platelia™ aspergillus eia 96 tests 62796 - Bio-Rad

PLATELIA™ ASPERGILLUS EIA
96 TESTS
62796
PLATELIA™ ASPERGILLUS EIA EST UNE TECHNIQUE IMMUNOENZYMATIQUE DE TYPE SANDWICH SUR MICROPLAQUE POUR LA
DÉTECTION DE L’ANTIGÈNE GALACTOMANNANE D’ASPERGILLUS
DANS LE SÉRUM
1- BUT
Platelia™ Aspergillus EIA est une technique immuno-enzymatique de type sandwich sur microplaque
pour la détection de l’antigène galactomannane d’Aspergillus dans le sérum.
2- INDICATIONS D’UTILISATION
Platelia™ Aspergillus EIA est un test qui, utilisé en association avec d’autres techniques de
diagnostic telles qu’une culture microbiologique, un examen histologique de biopsie et un
examen radiographique peut être utilisé comme une aide pour le diagnostic de l’Aspergillose
Invasive.
3- INTERET CLINIQUE
Les infections aspergillaires surviennent le plus souvent à la suite d’inhalation de spores d’Aspergillus
présentes dans l’environnement. Les formes invasives, qui ont augmenté durant les 10 dernières
années, représentent les infections les plus graves. Elles surviennent principalement chez les patients
neutropéniques (après un traitement anti-cancéreux), chez les patients immunodéprimés
(transplantations et greffes d’organes, en particulier greffe de moelle osseuse) et chez les patients
sous corticothérapie 7.
L’isolement d’Aspergillus par hémoculture reste rare et le diagnostic est souvent basé sur des
critères non spécifiques (symptômes cliniques ou radiologiques, CT-scan, radiographie du
thorax, etc.).
La recherche de l’antigène galactomannane soluble dans le sérum apparaît aujourd’hui comme la
principale méthode sérologique capable d’améliorer le diagnostic de l’Aspergillose Invasive 6, 9, 14, 34, 39.
4- PRINCIPE DE LA PROCEDURE
27
Platelia™ Aspergillus EIA est une technique immuno-enzymatique de type sandwich, en une étape,
sur microplaque permettant la détection de l’antigène galactomannane dans le sérum humain. Les
anticorps monoclonaux de rat EBA-2, dirigés contre le galactomannane d’Aspergillus, caractérisés
dans des études antérieures 16, 25, 28 sont utilisés, (1) pour sensibiliser les puits de la microplaque et se
lier à l’antigène, et (2) pour détecter l’antigène fixé à la microplaque sensibilisée (Conjugué : anticorps
monoclonaux marqués à la peroxydase). Les sérums sont traités à la chaleur en présence d’EDTA
pour dissocier les complexes immuns et précipiter les protéines sériques pouvant éventuellement
interférer avec la réaction immuno-enzymatique 15. Les sérums traités et le conjugué sont ajoutés
dans les puits sensibilisés avec les anticorps monoclonaux, et incubés. Un complexe anticorps
monoclonal – galactomannane – anticorps monoclonal / peroxydase se forme en présence de
l’antigène galactomannane.
Les barrettes sont lavées pour retirer tout matériau non fixé. Ensuite, la solution de révélation est
ajoutée, qui réagira avec tous les complexes fixés au puits pour former une réaction de couleur
bleue. La réaction enzymatique est arrêtée par l’addition d’acide, qui provoque le virage de la couleur
bleue au jaune. La densité optique (absorbance) des échantillons et des contrôles est déterminée par
un spectrophotomètre réglé à 450 / 620 nm.
5- REACTIFS
Platelia™ Aspergillus EIA : code produit n° 62796 (96 tests).
Conserver le kit à 2–8°C. Laisser tous les réactifs atteindre la température ambiante (18–25°C)
avant utilisation. Remettre tous les réactifs, sauf les contrôles, à 2–8°C immédiatement après
l’utilisation. Après reconstitution, les sérum négatif, sérum seuil et sérum positif non utilisés
doivent être congelés à –20°C. Remettre les barrettes non utilisées dans le sachet sous vide et
refermer avec soin. Ne pas retirer le dessicant. Après ouverture du sachet sous vide, les
barrettes conservées dans leur sachet d’origine, refermé avec soin, sont stables pendant
5 semaines. Après dilution, la solution de lavage se conserve à une température de 2–8°C
durant 14 jours. Après ouverture, tous les autres réactifs sont stables jusqu’à la date
d’expiration indiquée sur l’étiquette. Les réactifs sont fournis en quantité suffisante pour réaliser
96 tests en un maximum de 9 séries.
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Composant
Microwell
Strip
Plate
R1
R2
Concentrated
Washing
Solution
R3
Negative
Control
Serum
R4
Contenu
Microplaque :
- 96 puits (12 barrettes de 8 puits chacune)
sensibilisées avec les anticorps monoclonaux antigalactomannane
Quantité
1 microplaque /
12 x 8 puits
1 x 100 mL
Solution de lavage concentrée (10X) :
- tampon Tris NaCl
-1% Tween® 20
- 0,01% de thimerosal
Sérum de contrôle négatif :
- sérum humain lyophilisé ne contenant pas de
galactomannane
- testé négatif en anticorps anti-VIH-1, anti-VIH-2, antiHCV et en antigène HBs
3 x qs* 1 mL
Cut-off
Control
Serum
Sérum seuil :
- sérum humain lyophilisé contenant du
galactomannane
- testé négatif en anticorps anti-VIH-1, anti-VIH-2,
anti- HCV et en antigène HBs
3 x qs* 1mL
R5
Positive
Control
Serum
Sérum de contrôle positif :
- sérum humain lyophilisé contenant du
galactomannane
- testé négatif en anticorps anti-VIH-1, anti-VIH-2,
anti- HCV et en antigène HBs
3 x qs* 1 mL
R6
Conjugate
Conjugué (prêt à l’emploi) :
- anticorps monoclonal anti-galactomannane marqué
à la peroxydase
- Conservateur : 0,01% de thimerosal
R7
Serum
Treatment
Solution
Solution de traitement des sérums (prête à
l’emploi) :
- solution acide d’EDTA
1 x 10,5 mL
R8
TMB
Substrate
Buffer
Tampon substrat de la peroxydase (prêt à
l’emploi) :
- solution d’acide citrique et d’acétate de sodium
- 0,009% de peroxyde d’hydrogène
- 4% de diméthylsulfoxide (DMSO)
1 x 60 mL
R9
Chromogen:
TMB
Solution
Solution TMB chromogène (concentrée) :
- solution de diméthylsulfoxyde (DMSO) à 90%
1 x 1 mL
R10
1 x 8 mL
♦
contenant 0,6% de tétraméthylbenzidine (TMB)
Stopping
Solution
Solution d’arrêt (prête à l’emploi) :
- acide sulfurique 1,5 N (H2SO4)
1 x 12 mL
Plate sealers
- Films adhésifs pour microplaques
1 x 8 films
♦
Note: le TMB (tétraméthylbenzidine) est un chromogène pour la peroxydase non cancérigène
et non mutagène.
*Note: qs : quantité suffisante
23
6- CONSIGNES D’HYGIENE ET DE SECURITE
1. Pour diagnostic in vitro ,seulement.
2. Pour usage professionnel,uniquement.
3. L’utilisation de ce test avec des échantillons autres que du sérum humain n’est pas recommandée.
4. Les contrôle positif, sérum seuil et contrôle négatif sont préparés à partir de sérum humain
qui a été testé négatif en anticorps anti-VIH-1, anti-VIH-2, anti-VHC ainsi qu’en antigène HBs
avec des tests marqués CE. Cependant, tous les réactifs doivent être manipulés comme s’ils
étaient potentiellement infectieux. Tous les tests doivent être réalisés conformément à la
norme OSHA relative aux agents pathogènes transmis par voie hématogène, niveau 2 de
biosécurité ou conformément à d’autres pratiques de biosécurité adaptées.
5. Porter des vêtements protecteurs, comprenant une blouse de laboratoire, une protection des
yeux et du visage et des gants jetables (des gants en matière synthétique sans latex sont
recommandés) et manipuler les réactifs du kit ainsi que les échantillons de patients selon les
Bonnes Pratiques de Laboratoire (BPL) requises. Se laver soigneusement les mains après la
réalisation du test.
6. Ne pas pipeter à la bouche.
7. Ne pas fumer, boire ou manger dans les zones de manipulation des échantillons ou des
réactifs du kit.
8. Eviter les éclaboussures d’échantillons ou de solutions.
9. Les surfaces souillées par un liquide contaminant ne contenant pas d’acide doivent être
soigneusement nettoyées avec un désinfectant efficace. Les désinfectants pouvant être
utilisés sont (mais ne sont pas limités à) une solution d’eau de Javel diluée à 10% (solution à
0,5% d’hypochlorite de sodium),d’éthanol à 70% ou de Wescodyne Plus™ à 0,5%. Le
matériel utilisé pour le nettoyage devra être jeté dans un container spécial pour déchets
contaminés.
ATTENTION : Ne jamais placer de solutions contenant de l’eau de Javel dans l’autoclave.
10. Si le liquide contaminant est un acide, les surfaces souillées doivent être essuyées ou
neutralisées avec du bicarbonate de sodium et la zone doit être rincée et séchée ; dans le
cas où le liquide contaminant contiendrait de la matière biologiquement dangereuse, laver la
zone avec un désinfectant chimique..
11. Eliminer l’ensemble des échantillons et des réactifs utilisés pour le test comme s’ils étaient
potentiellement infectieux. L’élimination des déchets chimiques et biologiques dangereux
doit s’effectuer conformément aux exigences en vigueur.
12. ATTENTION: Voici, ci-après, une liste des risques chimiques potentiels, présentés par
certains composants du kit (se reporter au chapitre 5 - REACTIFS) :
La solution d’arrêt contenant de l’acide sulfurique 1,5 N (H 2SO 4 7.2%) est
corrosive :elle peut occasionner des brûlures au niveau des yeux et sur la
peau ; elle peut être dangereuse en cas d’ingestion ou si elle vient en contact
avec la peau ; elle peut occasionner des lésions oculaires graves, y compris un
C-Corrosif
trouble permanent de la vision ou une cécité.
Tenir éloigné des bases fortes et des agents réducteurs forts.
R34-41 : occasionne des brûlures. Risque de lésions oculaires graves.
S24/25-26-30-36/37/39-60 : éviter tout contact avec la peau et les yeux. En cas de contact
avec les yeux, rincer immédiatement et abondamment avec de l’eau et consulter un
médecin. Ne jamais verser d’eau dans ce produit. Porter des vêtements de protection
adaptés, des gants et une protection des yeux et du visage. Ce réactif et son contenant
doivent être éliminés comme des déchets dangereux.
Les résidus de ce réactif sont considérés comme des déchets acides dangereux :
cependant, si la réglementation en vigueur l’autorise, ils peuvent être neutralisés à pH 6-9
avant d’être éliminés comme des déchets non dangereux à condition que les utilisateurs
soient formés et équipés pour exécuter cette procédure.
24
Le thimérosal à 0,01 % (merthiolate de sodium), un conservateur biocide organomercuriel
ciblant le système nerveux central (SNC), est un agent toxique pour la reproduction et un
agent sensibilisant important ; une exposition prolongée ou répétée à ce produit peut
déclencher une réaction allergique chez certains individus sensibles ; il existe de nombreux
cas de sensibilisation due à une exposition à des solutions contenant du thimérosal dilué.
Eviter de rejeter le réactif dans l’environnement en raison d’un danger d’effets cumulatifs. Les
solutions usagées contenant du mercure à une concentration supérieure à 0,2 ppm doivent
être éliminées comme des déchets dangereux au sens de la loi fédérale américaine RCRA
(D009) ; cependant, éliminer tous les déchets conformément aux réglementations en vigueur.
(Remarque : le mercure (Hg) constitue jusqu’à 49,55 % de la molécule de thimérosal : ainsi,
un composant renfermant 0,01 % de thimérosal contient environ 0,005 % (environ 50 ppm)
de mercure (p/v).
En cas de contact avec la peau, rincer immédiatement et abondamment avec de l’eau.
Attention : l’Etat de Californie a reconnu que le thimérosal était un agent toxique pour la
reproduction.
13. La fiche de données de sécurité (FDS) est disponible sur demande.
7- PRECAUTIONS D’UTILISATION
1. LES ÉCHANTILLONS DE SÉRUM CONGELÉS STOCKÉS DANS DES CONDITIONS
INCONNUES PEUVENT DONNER DES RÉSULTATS FAUX POSITIFS DU FAIT DE LA
CONTAMINATION PAR UN CHAMPIGNON ET/OU UNE BACTÉRIE.
2. Ne pas utiliser le kit ou l’un des réactifs du kit après la date d’expiration.
3. A l’exception de la solution de lavage concentrée (R2) et de la solution d’arrêt (R10), ne pas
mélanger les réactifs d’autres kits portant des numéros de lot différents.
4. Laisser tous les réactifs à température ambiante durant au moins 15 minutes avant
utilisation.
5. Reconstituer soigneusement les réactifs, en évitant toute contamination.
6. Ne pas effectuer le test en présence de vapeurs réactives (acides, alcalines, aldéhydes) ou
de poussières, qui pourraient altérer l’activité enzymatique du conjugué.
7. Utiliser des récipients en polypropylène, propres, à usage unique, pour préparer la solution
de révélation (tampon substrat + chromogène). Si de la verrerie doit être utilisée, elle doit
préalablement être lavée à l’acide chlorhydrique 1N, rincée à l’eau distillée, et séchée.
8. Lors du pipetage manuel des contrôles et des échantillons, utiliser un nouveau cône de
distribution pour chaque sérum afin d’éviter toute contamination.
9. Pour assurer un lavage adéquat des puits, se conformer au nombre de cycles de lavage
recommandés et s’assurer que tous les puits sont complètement remplis puis complètement
vidés. Le lavage ne doit pas être réalisé manuellement avec un flacon déformable.
10. Ne pas laisser la microplaque sécher entre la fin du cycle de lavage et l’addition des réactifs.
11. Ne pas utiliser le même récipient pour le conjugué et la solution de révélation.
12. Empêcher que le conjugué ou la solution de révélation n’entrent en contact avec du métal ou des
ions métalliques.
13. Eviter l’exposition de la solution de chromogène ou de la solution de révélation à une lumière forte
durant le stockage ou l’incubation. Ne pas laisser les solutions contenant le chromogène entrer en
contact avec un agent oxydant.
14. Eviter que la solution d’arrêt n’entre en contact avec un quelconque agent oxydant, du métal ou
des ions métalliques.
15. Utiliser du matériel (tubes, cônes, containers, etc.) propre, sans poussière, pour minimiser la
possibilité de contamination par les spores d’Aspergillus de l’environnement. Le galactomannane
étant thermostable, la stérilisation du matériel utilisé ne garantit pas l’absence d’antigène
contaminant. L’idéal reste l’utilisation de matériel apyrogène, mais avec un minimum de
précautions, l’utilisation de matériel standard est possible.
25
16. Limiter l’exposition des solutions (sérums, solution de traitement, conjugué) ou de récipients
ouverts (microplaques, tubes, pipettes) à l’air.
17. Ne pas reverser dans le flacon d’origine le surplus de conjugué non distribué.
18. La solution de révélation (tampon substrat + chromogène) doit être incolore. L’apparition d’une
coloration bleue dans les minutes suivant la reconstitution indique que le réactif est contaminé et
ne doit pas être utilisé. Le jeter et préparer un nouveau réactif.
8- PREPARATION ET CONSERVATION DES REACTIFS
Microplaque (R1)
Après ouverture du sachet sous vide, les barrettes conservées à +2-8°C dans leur sachet d’origine,
refermé avec soin, sont stables pendant 5 semaines. Vérifier la présence de dessicant.
Solution de lavage (R2)
Préparer la solution de lavage en diluant 10 fois la solution de lavage concentrée dans de l’eau
distillée stérile. Après dilution, la solution de lavage peut être conservée pendant 14 jours à +2–8°C.
Préparer une quantité suffisante de solution de lavage (prévoir 80 mL pour une barrette : 8 mL de R2
+ 72 mL d’eau distillée).
Après ouverture, la solution de lavage concentrée conservée à +2–25°C, en l’absence de
contamination, est stable jusqu’à la date d’expiration indiquée sur l’étiquette.
Sérum de contrôle négatif (R3)
Reconstituer le contenu d’un flacon de contrôle avec 1000 µL (1 mL) d’eau stérile extrapure
(de préférence de l’eau apyrogène). Les sérums doivent être réhydratés juste avant de réaliser le test.
Mélanger soigneusement après avoir attendu 2–3 minutes la réhydratation du sérum. Aliquoter
300 µL dans chacun des 3 tubes de microcentrifugation en polypropylène. Congeler immédiatement
à –20°C tout tube de centrifugation en polypropylène restant qui ne sera pas utilisé après la
réhydratation.
Note : les sérums de contrôle qui ont été préalablement réhydratés et immédiatement congelés à
–20°C peuvent être décongelés et utilisés sans autre réhydratation. Les contrôle réhydratés congelés
peuvent être stockés à –20°C jusqu’à cinq semaines. Manipuler les contrôles de la même façon que
les échantillons de patients (300 µL de sérum + 100 µL de solution de traitement des sérums, etc…).
Sérum seuil (R4) et sérum de contrôle positif (R5)
Préparer comme décrit ci-dessus pour le sérum de contrôle négatif.
Solution de révélation (R8 + R9)
Préparer la solution de révélation en diluant 51 fois la solution de chromogène concentrée R9
dans le tampon substrat R8. Préparer 2 mL de solution de révélation par barrette : 40 µL de R9
+ 2 mL de R8. La solution est stable durant 6 heures lorsqu’elle est stockée à l’obscurité à
température ambiante (+18–25°C).
Après ouverture, les réactifs R8 et R9 stockés à +2–8°C, en l’absence de contamination, sont
stables jusqu’à la date d’expiration indiquée sur l’étiquette.
Conjugué (R6), solution de traitement des sérums (R7) et solution d’arrêt (R10)
Après ouverture, les réactifs R6, R7 et R10 stockés à +2–8°C, en absence de contamination,
sont stables jusqu’à la date d’expiration indiquée sur l’étiquette.
9- ECHANTILLONS
Collecter des échantillons de sang selon les procédures standards de laboratoire. Le test est réalisé
sur du sérum. Les échantillons de sérum ne doivent pas être contaminés avec des spores fongiques
et/ou des bactéries. Transporter et stocker les échantillons dans des tubes scellés, non exposés à
l’air. Les échantillons non ouverts peuvent être stockés à 2–8°C jusqu’à 5 jours avant de les tester.
Après l’ouverture initiale, les échantillons peuvent être stockés à 2–8°C si le test est effectué dans les
48 heures. Pour un stockage plus long, congeler le sérum à –70°C.
Les sérums peuvent subir 4 cycles de congélation / décongélation. Les échantillons préalablement
congelés devront être soigneusement homogénéisés après décongélation avant réalisation du test.
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Les résultats ne sont pas affectés par les échantillons contenant 20 mg/mL de bilirubine, les
échantillons lipémiques contenant l’équivalent de 2 g/L de trioléine (triglycéride) ou les échantillons
hémolysés contenant 165 mg/L d’hémoglobine. Les interférences liées à une surcharge en albumine
n’ont pas été testées.
Ne pas décomplémenter les sérums.
10- PROCEDURE
Matériel fourni
Voir la section RÉACTIFS
Matériel nécessaire mais non fourni
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
Eau distillée ou déminéralisée stérile, pour la dilution de la solution de lavage concentrée.
Eau purifiée stérile pour la reconstitution des sérums de contrôle et du sérum seuil.
Papier absorbant.
Gants à usage unique.
Lunettes de protection.
Hypochlorite de sodium (eau de javel) et bicarbonate de sodium.
Pipettes ou multipipettes, réglables ou fixes, pouvant mesurer et distribuer 50 µL, 100 µL,
300 µL et 1000 µL.
8. Tubes de microcentrifugation en polypropylène de 1,5 mL avec des bouchons étanches,
capables de supporter une chaleur de 120°C (bloc chauffant) ou de 100°C (bain-marie
bouillant).
a. Tubes à vis : tubes coniques de 1,5 mL, Bio-Rad réf. 224-0100 ou équivalent.
b. Tubes avec capuchon attenant : EZ Micro Test Tubes, 1,5 mL, Bio-Rad réf. 223-9480 ou
équivalent.
9. Cavaliers de verrouillage (VWR réf. 6054001 ou équivalent). Ces cavaliers ferment
hermétiquement les tubes avec capuchon attenant et empêchent toute ouverture
accidentelle durant les changements de température et de pression. Une petite poignée
permet d’enlever le microtube du bloc chauffant ou du bain-marie, évitant ainsi tout risque de
brûlure.
10. Centrifugeuse de paillasse de laboratoire, pour tubes en polypropylène 1,5 mL capable
d’atteindre 10000 g.
11. Portoir flottant pour tubes de microcentrifugation.
12. Agitateur type « vortex ».
13. Bloc chauffant. Les modèles de bloc chauffant suivants sont recommandés :
a. modèle avec 1 bloc : Grant réf. QBD1 (VWR réf. 460-0074)
b. modèle avec 2 blocs : Grant réf. QBD2 (VWR réf. 460-0076)
14. Bloc pour bloc chauffant : les deux blocs chauffants doivent être utilisés avec le bloc Grant
réf. QB-E1 (VWR réf. 460-8517)
15. Bain-marie bouillant pouvant être thermostaté à 100°C
16. Incubateur de microplaque pouvant être thermostaté à 37 ± 1°C.
17. Laveur de microplaque semi-automatique ou automatique.
18. Lecteur de microplaque équipé de filtres à 450 et 620 nm.
Commentaires sur la procédure
Les contrôles négatif et positif ainsi que le sérum seuil doivent être testés lors de chaque série
pour valider les résultats du test.
Traitement des sérums
Tous les sérums de contrôle : négatif (R3), seuil (R4) et positif (R5) doivent être traités en même
temps que les échantillons de patients :
1. Distribuer 300 µL de chaque sérum à tester et de chaque sérum de contrôle dans un tube en
polypropylène de 1,5 mL.
2. Ajouter 100 µL de la solution de traitement des sérums (R7) dans chaque tube.
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3. Homogénéiser vigoureusement en vortexant. Fermer hermétiquement le tube afin de prévenir son
ouverture lors du chauffage, pour les tubes avec capuchon attenant : utiliser un cavalier de
verrouillage. Ne pas percer le bouchon.
4. Option bloc chauffant :
Placer les tubes pendant 6 minutes dans un bloc chauffant à 120°C. Les tubes doivent être placés
dans le bloc seulement lorsque la température de consigne de l’appareil est atteinte. (*)
OU
Option bain-marie :
En cas d’utilisation d’un bain-marie : chauffer les tubes pendant 3 minutes à 100°C (*).
5. Retirer soigneusement les tubes chauds du bloc chauffant ou du bain-marie et les placer dans une
centrifugeuse. Centrifuger les tubes à 10000 g pendant 10 minutes.
6. Le surnageant est utilisé pour la détection de l’antigène galactomannane.
7. Tester les surnageants en utilisant la procédure suivante. Après traitement, le surnageant peut être
conservé à +2–8°C pendant 48 heures avant de réaliser le test. Si l’analyse des résultats indique
qu’il faut retester le sérum, un autre aliquot de ce même sérum doit être traité puis testé.
(*) Le strict respect des consignes de durée et de température ainsi que l’utilisation de matériel
recommandé sont des facteurs essentiels à la réussite du test. Il conviendra donc de ne pas se fier à
la température affichée par l’appareil mais de vérifier que la température est conforme aux
spécifications en utilisant une sonde thermique qui sera introduite dans un tube contenant de l’huile
minérale : 120°C doivent être atteints à l’intérieur du tube dans le bloc chauffant et 100°C à l’intérieur
du tube dans le bain-marie bouillant.
Procédure EIA
Se conformer strictement au protocole proposé.
Se conformer aux bonnes pratiques de laboratoire.
1. Laisser les réactifs atteindre la température ambiante (18–25°C) pendant au moins 15 minutes
avant utilisation.
2. Préparer la solution de lavage, la solution de révélation, les sérums de contrôle négatif et positif et
le sérum seuil.
3. Etablir le plan d’identification des sérums de contrôle et des échantillons. Utiliser un puits pour le
sérum de contrôle négatif (R3), deux puits pour le sérum seuil (R4), et un puits pour le sérum de
contrôle positif (R5).
4. Sortir le cadre et les barrettes (R1) de l’emballage protecteur. Remettre les barrettes non utilisées
dans l’emballage et refermer ce dernier.
5. Mélanger par retournement le contenu du flacon de conjugué (R6) avant utilisation. Ajouter 50 µL
de conjugué (R6) dans chaque puits. Ensuite, ajouter 50 µL de surnageant de sérum traité dans
chaque puits. Ne pas ajouter les surnageants des sérums traités avant le conjugué.
6. Couvrir la microplaque d’un film adhésif en appuyant bien sur toute la surface pour assurer
l’étanchéité.
7. Incuber la microplaque dans un incubateur sec de microplaques pendant 90 ± 5 minutes à 37°C
(± 1°C).
8. Retirer le film adhésif. Aspirer le contenu de chaque puits dans un container pour déchets
contaminés (contenant de l’hypochlorite de sodium). Laver la microplaque 5 fois, en utilisant un
minimum de 370 µL de solution de lavage diluée. Après le dernier lavage, retourner la microplaque
et tapoter doucement sur le papier absorbant pour retirer le liquide restant.
9. Ajouter rapidement 200 µL de solution de révélation (R8 + R9) dans chaque puits, à l’abri de la
lumière vive.
10. Incuber la microplaque à l’obscurité à température ambiante (18 à 25°C) pendant 30 ± 5 minutes.
Ne pas utiliser de film adhésif durant cette étape d’incubation.
11. Ajouter 100 µL de solution d’arrêt (R10) dans chaque puits, en utilisant le même ordre que pour
l’addition de la solution de révélation. Bien mélanger.
28
12. Essuyer soigneusement le dessous de chaque plaque.
13. Lire la densité optique de chaque puits à 450 nm (filtre de référence à 620 nm) dans les 30 minutes
suivant l’addition de la solution d’arrêt.
11- CONTROLE DE QUALITE (CRITERES DE VALIDITE)
Sérum seuil : la D.O. de chaque sérum seuil doit être
≥ 0,300 et ≤ 0,800.
Contrôle positif : l’index du sérum de contrôle positif doit être supérieur à 2,00.
DO contrôle positif (R5)
I=
> 2,00
Valeur seuil
Contrôle négatif : l’index du sérum de contrôle négatif doit être inférieur à 0,40.
I=
DO contrôle négatif (R3)
< 0,40
Valeur seuil
Si l’un des contrôles ne satisfait pas l’un des critères de validité décrits ci-dessus, le test est
invalidé, et les résultats des échantillons de patients ne doivent pas être pris en compte.
L’opérateur peut décider de répéter le test, après avoir passé en revue la procédure, ou peut
contacter le fabricant pour une assistance. Si un sérum doit être retesté, un nouvel aliquot de
ce même sérum doit être utilisé.
Exemple de calcul :
Echantillon
DO du contrôle négatif (R3)
Absorbance (DO)
0,117
DO du sérum seuil (R4)
0,596
0,576
DO du contrôle positif (R5)
2,602
Calculs
Valeur seuil
La valeur seuil correspond à la moyenne des DO des puits contenant le sérum seuil R4 :
(0,596 + 0,576) ÷ 2 = 0,586
Index du contrôle négatif
Pour calculer l’index du contrôle négatif, diviser la DO du contrôle négatif par la valeur seuil :
I=
0,117
= 0,20
0,586
Index du contrôle positif
Pour calculer l’index du contrôle positif, diviser la DO du contrôle positif par la valeur seuil :
I=
2,602
= 4,44
0,586
Validation de l’essai
Dans l’exemple ci-dessus :
• Chaque DO du sérum seuil est ≥ 0,300 et ≤ 0,800 indiquant que le sérum seuil est valide.
• L’index du contrôle négatif est < 0,40 indiquant que le contrôle négatif est valide.
• L’index du contrôle positif est > 2,00 indiquant que le contrôle positif est valide.
Dans cet exemple le test est validé car les résultats satisfont les critères de validité de chaque
contrôle.
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12- INTERPRETATION DES RESULTATS
La présence ou l’absence de l’antigène galactomannane dans les échantillons testés est
déterminée par le calcul d’un index pour chaque échantillon de patient. L’index (I) est la DO de
l’échantillon divisée par la valeur seuil.
Calcul de la valeur seuil :
Ajouter les densités optiques des deux puits contenant le sérum seuil (R4) et diviser le total par 2.
Calcul d’un index (I) pour chaque sérum testé :
Calculer le rapport suivant pour chaque sérum testé :
I=
DO de l’échantillon
Valeur seuil
Les sérums avec un index < 0,50 sont considérés comme négatifs pour la présence de
l’antigène galactomannane.
Note : un résultat négatif peut indiquer que le résultat du patient est en-dessous du seuil de
détection du test.
Note : un résultat négatif n’exclut pas un diagnostic d’Aspergillose Invasive. Si une Aspergillose
Invasive est suspectée mais que le résultat est négatif, il conviendra de répéter le test sur un
autre prélèvement.
Les sérums avec un index ≥ 0,50 sont considérés comme positifs pour la présence de
l’antigène galactomannane.
Pour tous les patients positifs, il est recommandé de tester un nouvel aliquot du même échantillon
ainsi que de prélever un nouvel échantillon pour assurer le suivi du patient.
Remarque : une valeur de DO inférieure à 0,000 peut indiquer une erreur de procédure ou une erreur
liée aux instruments... Ce résultat est invalide et l’échantillon doit être re-testé.
Un dépistage régulier (deux fois par semaine) des patients à haut risque est recommandé pour
accroître la sensibilité et la précocité de positivité du test.
Remarque : Le test Platelia™ Aspergillus EIA est destiné à être utilisé comme une aide au diagnostic
d’ aspergillose invasive. Les résultats positifs obtenus avec le test Platelia™ Aspergillus EIA doivent
être confrontés à d’autres procédures diagnostiques telles qu’ une culture microbiologique, un
examen histologique de biopsie et un examen radiographique.
Exemple de calcul :
Echantillon
DO du contrôle négatif (R3)
Absorbance (DO)
0,117
0,596
0,576
2,602
0,134
0,436
1,196
DO du sérum seuil (R4)
DO du contrôle positif (R5)
Echantillon de patient # 1
Echantillon de patient # 2
Echantillon de patient # 3
Calculs
Se rapporter au paragraphe Contrôle de Qualité (critères de validité) pour un exemple de calculs
pour déterminer la validité des contrôles du test.
Valeur seuil
La valeur seuil correspond à la moyenne des DO des puits contenant le sérum seuil R4 :
(0,596 + 0,576) ÷ 2 = 0,586
30
Echantillon de patient #1
Pour calculer l’index de l’échantillon de patient #1, diviser la DO de l’échantillon de patient #1
par la valeur seuil :
0,134
= 0,23
0,586
Dans cet exemple, l’échantillon de patient #1 est négatif, car l’index de 0,23 est < 0,50.
I=
Echantillon de patient #2
Pour calculer l’index de l’échantillon de patient #2, diviser la DO de l’échantillon de patient #2
par la valeur seuil :
0,436
= 0,74
0,586
Dans cet exemple, l’échantillon de patient #2 est positif, car l’index de 0,74 est ≥ 0,50.
I=
Echantillon de patient #3
Pour calculer l’index de l’échantillon de patient #3, diviser la DO de l’échantillon de patient #3
par la valeur seuil :
1,196
= 2,04
0,586
Dans cet exemple, l’échantillon de patient #3 est positif, car l’index de 2,04 est ≥ 0,50.
I=
13- LIMITES D’UTILISATION
1. Un test négatif ne peut exclure le diagnostic d’Aspergillose Invasive. Les patients à risque
d’Aspergillose Invasive doivent être testés deux fois par semaine.
2. La procédure et l’interprétation des résultats décrites pour le test Platelia™ Aspergillus EIA doivent
être suivies quand les échantillons sont testés pour la présence de l’antigène galactomannane. On
conseille à l’utilisateur du kit de lire soigneusement la notice avant d’effectuer le test. Le protocole
doit être particulièrement bien suivi lors du pipetage des échantillons et des réactifs, le lavage de
la microplaque, et la durée des étapes d’incubation.
3. Un résultat faux négatif peut être obtenu si les échantillons et les réactifs ne sont pas ajoutés
comme indiqué dans la notice. Un nouvel échantillon du même patient devra être testé en cas
de suspicion clinique d’Aspergillose Invasive ou en cas d’erreur de procédure.
4. La contamination des puits contenant des échantillons de patients négatifs par les puits contenant
les contrôles positifs ou les échantillons de patients est possible si le contenu d’un puits déborde
dans un autre puits du fait d’une manipulation maladroite de la microplaque ou d’une mauvaise
technique de pipetage lors de l’addition des réactifs.
5. Les performances de Platelia™ Aspergillus EIA n’ont pas été évaluées avec des échantillons de
sérum provenant de nouveau-nés ou de patients pédiatriques.
6. Platelia™ Aspergillus EIA peut présenter un manque de sensibilité dans la détection du
galactomannane chez les patients atteints de maladie granulomateuse chronique (CGD) et du
syndrome de Job 36, 37.
7. L’usage simultané d’une thérapie anti-fongique chez certains patients atteints d’Aspergillose
Invasive peut résulter en une sensibilité réduite lors de l’utilisation du kit Platelia™ Aspergillus
EIA 20.
8. Platelia™ Aspergillus EIA n’a pas été évalué pour une utilisation avec du plasma ou d’autres types
d’échantillons tels que l’urine, le LBA ou le LCR.
9. Les performances de Platelia™ Aspergillus EIA n’ont pas été établies pour une lecture manuelle
et/ou une détermination visuelle des résultats.
10. D’autres genres de champignons tels que Penicillium, Alternaria, Paecilomyces, Geotrichum et
Histoplasma ont montré une réactivité avec les anticorps monoclonaux EBA-2 de rat utilisés dans
le test, pour la détection du galactommanane aspergillaire. L’histoplasmose doit être prise en
compte dans les zones endémiques, y compris dans les régions des Etats-Unis 23, 32, 38.
31
11. Réactions positives en l’absence de signes cliniques :
Etant donné la précocité de détection de l’antigène galactomannane dans le sérum avant même
l’apparition de signes cliniques et/ou radiologiques, des réactions positives en l’absence de signes
cliniques sont régulièrement observées : elles correspondent à des résultats de tests «vrais
positifs» chez des patients pour lesquels un diagnostic d’Aspergillose Invasive Prouvée ou
Probable est ultérieurement établi.
Cependant, dans certains cas particuliers, certains facteurs doivent être pris en compte lors de
l’interprétation du test :
a. des réactions positives sans développement de signes cliniques ont été rapportées, en
particulier chez les jeunes enfants 26. Bien que certains de ces cas puissent être associés à une
véritable circulation d’antigènes aspergillaires 5, la plupart des cas peuvent être considérés
comme des faux positifs.
b. Le galactofuranose a été mis en évidence dans différents aliments, en particulier les céréales,
leurs dérivés et les crèmes dessert 1, 17. Contrairement aux laits d’origine humaine, les laits
maternisés contiennent fréquemment de fortes concentrations de galactomannane 10. Il
convient donc, chez les jeunes enfants, et plus généralement chez tous les patients dont la
barrière intestinale peut être altérée, d’intégrer le facteur alimentaire dans l’interprétation de
l’évolution de l’antigénémie 4, 10. Toute antigénémie positive non accompagnée de signes
cliniques doit être interprétée avec encore plus de précautions dans cette population de
patients 17.
c. Il a été rapporté des résultats de tests positifs pour la présence de galactomannane chez des
patients recevant de la pipéracilline / tazobactam. Certains lots de pipéracilline / tazobactam
ont été testés positifs pour la présence de l’antigène galactomannane.
Ainsi, les résultats de test positifs chez les patients recevant de la pipéracilline / tazobactam
doivent être interprétés avec prudence et confirmés par d’autres techniques de diagnostic. La
présence de galactomannane a également été rapportée dans certains lots de préparations
parentérales d’amoxicilline associée à l’acide clavulanique. Ainsi, les traitements par des ßlactamines semi-synthétiques doivent être pris en compte lors de l’interprétation du test 1, 21.
Néanmoins, Platelia™ Aspergillus EIA pouvant détecter l’antigène galactomannane bien avant
l’apparition des signes cliniques ou radiologiques, une Aspergillose Invasive ne peut être
exclue. Ainsi, les patients avec une antigénémie positive, traités avec de la pipéracilline /
tazobactam doivent être suivis avec attention.
d. Des réactions positives en l’absence de signes cliniques peuvent être potentiellement
observées chez des patients recevant par voie parentérale ou par voie orale(en présence d’une
altération de la barrière intestinale) des produits contenant du galactomannane.
La présence de galactomannane dans ces produits est souvent expliquée par l’utilisation d’un
procédé de fermentation à partir de microorganismes fongiques.
Un résultat positif ne sera toutefois observé chez le patient que si la concentration sérique du
galactomannane exogène atteint ou dépasse le seuil de détection du test.
Ainsi, en présence d’un résultat positif suspect en l’absence d’autres signes évocateurs, nous
recommandons d’enquêter sur les produits que reçoit le patient et en particulier sur leur
procédé de fabrication et sur l’origine des matières premières utilisées 11, 24 31.
14- VALEURS ATTENDUES
La prévalence de l’Aspergillose Invasive varie selon la population de patients; des taux de 5 à 20 %
ont été rapportés 7, 13. Afin de déterminer les performances de Platelia™ Aspergillus EIA, une étude
clinique a été conduite dans deux centres européens sur un total de 4873 sérums à partir de
239 épisodes de 203 patients diagnostiqués avec et sans Aspergillose Invasive, atteints
d’hémopathies malignes ou ayant subi une allogreffe de cellules souches hématopoïétiques.
Etant donné qu’un patient a pu être inclus dans l’étude plus d’une fois, l’analyse a été réalisée par
épisodes de traitement.
32
Un épisode est considéré comme la période de temps encadrant un événement clinique (par
exemple, une transplantation, une greffe, etc.). En conséquence, plus d’un épisode peut être observé
pour un seul patient.
Le taux de prévalence moyen pour cette étude est de 16% (38/239). La distribution des valeurs
d’index pour ces populations est représentée dans les graphiques suivants.
Patients diagnostiqués sans Aspergillose Invasive (population témoin)
Distribution des valeurs d’index obtenus sur
les sérums de la population témoin N=3691
Nombre de sérums
Un total de 3691 sérums
obtenus à partir de 201
épisodes (168 patients)
dans deux centres
européens ont été testés
avec Platelia™ Aspergillus
EIA. La distribution des
valeurs d’index figure dans
le graphique suivant.
3500
3240
3000
2500
2000
1500
1000
330
500
54
32
13
4
4
3
0
1
0
0
3
1
6
0
0
Index
Ce diagramme représente
les valeurs d’index
obtenues pour les 3691
sérums de 201 épisodes
(168 patients témoins) de
cette étude (patients
subissant une thérapie
immunosuppressive en
vue d’une greffe de
cellules souches hématopoïétiques, ou dans le
cadre d’hémopathies
malignes).
POPULATION TÉMOIN :
DISTRIBUTION DES INDEX / ÉPISODES
(N = 201 épisodes de 168 patients)
2
1,5
1
0,5
0
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
Episode
Patients diagnostiqués avec une Aspergillose Invasive
Ce diagramme décrit les résultats du dosage de galactomannane pour les 1182 sérums de
38 épisodes (35 patients) de cette étude, diagnostiqués avec une Aspergillose Invasive Prouvée ou
Probable selon les critères de définition EORTC / NIAID.
On ne s’attend pas à ce que
chaque sérum de chaque
patient soit positif. La
prévalence de l’Aspergillose
Invasive varie selon la
population de patients ; des
taux de 5 à 20 % ont été
rapportés 7, 13. Le taux de
prévalence pour cette étude
était de 16%.
ASPERGILLOSE INVASIVE PROUVÉE / PROBABLE :
DISTRIBUTION DES INDEX / ÉPISODES
(N = 38 épisodes de 35 patients)
10,0
9,0
8,0
7,0
6,0
5,0
4,0
3,0
2,0
1,0
0,0
Cut-off
0,5
0
5
10
15
20
25
30
35
40
Episode
33
Les graphiques suivants représentent respectivement les exemples d’un patient sans signes
cliniques ou symptômes d’Aspergillose Invasive (négatif pour Aspergillus) et d’un patient atteint
d’Aspergillose Invasive Prouvée (positif pour Aspergillus).
Patient négatif :
PATIENT TÉMOIN
1,6
1,4
Index
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
0
10
20
30
40
50
60
Jours
Patient positif :
PATIENT ATTEINT D’ASPERGILLOSE INVASIVE PROUVEE
Index
1,6
1,4
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
0
10
20
30
40
50
60
Jours
15. PERFORMANCES
A. Etudes de reproductibilité
Les variations inter- et intra-essai de Platelia™ Aspergillus EIA ont été déterminées dans une étude
utilisant un panel de 6 sérums complémentés de patients (un négatif, un faible positif, deux positifs,
et deux fortement positifs) obtenus dans trois sites d’études cliniques en Amérique du Nord. Chacun
de ces 6 membres du panel a été testé en triple (x 3) sur trois jours différents, sur un lot, dans deux
sites (nombre total de répliquats pour chaque site = 9). Chacun des 6 membres du panel a été testé
en double (x 2) sur trois jours différents, sur un lot, dans un troisième site (nombre total de répliquats
pour le troisième site = 6). Un opérateur a réalisé l’ensemble des tests de précision sur chaque site.
Les données ont été analysées selon les normes NCCLS - National Committee for Clinical
Laboratory Standards (Commission Nationale pour les Normes de Laboratoire Cliniques). La densité
optique moyenne (DO), la valeur d’index moyenne, l’écart-type (SD), le pourcentage du coefficient de
variation (% CV), pour la précision de la manipulation (intra-essai) et pour la précision entre les sites
(inter-essai) pour chaque membre du panel dans chaque site sont illustrés dans les tableaux
suivants.
34
35
0,00
N/A
0,04
N/A
0,002
N/A
0,036
N/A
0,01
N/A
0,03
N/A
0,006
N/A
0,006
N/A
Index
6
0,10
0,01
N/A
0,03
N/A
DO
6
0,049
0,003
N/A
0,012
N/A
Nég.
Index
9
0,10
DO
9
0,040
Nég.
Index
9
0,09
Nég.
DO
9
0,052
0,03
10,4%
0,08
4,4%
27,0%
0,19
13,0%
0,09
Index
9
0,70
0,14
11,6%
19,8%
0,18
7,6%
0,07
Index
9
0,89
11,1%
0,15
12,2%
0,17
Index
6
1,36
0,08
18,7%
0,28
7,1%
0,11
Index
9
1,49
12,5%
0,104
8,2%
0,068
DO
6
0,830
14,3%
0,25
8,2%
0,14
Index
6
1,73
Pos. #2
9,5%
0,057
7,5%
0,045
DO
9
0,602
Pos. #2
15,7%
0,25
5,1%
0,09
14,3%
0,29
4,4%
26,5%
0,53
4,8%
0,10
Index
9
2,01
7,1%
0,082
8,1%
0,094
DO
6
1,158
6,2%
0,15
8,2%
0,20
Index
6
2,41
Fort pos. #1
5,3%
0,042
5,7%
0,046
DO
9
0,801
Fort pos. #1
4,7%
0,058
4,2%
0,051
Index
9
2,06
Fort pos. #1
DO
9
1,227
NCCLS EP5-A, Vol. 19, No. 2, Page 25, Equation (C3) et Equation (C4)
10,5%
0,068
12,5%
0,082
DO
6
0,652
Pos. #1
22,7%
0,083
6,4%
0,023
DO
9
0,364
4,7%
0,044
4,7%
0,044
Index
9
1,563
Pos. #2
DO
9
0,931
NCCLS EP5-A, Vol. 19, No. 2, Page 24, Equation (C2)
15,8%
0,13
2,4%
0,02
Index
6
0,81
0,09
7,6%
Pos. #1
10,0%
0,07
8,4%
0,059
Index
9
1,17
Pos. #1
DO
9
0,702
2
20,0%
0,078
2,4%
0,009
DO
6
0,388
Faible pos.
20,8%
0,058
14,5%
0,041
DO
9
0,280
Faible pos.
11,5%
0,051
4,8%
0,022
Index
9
0,74
Faible pos.
DO
9
0,445
1
N/A = non applicable
N
Moyenne
SD intra1
essai
%CV
SD inter2
essai
%CV
Site 3
Membre
du panel
N
Moyenne
SD intraessai 1
%CV
SD interessai 2
%CV
Site 2
Membre
du panel
N
Moyenne
SD intra1
essai
%CV
SD interessai 2
%CV
Site 1
Membre
du panel
0,17
11,9%
0,58
3,6%
29,2%
1,00
3,2%
0,11
Index
9
3,43
4,7%
0,111
5,3%
0,126
DO
6
2,378
6,8%
0,34
5,1%
0,25
Index
6
4,96
Fort pos. #2
5,8%
0,079
3,5%
0,047
DO
9
1,361
Fort pos. #2
5,9%
0,169
3,1%
0,089
Index
9
4,83
Fort pos. #2
DO
9
2,887
N/A
N/A
N/A
N/A
Index
3
0,08
N/A
N/A
N/A
N/A
Index
3
0,18
N/A
N/A
N/A
N/A
DO
3
0,059
N/A
N/A
N/A
N/A
Index
3
0,12
Contrôle nég.
N/A
N/A
N/A
N/A
DO
3
0,074
Contrôle nég.
N/A
N/A
N/A
N/A
DO
3
0,046
Contrôle nég.
0,02
0,03
2,8%
0,03
3,4%
0,9%
0,01
1,1%
0,01
Index
6
1,00
5,8%
0,028
5,8%
0,028
DO
6
0,480
4,1%
0,04
5,8%
0,06
Index
6
1,00
Sérum seuil
22,7%
0,094
1,1%
0,00
DO
6
0,415
Sérum seuil
16,9%
0,102
3,7%
Index
6
1,00
Sérum seuil
DO
6
0,606
3,3%
0,12
N/A
N/A
Index
3
3,67
18,2%
0,54
N/A
N/A
Index
3
2,97
3,4%
0,056
N/A
N/A
DO
3
1,652
6,6%
0,23
N/A
N/A
Index
3
3,45
Contrôle pos.
5,7%
0,068
N/A
N/A
DO
3
1,197
Contrôle pos.
14,3%
0,317
N/A
N/A
DO
3
2,216
Contrôle pos.
B. Réactions croisées
Une étude a été menée avec un lot de Platelia™ Aspergillus EIA afin d’évaluer l’effet de pathologies
non associées à l’Aspergillose Invasive, qui pourraient potentiellement interférer avec le test. Les
sérums suivants ont été testés pour évaluer les réactions croisées avec Platelia™ Aspergillus EIA. Un
total de 151 sérums ont été testés.
Nombre d’échantillons
testés
Nombre de
positifs
Facteur rhumatoïde
10
0
ANA positif
10
0
Hypergammaglobulinémie d’IgG
10
0
Hypergammaglobulinémie d’IgM
10
0
Cancer*
11
0
Cirrhose non virale (primaire biliaire ; induite par
l’alcool ; induite par un médicament)
10
0
Transfusions multiples
10
0
Femelles multipares
10
0
VHA
10
0
VHC
10
0
Rubéole
10
0
CMV
10
0
Syphilis (RPR+)
10
0
Toxoplasmose
10
0
Mycoplasme
10
0
Pathologie
* Cancer de la vessie, du colon, de l’endomètre, du poumon, de la prostate, du rein (1), du sein (2),
squameux (3).
C. Etudes cliniques
Des études cliniques ont été effectuées dans deux sites situés en Belgique et aux Pays-Bas afin
d’évaluer la sensibilité, la spécificité et la valeur prédictive de Platelia™ Aspergillus EIA. L’étude a été
menée rétrospectivement en utilisant un total de 4873 sérums collectés sur 203 patients des
populations suivantes* :
• patients sans signes d’Aspergillose Invasive (patients témoins)
• patients avec une Aspergillose Invasive Probable
• patients avec une Aspergillose Invasive Prouvée
* Le Groupe de Coopération sur l’Infection Fongique Invasive (IFICG) de l’Organisme Européen pour
la Recherche et le Traitement du Cancer (EORTC) et le Groupe d’Etudes sur les Mycoses (MSG) de
L’Institut National des Allergies et des Maladies Infectieuses (NIAID) ont défini des critères pour le
diagnostic de l’Aspergillose Invasive (AI) chez les patients atteints d’hémopathies malignes ou ayant
bénéficié d’une greffe de cellules souches hématopoïétiques 2.
L’Aspergillose Invasive Prouvée est définie par une culture positive d’un échantillon prélevé de
manière aseptique à partir d’un site normalement stérile et suspect d’infection et la mise en évidence
à l’examen histo-cytologique des formes morphologiques correspondantes chez un hôte présentant
des symptômes évocateurs d’une telle infection fongique.
L’Aspergillose Invasive Probable est définie par au moins un critère microbiologique ET un critère
clinique majeur (ou 2 critères mineurs) dans un site suspect d’infection chez un hôte présentant des
symptômes évocateurs d’une telle infection fongique.
36
L’Aspergillose Invasive Possible est définie par au moins un critère microbiologique OU un critère
clinique majeur (ou 2 critères mineurs) dans un site suspect d’infection chez un hôte présentant des
symptômes évocateurs d’une telle infection fongique.
Etant donné la rareté relative des Aspergilloses Invasives Probables et Prouvées, nous proposons,
dans le cadre de cette étude, les définitions de sensibilité et de spécificité cliniques suivantes.
SENSIBILITE
Les résultats de cette étude ont été analysés en termes de sensibilité patient. Les études de
sensibilité ont été réalisées en utilisant Platelia™ Aspergillus EIA dans deux sites sur un total de 38
épisodes de 35 patients leucémiques ou ayant bénéficié d’une greffe de moelle osseuse et
diagnostiqués avec une Aspergillose Invasive Prouvée ou Probable.
1. Aspergillose Prouvée ( selon les critères IFICG / EORTC ; voir ci-dessus)
Sites combinés
N = 19 épisodes de 16 patients
Sensibilité : 100% (19/19).
Note : L’intervalle de confiance de 95 % n’a pas pu être calculé du fait d’une taille d’échantillon
insuffisante.
2. Aspergillose Probable (selon les critères IFICG / EORTC ; voir ci-dessus)
Sites combinés
N = 19 épisodes de 19 patients
Sensibilité : 94,7 % (18/19)
Note : L’intervalle de confiance de 95 % n’a pas pu être calculé du fait d’une taille d’échantillon
insuffisante.
3. Aspergilloses Prouvée et Probable combinées (selon les critères IFICG / EORTC ; voir
ci-dessus)
Sites combinés
N = 38 épisodes de 35 patients
Sensibilité : 97,4 % (37/38). L’intervalle de confiance de 95% est de 86,2 – 99,9 %.
SPECIFICITE
Des études de spécificité ont été effectuées en utilisant Platelia™ Aspergillus EIA dans deux sites sur
un total de 3691 échantillons de 201 épisodes provenant de 168 patients sans signes d’Aspergillose
Invasive (patients témoins).
Site 1 :
N = 3060 échantillons de 103 épisodes (70 patients)
Spécificité : 92,2 % (95/103). L’intervalle de confiance de 95 % est de 85,3 – 96,6 %.
Site 2
N = 631 échantillons de 98 épisodes (98 patients)
Spécificité : 88,8 % (87/98). L’intervalle de confiance de 95 % est de 80,8 – 94,3 %.
Sites combinés N = 3691 échantillons de 201 épisodes (168 patients)
Spécificité : 90,5 % (182/201). L’intervalle de confiance de 95 % est de 85,6 – 94,2 %.
37
VALEUR PREDICITVE
Les valeurs prédictives positive et négative (VPP, VPN) ont été analysées pour la population de
patients de cette étude, en se basant sur la moyenne réelle du taux de prévalence de 16% observée
dans cette étude.
VPP : 66,1% (37/56)
VPN : 99,4% (182/183)
L’analyse a également été réalisée en considérant un résultat comme positif lorsque
2 échantillons consécutifs avaient un index supérieur ou égal à 0,5.
Les performances sont résumées dans le tableau suivant :
Sensibilité*
Spécificité
VPP
VPN
Sites combinés en considérant
1 échantillon ≥ 0,5
97,4%
(37/38)
90,5%
(182/201)
66,1%
(37/56)
99,4%
(182/183)
Sites combinés en considérant
2 échantillons consécutifs ≥ 0,5
92,1%
(35/38)
97,5%
(196/201)
87,5%
(35/40)
98,5%
(196/199)
*: la sensibilité a été calculée sur les Aspergilloses Invasives Prouvées et Probables.
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Tous les produits fabriqués et commercialisés par la société Bio-Rad sont placés sous un
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17- REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES
Voir la version Anglaise.
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