22 Diagnostic Cytogenetique par Caryotype classique a la CGH

UE Génétique médicale Typeur : HUNAULT Marine
Cours n° 22 – Dr Benkhalifa - 12.03.2014 Correcteur : JAAFAR Ali
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DIAGNOSTIC CYTOGENETIQUE DU CARYOTYPE
CLASSIQUE A LA CGH ARRAY
I. Généralités
- La cytogénétique est l’étude des phénomènes génétiques au niveau de la cellule, c’est-à-dire au
niveau des chromosomes sans la nécessité d’extraire l’ADN : anomalies chromosomiques (de
nombre et de structure), recombinaison de chromosomes ...
- Les techniques utilisées sont principalement :
o la réalisation du caryotype
o les méthodes de FISH (fluorescent in situ hybridation : hybridation in situ par des sondes
fluorescentes)
o l’utilisation de puces à ADN (chaque puce est spécifique, difficile de conclure à un
résultat).
- La culture cellulaire la plus fréquente dans les laboratoires de cytogénétique est celle des
lymphocytes périphériques.
o On Bloque les chromosomes en métaphase grâce à la colchicine puis on analyse les gènes.
- Homme 46XX : phénotype masculin mais a perdu les gènes responsables de la spermatogenèse.
Après les premières observations de chromosomes en 1880 par Flemming, la génétique est
longtemps restée une science marginale, c’est pourquoi ce n’est qu’en 1956 que le nombre de
chromosomes de l’espèce humaine a été correctement établi à 46 par Tjio et Levan.
- La cytogénétique permet d’évaluer la constitution chromosomique d’un individu, soit la
composition en chromosomes des cellules d‘un individu.
Par exemple, un homme normal est 46, XY, c’est-à-dire qu’il a :
o 46 chromosomes par cellules (23 paires) = 44 autosomes + 2 gonosomes.
o Dont 2 gonosomes (X et Y) : ce sont les deux chromosomes sexuels.
- Exemple d’anomalie du caryotype : remaniement chromosomique au niveau du chromosome 15,
un élément est greffé dessus = translocation Robertsonienne.
o Peut-on parler de trisomie 15 ? Non car cette anomalie est non viable, on utilisera donc
d’autres méthodes d’analyse.
- Depuis : association rapide entre syndrome et anomalie chromosomique spécifique.
- En 1959, a été décrite par Jérôme Lejeune et ses collaborateurs la première anomalie
chromosomique liée à une pathologie : la trisomie 21 (3 chromosomes 21 au lieu de 2). On décrit
aussi à ce moment le syndrome de Klinefelter (hommes) et de Turner (femme).

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- En 1960, a été établie à Denver la première nomenclature internationale pour la classification des
chromosomes, basée sur leur taille et la position de leur centromère.
- Ils ont alors établi un caryotype dit normal.
- Caryotype à haute résolution : 800 bandes.
o Permet d’améliorer la qualité des chromosomes que l’on va étudier grâce à des
intercalants ou des bases modifiées.
o On repère alors des micro-remaniements chromosomiques = syndromes micro-
délétionnels (ex : syndrome du cri du chat …).
o Utilisée surtout en pédiatrie (maladies mono-géniques détectées à la naissance).
- Les causes des syndromes malformatifs chromosomiques les plus fréquents ont été découvertes
très rapidement ensuite : syndrome de Turner, trisomies 13, 18 et 21…
- En 1960, a été identifiée aussi, par Nowell et Hungerford, la première anomalie chromosomique
dans une affection maligne, donc acquise, le chromosome de Philadelphie, initialement décrit
comme un 22 délété, dont Rowley a démontré par la suite qu’il était le résultat d’une
translocation t (9 ; 22) et qui entraine une leucémie myéloïde chronique.
II. Technique cytogénétique et chromosomique
Depuis 1970 : amélioration des techniques : niveau de résolution pour une meilleure analyse des
remaniements chromosomiques.
- Le but est d’avoir un maximum de cellules bloquées au stade métaphasique.
- Permet par exemple de classer des tumeurs en différents grades (le fait de savoir qu’une tumeur
est grade 1 ou grade 4 orientera le traitement).
- Mais tout dépend du type de cellules étudiées : lymphocytes, cellules musculaires …
Généralement on essaye d’utiliser 2 types de cellules différentes car les milieux de culture
peuvent parfois altérer les cellules.
 Après culture cellulaire, les cellules à étudier subissent un choc hypotonique (dans une solution
saline), qui provoque une entrée d’eau dans la cellule. La cellule ainsi gonflée est fragilisée.
 On prélève une goutte de solution qu’on laisse tomber sur une lame. Le choc rompt la membrane
plasmique des cellules, libérant noyau (pour les cellules en interphase) et chromosomes (pour les
cellules en mitose) sur la lame.
 Ces noyaux et chromosomes sont ensuite fixés sur la lame avec du méthanol (déshydrate et
aplatit les noyaux) ou du para-formaldéhyde (qui maintient la forme du noyau).
 Il existe un diagramme pour classer les chromosomes selon leur taille et la position de leur
centromère :
o Centromère = séquences hautement répétées et séquences non codantes qui protègent
l’ADN.
o Les chromosomes ont été classés de 1 à 22 + X et Y.
o 22 paires : ½ vient du père, ½ vient de la mère.
o Un X vient toujours de la mère, puis soit 2e X soit Y selon le père.

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III. Caryotype de base
- Banding chromosomique : possibilité de classer les chromosomes selon la morphologie, la taille,
la position du centromère.
- Ex de remaniement visible du caryotype : 46 chromosomes, individu de sexe masculin, anomalie
sur le chromosome 10 (on utilise plusieurs techniques de marquage et d’hybridations in situ).
- Translocation t (11 ; 14)(q14 ; q32) du myélome : translocation entre chromosomes 11 et 14.
 Ici on parle de translocation réciproque entre 2 chromosomes. C’est une anomalie
chromosomique très connue en onco-hémato.
- Caryotype : remaniements chromosomiques multiples.
o De nombre = aneuploïdie.
o De structure : translocations réciproques et Robertsoniennes équilibrées ou non.
o Microremaniements : inversions, insertions, délétions, duplications.
Ex : un couple consulte pour une grossesse (de déjà 22 semaines), sachant qu’un de leurs enfants est
né avec un syndrome micro-délétionnel.
Au caryotype on observe une translocation entre les chromosomes 4 et 5.
 Proposition d’IVG.
IV. Technique FISH : Fluorescence in situ hybridation
- Découverte en 1969. On utilise des sondes radioactives froides.
o Au lieu du marquage bande R (dénaturation thermique) ou bande G (digestion à la
trypsine) on utilise des sondes.
 Amélioration du diagnostic.
- Quand la biologie a évolué, on a réussi à intégrer une séquence d’ADN du génome humain dans
des vecteurs : on est capable de couper une séquence d’ADN humain de 2 à 3 kbases et de la
mettre dans un plasmide ou un cosmide. On réinjecte alors ce plasmide/cosmide dans des
bactéries (E. Coli). On cultive la bactérie et on marque l’ADN avec une molécule fluorescente. On
fait une hybridation de cette sonde avec un ADN compétiteur.
- La FISH révèle la séquence que l’on a hybridée et donne une information sur la région que l’on
cherche à analyser.
- L’avantage de cette technique, c’est sa rapidité : résultat en 24 heures.
- On utilise cette technique pour un diagnostic bien ciblé (par exemple pour diagnostiquer une
trisomie 21 ou 18 quand on a un doute à partir du phénotype).
- Par exemple pour diagnostiquer une trisomie 21, on marque aussi le chromosome 18 pour en
fait faire un contrôle interne et vérifier que la technique fonctionne.

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- FISH d’un centromère : une sonde reconnait 2 chromosomes X et un fragment supplémentaire
qui vient du X. Soit on arrête là parce que la patiente n’a pas de pathologie connue, soit on fait
des recherches complémentaires. Il faut associer le tableau clinique au tableau génétique et
génomique.
A. Syndrome de Williams
o Syndrome causé par la délétion d’une séquence d’ADN sur le chromosome 7 pour la synthèse de
l’élastine.
o On établit le caryotype en cherchant un remaniement de structure majeur. Puisque le tableau
clinique évoque un syndrome de Williams, on regarde surtout le chromosome 7 : on prend un
marqueur pour le chromosome 7 et on utilise une sonde qui s’hybride sur la séquence qui couvre
le gène de l’élastine. On voit alors que sur le 2eme chromosome 7 le gène est délété, on confirme
donc le diagnostic. On teste en parallèle la sonde sur un caryotype normal (test de référence).
B. Micro-délétion di George
o Risque de malformation cardiaque.
o Syndrome causé par une micro-délétion d’une séquence d’ADN sur le bras long du
chromosome 22.
o La FISH permet de voir s’il y a eu des échanges de fragments entre chromosomes (translocation
chromosomique).
V. CGH ou profils génomiques de gains et de pertes
- Si il y a un remaniement entre plusieurs chromosomes, grâce à la CGH on fait une hybridation
génomique comparative, on obtient un caryotype en multi-couleurs.
- Hybridation génomique comparative ou CGH : on hybride l’ADN d’un malade avec un ADN témoin
(patient normal). La comparaison permet d’identifier s’il y a une perte ou un gain d’ADN.
- Principe : co-hybridation sur métaphases normales.
1- ADN modifié (tumoral) marqué par un fluorochrome vert.
2- ADN normal marqué par un autre fluorochrome rouge.
- Par analyse d’image, calcul du ratio d’hybridation de chacun des 2 ADN le long de chaque
chromosome.
- Si le remaniement touche plus de 3 chromosomes  mauvais pronostic.
- CGH :
o Recherche de gain ou de perte de segment de chromosome.
o Technique essentiellement utilisée en onco-hémato :
 Gain ou perte d’oncogènes.
 Gain ou perte de gènes suppresseurs de tumeurs.

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- Hybridation génomique comparative : on prend un ADN de référence et un ADN test et on les
mélange sur une plaque métaphasique. Quand il y a un gain d’ADN, c’est l’ADN test qui sort en
excès, quand il y a une délétion c’est l’ADN référence qui sort en excès.
VI. Nanotechnologie
- On imprime le génome sur une lame.
- La nanotechnologie ouvre un nouveau domaine en pathologie clinique et en pharmacologie.
- La nanotechnologie (NT) = technologie miniature, elle a été développée au début des
années 90.
- NT : on prend des séquences d’ADN de génome humain et on les place alignées sur les
chromosomes. Par exemple, le gène de l’élastine, on sait qu’il est sur le chromosome 7, on
prend un fragment d’ADN qui connaît cette séquence et on l’utilise comme marqueur. En
fait, on analyse le génome d’une manière inversée. Les techniques d’hybridation in situ
deviennent des techniques de confirmation.
- On a alors imprimé des puces en fonction des diagnostics souhaités (post-natal, prénatal,
onco etc.). Chaque spot est spécifique d’une séquence précise sur le génome = CGH sur une
puce.
- On mélange de l’ADN témoin et de l’ADN malade qu’on hybride sur une puce imprimée : on
fait de l’hybridation génomique comparative sur une puce.
- Cela a changé les méthodes de travail : on est capable de prélever l’ADN ou l’ARN de
n’importe quelle source.
- Puis on peut amplifier (par PCR) si besoin. Puis on marque avec plusieurs fluorochromes, on
fait ensuite une pré-hybridation, une hybridation, un lavage et une décontamination puis
scan des données et analyse des résultats.
o Le rendu obtenu est un caryotype moléculaire (et non une « photo des
chromosomes »).
- Caryotype moléculaire : chaque spot correspond à une séquence du génome humain.
- Pour le syndrome d’insuffisance ovarienne, il peut y avoir perte ou gain d’ADN mais si gain
d’ADN, le gain ne s’exprime pas à cause d’une méthylation.