, J. H., A. B. Roberts, et al. (1986). "Transforming growth factor beta is an important
immunomodulatory protein for human B lymphocytes." J Immunol 137(12): 3855-60.
Kehrl, J. H., L. M. Wakefield, et al. (1986). "Production of transforming growth factor beta by
human T lymphocytes and its potential role in the regulation of T cell growth." J Exp
Med 163(5): 1037-50.
Keir, M. E. and A. H. Sharpe (2005). "The B7/CD28 costimulatory family in autoimmunity."
Immunol Rev 204: 128-43.
Kennedy, M. K., D. S. Torrance, et al. (1992). "Analysis of cytokine mRNA expression in the
central nervous system of mice with experimental autoimmune encephalomyelitis
reveals that IL-10 mRNA expression correlates with recovery." J Immunol 149(7):
2496-505.
Kerfoot, S. M., M. U. Norman, et al. (2006). "Reevaluation of P-selectin and alpha 4 integrin
as targets for the treatment of experimental autoimmune encephalomyelitis." J
Immunol 176(10): 6225-34.
Khanna, K. M., R. H. Bonneau, et al. (2003). "Herpes simplex virus-specific memory CD8+ T
cells are selectively activated and retained in latently infected sensory ganglia."
Immunity 18(5): 593-603.
219
Khoury, S. J., W. W. Hancock, et al. (1992). "Oral tolerance to myelin basic protein and
natural recovery from experimental autoimmune encephalomyelitis are associated
with downregulation of inflammatory cytokines and differential upregulation of
transforming growth factor beta, interleukin 4, and prostaglandin E expression in the
brain." J Exp Med 176(5): 1355-64.
Kimura, A., T. Naka, et al. (2007). "IL-6-dependent and -independent pathways in the
development of interleukin 17-producing T helper cells." Proc Natl Acad Sci U S A
104(29): 12099-104.
King, C. L., R. J. Stupi, et al. (1995). "CD28 activation promotes Th2 subset differentiation
by human CD4+ cells." Eur J Immunol 25(2): 587-95.
Kingston, R., E. J. Jenkinson, et al. (1985). "A single stem cell can recolonize an embryonic
thymus, producing phenotypically distinct T-cell populations." Nature 317(6040):
811-3.
Kirberg, J., A. Baron, et al. (1994). "Thymic selection of CD8+ single positive cells with a
class II major histocompatibility complex-restricted receptor." J Exp Med 180(1): 2534.
Kirk, J., J. Plumb, et al. (2003). "Tight junctional abnormality in multiple sclerosis white
matter affects all calibres of vessel and is associated with blood-brain barrier leakage
and active demyelination." J Pathol 201(2): 319-27.
Kisielow, P., H. Bluthmann, et al. (1988). "Tolerance in T-cell-receptor transgenic mice
involves deletion of nonmature CD4+8+ thymocytes." Nature 333(6175): 742-6.
Kivisakk, P., J. Imitola, et al. (2009). "Localizing central nervous system immune
surveillance: meningeal antigen-presenting cells activate T cells during experimental
autoimmune encephalomyelitis." Ann Neurol 65(4): 457-69.
Klein, L., M. Klugmann, et al. (2000). "Shaping of the autoreactive T-cell repertoire by a
splice variant of self protein expressed in thymic epithelial cells." Nat Med 6(1): 5661.
Klein, L. and B. Kyewski (2000). ""Promiscuous" expression of tissue antigens in the thymus:
a key to T-cell tolerance and autoimmunity?" J Mol Med 78(9): 483-94.
Kobie, J. J., P. R. Shah, et al. (2006). "T regulatory and primed uncommitted CD4 T cells
express CD73, which suppresses effector CD4 T cells by converting 5'-adenosine
monophosphate to adenosine." J Immunol 177(10): 6780-6.
Koh, D. R., W. P. Fung-Leung, et al. (1992). "Less mortality but more relapses in
experimental allergic encephalomyelitis in CD8-/- mice." Science 256(5060): 1210-3.
Kohn, L. D. and N. Harii (2003). "Thyrotropin receptor autoantibodies (TSHRAbs): epitopes,
origins and clinical significance." Autoimmunity 36(6-7): 331-7.
Kojima, K., M. Reindl, et al. (1997). "The thymus and self-tolerance: co-existence of
encephalitogenic S100 beta-specific T cells and their nominal autoantigen in the
normal adult rat thymus." Int Immunol 9(6): 897-904.
Komiyama, Y., S. Nakae, et al. (2006). "IL-17 plays an important role in the development of
experimental autoimmune encephalomyelitis." J Immunol 177(1): 566-73.
Kont, V., M. Laan, et al. (2008). "Modulation of Aire regulates the expression of tissuerestricted antigens." Mol Immunol 45(1): 25-33.
Koopman, G., Y. van Kooyk, et al. (1990). "Triggering of the CD44 antigen on T
lymphocytes promotes T cell adhesion through the LFA-1 pathway." J Immunol
145(11): 3589-93.
Korn, T., J. Reddy, et al. (2007). "Myelin-specific regulatory T cells accumulate in the CNS
but fail to control autoimmune inflammation." Nat Med 13(4): 423-31.
Koulova, L., E. A. Clark, et al. (1991). "The CD28 ligand B7/BB1 provides costimulatory
signal for alloactivation of CD4+ T cells." J Exp Med 173(3): 759-62.
220
Kovats, S., E. K. Main, et al. (1990). "A class I antigen, HLA-G, expressed in human
trophoblasts." Science 248(4952): 220-3.
Koyama, Y., Y. Tanaka, et al. (1996). "Cross-linking of intercellular adhesion molecule 1
(CD54) induces AP-1 activation and IL-1beta transcription." J Immunol 157(11):
5097-103.
Krakowski, M. and T. Owens (1996). "Interferon-gamma confers resistance to experimental
allergic encephalomyelitis." Eur J Immunol 26(7): 1641-6.
Krishnamoorthy, G., H. Lassmann, et al. (2006). "Spontaneous opticospinal
encephalomyelitis in a double-transgenic mouse model of autoimmune T cell/B cell
cooperation." J Clin Invest 116(9): 2385-92.
Kuchroo, V. K., A. C. Anderson, et al. (2002). "T cell response in experimental autoimmune
encephalomyelitis (EAE): role of self and cross-reactive antigens in shaping, tuning,
and regulating the autopathogenic T cell repertoire." Annu Rev Immunol 20: 101-23.
Kuchroo, V. K., R. A. Sobel, et al. (1992). "Experimental allergic encephalomyelitis mediated
by cloned T cells specific for a synthetic peptide of myelin proteolipid protein. Fine
specificity and T cell receptor V beta usage." J Immunol 148(12): 3776-82.
Kuhle, J., R. L. Lindberg, et al. (2007). "Antimyelin antibodies in clinically isolated
syndromes correlate with inflammation in MRI and CSF." J Neurol 254(2): 160-8.
Kuhlmann, T., G. Lingfeld, et al. (2002). "Acute axonal damage in multiple sclerosis is most
extensive in early disease stages and decreases over time." Brain 125(Pt 10): 2202-12.
Kuroda, N., T. Mitani, et al. (2005). "Development of autoimmunity against transcriptionally
unrepressed target antigen in the thymus of Aire-deficient mice." J Immunol 174(4):
1862-70.
Kurts, C., F. R. Carbone, et al. (1997). "CD4+ T cell help impairs CD8+ T cell deletion
induced by cross-presentation of self-antigens and favors autoimmunity." J Exp Med
186(12): 2057-62.
Kurts, C., F. R. Carbone, et al. (1999). "Signalling through CD30 protects against
autoimmune diabetes mediated by CD8 T cells." Nature 398(6725): 341-4.
Kurts, C., W. R. Heath, et al. (1996). "Constitutive class I-restricted exogenous presentation
of self antigens in vivo." J Exp Med 184(3): 923-30.
Kurts, C., R. M. Sutherland, et al. (1999). "CD8 T cell ignorance or tolerance to islet antigens
depends on antigen dose." Proc Natl Acad Sci U S A 96(22): 12703-7.
Kuruvilla, A. P., R. Shah, et al. (1991). "Protective effect of transforming growth factor beta 1
on experimental autoimmune diseases in mice." Proc Natl Acad Sci U S A 88(7):
2918-21.
Kurzinger, K., T. Reynolds, et al. (1981). "A novel lymphocyte function-associated antigen
(LFA-1): cellular distribution, quantitative expression, and structure." J Immunol
127(2): 596-602.
Kyewski, B. and J. Derbinski (2004). "Self-representation in the thymus: an extended view."
Nat Rev Immunol 4(9): 688-98.
Ladel, C. H., C. Blum, et al. (1996). "Control of natural killer cell-mediated innate resistance
against the intracellular pathogen Listeria monocytogenes by gamma/delta T
lymphocytes." Infect Immun 64(5): 1744-9.
Lafaille, J. J., F. V. Keere, et al. (1997). "Myelin basic protein-specific T helper 2 (Th2) cells
cause experimental autoimmune encephalomyelitis in immunodeficient hosts rather
than protect them from the disease." J Exp Med 186(2): 307-12.
Lafaille, J. J., K. Nagashima, et al. (1994). "High incidence of spontaneous autoimmune
encephalomyelitis in immunodeficient anti-myelin basic protein T cell receptor
transgenic mice." Cell 78(3): 399-408.
221
Lal, G., M. S. Shaila, et al. (2005). "Activated mouse T-cells synthesize MHC class II,
process, and present morbillivirus nucleocapsid protein to primed T-cells." Cell
Immunol 234(2): 133-45.
Lamhamedi-Cherradi, S. E., S. J. Zheng, et al. (2003). "Defective thymocyte apoptosis and
accelerated autoimmune diseases in TRAIL-/- mice." Nat Immunol 4(3): 255-60.
Lampson, L. A. and C. A. Fisher (1984). "Weak HLA and beta 2-microglobulin expression of
neuronal cell lines can be modulated by interferon." Proc Natl Acad Sci U S A 81(20):
6476-80.
Lang, H. L., H. Jacobsen, et al. (2002). "A functional and structural basis for TCR crossreactivity in multiple sclerosis." Nat Immunol 3(10): 940-3.
Langrish, C. L., Y. Chen, et al. (2005). "IL-23 drives a pathogenic T cell population that
induces autoimmune inflammation." J Exp Med 201(2): 233-40.
Lanzavecchia, A. (1990). "Receptor-mediated antigen uptake and its effect on antigen
presentation to class II-restricted T lymphocytes." Annu Rev Immunol 8: 773-93.
Lassmann, H., C. Brunner, et al. (1988). "Experimental allergic encephalomyelitis: the
balance between encephalitogenic T lymphocytes and demyelinating antibodies
determines size and structure of demyelinated lesions." Acta Neuropathol 75(6): 56676.
Laufer, T. M., J. DeKoning, et al. (1996). "Unopposed positive selection and autoreactivity in
mice expressing class II MHC only on thymic cortex." Nature 383(6595): 81-5.
Le Saout, C., S. Mennechet, et al. (2008). "Memory-like CD8+ and CD4+ T cells cooperate to
break peripheral tolerance under lymphopenic conditions." Proc Natl Acad Sci U S A
105(49): 19414-9.
Lee, B. O., L. Hartson, et al. (2003). "CD40-deficient, influenza-specific CD8 memory T cells
develop and function normally in a CD40-sufficient environment." J Exp Med
198(11): 1759-64.
Lehar, S. M. and M. J. Bevan (2004). "Immunology: polarizing a T-cell response." Nature
430(6996): 150-1.
Lehrmann, E., R. Kiefer, et al. (1998). "Microglia and macrophages are major sources of
locally produced transforming growth factor-beta1 after transient middle cerebral
artery occlusion in rats." Glia 24(4): 437-48.
Lemire, J. (2000). "1,25-Dihydroxyvitamin D3--a hormone with immunomodulatory
properties." Z Rheumatol 59 Suppl 1: 24-7.
Lennon, G. P., M. Bettini, et al. (2009). "T cell islet accumulation in type 1 diabetes is a
tightly regulated, cell-autonomous event." Immunity 31(4): 643-53.
Leonard, J. P., K. E. Waldburger, et al. (1995). "Prevention of experimental autoimmune
encephalomyelitis by antibodies against interleukin 12." J Exp Med 181(1): 381-6.
Lesourne, R., S. Uehara, et al. (2009). "Themis, a T cell-specific protein important for late
thymocyte development." Nat Immunol 10(8): 840-7.
Letourneau, R., J. J. Rozniecki, et al. (2003). "Ultrastructural evidence of brain mast cell
activation without degranulation in monkey experimental allergic encephalomyelitis."
J Neuroimmunol 145(1-2): 18-26.
Levin, M. C., S. M. Lee, et al. (2002). "Autoimmunity due to molecular mimicry as a cause of
neurological disease." Nat Med 8(5): 509-13.
Levin, M. C., S. M. Lee, et al. (2002). "Cross-reactivity between immunodominant human T
lymphotropic virus type I tax and neurons: implications for molecular mimicry." J
Infect Dis 186(10): 1514-7.
Levine, S. and R. Sowinski (1973). "Experimental allergic encephalomyelitis in inbred and
outbred mice." J Immunol 110(1): 139-43.
222
Levings, M. K., S. Gregori, et al. (2005). "Differentiation of Tr1 cells by immature dendritic
cells requires IL-10 but not CD25+CD4+ Tr cells." Blood 105(3): 1162-9.
Lewkowich, I. P., N. S. Herman, et al. (2005). "CD4+CD25+ T cells protect against
experimentally induced asthma and alter pulmonary dendritic cell phenotype and
function." J Exp Med 202(11): 1549-61.
Li, M. O., Y. Y. Wan, et al. (2006). "Transforming growth factor-beta regulation of immune
responses." Annu Rev Immunol 24: 99-146.
Li, Y., Y. Huang, et al. (2005). "Structure of a human autoimmune TCR bound to a myelin
basic protein self-peptide and a multiple sclerosis-associated MHC class II molecule."
Embo J 24(17): 2968-79.
Liblau, R., L. Steinman, et al. (1997). "Experimental autoimmune encephalomyelitis in IL-4deficient mice." Int Immunol 9(5): 799-803.
Liblau, R. S., F. S. Wong, et al. (2002). "Autoreactive CD8 T cells in organ-specific
autoimmunity: emerging targets for therapeutic intervention." Immunity 17(1): 1-6.
Lin, J. and A. Weiss (2001). "T cell receptor signalling." J Cell Sci 114(Pt 2): 243-4.
Linares, D., P. Mana, et al. (2003). "The magnitude and encephalogenic potential of
autoimmune response to MOG is enhanced in MOG deficient mice." J Autoimmun
21(4): 339-51.
Ling, C., M. Sandor, et al. (2003). "In situ processing and distribution of intracerebrally
injected OVA in the CNS." J Neuroimmunol 141(1-2): 90-8.
Linington, C. (1998). "Experimental animal models." immunotherapy in neuroimmunologic
disease: 11-28.
Linington, C., M. Bradl, et al. (1988). "Augmentation of demyelination in rat acute allergic
encephalomyelitis by circulating mouse monoclonal antibodies directed against a
myelin/oligodendrocyte glycoprotein." Am J Pathol 130(3): 443-54.
Linington, C., S. Izumo, et al. (1984). "A permanent rat T cell line that mediates experimental
allergic neuritis in the Lewis rat in vivo." J Immunol 133(4): 1946-50.
Linington, C. and H. Lassmann (1987). "Antibody responses in chronic relapsing
experimental allergic encephalomyelitis: correlation of serum demyelinating activity
with antibody titre to the myelin/oligodendrocyte glycoprotein (MOG)." J
Neuroimmunol 17(1): 61-9.
Linington, C., B. P. Morgan, et al. (1989). "The role of complement in the pathogenesis of
experimental allergic encephalomyelitis." Brain 112 (Pt 4): 895-911.
Linsley, P. S., J. Bradshaw, et al. (1993). "CD28 engagement by B7/BB-1 induces transient
down-regulation of CD28 synthesis and prolonged unresponsiveness to CD28
signaling." J Immunol 150(8 Pt 1): 3161-9.
Linsley, P. S., J. L. Greene, et al. (1992). "Coexpression and functional cooperation of CTLA4 and CD28 on activated T lymphocytes." J Exp Med 176(6): 1595-604.
Linsley, P. S. and J. A. Ledbetter (1993). "The role of the CD28 receptor during T cell
responses to antigen." Annu Rev Immunol 11: 191-212.
Linthicum, D. S., J. J. Munoz, et al. (1982). "Acute experimental autoimmune
encephalomyelitis in mice. I. Adjuvant action of Bordetella pertussis is due to
vasoactive amine sensitization and increased vascular permeability of the central
nervous system." Cell Immunol 73(2): 299-310.
Litzenburger, T., R. Fassler, et al. (1998). "B lymphocytes producing demyelinating
autoantibodies: development and function in gene-targeted transgenic mice." J Exp
Med 188(1): 169-80.
Liu, G. Y. and D. C. Wraith (1995). "Affinity for class II MHC determines the extent to
which soluble peptides tolerize autoreactive T cells in naive and primed adult mice-implications for autoimmunity." Int Immunol 7(8): 1255-63.
223
Liu, H., A. J. MacKenzie-Graham, et al. (2001). "Mice resistant to experimental autoimmune
encephalomyelitis have increased thymic expression of myelin basic protein and
increased MBP specific T cell tolerance." J Neuroimmunol 115(1-2): 118-26.
Liu, J., M. W. Marino, et al. (1998). "TNF is a potent anti-inflammatory cytokine in
autoimmune-mediated demyelination." Nat Med 4(1): 78-83.
Liu, T., K. M. Khanna, et al. (2000). "CD8(+) T cells can block herpes simplex virus type 1
(HSV-1) reactivation from latency in sensory neurons." J Exp Med 191(9): 1459-66.
Lock, C., G. Hermans, et al. (2002). "Gene-microarray analysis of multiple sclerosis lesions
yields new targets validated in autoimmune encephalomyelitis." Nat Med 8(5): 500-8.
Losy, J., P. D. Mehta, et al. (1990). "Identification of IgG subclasses' oligoclonal bands in
multiple sclerosis CSF." Acta Neurol Scand 82(1): 4-8.
Lu, L., H. J. Kim, et al. (2008). "Regulation of CD8+ regulatory T cells: Interruption of the
NKG2A-Qa-1 interaction allows robust suppressive activity and resolution of
autoimmune disease." Proc Natl Acad Sci U S A 105(49): 19420-5.
Lublin, F. D., R. L. Knobler, et al. (1993). "Monoclonal anti-gamma interferon antibodies
enhance experimental allergic encephalomyelitis." Autoimmunity 16(4): 267-74.
Lucchinetti, C., W. Bruck, et al. (2000). "Heterogeneity of multiple sclerosis lesions:
implications for the pathogenesis of demyelination." Ann Neurol 47(6): 707-17.
Luger, D., P. B. Silver, et al. (2008). "Either a Th17 or a Th1 effector response can drive
autoimmunity: conditions of disease induction affect dominant effector category." J
Exp Med 205(4): 799-810.
Luo, C., E. Burgeon, et al. (1996). "Mechanisms of transactivation by nuclear factor of
activated T cells-1." J Exp Med 184(1): 141-7.
Lyons, J. A., M. San, et al. (1999). "B cells are critical to induction of experimental allergic
encephalomyelitis by protein but not by a short encephalitogenic peptide." Eur J
Immunol 29(11): 3432-9.
Macian, F., F. Garcia-Cozar, et al. (2002). "Transcriptional mechanisms underlying
lymphocyte tolerance." Cell 109(6): 719-31.
Mack, C. L., C. L. Vanderlugt-Castaneda, et al. (2003). "Microglia are activated to become
competent antigen presenting and effector cells in the inflammatory environment of
the Theiler's virus model of multiple sclerosis." J Neuroimmunol 144(1-2): 68-79.
Magliozzi, R., O. Howell, et al. (2007). "Meningeal B-cell follicles in secondary progressive
multiple sclerosis associate with early onset of disease and severe cortical pathology."
Brain 130(Pt 4): 1089-104.
Mallone, R., E. Martinuzzi, et al. (2007). "CD8+ T-cell responses identify beta-cell
autoimmunity in human type 1 diabetes." Diabetes 56(3): 613-21.
Mallone, R. and P. van Endert (2008). "T cells in the pathogenesis of type 1 diabetes." Curr
Diab Rep 8(2): 101-6.
Mannie, M. D., K. D. Prevost, et al. (1995). "Prostaglandin E2 promotes the induction of
anergy during T helper cell recognition of myelin basic protein." Cell Immunol
160(1): 132-8.
Mao, Y., D. Brigham, et al. (2004). "Overexpression of a mutant CTLA4 inhibits T-cell
activation and homeostasis-driven expansion." Exp Hematol 32(8): 735-47.
Markovic-Plese, S., B. Hemmer, et al. (2005). "High level of cross-reactivity in influenza
virus hemagglutinin-specific CD4+ T-cell response: implications for the initiation of
autoimmune response in multiple sclerosis." J Neuroimmunol 169(1-2): 31-8.
Marrack, P., K. Rubtsova, et al. (2008). "T cell receptor specificity for major
histocompatibility complex proteins." Curr Opin Immunol 20(2): 203-7.
Mars, L. T., L. Araujo, et al. (2009). "Invariant NKT cells inhibit development of the Th17
lineage." Proc Natl Acad Sci U S A 106(15): 6238-43.
224
Mars, L. T., V. Laloux, et al. (2002). "Cutting edge: V alpha 14-J alpha 281 NKT cells
naturally regulate experimental autoimmune encephalomyelitis in nonobese diabetic
mice." J Immunol 168(12): 6007-11.
Mars, L. T., J. Novak, et al. (2004). "Therapeutic manipulation of iNKT cells in
autoimmunity: modes of action and potential risks." Trends Immunol 25(9): 471-6.
Martin, B. K., K. C. Chin, et al. (1997). "Induction of MHC class I expression by the MHC
class II transactivator CIITA." Immunity 6(5): 591-600.
Mathey, E. K., T. Derfuss, et al. (2007). "Neurofascin as a novel target for autoantibodymediated axonal injury." J Exp Med 204(10): 2363-72.
Matsumura, M., D. H. Fremont, et al. (1992). "Emerging principles for the recognition of
peptide antigens by MHC class I molecules." Science 257(5072): 927-34.
Matyszak, M. K., S. Denis-Donini, et al. (1999). "Microglia induce myelin basic proteinspecific T cell anergy or T cell activation, according to their state of activation." Eur J
Immunol 29(10): 3063-76.
Matyszak, M. K. and V. H. Perry (1996). "The potential role of dendritic cells in immunemediated inflammatory diseases in the central nervous system." Neuroscience 74(2):
599-608.
Matzinger, P., R. Zamoyska, et al. (1984). "Self tolerance is H-2-restricted." Nature
308(5961): 738-41.
Maynard, J., K. Petersson, et al. (2005). "Structure of an autoimmune T cell receptor
complexed with class II peptide-MHC: insights into MHC bias and antigen
specificity." Immunity 22(1): 81-92.
McGeachy, M. J., Y. Chen, et al. (2009). "The interleukin 23 receptor is essential for the
terminal differentiation of interleukin 17-producing effector T helper cells in vivo."
Nat Immunol 10(3): 314-24.
McGeachy, M. J., L. A. Stephens, et al. (2005). "Natural recovery and protection from
autoimmune encephalomyelitis: contribution of CD4+CD25+ regulatory cells within
the central nervous system." J Immunol 175(5): 3025-32.
McGuinness, D. H., P. K. Dehal, et al. (2003). "Pattern recognition molecules and innate
immunity to parasites." Trends Parasitol 19(7): 312-9.
McMahon, E. J., S. L. Bailey, et al. (2005). "Epitope spreading initiates in the CNS in two
mouse models of multiple sclerosis." Nat Med 11(3): 335-9.
McMenamin, C., M. McKersey, et al. (1995). "Gamma delta T cells down-regulate primary
IgE responses in rats to inhaled soluble protein antigens." J Immunol 154(9): 4390-4.
Meinl, E., M. Krumbholz, et al. (2006). "B lineage cells in the inflammatory central nervous
system environment: migration, maintenance, local antibody production, and
therapeutic modulation." Ann Neurol 59(6): 880-92.
Mellor, A. L. and D. H. Munn (2004). "IDO expression by dendritic cells: tolerance and
tryptophan catabolism." Nat Rev Immunol 4(10): 762-74.
Menager-Marcq, I., C. Pomie, et al. (2006). "CD8+CD28- regulatory T lymphocytes prevent
experimental inflammatory bowel disease in mice." Gastroenterology 131(6): 177585.
Mendel, I., N. Kerlero de Rosbo, et al. (1995). "A myelin oligodendrocyte glycoprotein
peptide induces typical chronic experimental autoimmune encephalomyelitis in H-2b
mice: fine specificity and T cell receptor V beta expression of encephalitogenic T
cells." Eur J Immunol 25(7): 1951-9.
Mendel, I., K. Natarajan, et al. (2004). "A novel protective model against experimental
allergic encephalomyelitis in mice expressing a transgenic TCR-specific for myelin
oligodendrocyte glycoprotein." J Neuroimmunol 149(1-2): 10-21.
225
Meuer, S. C., O. Acuto, et al. (1984). "The human T-cell receptor." Annu Rev Immunol 2: 2350.
Meyers, C. M. and C. J. Kelly (1991). "Effector mechanisms in organ-specific autoimmunity.
I. Characterization of a CD8+ T cell line that mediates murine interstitial nephritis." J
Clin Invest 88(2): 408-16.
Miellot, A., R. Zhu, et al. (2005). "Activation of invariant NK T cells protects against
experimental rheumatoid arthritis by an IL-10-dependent pathway." Eur J Immunol
35(12): 3704-13.
Miosge, L. A. and C. C. Goodnow (2005). "Genes, pathways and checkpoints in lymphocyte
development and homeostasis." Immunol Cell Biol 83(4): 318-35.
Mishra, B. B., U. M. Gundra, et al. (2008). "Expression and distribution of Toll-like receptors
11-13 in the brain during murine neurocysticercosis." J Neuroinflammation 5: 53.
Misra, N., J. Bayry, et al. (2004). "Cutting edge: human CD4+CD25+ T cells restrain the
maturation and antigen-presenting function of dendritic cells." J Immunol 172(8):
4676-80.
Mizoguchi, A., E. Mizoguchi, et al. (2002). "Chronic intestinal inflammatory condition
generates IL-10-producing regulatory B cell subset characterized by CD1d
upregulation." Immunity 16(2): 219-30.
Mombaerts, P., J. Arnoldi, et al. (1993). "Different roles of alpha beta and gamma delta T
cells in immunity against an intracellular bacterial pathogen." Nature 365(6441): 53-6.
Montero, E., G. Nussbaum, et al. (2004). "Regulation of experimental autoimmune
encephalomyelitis by CD4+, CD25+ and CD8+ T cells: analysis using depleting
antibodies." J Autoimmun 23(1): 1-7.
Montgomery, I. N. and H. C. Rauch (1982). "Experimental allergic encephalomyelitis (EAE)
in mice: primary control of EAE susceptibility is outside the H-2 complex." J
Immunol 128(1): 421-5.
Moore, T. A., U. von Freeden-Jeffry, et al. (1996). "Inhibition of gamma delta T cell
development and early thymocyte maturation in IL-7 -/- mice." J Immunol 157(6):
2366-73.
Morandi, B., P. Bramanti, et al. (2008). "Role of natural killer cells in the pathogenesis and
progression of multiple sclerosis." Pharmacol Res 57(1): 1-5.
Morgan, D. J., H. T. Kreuwel, et al. (1999). "Antigen concentration and precursor frequency
determine the rate of CD8+ T cell tolerance to peripherally expressed antigens." J
Immunol 163(2): 723-7.
Morgan, D. J., C. Kurts, et al. (1999). "Ontogeny of T cell tolerance to peripherally expressed
antigens." Proc Natl Acad Sci U S A 96(7): 3854-8.
Morgan, D. J., R. Liblau, et al. (1996). "CD8(+) T cell-mediated spontaneous diabetes in
neonatal mice." J Immunol 157(3): 978-83.
Moser, M. and K. M. Murphy (2000). "Dendritic cell regulation of TH1-TH2 development."
Nat Immunol 1(3): 199-205.
Mosmann, T. R. (1994). "Properties and functions of interleukin-10." Adv Immunol 56: 1-26.
Mosmann, T. R., H. Cherwinski, et al. (2005). "Two types of murine helper T cell clone. I.
Definition according to profiles of lymphokine activities and secreted proteins. 1986."
J Immunol 175(1): 5-14.
Mowat, A. M. (2003). "Anatomical basis of tolerance and immunity to intestinal antigens."
Nat Rev Immunol 3(4): 331-41.
Munz, C., J. D. Lunemann, et al. (2009). "Antiviral immune responses: triggers of or triggered
by autoimmunity?" Nat Rev Immunol 9(4): 246-58.
Muraro, P. A., M. Vergelli, et al. (1997). "Immunodominance of a low-affinity major
histocompatibility complex-binding myelin basic protein epitope (residues 111-129) in
226
HLA-DR4 (B1*0401) subjects is associated with a restricted T cell receptor
repertoire." J Clin Invest 100(2): 339-49.
Murray, R., T. Suda, et al. (1989). "IL-7 is a growth and maintenance factor for mature and
immature thymocyte subsets." Int Immunol 1(5): 526-31.
Nagarajan, U. M., P. Louis-Plence, et al. (1999). "RFX-B is the gene responsible for the most
common cause of the bare lymphocyte syndrome, an MHC class II
immunodeficiency." Immunity 10(2): 153-62.
Najafian, N., T. Chitnis, et al. (2003). "Regulatory functions of CD8+CD28- T cells in an
autoimmune disease model." J Clin Invest 112(7): 1037-48.
Nakamura, K., A. Kitani, et al. (2001). "Cell contact-dependent immunosuppression by
CD4(+)CD25(+) regulatory T cells is mediated by cell surface-bound transforming
growth factor beta." J Exp Med 194(5): 629-44.
Nakamura, T., K. H. Sonoda, et al. (2003). "CD4+ NKT cells, but not conventional CD4+ T
cells, are required to generate efferent CD8+ T regulatory cells following antigen
inoculation in an immune-privileged site." J Immunol 171(3): 1266-71.
Nakanishi, Y., B. Lu, et al. (2009). "CD8(+) T lymphocyte mobilization to virus-infected
tissue requires CD4(+) T-cell help." Nature 462(7272): 510-3.
Naluai, A. T., S. Nilsson, et al. (2000). "The CTLA4/CD28 gene region on chromosome 2q33
confers susceptibility to celiac disease in a way possibly distinct from that of type 1
diabetes and other chronic inflammatory disorders." Tissue Antigens 56(4): 350-5.
Nataf, S., N. Strazielle, et al. (2006). "Rat choroid plexuses contain myeloid progenitors
capable of differentiation toward macrophage or dendritic cell phenotypes." Glia
54(3): 160-71.
Nave, K. A., C. Lai, et al. (1987). "Splice site selection in the proteolipid protein (PLP) gene
transcript and primary structure of the DM-20 protein of central nervous system
myelin." Proc Natl Acad Sci U S A 84(16): 5665-9.
Nepom, G. T. and H. Erlich (1991). "MHC class-II molecules and autoimmunity." Annu Rev
Immunol 9: 493-525.
Netea, M. G., R. Sutmuller, et al. (2004). "Toll-like receptor 2 suppresses immunity against
Candida albicans through induction of IL-10 and regulatory T cells." J Immunol
172(6): 3712-8.
Neumann, H., A. Cavalie, et al. (1995). "Induction of MHC class I genes in neurons." Science
269(5223): 549-52.
Neumann, H., I. M. Medana, et al. (2002). "Cytotoxic T lymphocytes in autoimmune and
degenerative CNS diseases." Trends Neurosci 25(6): 313-9.
Neveu, I., P. Naveilhan, et al. (1994). "1,25-dihydroxyvitamin D3 regulates the synthesis of
nerve growth factor in primary cultures of glial cells." Brain Res Mol Brain Res 24(14): 70-6.
Newman, T. A., I. Galea, et al. (2005). "Blood-derived dendritic cells in an acute brain
injury." J Neuroimmunol 166(1-2): 167-72.
Nicholson, M. J., M. Hahn, et al. (2005). "Unusual features of self-peptide/MHC binding by
autoimmune T cell receptors." Immunity 23(4): 351-60.
Niederkorn, J. Y. (2006). "See no evil, hear no evil, do no evil: the lessons of immune
privilege." Nat Immunol 7(4): 354-9.
Niederkorn, J. Y., E. Y. Chiang, et al. (1999). "Expression of a nonclassical MHC class Ib
molecule in the eye." Transplantation 68(11): 1790-9.
Niki, S., K. Oshikawa, et al. (2006). "Alteration of intra-pancreatic target-organ specificity by
abrogation of Aire in NOD mice." J Clin Invest 116(5): 1292-301.
Oberle, N., N. Eberhardt, et al. (2007). "Rapid suppression of cytokine transcription in human
CD4+CD25 T cells by CD4+Foxp3+ regulatory T cells: independence of IL-2
227
consumption, TGF-beta, and various inhibitors of TCR signaling." J Immunol 179(6):
3578-87.
Oderup, C., L. Cederbom, et al. (2006). "Cytotoxic T lymphocyte antigen-4-dependent downmodulation of costimulatory molecules on dendritic cells in CD4+ CD25+ regulatory
T-cell-mediated suppression." Immunology 118(2): 240-9.
Oh, S., L. P. Perera, et al. (2008). "IL-15 as a mediator of CD4+ help for CD8+ T cell
longevity and avoidance of TRAIL-mediated apoptosis." Proc Natl Acad Sci U S A
105(13): 5201-6.
Ohashi, P. S., S. Oehen, et al. (1991). "Ablation of "tolerance" and induction of diabetes by
virus infection in viral antigen transgenic mice." Cell 65(2): 305-17.
Oldstone, M. B. (1998). "Molecular mimicry and immune-mediated diseases." Faseb J
12(13): 1255-65.
Olson, J. K., A. M. Ercolini, et al. (2005). "A virus-induced molecular mimicry model of
multiple sclerosis." Curr Top Microbiol Immunol 296: 39-53.
Olsson, T. (1992). "Immunology of multiple sclerosis." Curr Opin Neurol Neurosurg 5(2):
195-202.
Olsson, T., J. Sun, et al. (1992). "Increased numbers of T cells recognizing multiple myelin
basic protein epitopes in multiple sclerosis." Eur J Immunol 22(4): 1083-7.
Ortiz-Ortiz, L. and W. O. Weigle (1976). "Cellular events in the induction of experimental
allergic encephalomyelitis in rats." J Exp Med 144(3): 604-16.
Orton, S. M., A. P. Morris, et al. (2008). "Evidence for genetic regulation of vitamin D status
in twins with multiple sclerosis." Am J Clin Nutr 88(2): 441-7.
Ostergaard, H. L., K. P. Kane, et al. (1987). "Cytotoxic T lymphocyte mediated lysis without
release of serine esterase." Nature 330(6143): 71-2.
Owens, G. P., A. M. Ritchie, et al. (2003). "Single-cell repertoire analysis demonstrates that
clonal expansion is a prominent feature of the B cell response in multiple sclerosis
cerebrospinal fluid." J Immunol 171(5): 2725-33.
Owyang, A. M., C. Zaph, et al. (2006). "Interleukin 25 regulates type 2 cytokine-dependent
immunity and limits chronic inflammation in the gastrointestinal tract." J Exp Med
203(4): 843-9.
Paglinawan, R., U. Malipiero, et al. (2003). "TGFbeta directs gene expression of activated
microglia to an anti-inflammatory phenotype strongly focusing on chemokine genes
and cell migratory genes." Glia 44(3): 219-31.
Parekh, V. V., D. V. Prasad, et al. (2003). "B cells activated by lipopolysaccharide, but not by
anti-Ig and anti-CD40 antibody, induce anergy in CD8+ T cells: role of TGF-beta 1." J
Immunol 170(12): 5897-911.
Pashenkov, M., Y. M. Huang, et al. (2001). "Two subsets of dendritic cells are present in
human cerebrospinal fluid." Brain 124(Pt 3): 480-92.
paterson, P. Y. (1976). "Experimental autoimmune encephalomyelitis: induction,
pathogenesis and suppression." textbook in immunopathology, P.A.M. à H.S.M.Eberhard, ed (Nex York: Grune and Stratton): 179-213.
Pawson, T. and J. D. Scott (1997). "Signaling through scaffold, anchoring, and adaptor
proteins." Science 278(5346): 2075-80.
Pedotti, R., J. J. DeVoss, et al. (2003). "Multiple elements of the allergic arm of the immune
response modulate autoimmune demyelination." Proc Natl Acad Sci U S A 100(4):
1867-72.
Pelayo, R., M. Tintore, et al. (2007). "Antimyelin antibodies with no progression to multiple
sclerosis." N Engl J Med 356(4): 426-8.
Perchellet, A., I. Stromnes, et al. (2004). "CD8+ T cells maintain tolerance to myelin basic
protein by 'epitope theft'." Nat Immunol 5(6): 606-14.
228
Perry, V. H. (1998). "A revised view of the central nervous system microenvironment and
major histocompatibility complex class II antigen presentation." J Neuroimmunol
90(2): 113-21.
Pettinelli, C. B. and D. E. McFarlin (1981). "Adoptive transfer of experimental allergic
encephalomyelitis in SJL/J mice after in vitro activation of lymph node cells by
myelin basic protein: requirement for Lyt 1+ 2- T lymphocytes." J Immunol 127(4):
1420-3.
Piazza, F., J. C. DiFrancesco, et al. "Cerebrospinal fluid levels of BAFF and APRIL in
untreated multiple sclerosis." J Neuroimmunol 220(1-2): 104-7.
Piccirillo, C. A. and E. M. Shevach (2001). "Cutting edge: control of CD8+ T cell activation
by CD4+CD25+ immunoregulatory cells." J Immunol 167(3): 1137-40.
Piddlesden, S. J., H. Lassmann, et al. (1993). "The demyelinating potential of antibodies to
myelin oligodendrocyte glycoprotein is related to their ability to fix complement." Am
J Pathol 143(2): 555-64.
Pieters, J. (2000). "MHC class II-restricted antigen processing and presentation." Adv
Immunol 75: 159-208.
Pinkoski, M. J. and D. R. Green (2002). "Lymphocyte apoptosis: refining the paths to
perdition." Curr Opin Hematol 9(1): 43-9.
Piskurich, J. F., Y. Wang, et al. (1998). "Identification of distinct regions of 5' flanking DNA
that mediate constitutive, IFN-gamma, STAT1, and TGF-beta-regulated expression of
the class II transactivator gene." J Immunol 160(1): 233-40.
Polfliet, M. M., F. van de Veerdonk, et al. (2002). "The role of perivascular and meningeal
macrophages in experimental allergic encephalomyelitis." J Neuroimmunol 122(1-2):
1-8.
Polfliet, M. M., P. J. Zwijnenburg, et al. (2001). "Meningeal and perivascular macrophages of
the central nervous system play a protective role during bacterial meningitis." J
Immunol 167(8): 4644-50.
Ponomarev, E. D. and B. N. Dittel (2005). "Gamma delta T cells regulate the extent and
duration of inflammation in the central nervous system by a Fas ligand-dependent
mechanism." J Immunol 174(8): 4678-87.
Ponomarev, E. D., L. P. Shriver, et al. (2006). "CD40 expression by microglial cells is
required for their completion of a two-step activation process during central nervous
system autoimmune inflammation." J Immunol 176(3): 1402-10.
Ponomarev, E. D., L. P. Shriver, et al. (2005). "Microglial cell activation and proliferation
precedes the onset of CNS autoimmunity." J Neurosci Res 81(3): 374-89.
Pratt, B. M. and J. M. McPherson (1997). "TGF-beta in the central nervous system: potential
roles in ischemic injury and neurodegenerative diseases." Cytokine Growth Factor
Rev 8(4): 267-92.
Prehaud, C., F. Megret, et al. (2005). "Virus infection switches TLR-3-positive human
neurons to become strong producers of beta interferon." J Virol 79(20): 12893-904.
Pribyl, T. M., C. Campagnoni, et al. (1996). "The major myelin protein genes are expressed in
the human thymus." J Neurosci Res 45(6): 812-9.
Pribyl, T. M., C. W. Campagnoni, et al. (1993). "The human myelin basic protein gene is
included within a 179-kilobase transcription unit: expression in the immune and
central nervous systems." Proc Natl Acad Sci U S A 90(22): 10695-9.
Pribyl, T. M., C. W. Campagnoni, et al. (1996). "Expression of the myelin proteolipid protein
gene in the human fetal thymus." J Neuroimmunol 67(2): 125-30.
Prilliman, K. R., E. E. Lemmens, et al. (2002). "Cutting edge: a crucial role for B7-CD28 in
transmitting T help from APC to CTL." J Immunol 169(8): 4094-7.
229
Prineas, J. W. and J. S. Graham (1981). "Multiple sclerosis: capping of surface
immunoglobulin G on macrophages engaged in myelin breakdown." Ann Neurol
10(2): 149-58.
Prufer, K., T. D. Veenstra, et al. (1999). "Distribution of 1,25-dihydroxyvitamin D3 receptor
immunoreactivity in the rat brain and spinal cord." J Chem Neuroanat 16(2): 135-45.
Puel, A., R. Doffinger, et al. "Autoantibodies against IL-17A, IL-17F, and IL-22 in patients
with chronic mucocutaneous candidiasis and autoimmune polyendocrine syndrome
type I." J Exp Med 207(2): 291-7.
Putheti, P., A. Pettersson, et al. (2004). "Circulating CD4+CD25+ T regulatory cells are not
altered in multiple sclerosis and unaffected by disease-modulating drugs." J Clin
Immunol 24(2): 155-61.
Quandt, J. A., M. Baig, et al. (2004). "Unique clinical and pathological features in HLADRB1*0401-restricted MBP 111-129-specific humanized TCR transgenic mice." J
Exp Med 200(2): 223-34.
Racke, M. K., A. Bonomo, et al. (1994). "Cytokine-induced immune deviation as a therapy
for inflammatory autoimmune disease." J Exp Med 180(5): 1961-6.
Racke, M. K., B. Cannella, et al. (1992). "Evidence of endogenous regulatory function of
transforming growth factor-beta 1 in experimental allergic encephalomyelitis." Int
Immunol 4(5): 615-20.
Racke, M. K., S. Dhib-Jalbut, et al. (1991). "Prevention and treatment of chronic relapsing
experimental allergic encephalomyelitis by transforming growth factor-beta 1." J
Immunol 146(9): 3012-7.
Raghavan, M., N. Del Cid, et al. (2008). "MHC class I assembly: out and about." Trends
Immunol 29(9): 436-43.
Rahman, A. and D. A. Isenberg (2008). "Systemic lupus erythematosus." N Engl J Med
358(9): 929-39.
Ramagopalan, S. V., C. Anderson, et al. (2007). "Genomewide study of multiple sclerosis." N
Engl J Med 357(21): 2199-200; author reply 2200-1.
Rammensee, H. G. and M. J. Bevan (1984). "Evidence from in vitro studies that tolerance to
self antigens is MHC-restricted." Nature 308(5961): 741-4.
Ramsey, C., O. Winqvist, et al. (2002). "Aire deficient mice develop multiple features of
APECED phenotype and show altered immune response." Hum Mol Genet 11(4):
397-409.
Ransohoff, R. M., P. Kivisakk, et al. (2003). "Three or more routes for leukocyte migration
into the central nervous system." Nat Rev Immunol 3(7): 569-81.
Re, F. and J. L. Strominger (2001). "Toll-like receptor 2 (TLR2) and TLR4 differentially
activate human dendritic cells." J Biol Chem 276(40): 37692-9.
Read, S., R. Greenwald, et al. (2006). "Blockade of CTLA-4 on CD4+CD25+ regulatory T
cells abrogates their function in vivo." J Immunol 177(7): 4376-83.
Reboldi, A., C. Coisne, et al. (2009). "C-C chemokine receptor 6-regulated entry of TH-17
cells into the CNS through the choroid plexus is required for the initiation of EAE."
Nat Immunol 10(5): 514-23.
Reboul, J., C. Mertens, et al. (2000). "Cytokines in genetic susceptibility to multiple sclerosis:
a candidate gene approach. French Multiple Sclerosis Genetics Group." J
Neuroimmunol 102(1): 107-12.
Redmond, W. L., M. J. Gough, et al. (2009). "Ligation of the OX40 co-stimulatory receptor
reverses self-Ag and tumor-induced CD8 T-cell anergy in vivo." Eur J Immunol 39(8):
2184-2194.
230
Redmond, W. L., J. Hernandez, et al. (2003). "Deletion of naive CD8 T cells requires
persistent antigen and is not programmed by an initial signal from the tolerogenic
APC." J Immunol 171(12): 6349-54.
Redmond, W. L. and L. A. Sherman (2005). "Peripheral tolerance of CD8 T lymphocytes."
Immunity 22(3): 275-84.
Reich, A., C. Spering, et al. (2008). "Death receptor Fas (CD95) signaling in the central
nervous system: tuning neuroplasticity?" Trends Neurosci 31(9): 478-86.
Reinke, E. and Z. Fabry (2006). "Breaking or making immunological privilege in the central
nervous system: the regulation of immunity by neuropeptides." Immunol Lett 104(12): 102-9.
Reith, W. and B. Mach (2001). "The bare lymphocyte syndrome and the regulation of MHC
expression." Annu Rev Immunol 19: 331-73.
Remlinger, J. (1905). "accidents paralytiques au cours du traitement anti-rabique." ann. Inst.
Pasteur 19(625-646).
Ren, X., F. Ye, et al. (2007). "Involvement of cellular death in TRAIL/DR5-dependent
suppression induced by CD4(+)CD25(+) regulatory T cells." Cell Death Differ 14(12):
2076-84.
Rifa'i, M., Z. Shi, et al. (2008). "CD8+CD122+ regulatory T cells recognize activated T cells
via conventional MHC class I-alphabetaTCR interaction and become IL-10-producing
active regulatory cells." Int Immunol 20(7): 937-47.
Rock, K. L., I. A. York, et al. (2004). "Post-proteasomal antigen processing for major
histocompatibility complex class I presentation." Nat Immunol 5(7): 670-7.
Roelofs-Haarhuis, K., X. Wu, et al. (2004). "Oral tolerance to nickel requires CD4+ invariant
NKT cells for the infectious spread of tolerance and the induction of specific
regulatory T cells." J Immunol 173(2): 1043-50.
Rohn, W. M., Y. J. Lee, et al. (1996). "Regulation of class II MHC expression." Crit Rev
Immunol 16(3): 311-30.
Rojo, J. M., R. Bello, et al. (2008). "T-cell receptor." Adv Exp Med Biol 640: 1-11.
Romagnoli, P., D. Hudrisier, et al. (2002). "Preferential recognition of self antigens despite
normal thymic deletion of CD4(+)CD25(+) regulatory T cells." J Immunol 168(4):
1644-8.
Roncarolo, M. G., S. Gregori, et al. (2006). "Interleukin-10-secreting type 1 regulatory T cells
in rodents and humans." Immunol Rev 212: 28-50.
Rosmalen, J. G., W. van Ewijk, et al. (2002). "T-cell education in autoimmune diabetes:
teachers and students." Trends Immunol 23(1): 40-6.
Rothlein, R., M. L. Dustin, et al. (1986). "A human intercellular adhesion molecule (ICAM-1)
distinct from LFA-1." J Immunol 137(4): 1270-4.
Rott, O., B. Fleischer, et al. (1994). "Interleukin-10 prevents experimental allergic
encephalomyelitis in rats." Eur J Immunol 24(6): 1434-40.
Rudd, C. E., M. Martin, et al. (2002). "CTLA-4 negative signaling via lipid rafts: A new
perspective." Sci STKE 2002(128): pe18.
Ruddle, N. H., C. M. Bergman, et al. (1990). "An antibody to lymphotoxin and tumor necrosis
factor prevents transfer of experimental allergic encephalomyelitis." J Exp Med
172(4): 1193-200.
Safford, M., S. Collins, et al. (2005). "Egr-2 and Egr-3 are negative regulators of T cell
activation." Nat Immunol 6(5): 472-80.
Sakuishi, K., S. Miyake, et al. (2009). "Role of NK Cells and Invariant NKT Cells in Multiple
Sclerosis." Results Probl Cell Differ.
Santamaria, P. (2008). "Genetic and therapeutic control of diabetogenic CD8+ T cells."
Novartis Found Symp 292: 130-6; discussion 136-45, 202-3.
231
Saoudi, A., S. Simmonds, et al. (1995). "Prevention of experimental allergic
encephalomyelitis in rats by targeting autoantigen to B cells: evidence that the
protective mechanism depends on changes in the cytokine response and migratory
properties of the autoantigen-specific T cells." J Exp Med 182(2): 335-44.
Sargsyan, S. A., A. J. Shearer, et al. "Absence of Epstein-Barr virus in the brain and CSF of
patients with multiple sclerosis." Neurology 74(14): 1127-35.
Saveanu, L., O. Carroll, et al. (2005). "Concerted peptide trimming by human ERAP1 and
ERAP2 aminopeptidase complexes in the endoplasmic reticulum." Nat Immunol 6(7):
689-97.
Saveanu, L. and P. van Endert (2005). "Dendritic cells: open for presentation business." Nat
Immunol 6(1): 7-8.
Saxena, A., J. Bauer, et al. (2008). "Cutting edge: Multiple sclerosis-like lesions induced by
effector CD8 T cells recognizing a sequestered antigen on oligodendrocytes." J
Immunol 181(3): 1617-21.
Scaffidi, C., S. Fulda, et al. (1998). "Two CD95 (APO-1/Fas) signaling pathways." Embo J
17(6): 1675-87.
Schenkel, A. R., Z. Mamdouh, et al. (2002). "CD99 plays a major role in the migration of
monocytes through endothelial junctions." Nat Immunol 3(2): 143-50.
Schluesener, H. J., R. A. Sobel, et al. (1987). "A monoclonal antibody against a myelin
oligodendrocyte glycoprotein induces relapses and demyelination in central nervous
system autoimmune disease." J Immunol 139(12): 4016-21.
Schreuder, G. M., C. K. Hurley, et al. (2001). "The HLA dictionary 2001: a summary of
HLA-A, -B, -C, -DRB1/3/4/5, -DQB1 alleles and their association with serologically
defined HLA-A, -B, -C, -DR, and -DQ antigens." Hum Immunol 62(8): 826-49.
Schroeter, M., G. Stoll, et al. (2003). "CD8+ phagocyte recruitment in rat experimental
autoimmune encephalomyelitis: association with inflammatory tissue destruction."
Am J Pathol 163(4): 1517-24.
Scollay, R., P. Bartlett, et al. (1984). "T cell development in the adult murine thymus: changes
in the expression of the surface antigens Ly2, L3T4 and B2A2 during development
from early precursor cells to emigrants." Immunol Rev 82: 79-103.
Scott, B., H. Bluthmann, et al. (1989). "The generation of mature T cells requires interaction
of the alpha beta T-cell receptor with major histocompatibility antigens." Nature
338(6216): 591-3.
Seamons, A., A. Perchellet, et al. (2003). "Immune tolerance to myelin proteins." Immunol
Res 28(3): 201-21.
Sebzda, E., S. Mariathasan, et al. (1999). "Selection of the T cell repertoire." Annu Rev
Immunol 17: 829-74.
Seder, R. A., W. E. Paul, et al. (1992). "The presence of interleukin 4 during in vitro priming
determines the lymphokine-producing potential of CD4+ T cells from T cell receptor
transgenic mice." J Exp Med 176(4): 1091-8.
Selmaj, K., C. S. Raine, et al. (1991). "Identification of lymphotoxin and tumor necrosis
factor in multiple sclerosis lesions." J Clin Invest 87(3): 949-54.
Sepulcre, J., A. Sanchez-Ibarrola, et al. (2005). "Association between peripheral IFN-gamma
producing CD8+ T-cells and disability score in relapsing-remitting multiple sclerosis."
Cytokine 32(2): 111-6.
Serafini, B., B. Rosicarelli, et al. (2007). "Dysregulated Epstein-Barr virus infection in the
multiple sclerosis brain." J Exp Med 204(12): 2899-912.
Serafini, B., B. Rosicarelli, et al. (2006). "Dendritic cells in multiple sclerosis lesions:
maturation stage, myelin uptake, and interaction with proliferating T cells." J
Neuropathol Exp Neurol 65(2): 124-41.
232
Serafini, P., R. Carbley, et al. (2004). "High-dose granulocyte-macrophage colony-stimulating
factor-producing vaccines impair the immune response through the recruitment of
myeloid suppressor cells." Cancer Res 64(17): 6337-43.
Seroogy, C. M., L. Soares, et al. (2004). "The gene related to anergy in lymphocytes, an E3
ubiquitin ligase, is necessary for anergy induction in CD4 T cells." J Immunol 173(1):
79-85.
Serra, P., A. Amrani, et al. (2003). "CD40 ligation releases immature dendritic cells from the
control of regulatory CD4+CD25+ T cells." Immunity 19(6): 877-89.
Seth, P. and N. Koul (2008). "Astrocyte, the star avatar: redefined." J Biosci 33(3): 405-21.
Severe, S., A. Gauvrit, et al. (2007). "CD8+ T lymphocytes specific for glutamic acid
decarboxylase 90-98 epitope mediate diabetes in NOD SCID mouse." Mol Immunol
44(11): 2950-60.
Shimizu, Y., G. A. van Seventer, et al. (1992). "Crosslinking of the T cell-specific accessory
molecules CD7 and CD28 modulates T cell adhesion." J Exp Med 175(2): 577-82.
Shrikant, P., S. J. Lee, et al. (1996). "Stimulus-specific inhibition of intracellular adhesion
molecule-1 gene expression by TGF-beta." J Immunol 157(2): 892-900.
Shumacher, H. R. (2002). "A surprise on joint fluid aspiration." J Clin Rheumatol 8(2): 117.
Sigaux, F. (1994). "The V(D)J recombination in acute lymphoid leukemias: a short review."
Leuk Lymphoma 13 Suppl 1: 53-7.
Silva, G. C., P. R. Nagib, et al. (2004). "Peripheral macrophage depletion reduces central
nervous system parasitism and damage in Trypanosoma cruzi-infected suckling rats."
J Neuroimmunol 149(1-2): 50-8.
Singer, A., S. Adoro, et al. (2008). "Lineage fate and intense debate: myths, models and
mechanisms of CD4- versus CD8-lineage choice." Nat Rev Immunol 8(10): 788-801.
Singer, A. and R. Bosselut (2004). "CD4/CD8 coreceptors in thymocyte development,
selection, and lineage commitment: analysis of the CD4/CD8 lineage decision." Adv
Immunol 83: 91-131.
Singh, A. K., M. T. Wilson, et al. (2001). "Natural killer T cell activation protects mice
against experimental autoimmune encephalomyelitis." J Exp Med 194(12): 1801-11.
Sobel, E. S., V. N. Kakkanaiah, et al. (1993). "Correction of gld autoimmunity by co-infusion
of normal bone marrow suggests that gld is a mutation of the Fas ligand gene." Int
Immunol 5(10): 1275-8.
Sonobe, Y., H. Takeuchi, et al. (2009). "Interleukin-25 expressed by brain capillary
endothelial cells maintains blood-brain barrier function in a protein kinase C{epsilon}dependent manner." J Biol Chem.
Sonoda, K. H., D. E. Faunce, et al. (2001). "NK T cell-derived IL-10 is essential for the
differentiation of antigen-specific T regulatory cells in systemic tolerance." J Immunol
166(1): 42-50.
Sospedra, M., X. Ferrer-Francesch, et al. (1998). "Transcription of a broad range of selfantigens in human thymus suggests a role for central mechanisms in tolerance toward
peripheral antigens." J Immunol 161(11): 5918-29.
Sospedra, M. and R. Martin (2005). "Immunology of multiple sclerosis." Annu Rev Immunol
23: 683-747.
Soulet, D. and S. Rivest (2008). "Bone-marrow-derived microglia: myth or reality?" Curr
Opin Pharmacol 8(4): 508-18.
Spach, K. M., F. E. Nashold, et al. (2006). "IL-10 signaling is essential for 1,25dihydroxyvitamin D3-mediated inhibition of experimental autoimmune
encephalomyelitis." J Immunol 177(9): 6030-7.
Springer, T. A. (1990). "Adhesion receptors of the immune system." Nature 346(6283): 42534.
233
Springer, T. A. (1990). "The sensation and regulation of interactions with the extracellular
environment: the cell biology of lymphocyte adhesion receptors." Annu Rev Cell Biol
6: 359-402.
Srinivas, S., T. Watanabe, et al. (2001). "Cre reporter strains produced by targeted insertion of
EYFP and ECFP into the ROSA26 locus." BMC Dev Biol 1: 4.
Srivastava, P. K., H. Udono, et al. (1994). "Heat shock proteins transfer peptides during
antigen processing and CTL priming." Immunogenetics 39(2): 93-8.
Stanton, T. H., C. E. Calkins, et al. (1978). "The Qa-1 antigenic system. Relation of Qa-1
phenotypes to lymphocyte sets, mitogen responses, and immune functions." J Exp
Med 148(4): 963-73.
Staunton, D. E., M. L. Dustin, et al. (1989). "Functional cloning of ICAM-2, a cell adhesion
ligand for LFA-1 homologous to ICAM-1." Nature 339(6219): 61-4.
Steinman, L. (1999). "Assessment of animal models for MS and demyelinating disease in the
design of rational therapy." Neuron 24(3): 511-4.
Steinmetz, M. and Z. Dembic (1986). "Organization, rearrangement, and diversification of
mouse T-cell receptor genes." Curr Top Microbiol Immunol 126: 45-51.
Stern, L. J., J. H. Brown, et al. (1994). "Crystal structure of the human class II MHC protein
HLA-DR1 complexed with an influenza virus peptide." Nature 368(6468): 215-21.
Storch, M. K., S. Piddlesden, et al. (1998). "Multiple sclerosis: in situ evidence for antibodyand complement-mediated demyelination." Ann Neurol 43(4): 465-71.
Streit, W. J. (2002). "Microglia as neuroprotective, immunocompetent cells of the CNS." Glia
40(2): 133-9.
Stuart, G., and Krikorian, K. S. (1928). "the neuro-paralytic accidents of anti-rabies
treatment." ann. Trop. Med. Parasitol 22: 327-377.
Stura, E. A., P. Chen, et al. (1992). "Crystallization studies of glycosylated and
unglycosylated human recombinant interleukin-2." Proteins 12(1): 24-30.
Suda, T., T. Takahashi, et al. (1993). "Molecular cloning and expression of the Fas ligand, a
novel member of the tumor necrosis factor family." Cell 75(6): 1169-78.
Suen, W. E., C. M. Bergman, et al. (1997). "A critical role for lymphotoxin in experimental
allergic encephalomyelitis." J Exp Med 186(8): 1233-40.
Sun, D., J. N. Whitaker, et al. (2001). "Myelin antigen-specific CD8+ T cells are
encephalitogenic and produce severe disease in C57BL/6 mice." J Immunol 166(12):
7579-87.
Sun, J., H. Link, et al. (1991). "T and B cell responses to myelin-oligodendrocyte
glycoprotein in multiple sclerosis." J Immunol 146(5): 1490-5.
Sundvall, M., J. Jirholt, et al. (1995). "Identification of murine loci associated with
susceptibility to chronic experimental autoimmune encephalomyelitis." Nat Genet
10(3): 313-7.
Suri-Payer, E., A. Z. Amar, et al. (1998). "CD4+CD25+ T cells inhibit both the induction and
effector function of autoreactive T cells and represent a unique lineage of
immunoregulatory cells." J Immunol 160(3): 1212-8.
Suvannavejh, G. C., M. C. Dal Canto, et al. (2000). "Fas-mediated apoptosis in clinical
remissions of relapsing experimental autoimmune encephalomyelitis." J Clin Invest
105(2): 223-31.
Suzuki, A., M. T. Yamaguchi, et al. (2001). "T cell-specific loss of Pten leads to defects in
central and peripheral tolerance." Immunity 14(5): 523-34.
Suzumura, A., M. Sawada, et al. (1993). "Transforming growth factor-beta suppresses
activation and proliferation of microglia in vitro." J Immunol 151(4): 2150-8.
Swain, S. L. (1983). "T cell subsets and the recognition of MHC class." Immunol Rev 74:
129-42.
234
Swain, S. L., A. D. Weinberg, et al. (1990). "IL-4 directs the development of Th2-like helper
effectors." J Immunol 145(11): 3796-806.
Tadokoro, C. E., G. Shakhar, et al. (2006). "Regulatory T cells inhibit stable contacts between
CD4+ T cells and dendritic cells in vivo." J Exp Med 203(3): 505-11.
Takahashi, T., Y. Kuniyasu, et al. (1998). "Immunologic self-tolerance maintained by
CD25+CD4+ naturally anergic and suppressive T cells: induction of autoimmune
disease by breaking their anergic/suppressive state." Int Immunol 10(12): 1969-80.
Tan, L., K. B. Gordon, et al. (1998). "Presentation of proteolipid protein epitopes and B7-1dependent activation of encephalitogenic T cells by IFN-gamma-activated SJL/J
astrocytes." J Immunol 160(9): 4271-9.
Tang, Q. and J. A. Bluestone (2006). "Regulatory T-cell physiology and application to treat
autoimmunity." Immunol Rev 212: 217-37.
Tang, Q., E. K. Boden, et al. (2004). "Distinct roles of CTLA-4 and TGF-beta in
CD4+CD25+ regulatory T cell function." Eur J Immunol 34(11): 2996-3005.
Tanuma, N., T. Kojima, et al. (1997). "Competitive PCR quantification of pro- and antiinflammatory cytokine mRNA in the central nervous system during autoimmune
encephalomyelitis." J Neuroimmunol 73(1-2): 197-206.
Tanzola, M. B., M. Robbie-Ryan, et al. (2003). "Mast cells exert effects outside the central
nervous system to influence experimental allergic encephalomyelitis disease course." J
Immunol 171(8): 4385-91.
Tarbell, K. V., S. Yamazaki, et al. (2004). "CD25+ CD4+ T cells, expanded with dendritic
cells presenting a single autoantigenic peptide, suppress autoimmune diabetes." J Exp
Med 199(11): 1467-77.
Tato, C. M., A. Laurence, et al. (2006). "Helper T cell differentiation enters a new era: le roi
est mort; vive le roi!" J Exp Med 203(4): 809-12.
Taylor, P. A., C. J. Lees, et al. (2004). "B7 expression on T cells down-regulates immune
responses through CTLA-4 ligation via T-T interactions [corrections]." J Immunol
172(1): 34-9.
Teleshova, N., M. Pashenkov, et al. (2002). "Multiple sclerosis and optic neuritis: CCR5 and
CXCR3 expressing T cells are augmented in blood and cerebrospinal fluid." J Neurol
249(6): 723-9.
Terabe, M., S. Matsui, et al. (2003). "Transforming growth factor-beta production and
myeloid cells are an effector mechanism through which CD1d-restricted T cells block
cytotoxic T lymphocyte-mediated tumor immunosurveillance: abrogation prevents
tumor recurrence." J Exp Med 198(11): 1741-52.
Testi, R., J. H. Phillips, et al. (1989). "T cell activation via Leu-23 (CD69)." J Immunol
143(4): 1123-8.
Thebault-Baumont, K., D. Dubois-Laforgue, et al. (2003). "Acceleration of type 1 diabetes
mellitus in proinsulin 2-deficient NOD mice." J Clin Invest 111(6): 851-7.
Thomas, W. E. (1999). "Brain macrophages: on the role of pericytes and perivascular cells."
Brain Res Brain Res Rev 31(1): 42-57.
Thornton, A. M. and E. M. Shevach (1998). "CD4+CD25+ immunoregulatory T cells
suppress polyclonal T cell activation in vitro by inhibiting interleukin 2 production." J
Exp Med 188(2): 287-96.
Thornton, A. M. and E. M. Shevach (2000). "Suppressor effector function of CD4+CD25+
immunoregulatory T cells is antigen nonspecific." J Immunol 164(1): 183-90.
Tienari, P., A. Bonetti, et al. (2006). "Multiple sclerosis in G: genes and geography." Clin
Neurol Neurosurg 108(3): 223-6.
235
Tierney, J. B., M. Kharkrang, et al. (2009). "Type II-activated macrophages suppress the
development of experimental autoimmune encephalomyelitis." Immunol Cell Biol
87(3): 235-40.
Ting, J. P. and A. S. Baldwin (1993). "Regulation of MHC gene expression." Curr Opin
Immunol 5(1): 8-16.
Toft-Hansen, H., A. A. Babcock, et al. (2007). "Downregulation of membrane type-matrix
metalloproteinases in the inflamed or injured central nervous system." J
Neuroinflammation 4: 24.
Toft-Hansen, H., R. K. Nuttall, et al. (2004). "Key metalloproteinases are expressed by
specific cell types in experimental autoimmune encephalomyelitis." J Immunol
173(8): 5209-18.
Tough, D. F. and J. Sprent (1994). "Turnover of naive- and memory-phenotype T cells." J
Exp Med 179(4): 1127-35.
Trapp, B. D., J. Peterson, et al. (1998). "Axonal transection in the lesions of multiple
sclerosis." N Engl J Med 338(5): 278-85.
Trifari, S., C. D. Kaplan, et al. (2009). "Identification of a human helper T cell population that
has abundant production of interleukin 22 and is distinct from T(H)-17, T(H)1 and
T(H)2 cells." Nat Immunol 10(8): 864-71.
Tsai, S., A. Shameli, et al. (2008). "CD8+ T cells in type 1 diabetes." Adv Immunol 100: 79124.
Tsitoura, D. C., V. P. Yeung, et al. (2002). "Critical role of B cells in the development of T
cell tolerance to aeroallergens." Int Immunol 14(6): 659-67.
Tsunawaki, S., M. Sporn, et al. (1988). "Deactivation of macrophages by transforming growth
factor-beta." Nature 334(6179): 260-2.
Tuohy, V. K., Z. Lu, et al. (1989). "Identification of an encephalitogenic determinant of
myelin proteolipid protein for SJL mice." J Immunol 142(5): 1523-7.
Tzartos, J. S., M. A. Friese, et al. (2008). "Interleukin-17 production in central nervous
system-infiltrating T cells and glial cells is associated with active disease in multiple
sclerosis." Am J Pathol 172(1): 146-55.
Vaknin-Dembinsky, A., K. Balashov, et al. (2006). "IL-23 is increased in dendritic cells in
multiple sclerosis and down-regulation of IL-23 by antisense oligos increases dendritic
cell IL-10 production." J Immunol 176(12): 7768-74.
van den Berg, W. B. (2009). "Lessons from animal models of arthritis over the past decade."
Arthritis Res Ther 11(5): 250.
van der Laan, L. J., S. R. Ruuls, et al. (1996). "Macrophage phagocytosis of myelin in vitro
determined by flow cytometry: phagocytosis is mediated by CR3 and induces
production of tumor necrosis factor-alpha and nitric oxide." J Neuroimmunol 70(2):
145-52.
van Endert, P. M., L. Saveanu, et al. (2002). "Powering the peptide pump: TAP crosstalk with
energetic nucleotides." Trends Biochem Sci 27(9): 454-61.
Venken, K., N. Hellings, et al. (2006). "Secondary progressive in contrast to relapsingremitting multiple sclerosis patients show a normal CD4+CD25+ regulatory T-cell
function and FOXP3 expression." J Neurosci Res 83(8): 1432-46.
Viglietta, V., C. Baecher-Allan, et al. (2004). "Loss of functional suppression by
CD4+CD25+ regulatory T cells in patients with multiple sclerosis." J Exp Med
199(7): 971-9.
Vogt, T. C., J. A. Killian, et al. (1994). "Structure and dynamics of the acyl chain of a
transmembrane polypeptide." Biochemistry 33(8): 2063-70.
Wadachi, R. and K. M. Hargreaves (2006). "Trigeminal nociceptors express TLR-4 and
CD14: a mechanism for pain due to infection." J Dent Res 85(1): 49-53.
236
Waldner, H., M. J. Whitters, et al. (2000). "Fulminant spontaneous autoimmunity of the
central nervous system in mice transgenic for the myelin proteolipid protein-specific T
cell receptor." Proc Natl Acad Sci U S A 97(7): 3412-7.
Waldor, M. K., S. Sriram, et al. (1985). "Reversal of experimental allergic encephalomyelitis
with monoclonal antibody to a T-cell subset marker." Science 227(4685): 415-7.
Walker, L. S., L. J. Ausubel, et al. (2002). "CTLA-4 differentially regulates T cell responses
to endogenous tissue protein versus exogenous immunogen." J Immunol 169(11):
6202-9.
Walker, P. R., T. Calzascia, et al. (2003). "T-cell immune responses in the brain and their
relevance for cerebral malignancies." Brain Res Brain Res Rev 42(2): 97-122.
Walsh, M. J. and W. W. Tourtellotte (1986). "Temporal invariance and clonal uniformity of
brain and cerebrospinal IgG, IgA, and IgM in multiple sclerosis." J Exp Med 163(1):
41-53.
Wang, L. and R. Bosselut (2009). "CD4-CD8 lineage differentiation: Thpok-ing into the
nucleus." J Immunol 183(5): 2903-10.
Warren, K. G. and I. Catz (1993). "Autoantibodies to myelin basic protein within multiple
sclerosis central nervous system tissue." J Neurol Sci 115(2): 169-76.
Weber, F., B. Fontaine, et al. (2008). "IL2RA and IL7RA genes confer susceptibility for
multiple sclerosis in two independent European populations." Genes Immun 9(3): 25963.
Wei, R. and G. M. Jonakait (1999). "Neurotrophins and the anti-inflammatory agents
interleukin-4 (IL-4), IL-10, IL-11 and transforming growth factor-beta1 (TGF-beta1)
down-regulate T cell costimulatory molecules B7 and CD40 on cultured rat
microglia." J Neuroimmunol 95(1-2): 8-18.
Wekerle, H. and R. Hohlfeld "Molecular oracles for multiple sclerosis therapy." Nat Med
16(4): 376-7.
Weller, R. O., B. Engelhardt, et al. (1996). "Lymphocyte targeting of the central nervous
system: a review of afferent and efferent CNS-immune pathways." Brain Pathol 6(3):
275-88.
Wiedemann, A., D. Depoil, et al. (2006). "Cytotoxic T lymphocytes kill multiple targets
simultaneously via spatiotemporal uncoupling of lytic and stimulatory synapses." Proc
Natl Acad Sci U S A 103(29): 10985-90.
Willer, C. J., D. A. Dyment, et al. (2003). "Twin concordance and sibling recurrence rates in
multiple sclerosis." Proc Natl Acad Sci U S A 100(22): 12877-82.
Williams, A. F. and A. N. Barclay (1988). "The immunoglobulin superfamily--domains for
cell surface recognition." Annu Rev Immunol 6: 381-405.
Williams, G. T., R. Kingston, et al. (1986). "A single micromanipulated stem cell gives rise to
multiple T-cell receptor gene rearrangements in the thymus in vitro." Nature
324(6092): 63-4.
Williams, O. and H. J. Brady (2001). "The role of molecules that mediate apoptosis in T-cell
selection." Trends Immunol 22(2): 107-11.
Williamson, F. (1973). "Microbes. 5. Elie Metchnikoff: advocate for phagocytes." Nurs Times
69(50): 1702-3.
Willis, S. N., C. Stadelmann, et al. (2009). "Epstein-Barr virus infection is not a characteristic
feature of multiple sclerosis brain." Brain 132(Pt 12): 3318-28.
Wolf, S. D., B. N. Dittel, et al. (1996). "Experimental autoimmune encephalomyelitis
induction in genetically B cell-deficient mice." J Exp Med 184(6): 2271-8.
Wong, G. H., P. F. Bartlett, et al. (1984). "Inducible expression of H-2 and Ia antigens on
brain cells." Nature 310(5979): 688-91.
237
Wucherpfennig, K. W., I. Catz, et al. (1997). "Recognition of the immunodominant myelin
basic protein peptide by autoantibodies and HLA-DR2-restricted T cell clones from
multiple sclerosis patients. Identity of key contact residues in the B-cell and T-cell
epitopes." J Clin Invest 100(5): 1114-22.
Wucherpfennig, K. W. and J. L. Strominger (1995). "Molecular mimicry in T cell-mediated
autoimmunity: viral peptides activate human T cell clones specific for myelin basic
protein." Cell 80(5): 695-705.
Xystrakis, E., A. S. Dejean, et al. (2004). "Identification of a novel natural regulatory CD8 Tcell subset and analysis of its mechanism of regulation." Blood 104(10): 3294-301.
Xystrakis, E., S. Kusumakar, et al. (2006). "Reversing the defective induction of IL-10secreting regulatory T cells in glucocorticoid-resistant asthma patients." J Clin Invest
116(1): 146-55.
Yamamura, T., K. Miyamoto, et al. (2004). "NKT cell-stimulating synthetic glycolipids as
potential therapeutics for autoimmune disease." Curr Top Med Chem 4(5): 561-7.
Yannelli, J. R., J. A. Sullivan, et al. (1986). "Reorientation and fusion of cytotoxic T
lymphocyte granules after interaction with target cells as determined by high
resolution cinemicrography." J Immunol 136(2): 377-82.
Ye, Z., K. A. Ahmed, et al. (2008). "Active CD4+ helper T cells directly stimulate CD8+
cytotoxic T lymphocyte responses in wild-type and MHC II gene knockout C57BL/6
mice and transgenic RIP-mOVA mice expressing islet beta-cell ovalbumin antigen
leading to diabetes." Autoimmunity 41(7): 501-11.
Yin, G. Q., S. Y. Zhao, et al. (2006). "[Galectin-7 is associated with bronchial epithelial cell
apoptosis in asthmatic children]." Zhonghua Er Ke Za Zhi 44(7): 523-6.
Yu, Q., J. H. Park, et al. (2006). "Cytokine signal transduction is suppressed in preselection
double-positive thymocytes and restored by positive selection." J Exp Med 203(1):
165-75.
Zamvil, S., P. Nelson, et al. (1985). "T-cell clones specific for myelin basic protein induce
chronic relapsing paralysis and demyelination." Nature 317(6035): 355-8.
Zamvil, S. S., D. J. Mitchell, et al. (1986). "T-cell epitope of the autoantigen myelin basic
protein that induces encephalomyelitis." Nature 324(6094): 258-60.
Zang, Y. C., S. Li, et al. (2004). "Increased CD8+ cytotoxic T cell responses to myelin basic
protein in multiple sclerosis." J Immunol 172(8): 5120-7.
Zappulla, J. P., M. Arock, et al. (2002). "Mast cells: new targets for multiple sclerosis
therapy?" J Neuroimmunol 131(1-2): 5-20.
Zarek, P. E., C. T. Huang, et al. (2008). "A2A receptor signaling promotes peripheral
tolerance by inducing T-cell anergy and the generation of adaptive regulatory T cells."
Blood 111(1): 251-9.
Zehn, D. and M. J. Bevan (2006). "T cells with low avidity for a tissue-restricted antigen
routinely evade central and peripheral tolerance and cause autoimmunity." Immunity
25(2): 261-70.
Zhang, B., T. Yamamura, et al. (1997). "Regulation of experimental autoimmune
encephalomyelitis by natural killer (NK) cells." J Exp Med 186(10): 1677-87.
Zhang, X., D. N. Koldzic, et al. (2004). "IL-10 is involved in the suppression of experimental
autoimmune encephalomyelitis by CD25+CD4+ regulatory T cells." Int Immunol
16(2): 249-56.
Zhang, X., Y. Tang, et al. (2008). "Degenerate TCR recognition and dual DR2 restriction of
autoreactive T cells: implications for the initiation of the autoimmune response in
multiple sclerosis." Eur J Immunol 38(5): 1297-309.
Zhao, D. M., A. M. Thornton, et al. (2006). "Activated CD4+CD25+ T cells selectively kill B
lymphocytes." Blood 107(10): 3925-32.
238
Zhao, Y., A. Balato, et al. (2009). "Th17/Tc17 infiltration and associated cytokine gene
expression in elicitation phase of allergic contact dermatitis." Br J Dermatol 161(6):
1301-6.
Zhou, J., C. Xiao, et al. (2006). "The effect of triptolide on CD4+ and CD8+ cells in Peyer's
patch of SD rats with collagen induced arthritis." Int Immunopharmacol 6(2): 198203.
Zhu, C., A. C. Anderson, et al. (2005). "The Tim-3 ligand galectin-9 negatively regulates T
helper type 1 immunity." Nat Immunol 6(12): 1245-52.
Zhu, Y., S. Roth-Eichhorn, et al. (2000). "The expression of transforming growth factor-beta1
(TGF-beta1) in hippocampal neurons: a temporary upregulated protein level after
transient forebrain ischemia in the rat." Brain Res 866(1-2): 286-98.
Zinkernagel, R. M., G. N. Callahan, et al. (1978). "On the thymus in the differentiation of "H2 self-recognition" by T cells: evidence for dual recognition?" J Exp Med 147(3): 88296.
Zitvogel, L., A. Tesniere, et al. (2006). "Cancer despite immunosurveillance:
immunoselection and immunosubversion." Nat Rev Immunol 6(10): 715-27.
Zozulya, A. L. and H. Wiendl (2008). "The role of CD8 suppressors versus destructors in
autoimmune central nervous system inflammation." Hum Immunol 69(11): 797-804.
239
ANNEXE
240
Multimerized T cell epitopes protect from
experimental autoimmune diabetes
by inducing dominant tolerance
Eliane Piaggio*†, Lennart T. Mars*†, Cécile Cassan*†, Julie Cabarrocas*†, Maria Hofstätter‡, Sabine Desbois*†,
Emilie Bergereau*†, Olaf Rötzschke‡, Kirsten Falk‡§, and Roland S. Liblau*†§
*Unité 563, Centre de Physiopathologie de Toulouse Purpan, Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale, F-31300 Toulouse, France;
†Université Paul-Sabatier, F-31400 Toulouse, France; and ‡Max-Delbrück Center for Molecular Medicine, 13125 Berlin, Germany
Immunotherapy by using multimerized self-peptides has demonstrated a clear protective effect on experimental models of autoimmune diseases. However, the mechanisms involved remain illdefined. Here we have evaluated the therapeutic efficacy of
multimerized self-peptides at the effector phase of autoimmune
diabetes and examined their mechanisms of action. Diabetes was
induced in rat insulin promoter-hemagglutinin (HA) mice expressing HA in pancreatic ␤-cells by adoptive transfer of HA110 –119specific T helper 1 cells. Complete protection was provided by low
doses of the HA 4-mer consisting of four covalently linked linear
HA107–119 peptides. In vivo, the 4-mer appeared to act directly on
the pathogenic HA-specific T helper 1 cells and indirectly by
activation/recruitment of lymphocytes with regulatory properties
so that mice became resistant to a second transfer of diabetogenic
T cells. This effect was associated with a recruitment of Foxp3ⴙ CD4
T cells around islets. Moreover, we show that dominant protection
from autoimmunity was transferable by spleen cells, and that
development of this regulatory population was crucially dependent on the lymphocytes from treated rat insulin promoter-HA
mice. Thus, immunotherapy using multimerized epitopes emerges
as a promising strategy in view of the current identification of
self-epitopes that are major targets of the pathogenic CD4 T cell
response in autoimmune diseases.
autoimmunity immune tolerance 兩 immunotherapy 兩 regulatory T cells 兩
Foxp3
T
he treatment of human autoimmune diseases is particularly
challenging. Indeed, diseases such as rheumatoid arthritis,
multiple sclerosis, and type 1 diabetes (T1D) are mainly chronic
and impact quality of life more than life expectancy. Moreover,
treatments are often started long after the onset of the pathogenic process, at a time when the autoimmune recognition has
spread to multiple self-antigens (1). In this context, conventional
immunosuppression offers only partial benefit at the price of
frequent and sometimes serious adverse events. More recently,
targeted immunotherapies using antiinflammatory cytokines,
antibodies against lymphocyte surface molecules, or neutralization of proinflammatory cytokines or homing receptors have
achieved great clinical success. However, by affecting indiscriminately the pathogenic autoimmune process, together with beneficial immune responses, they too can be saddled with serious
side effects. An attractive alternative is to use antigen-specific
approaches to selectively silence autoreactive T cells (2–5). In
animal models, prevention of autoimmune disease can be
achieved by i.v., mucosal, or s.c. administration of soluble
self-antigen or by vaccination with DNA-encoding self-antigens
(3, 5). However, therapeutic results were often inconsistent (2,
3) possibly due to the selective targeting of T cells specific for the
injected self-antigen.
Peptides bind MHC class II molecules with both ends extruding from the peptide-binding groove (6). This structural feature
provides the opportunity to design linear multimeric peptides
www.pnas.org兾cgi兾doi兾10.1073兾pnas.0610423104
that consist of multiple copies of a CD4 T cell epitope connected
by spacer sequences (7). This unique structure is designed to
form multivalent arrays of peptide:MHC complexes on the
surface of the antigen-presenting cells (APCs). The cross-linking
of MHC class II molecules and the resulting clustering of
peptide:MHC/T cell receptor (TCR) greatly enhance both APC
and T cell activation. Therefore, multimerized T cell epitopes
increase the immunological potency of soluble peptides and can
promote either antigen-specific T cell activation or tolerance
through activation-induced cell death in vitro at much lower
concentrations than the monomeric peptide (7, 8). Similarly, in
vivo immunization with multimerized myelin peptides led to an
exacerbated experimental autoimmune disease, whereas the
same multimer injected i.v. resulted in inactivation of pathogenic
CD4 T cells and dramatic suppression of disease (9, 10). However, despite their great therapeutic potential, little is known
about the mechanisms of action of multimerized epitopes in vivo.
In the present study, we have evaluated the therapeutic efficacy
of multimerized epitopes at the effector phase of a T1D model
and assessed their mechanisms of action.
Results
Comparison of the Effects of the 4-Mer and the HA107–119 Peptide on
T Cell Recognition. The hemagglutinin (HA) 4-mer used in this
study was produced by recombinant techniques and consists of
four covalently linked HA107–119 peptides. We first compared the
in vitro activity of the 4-mer and the monomeric HA107–119
peptide on HA-specific CD4 T cells from 6.5-TCR transgenic
animals. These cells can be specifically labeled with the 6.5
anticlonotypic mAb (11). 6.5⫹ CD4 T cells exhibited an enhanced TCR down-regulation after in vitro incubation with the
4-mer compared with monomeric HA107–119 peptide (Fig. 1A).
Moreover, the half-maximal proliferative response of naı̈ve (Fig.
1B Left) or TH1-differentiated (Fig. 1B Right) 6.5-TCR CD4 T
cells was consistently induced by a 10- to 100-fold lower concentration of the 4-mer compared with the monomeric HA107–119
peptide. Furthermore, the 4-mer induced a bell-shaped proliferation curve, suggesting that high concentrations of the multimer favored death and/or anergy of the specific T cells in vitro,
Author contributions: E.P., L.T.M., O.R., K.F., and R.S.L. designed research; E.P., L.T.M., C.C.,
J.C., M.H., S.D., and E.B. performed research; M.H., O.R., and K.F. contributed new reagents/
analytic tools; E.P., L.T.M., C.C., J.C., E.B., O.R., K.F., and R.S.L. analyzed data; and E.P., O.R.,
K.F., and R.S.L. wrote the paper.
The authors declare no conflict of interest.
This article is a PNAS Direct Submission.
Abbreviations: APC, antigen-presenting cell; GA, glatiramer acetate; RIP, rat insulin promotor; T1D, type 1 diabetes; TCR, T cell receptor; TH1, T helper 1.
§To
whom correspondence may be addressed. E-mail: [email protected] or
[email protected].
This article contains supporting information online at www.pnas.org/cgi/content/full/
0610423104/DC1.
© 2007 by The National Academy of Sciences of the USA
PNAS 兩 May 29, 2007 兩 vol. 104 兩 no. 22 兩 9393–9398
IMMUNOLOGY
Edited by Jack L. Strominger, Harvard University, Cambridge, MA, and approved April 12, 2007 (received for review November 24, 2006)
Fig. 1. Influence of epitope multimerization on T cell responses in vitro and
on half-life in vivo. (A) Effect on TCR down-regulation. 6.5 expression on gated
CD4 cells from 6.5-TCR mice was analyzed by FACS after 12 h of stimulation
with medium alone, monomeric HA107–119 peptide (10 ␮g/ml), 4-mer (10
␮g/ml), or anti-CD3␧ mAb (0.5 ␮g/ml). The decrease in 6.5⫹ CD4⫹ T cells
compared with the unstimulated cells is shown in parentheses. (B) Effect on
the proliferative response of HA-specific CD4 T cells. (Left) Spleen and lymph
nodes of 6.5-TCR mice were incubated with the indicated concentrations of
the HA107–119 peptide or 4-mer, and [3H]thymidine incorporation was measured after 72 h of stimulation. Similar results were obtained with shorter (12,
24, and 48 h) stimulation periods (data not shown). (Right) TH1-differentiated
6.5-TCR CD4 T cells were incubated for 24 h with the indicated concentrations
of the HA107–119 peptide or 4-mer and irradiated APCs, and [3H]thymidine
uptake was evaluated. Results are from one of two similar experiments. (C) In
vivo half-life on splenic APCs of the HA107–119 peptide or 4-mer. Splenocytes
from BALB/c mice, injected i.v. with 2.5 ␮g of the HA107–119 peptide or 4-mer,
were harvested at the indicated time points to induce proliferation of purified
6.5-TCR CD4 T cells. Maximum [3H]thymidine uptake (62,885 ⫾ 11,655 cpm)
was defined as the stimulation induced by splenocytes from BALB/c mice
injected 0.5 h earlier with 4-mer. Results from three experiments are presented as the mean percentage (⫾ SEM) of the maximum value.
as previously documented in other systems (8, 9). An oligomer
consisting of 16 copies of the HA107–119 peptide also acted as a
superagonist in vitro. Presumably due to aggregation the longer
oligomer proved slightly less potent than the 4-mer (data not
shown) so that further in vivo investigations were performed by
using the 4-mer.
We next compared the in vivo half-life of the 4-mer and the
HA107–119 peptide on APCs. To this end, BALB/c mice received
PBS or 2.5 ␮g of either 4-mer or HA107–119 peptide, and their
splenocytes, harvested at different times postinjection, were
used to stimulate purified CD4 T cells from 6.5-TCR mice.
Splenocytes from mice injected with the peptide induced minimal proliferation, preventing accurate assessment of the in vivo
half-life. In contrast, a strong response was elicited by splenocytes from 4-mer-injected mice, revealing an in vivo half-life of
the 4-mer of 4.8 h (Fig. 1C).
9394 兩 www.pnas.org兾cgi兾doi兾10.1073兾pnas.0610423104
Fig. 2. Injection of 4-mer protects from diabetes induced by transfer of
effector 6.5-TCR TH1 cells in RIP-HA mice. (A) Development of the diabetes
model. Increasing numbers of 6.5-TCR TH1 cells were injected i.v. into immunocompetent RIP-HA mice, and development of diabetes was plotted against
time. (B and C) Protection from diabetes by 4-mer. (B) RIP-HA mice were
adoptively transferred with 2.5 ⫻ 106 6.5-TCR TH1 cells. The animals were
injected with the indicated doses (0.01–2.5 ␮g) of either the HA107–119 peptide
or 4-mer. The frequency of diabetes in each group is shown. All PBS-treated
control RIP-HA mice (n ⫽ 13) developed diabetes. (C) The extent of insulitis was
determined at day 30 as the percentage of normal, periinfiltrated, infiltrated
⬍50%, or infiltrated ⬎50% islets (n ⫽ number of mice). Total number of islets
is indicated in parentheses. Among the HA107–119 peptide-treated mice, 4 of 8
mice treated with 0.63 ␮g and 7 of 11 mice treated with 2.5 ␮g survived and
could be analyzed histologically.
Injection of 4-Mer Polypeptide Blocks Autoimmune Diabetes Induced
by Effector TH1 Cells. We then tested the ability of the HA 4-mer to
induce tolerance to a pancreatic neo-self-antigen in a new T1D
model. The model consists of the adoptive transfer of 6.5-TCR TH1
cells into nonirradiated immunocompetent rat insulin promoter
(RIP)-HA mice (12). Transfer of 2.5 ⫻ 106 TH1 cells or more
invariably resulted in diabetes, which proved rapidly fatal (Fig. 2A).
To compare the ability of the 4-mer and the HA107–119 peptide to
block the effector phase of autoimmune diabetes, increasing doses
(0.01–2.5 ␮g) of either molecule were injected after the adoptive
transfer of diabetogenic TH1 cells. Treatment with the HA107–119
peptide resulted in incomplete protection from diabetes only at the
highest dose tested (2.5 ␮g) (P ⫽ 0.086). In sharp contrast,
treatment with the 4-mer completely protected RIP-HA mice from
disease development at the 2.5-␮g (P ⬍ 0.0001) or 0.63-␮g (P ⬍
0.0001) doses (Fig. 2B). Moreover, a partial but significant (P ⫽
0.01) protection from diabetes was observed with as little as 0.04 ␮g
of the 4-mer. The histological analysis of the pancreas showed that
the severity of insulitis correlated with the development of disease
(Fig. 2C). However, despite full protection from diabetes, pancreatic islets from 4-mer-treated mice still exhibited mononuclear cell
infiltration.
Piaggio et al.
tigate the mode of action of the 4-mer treatment, we evaluated
the duration of 4-mer presentation by host APCs in vivo.
RIP-HA mice were first injected with 2.5 ␮g of 4-mer or
HA107–119 peptide, or PBS alone. One or 15 days later, they
received CFSE-labeled splenocytes from 6.5-TCR RAG2⫺/⫺
mice, and CD69 induction was assessed on CFSE⫹ HA-specific
CD4 T cells as an indicator of in vivo priming. Expression of
CD69 on HA-specific CD4 T cells was only increased in mice
that received the 4-mer 24 h before the cell transfer (Fig. 3A).
These results establish that the 4-mer is no longer presented 15
days after its injection.
We then challenged protected RIP-HA mice with a second
transfer of 6.5-TCR TH1 cells 15 days after the first cell transfer
without further injection of the multimer. Ten of 11 tolerized mice
were able to control this second wave of diabetogenic TH1 cells
(Fig. 3B; P ⬍ 0.0001). Moreover, a protective effect was also
observed in mice, referred to as the ‘‘4-mer-only’’ group, which
initially received only the 4-mer treatment (but no diabetogenic T
cells) and were injected 15 days later with 6.5-TCR TH1 cells (Fig.
3B; P ⫽ 0.0007). These results suggest that multimer injection can
induce dominant tolerance.
To investigate whether protection from diabetes could be transferred to naive animals, splenocytes from unmanipulated or tolerized RIP-HA mice were transferred to a second group of RIP-HA
mice. The next day, these recipient mice received 6.5-TCR TH1
diabetogenic cells. Splenocytes from tolerized RIP-HA mice significantly (P ⫽ 0.022) protected the recipients from diabetes
induced by TH1 cells (Fig. 3C). Collectively, these results indicate
that a regulatory cell population capable of transferring protection
from diabetes is induced and/or expanded after 4-mer injection.
This conclusion led us to evaluate the proportion of infiltrating
mononuclear cells expressing Foxp3, a major specification factor for
regulatory T cells (13, 14), in the islets of 4-mer versus HA
peptide-treated mice by immunohistochemistry (Fig. 4). The insulitis of 4-mer-treated animals was characterized by a significant
decrease in mononuclear cells (P ⫽ 7 ⫻ 10⫺4) and an ⬇50%
increase in the proportion of Foxp3⫹ cells (P ⫽ 2 ⫻ 10⫺6) (Fig. 4B),
and ⬎90% of these cells were also stained with an anti-CD4 mAb
(Fig. 4A Lower). These Foxp3⫹ CD4 T cells usually displayed a
periinsular distribution, with few cells penetrating within the islets
(Fig. 4A Upper). Collectively, these data show that the 4-mertreated mice exhibit a nondestructive insulitis enriched in Foxp3⫹
CD4 T cells.
In contrast to the islets, no significant difference in the proportion of CD25⫺ or CD25⫹ Foxp3⫹ CD4 T cells was observed in the
spleen and pancreatic lymph nodes of 4-mer- versus HA peptidetreated mice [see supporting information (SI) Fig. 6]. These findings
suggest that in lymphoid organs the relevant regulatory T cells are
diluted among polyclonal regulatory T cells and/or that these cells
are recruited selectively to the islets. Study of cytokine production
by splenocytes and pancreatic lymph node cells ex vivo indicated
that the production of IL-6, IL-10, TNF-␣, and IFN-␥ in response
to HA peptide was reduced or even inhibited in 4-mer-treated mice
(see SI Fig. 7). No increase in basal or HA-induced TGF-␤
production was observed in 4-mer-treated animals, and in vivo
neutralization of IL-4, IL-10, and TGF-␤ either alone or in combination did not impair the ability of the 4-mer to protect from
diabetes (data not shown).
Control of Pathogenic Effector T Cells with Different HA Specificity. To
assess whether the regulatory cell population acts on pathogenic T
cells bearing different antigenic specificity (bystander suppression),
diabetogenic HNT-TCR TH1 cells, specific for the I-Ad:HA126–138
complex, were used. As described above, RIP-HA mice were
tolerized by transfer of 6.5-TCR TH1 cells, followed by injection of
the 4-mer or treated with the 4-mer only. Fifteen days later, mice
were challenged with a dose of HNT-TCR TH1 cells that induces
Piaggio et al.
IMMUNOLOGY
Induction of Active Suppression by the 4-Mer Treatment. To inves-
Fig. 3. The 4-mer treatment induces dominant tolerance. (A) Duration of 4-mer
presentation by APCs in vivo. RIP-HA mice were treated with PBS or with 2.5 ␮g
of HA107–119 peptide or 4-mer. One day (Left) or 15 days (Right) later, mice were
injected with 30 ⫻ 106 CFSE-labeled 6.5-TCR RAG2⫺/⫺ splenocytes. The proportion
of HA-specific CD4⫹ CFSE⫹ T cells expressing CD69 was determined 24 h later in
the spleen of recipient mice. (B–D) Dominant tolerance induced by 4-mer. RIP-HA
mice received 5 ⫻ 106 6.5-TCR TH1 cells and were treated with 2.5 ␮g of 4-mer.
These tolerized mice (filled circles) were challenged 15 days later by a second
transfer of 5 ⫻ 106 6.5-TCR TH1 cells (HA107–119-specific) (B) or 25 ⫻ 106 HNT-TCR
TH1 cells (HA126 –138-specific) (D). In parallel, adoptive transfer was carried out in
4-mer-only mice that had received only the 4-mer treatment (filled squares).
Control RIP-HA recipient mice were left untreated to confirm the diabetogenic
potential of each TH1 preparation (filled triangles). (C) RIP-HA mice were transferred with 5 ⫻ 107 splenocytes from control unmanipulated RIP-HA mice (empty
circles) or tolerized RIP-HA mice (filled circles). The next day, these recipient mice
received 5 ⫻ 106 6.5-TCR TH1 cells, and the development of diabetes was assessed.
fully penetrant diabetes in RIP-HA mice (Fig. 3D). Nearly half of
the tolerized RIP-HA mice were able to control a subsequent
transfer of HNT-TCR TH1 cells (8 of 15 mice became diabetic; P ⫽
0.02). Similar results were obtained with animals treated with the
4-mer alone (9 of 15 mice became diabetic; P ⫽ 0.005). These results
indicate that treatment with the 4-mer induces a regulatory cell
population able to confer protection from T1D induced by diabetogenic CD4 T cells with a different specificity.
PNAS 兩 May 29, 2007 兩 vol. 104 兩 no. 22 兩 9395
Fig. 5. The 4-mer-induced dominant tolerance depends on endogenous lymphocytes. RAG2⫺/⫺ RIP-HA mice received a first injection of 5 ⫻ 106 6.5-TCR TH1
cells, called here TH1(A), and were injected i.v. with 2.5 ␮g of 4-mer (filled circles)
or PBS only (filled triangles). A group of mice were tolerized by the combined
treatment with 4-mer and 6.5-TCR TH1 cells (filled squares), and a group of
control untreated mice (filled diamonds) received on day 15 a second transfer of
diabetogenic T cells, called here TH1(B). Adoptive T cell transfers are indicated by
solid arrows and i.v. injections of 4-mer by dashed arrows. All PBS-treated mice (6
of 6) eventually developed fatal diabetes within 12 days of TH1 cell transfer.
and B cells, the 4-mer is able to delay the onset of disease by directly
targeting the transferred TH1 cells, but cannot establish longlasting dominant tolerance.
Fig. 4. Accumulation of Foxp3⫹ mononuclear cells in the infiltrated islets of
4-mer-treated mice. (A) Pancreatic sections from 4-mer- or HA107–119 peptidetreated mice described in Fig. 2B were stained for nuclear Foxp3 (brown,
counterstained by H&E). (Upper) Islet-infiltrating mononuclear cells and
Foxp3⫹ cells were counted. (Lower) Double staining was performed on frozen
sections to reveal Foxp3 (brown) and CD4 (blue). (B) The number of Foxp3⫹
and Foxp3⫺ mononuclear cells was counted for each infiltrated islets for a
total of 30,096 cells. The mean number (⫾ SEM) of infiltrating cells (Left) and
the proportion of Foxp3⫹ cells (Right) are indicated (n ⫽ number of mice). The
number of islets is indicated in parentheses.
Development of Dominant Tolerance Requires an Endogenous Lymphocyte Population. Because treatment with the 4-mer alone was
almost as effective as the combined tolerization with 4-mer and
adoptive transfer of TH1 cells, conversion of the transferred T cells
into regulatory cells does not appear to be a major mechanism of
protection. To determine the contribution of recipients’ lymphocytes in the regulation, adoptive transfer experiments were carried
out in T and B cell-deficient RAG2⫺/⫺ RIP-HA recipients. These
RAG2⫺/⫺ RIP-HA mice received 6.5-TCR TH1 cells and were
injected with 2.5 ␮g of the 4-mer or PBS. PBS-treated mice
developed T1D within 12 days of transfer, whereas mice treated
with the 4-mer presented a significantly delayed diabetes onset (Fig.
5; P ⫽ 0.014). This result indicates that endogenous lymphocytes
were not responsible for the early control of the diabetogenic TH1
cells. This initial control was associated with a rapid but partial
deletion of the pathogenic T cells. Indeed, 48 h after treatment, the
number of HA-specific T cells was decreased by 88% in the spleen
and 55% in pancreatic lymph nodes in 4-mer-treated compared
with PBS-treated mice (data not shown).
To determine the influence of endogenous T or B cells on the
subsequent induction of dominant tolerance, a group of RAG2⫺/⫺
RIP-HA mice that had been tolerized by the combined application
of 6.5-TCR TH1 cells and 4-mer received a second transfer of
diabetogenic 6.5-TCR TH1 cells 15 days later. In contrast to
immunocompetent RIP-HA mice (Fig. 3B), the tolerized
RAG2⫺/⫺ RIP-HA mice developed diabetes with the same kinetics
as untreated mice (Fig. 5). Thus, in the absence of endogenous T
9396 兩 www.pnas.org兾cgi兾doi兾10.1073兾pnas.0610423104
Discussion
In the present study, we characterized the cellular mechanisms
underlying the therapeutic effect of the injection of small doses of
a multimerized epitope in a mouse model of T1D. In this model, the
4-mer appeared to act through distinct mechanisms, leading to a
shift in the balance between pathogenic and regulatory cells. Its first
effect was to induce a partial deletion of diabetogenic TH1 cells.
However, development of diabetes was only delayed in 4-mertreated RAG⫺/⫺ RIP-HA mice. In a second phase, we observed an
induction and/or activation of cells with regulatory properties.
These regulatory cells developed in immunocompetent RIP-HA
mice treated with 4-mer, but not in RAG⫺/⫺ recipients, suggesting
that they originate from the recipients’ lymphocytes, rather than
from conversion of the transferred pathogenic TH1 cells. In
addition, preliminary experiments suggest that the 4-mer treatment
does not convert naive conventional HA-specific CD4 T cells into
Foxp3⫹ CD25⫹ regulatory cells (L.T.M., S.B., and R.S.L., unpublished data). These regulatory cells were able to control diabetogenic TH1 cells injected at a time when presentation of the 4-mer
was no longer detectable in the recipients. The dominant regulatory
capacity of these cells was further evidenced by their ability to block
diabetes when transferred in conjunction with pathogenic T cells
(Fig. 3C). In addition, islets from 4-mer-treated mice were significantly enriched in Foxp3⫹ CD4 T cells, suggesting that tissueinfiltrating regulatory T cells were contributing to the tolerant
phenotype, as previously described in other diabetes models (15–
18). Very few regulatory T cells are needed to inhibit autoimmunity, provided that they express a relevant specificity. Thus, even if
only some of the islet-infiltrating Foxp3⫹ CD4 T cells from 4-mertreated mice were HA-specific, it could certainly explain their
major clinical effect. However, at this stage, we have no tools to
directly assess their antigenic specificity. Although dominant tolerance in vivo has been attributed to antiinflammatory cytokines in
several experimental situations (19–21), in our model, administration of mAbs neutralizing IL-4, IL-10, and TGF-␤ did not impair the
diabetes-protective effect of the 4-mer.
Probably the most interesting aspect of the 4-mer effect is its
ability to promote suppression of pathogenic T cells that are not
Piaggio et al.
Piaggio et al.
transgenic animals expressing human MHC molecules. A further
prerequisite is the ability to accurately monitor the number and
function of antigen-specific CD4 T cells in humans (41, 42). In any
event, immunomodulation by multimerized epitopes emerges as a
promising alternative for organ-specific autoimmune diseases. The
ongoing identification of major self-peptides recognized by pathogenic T cells in human diseases, such as diabetes (43) and multiple
sclerosis (39), should help the design of therapeutically relevant
multimerized epitopes.
Materials and Methods
Antigens. The monomeric HA110–119 and HA107–119 peptides were
synthesized by NeoMPS (Strasbourg, France). The 4-mer consists
of four covalently linked linear HA107–119 peptides separated by 12
aa-long spacer sequences [-(GGPG)3-]. It was produced as previously described (7) and was purified on a reverse-phase C4-HPLC
column (Vydac, Hesperia, CA). Absence of endotoxin was confirmed by a standard limulus amoebocyte lysate assay (Cambrex,
East Rutherford, NJ).
Mice. RIP-HA (12), 6.5-TCR (11), and HNT-TCR (44) transgenic
mice were backcrossed at least 10 times onto the BALB/c background. Where indicated, RAG2⫺/⫺ 6.5-TCR and RAG2⫺/⫺
RIP-HA mice were used. All animal experiments were performed
under specific pathogen-free conditions in accordance with the
European Union guidelines and had local committee approval.
Flow Cytometry. The following biotin-, FITC-, and PE-conjugated
monoclonal antibodies (mAb) were used: anti-mouse CD4 (clone
CT-CD4), CD8 (clones CT-CD8a and 5H10), CD25 (clone 7D4),
CD69 (clone H1.2F3), CD62L (clone MEL-14), anti-rat IgG2b-PE
(clone 2b10A8), anti-rat IgG2b biotin (clone RG7/11.1), and the 6.5
anti-clonotypic mAb (11). Analysis was performed by using a
FACScan flow cytometer, and data were analyzed by using
CellQuest software (Becton Dickinson, Mountain View, CA).
In Vitro TH1 Cell Differentiation. To generate HA-specific TH1 cells,
107 spleen and lymph node cells from 6.5-TCR mice were stimulated with 10 ␮g/ml HA110–119 peptide in RPMI medium 1640
supplemented with 10% FCS, 1 ng/ml IL-2, and 20 ng/ml IL-12
(R&D Systems, Minneapolis, MN). At day 6, CD4 cells were
purified by magnetic sorting by using a rat anti-mouse CD4 mAb (3
␮g/ml, clone CT-CD4), goat anti-rat IgG-coated magnetic beads,
and separation columns (Miltenyi Biotech, Bergish Gladbach,
Germany). Positively selected CD4 T cells (106 per well) were
restimulated with HA peptide-pulsed irradiated syngeneic spleen
cells (107 per well) in complete medium. At day 9, living cells were
collected by Ficoll density separation and used in adoptive transfer
experiments. TH1 cells were generated from HNT-TCR mice
under the same conditions.
Proliferation Assays. Single-cell suspensions from spleens and
lymph nodes of 6.5-TCR mice (106 per well) or purified TH1
cells were stimulated with anti-CD3␧ mAb (0.5 ␮g/ml; clone
145–2C11; PharMingen, San Diego, CA) or with increasing
concentrations of the HA110 –119 peptide (10⫺5 to 10 ␮g/ml) in the
presence of irradiated BALB/c spleen cells (106 per well).
Proliferation was assessed by the incorporation of [3H]thymidine
(Amersham, Arlington Heights, IL) added for the last 16 h of
culture. To measure the in vivo half-life of the 4-mer on APCs,
splenocytes (106 cells per well) from BALB/c mice injected i.v.
with 2.5 ␮g of the 4-mer or HA107–119 peptide, or with PBS, were
irradiated and used to induce proliferation of purified CD4 T
cells from unmanipulated 6.5-TCR mice (APC:T cell ratio of
5:1), without exogenously added antigen (45).
In Vivo Activation of CD4 T Cells. Splenocytes from 6.5-TCR
RAG2⫺/⫺ mice (106 per ml) were labeled for 10 min at 37°C with
PNAS 兩 May 29, 2007 兩 vol. 104 兩 no. 22 兩 9397
IMMUNOLOGY
specific for the injected multimerized epitope. This type of bystander suppression induced by multimer treatment has previously
been documented in the experimental autoimmune encephalomyelitis setting (9). In a likely scenario, regulatory cells directly
inactivate effector T cells attracted to their immediate vicinity by a
shared source of antigen. Alternatively, the ability of the 4-mer to
induce regulatory lymphocytes could be related to a tolerogenic
effect on the APCs in the absence of a ‘‘danger’’ signal. These
tolerogenic APCs can be further educated by tolerant T cells (22).
Consequently, the same tolerogenic APC could be simultaneously
presenting different HA epitopes, modulating the diabetogenicity
of the two different HA-specific T cell populations analyzed here.
One possible implication of our findings is that specifically designed
multimers may inhibit T cell responses to autoantigens secondarily
recognized during the course of a destructive autoimmune process.
Several antigen-specific strategies have been devised to promote
deletion or anergy of pathogenic autoreactive T cells, or to convert
them into innocuous or even regulatory cells (2–5, 23). The
observation that full protection from experimental autoimmune
disease was achieved with very low doses of multimerized selfantigen is potentially of therapeutic interest and represents a
distinct advantage over earlier approaches (2, 3). However, antigenspecific immune suppression at very low-antigen doses is not
unprecedented. Indeed, similar to the multimer used here, soluble
dimeric HA110–120:I-Ed-Fc chimeric molecules display potent stimulatory properties on 6.5-TCR T cells and have a long half-life in
vivo (24, 25). Treatment of (6.5-TCR ⫻ RIP-HA)F1 double
transgenic mice with 2 ␮g of these chimeric molecules prevented
and even reversed diabetes through the induction of T cell anergy
in the spleen and stimulation of IL-10-secreting Tr1 cells in the
pancreas (25). However, due to the transient nature of the tolerance
induced, a chronic treatment was required to maintain the diabetesprotective effect. An analogous approach using peptide:I-Ag7-Fc
chimeric molecules was shown to prevent diabetes induced by the
adoptive transfer of BDC2.5 transgenic T cells into TCR␣⫺/⫺
nonobese diabetic mice. This treatment induced clonal anergy and
antiinflammatory cytokines, but here again diabetes reappeared
after suspension of the treatment (26).
To date, the only product approved by the Food and Drug
Administration for autoimmune diseases acting at the level of the
peptide:MHC/TCR complex is glatiramer acetate (GA) for the
treatment of multiple sclerosis (27). GA is made of synthetic amino
acid copolymers that promiscuously bind to MHC class II molecules. Notably, GA has been shown to directly impair the capacity
of dendritic cells to secrete the TH1-polarizing cytokine, IL-12p70,
and to promote the induction of IL-4 and IL-10-secreting T cells
(27–30). Moreover, modified amino acid copolymers ameliorate
experimental autoimmune encephalomyelitis through mechanisms
similar to those described here for the 4-mer (31, 32). Similarities
are also found in the mechanisms of action of anti-CD3 Abs, which
afford long-term remission from T1D in nonobese diabetic mice by
first inducing the depletion or inactivation of T cells and then
promoting active tolerance involving TGF-␤-producing regulatory
CD4 T cells (33). However, in contrast to GA and anti-CD3 mAbs,
the multimers specifically target the deleterious autoreactive T cells.
In addition, the sequence of T cell epitope multimers can, in
principle, be adapted for the treatment of various autoimmune
diseases by representing crucial target autoantigens (9, 10).
A major concern regarding immunotherapy using the systemic
administration of self-antigens is safety. Indeed, hypersensitivity or
anaphylactic reactions can develop in mouse and man (34–37).
Moreover, tolerance induction may be preceded by a transient T
cell activation phase, which would pose a risk of exacerbating the
autoimmune disease (2, 38, 39). Defining the correct dose is also
essential to ensure efficacy and avoid side effects. Several additional
steps are therefore needed before implementing a multimerized
self-peptide therapy in humans (40). These include the early
detection of a potentially harmful immune response in vivo in
5 ␮M 5,6-carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE;
Molecular Probes, Eugene, OR). Thirty million CFSE-labeled cells
were adoptively transferred into RIP-HA mice injected with PBS
or 2.5 ␮g of either 4-mer or HA107–119 peptide 1 or 15 days earlier.
The percentage of activated (CD69⫹) CD4⫹ CFSE⫹ cells was
determined by FACS 24 h after the transfer.
Adoptive Transfer of Diabetes, Prevention of Diabetes by Injection of
the Peptides, and in Vivo Neutralization of IL-4, IL-10, and TGF-␤. T1D
was induced in RAG2⫺/⫺ or immunocompetent RIP-HA adult
mice by i.v. injection of the indicated number of 6.5-TCR TH1 cells.
In some experiments, mice received a second i.v. injection of 5 ⫻
106 6.5-TCR TH1 cells or 25 ⫻ 106 HNT-TCR TH1 cells. In
cotransfer experiments, RIP-HA mice were first injected i.v. with
5 ⫻ 107 total splenocytes from either control RIP-HA mice or
RIP-HA mice injected 15 days earlier with 5 ⫻ 106 6.5-TCR TH1
cells and the 4-mer. The next day, recipient mice received 5 ⫻ 106
diabetogenic 6.5-TCR TH1.
Mice were treated with two identical i.v. injections of the 4-mer
or the HA107–119 peptide in 200 ␮l PBS 3 h and 3 days after TH1
cell transfer. Control animals were injected i.v. with PBS. In some
experiments, mice also received i.p. control rat IgG (Sigma–
Aldrich, St. Louis, MO) or neutralizing mAbs against IL-10 (clone
JES5–2A5, 0.5 mg at days 0 and 3), IL-4 (clone 11B11, 0.5 mg at days
0 and 3), and TGF-␤ (clone 2G7, 0.5 mg at days ⫺2, 0, 2, 4, 6, and
8). This mAb dose has been previously shown to neutralize cytokine
effects in vivo (46, 47).
Glycosuria was assessed by using test strips (Glukotest; RocheDiagnostic, Mannheim, Germany). Mice were considered diabetic
if glycosuria was above 1 g/liter on two consecutive tests. Cumulative diabetes frequencies were compared by using the log-rank test.
1. Vanderlugt CL, Miller SD (2002) Nat Rev Immunol 2:85–95.
2. Liblau R, Tisch R, Bercovici N, McDevitt HO (1997) Immunol Today
18:599–604.
3. Harrison LC, Hafler DA (2000) Curr Opin Immunol 12:704–711.
4. McDevitt H (2004) Proc Natl Acad Sci USA 101(Suppl 2):14627–14630.
5. Feldmann M, Steinman L (2005) Nature 435:612–619.
6. Stern LJ, Wiley DC (1994) Structure (London) 2:245–251.
7. Rotzschke O, Falk K, Strominger JL (1997) Proc Natl Acad Sci USA 94:14642–
14647.
8. Falk K, Rotzschke O, Strominger JL (2000) Eur J Immunol 30:3012–3020.
9. Falk K, Rotzschke O, Santambrogio L, Dorf ME, Brosnan C, Strominger JL
(2000) J Exp Med 191:717–730.
10. Stienekemeier M, Falk K, Rotzschke O, Weishaupt A, Schneider C, Toyka KV,
Gold R, Strominger JL (2001) Proc Natl Acad Sci USA 98:13872–13877.
11. Kirberg J, Baron A, Jakob S, Rolink A, Karjalainen K, von Boehmer H (1994)
J Exp Med 180:25–34.
12. Lo D, Freedman J, Hesse S, Palmiter RD, Brinster RL, Sherman LA (1992)
Eur J Immunol 22:1013–1022.
13. Hori S, Nomura T, Sakaguchi S (2003) Science 299:1057–1061.
14. Fontenot JD, Gavin MA, Rudensky AY (2003) Nat Immunol 4:330–336.
15. Pop SM, Wong CP, Culton DA, Clarke SH, Tisch R (2005) J Exp Med
201:1333–1346.
16. Chen Z, Herman AE, Matos M, Mathis D, Benoist C (2005) J Exp Med
202:1387–1397.
17. Green EA, Choi Y, Flavell RA (2002) Immunity 16:183–191.
18. Battaglia M, Stabilini A, Draghici E, Migliavacca B, Gregori S, Bonifacio E,
Roncarolo MG (2006) Diabetes 55:1571–1580.
19. Homann D, Holz A, Bot A, Coon B, Wolfe T, Petersen J, Dyrberg TP, Grusby
MJ, von Herrath MG (1999) Immunity 11:463–472.
20. Maloy KJ, Powrie F (2001) Nat Immunol 2:816–822.
21. Green EA, Gorelik L, McGregor CM, Tran EH, Flavell RA (2003) Proc Natl
Acad Sci USA 100:10878–10883.
22. Alpan O, Bachelder E, Isil E, Arnheiter H, Matzinger P (2004) Nat Immunol
5:615–622.
23. Apostolou I, von Boehmer H (2004) J Exp Med 199:1401–1408.
24. Casares S, Zong CS, Radu DL, Miller A, Bona CA, Brumeanu TD (1999) J Exp
Med 190:543–553.
25. Casares S, Hurtado A, McEvoy RC, Sarukhan A, von Boehmer H, Brumeanu
TD (2002) Nat Immunol 3:383–391.
26. Masteller EL, Warner MR, Ferlin W, Judkowski V, Wilson D, Glaichenhaus
N, Bluestone JA (2003) J Immunol 171:5587–5595.
9398 兩 www.pnas.org兾cgi兾doi兾10.1073兾pnas.0610423104
Histology. Pancreata were fixed in formol solution and processed for
paraffin embedding. Sections (5-␮m thick) were stained with H&E,
and the degree of insulitis was evaluated microscopically. For
detection of nuclear Foxp3, sections were first treated with S2368
buffer (pH ⫽ 9) (DakoCytomation, Glostrup, Denmark) for
epitope retrieval and then incubated with purified anti-mouse
Foxp3 mAb (clone FJK-16s; e-Bioscience, San Diego, CA). After
washes, a secondary biotinylated rabbit anti-rat Ig was added, and
a peroxidase-based ABC detection system (DakoCytomation) using DAB as the chromogenic substrat was used. Slides were
counterstained with hematoxylin. Photographs were taken for each
infiltrated islet, and the number of Foxp3⫺ and Foxp3⫹ in each islet
was counted by an investigator unaware of the treatment received
by the animals.
For double staining, pancreata were snap-frozen, cryosections
(5-␮m thick) were acetone-fixed, and endogenous peroxydase
activity and biotin groups were blocked. Staining was first
performed by using anti-mouse Foxp3 mAb as described above.
The CD4 staining (L3T4; BD Biosciences) was then performed
and revealed by using Vector Blue (Vector Laboratories, Burlingame, CA).
For additional information, see SI Methods.
We thank F. Capilla for assistance with immunohistochemistry, A.
Estival for multiplex cytokine analyses, and Drs. A. Saoudi and D.
Gonzalez-Dunia for helpful comments on the manuscript. This work was
supported by grants from the Juvenile Diabetes Research Foundation
International, the French Institute for Medical Research, the Fondation
pour la Recherche Médicale, the Midi-Pyrénées Region (to R.S.L.), and
Deutsche Forschungsgemeinschaft Grant SFB650 (to O.R. and K.F.).
27. Sela M, Mozes E (2004) Proc Natl Acad Sci USA 101(Suppl 2):14586–14592.
28. Duda PW, Schmied MC, Cook SL, Krieger JI, Hafler DA (2000) J Clin Invest
105:967–976.
29. Neuhaus O, Farina C, Wekerle H, Hohlfeld R (2001) Neurology 56:702–708.
30. Vieira PL, Heystek HC, Wormmeester J, Wierenga EA, Kapsenberg ML
(2003) J Immunol 170:4483–4488.
31. Stern JN, Illes Z, Reddy J, Keskin DB, Sheu E, Fridkis-Hareli M, Nishimura
H, Brosnan CF, Santambrogio L, Kuchroo VK, Strominger JL (2004) Proc Natl
Acad Sci USA 101:11743–11748.
32. Illes Z, Stern JN, Reddy J, Waldner H, Mycko MP, Brosnan CF, Ellmerich S,
Altmann DM, Santambrogio L, Strominger JL, Kuchroo VK (2004) Proc Natl
Acad Sci USA 101:11749–11754.
33. Belghith M, Bluestone JA, Barriot S, Megret J, Bach JF, Chatenoud L (2003)
Nat Med 9:1202–1208.
34. Kappos L, Comi G, Panitch H, Oger J, Antel J, Conlon P, Steinman L (2000)
Nat Med 6:1176–1182.
35. Pedotti R, Mitchell D, Wedemeyer J, Karpuj M, Chabas D, Hattab EM, Tsai
M, Galli SJ, Steinman L (2001) Nat Immunol 2:216–222.
36. Liu E, Moriyama H, Abiru N, Miao D, Yu L, Taylor RM, Finkelman FD,
Eisenbarth GS (2002) J Clin Invest 110:1021–1027.
37. Smith CE, Eagar TN, Strominger JL, Miller SD (2005) Proc Natl Acad Sci USA
102:9595–9600.
38. Lanoue A, Bona C, von Boehmer H, Sarukhan A (1997) J Exp Med 185:405–
414.
39. Bielekova B, Goodwin B, Richert N, Cortese I, Kondo T, Afshar G, Gran B,
Eaton J, Antel J, Frank JA, et al. (2000) Nat Med 6:1167–1175.
40. von Herrath MG, Nepom GT (2005) J Exp Med 202:1159–1162.
41. Arif S, Tree TI, Astill TP, Tremble JM, Bishop AJ, Dayan CM, Roep BO,
Peakman M (2004) J Clin Invest 113:451–463.
42. Mallone R, Nepom GT (2004) Clin Immunol 110:232–242.
43. Kent SC, Chen Y, Bregoli L, Clemmings SM, Kenyon NS, Ricordi C, Hering
BJ, Hafler DA (2005) Nature 435:224–228.
44. Scott B, Liblau R, Degermann S, Marconi LA, Ogata L, Caton AJ, McDevitt
HO, Lo D (1994) Immunity 1:73–83.
45. Bercovici N, Heurtier A, Vizler C, Pardigon N, Cambouris C, Desreumaux P,
Liblau R (2000) J Immunol 165:202–210.
46. Cautain B, Damoiseaux J, Bernard I, van Straaten H, van Breda Vriesman P,
Boneu B, Druet P, Saoudi A (2001) Eur J Immunol 31:1132–1140.
47. Chiba A, Oki S, Miyamoto K, Hashimoto H, Yamamura T, Miyake S (2004)
Arthritis Rheum 50:305–313.
Piaggio et al.