Technologie Droplet Digital PCR

Technologie Droplet Digital™ PCR (ddPCR™)
La PCR digitale (dPCR) permet une quantification précise, absolue et hautement
sensible des acides nucléiques. La PCR traditionnelle est une analyse de point final
semi-quantitative parce que le produit amplifié est détecté par électrophorèse sur gel
d'agarose. La PCR en temps réel (ou qPCR) utilise la détection à base de
fluorescence pour permettre la mesure du produit amplifié accumulé au fur et à
mesure que la réaction progresse. La qPCR nécessite des contrôles pour une
normalisation soit à une référence, soit à une courbe standard, ne permettant qu'une
quantification relative. En outre, des variations dans l'efficacité d'amplification
peuvent
affecter
les
résultats
de
qPCR.
La PCR digitale repose sur des méthodes traditionnelles d'amplification par PCR et
de détection par fluorescence pour fournir une quantification absolue hautement
sensible des acides nucléiques sans avoir besoin de courbes standards. Dans le
système de PCR Droplet Digital™, un échantillon de PCR est divisé en 20 000
gouttelettes. Après amplification, les gouttelettes contenant la séquence cible sont
détectées par fluorescence et notées positives, et les gouttelettes sans fluorescence
sont notées négatives. L'analyse statistique de Poisson du nombre de gouttelettes
positives et négatives donne une quantification absolue de la séquence cible.
La PCR digitale améliore la sensibilité de qPCR et permet la détection d'événements
rares tels que des mutations de nucléotide unique dans une population de
séquences de type sauvage. En qPCR traditionnelle, le signal provenant de
séquences de type sauvage peut dominer et obscurcir le signal provenant de la
séquence rare. En minimisant les effets de la concurrence entre les cibles, la PCR
digitale surmonte les difficultés inhérentes à l'amplification des séquences rares et
permet une quantification absolue et précise des acides nucléiques.
Une étape critique dans la PCR digitale est le partitionnement par échantillonnage la division de chaque échantillon en sous-unités discrètes (gouttelettes) avant
l'amplification par PCR. L'échantillon est préparé d'une manière similaire à celle de la
PCR en temps réel, mais est ensuite séparé en milliers de partitions, chacune
contenant soit zéro soit une ou quelques molécules. Chaque partition se comporte
comme une réaction de PCR individuelle et, comme avec la PCR en temps réel, des
sondes fluorescentes sont utilisées pour identifier l'ADN cible amplifié. Chaque
partition peut alors être facilement analysée après amplification pour déterminer si
elle contient ou non la séquence cible. Les échantillons contenant un produit amplifié
sont considérés positifs (1, fluorescents), et ceux sans produit, et donc avec peu ou
pas de fluorescence, sont négatifs (0). Le ratio des positifs par rapport aux négatifs
dans chaque échantillon est la base de la quantification. Contrairement à la qPCR, la
PCR digitale ne repose pas sur le nombre de cycles d'amplification pour déterminer
la quantité initiale d'acide nucléique dans chaque échantillon ; elle s'appuie plutôt sur
les statistiques de Poisson pour déterminer la quantité absolue de copies.
L'étape unique de partitionnement par échantillonnage de la ddPCR, associée à
l'analyse des données statistiques de Poisson, permet une plus grande précision que
les méthodes traditionnelles PCR et qPCR. En conséquence, la ddPCR est
particulièrement bien adaptée pour des applications qui nécessitent la détection de
faibles quantités de copies ou une résolution plus fine des quantités cibles parmi des
échantillons ; par exemple, une détection de séquence rare, une analyse de variation
du nombre de copies (CNV), et l’analyse d’expressions faibles et/ou de cibles rares.
Le partitionnement de l'échantillon dans le système ddPCR permet la détection
sensible et spécifique de molécules à gabarit unique et une quantification précise
tout en atténuant les effets de compétition de cibles, rendant l'amplification par PCR
moins sensible à l'inhibition et améliorant considérablement la capacité
discriminatoire des analyses qui ne diffèrent que par un seul nucléotide. La ddPCR
offre des avantages significatifs par rapport aux autres méthodes de PCR:
quantification absolue et sensibilité et plage dynamique très accrues. Grâce à sa
grande sensibilité, à sa précision et à sa quantification absolue, la PCR digitale étend
la portée de l'analyse des acides nucléiques au-delà de la portée d'autres méthodes
dans un certain nombre d'applications comme :
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Biopsie liquide
Variation du nombre de copies (CNV)
Détection de séquences rares
Expression génique et analyse des miARN
Analyse monocellulaire
Détection des pathogènes
Analyse de bibliothèques (NGS)