Effets de la salinité sur la stabilité des biosurfactants produits par

UNIVERSITE KASDI MERBAH-OUARGLA
FACULTE DES SCIENCES DE LA NATURE ET DE LA VIE
DEPARTEMENT DES SCIENCES BIOLOGIQUES
Mimoire
MASTER ACADEMIQUE
Domaine: Sciences de la nature et de la vie
Filière : Biologie
Spécialité : Microbiologie appliquée
Présenté par: GHERBAL Aldjia
Thème
Thème
Effets de la salinité sur la stabilité des biosurfactants
produits par des souches bactériennes telluriques en
présence de pétrole brut.
Soutenu publiquement
Le : 09/06/2014
Devant le jury :
OULD EL HADJ M.
(Professeur)
Président
OULD EL HADJ-KHELIL A. (Professeur)
Encadreur
DJERBAOUI A N.
(MAA)
Co-Encadreur
HESSAINE A
(MA)
Examinateur
Année universitaire: 2013/2014
UKM Ouargla.
UKM Ouargla.
UKM Ouargla.
UKM Ouargla.
Je dédie fruits de ce modeste travail à :
Primo à mes parents : ma belle mère et mon bon père
qui m’ont beaucoup soutenu et en couragè jusqu’à bout et
que dieu leur accorde une longue vie.
Mes sœurs qui ont toujours cru à ma réussite.
Mes neveux (Anas, Nidhal, Montana, Fatah, Ismail, Doha et Djanat).
Tous mes frères ABD ALHAMID, AZDDIN, ABD ALHAFIDE et
leurs familles, aussi ADEL.
Je dédie spécialement à mon neveu TAYEB.
À mes enseignantes OULD EL HADJ KHELIL. A, DJARBAOUI
AMINA NESRINE et BOUDERHEM AMEL.
Mes amies : khadija, Hana, Meriem, Radia, Aziza, Halima, Souria,
Sara, Masouda, Ferdous, Nesrine, Amina, Khaoula, Asma, Samiha,
Batoul, Imane…etc.
N’oublier pas de dédier à ma très chère Amel et sa tous
famille et je souhaite une belle vie.
À la deuxième moitié dans ma vie LAID et sa famille.
Particulière à ma chère HADJER BEN LAMOUDI et sa famille.
Tous mes camarades surtout la promotion 2013/2014 Option Master II
microbiologie Appliquée.
A toute ma famille.
A tout mes amis.
Ainsi qu’à tous ceux qui me sont chers.
Tous qui m’on aider de proche ou de loin.
Aldjia
(Djanat)
Je tiens tout d’abord à remercier ALLAH
de m’avoir donné le courage, la patience et la volonté pour
achever ce modeste travail.
Je remercie très chaleureusement mon encadreur madame
OULD EL HADJ-KHELIL Aminata., Professeur à l’Université
Kasdi Merbah-Ouargla, qui n’a ménagé aucun effort pour que ce mémoire
puisse voir le jour. Je lui exprime ma reconnaissance
de m’avoir fait confiance, et pour l’intérêt qu’elle a porté à ce travail
en acceptant de diriger cette étude.
Mes vifs remerciements et ma profonde reconnaissance s’adressent à
Mon Co-Encadreur Melle DJERBAOUI Amina-nesrine, d’avoir accepter de
m’encadrer au laboratoire. Je la remercie infiniment pour son aide et
ses conseils judicieux durant la réalisation de ce travail.
Je remercie l’ensemble du jury, Monsieur OULD-EL-HADJ Med DIDI
Professeur à l’U.K.M.O. Je lui exprime ma gratitude pour avoir accepter
de présider le jury de ma soutenance, et Mme HESSAINE A.,
Maitre Assistante A à l’U.K.M.O, qui a bien voulu examiner ce travail.
Je remercie également tous les enseignants de mon cursus universitaire
qui ont contribué à ma formation.
A touts le personnel des laboratoires pédagogiques et aux travailleurs
De la faculté SNV pour leur gentillesse et leur disponibilité.
Je remercie enfin toute la promotion (02) de
Master II microbiologie Appliquée
Toutes les personnes qui nous ont apporté leur Soutien
et qui ont contribués de prés ou de loin
à la réalisation de Ce travail.
*Aldjia*
TABLE DES MATIERES
Liste des figures
Liste des photos
Liste des tableaux
Liste des abréviations
Résumé
‫ملخص‬
Abstract
I
II
III
IV
V
VI
VII
Partie I : Etude bibliographique
Introduction
1
I.
Généralité sur les hydrocarbures
3
I. 1.
Définition et caractéristiques
3
I. 2.
Origine des hydrocarbures
3
I. 3.
Classification
4
II.
Généralité sur les biosurfactants
5
II. 1.
Définition
5
II. 2.
Type de biosurfactants
6
II. 3.
Nature chimique et classification des biosurfactants
7
II. 4.
Biosynthèse et rôle physiologique
14
II. 5.
Utilisation des biosurfactants
14
II. 6.
Potentialité des biosurfactants
15
II. 7.
Les différentes applications des biosurfactants
16
III.
Production des biosurfactants
17
III. 1.
Microorganismes producteurs
17
III. 2.
Identification des biosurfactants
19
III. 3.
Propriétés physico-chimiques des biosurfactants
19
III. 4.
Paramètres influençant la production des biosurfactants
22
a)
Influence de la source de carbone.
22
b)
Influence de l'azote
22
c)
Influence du PH
23
d)
Influence des sels minéraux
23
e)
Influence de l’oxygène
23
f)
Influence de la vitesse d’agitation
23
IV.
Généralités sur la salinité
23
IV. 1.
Définition
23
IV. 2.
Définition de la salinisation
24
IV. 3.
Mesure de la salinité
24
IV. 4.
Effet de la salinité
Partie II: matériel et méthodes
24
I.
Situation de la région d’étude : (OUARGLA)
26
II.
Matériel et méthodes
27
II. 1.
Matériel
27
II. 1. 1.
Matériel biologique
27
a)
Origine des souches bactériennes utilisées
27
b)
Milieux et conditions de culture
27
II. 2.
Méthodologie de travail
27
II. 2. 1.
Etude microbiologique
27
II. 2. 1. 1.
Repiquage des souches isolées
27
II. 2. 1. 2.
Conservation des souches bactériennes
27
II. 2. 2.
La production des biosurfactants par les souches sélectionnées
27
II. 2. 2. 1.
Pré-culture
27
II. 2. 2. 2.
Les cultures
28
II. 2. 2. 3.
Suivi de la cinétique de croissance des souches sélectionnées
30
II. 2. 3.
Etude de l’effet de la salinité sur les propriétés tensioactives des
31
biosurfactants produits par les souches bactériennes sélectionnées en
présence de pétrole brut
L’index d’émulsion E24
31
a)
Détermination de l’index d’émulsion et le test de salinité
31
b)
Calcul de l’index d’émulsion E24
31
III.
Partie III : résultats et discussions
Résultats et discussion
32
III. 1.
Résultats
32
III. 1. 1.
Cinétique de croissance des souches bactériennes étudiées (S 70, 75 et
32
II. 2. 3. 1.
81)
III. 1. 1. 1.
Cinétique de croissance de S70
32
III. 1. 1. 2.
Cinétique de croissance de S75
33
III. 1. 1. 3.
Cinétique de croissance de S81
33
III. 1. 2.
Index d’émulsification (E24) et test de la salinité (NaCl)
34
III. 1. 2. 1.
Evaluation du pouvoir émulsifiant des souches sélectionnées en présence
34
du pétrole
III. 1. 2. 1. 1.
Pouvoir émulsifiant de biosurfactant produit par la souche 70
34
III. 1. 2. 1. 2.
Pouvoir émulsifiant de biosurfactant produit par la souche 75
35
III. 1. 2. 1. 3.
Pouvoir émulsifiant de biosurfactant produit par la souche 81
36
III. 2.
Discussion
38
Conclusion
Références bibliographiques
Annexes
41
43
Liste des figures
Figure 01
Figure 02
Figure 03
Figure 04
Figure 05
les plus utilisées pour illustrer les deux parties (hydrophile et
hydrophobe) des molécules amphiphiles des surfactants.
structure de rhamnolipide.
structure de tréhalose-lipides.
de sophorolipide produit par Candida bombicola ATCC.
structure de surfactine.
6
8
9
10
10
Figure 06
Les fonctions des biosurfactants les plus demandées pour usage
industriel.
16
Figure 07
Figure 08
Figure 09
Figure 10
schématique d'une micelle de biosurfactant.
Localisation des sites d’étude.
La production des biosurfactants par les souches sélectionnées.
Cinétique de croissance de la souche bactérienne étudiée S70.
21
26
29
32
Figure 11
Cinétique de croissance de la souche bactérienne étudiée S75.
33
Figure 12
Figure 13
Cinétique de croissance de la souche bactérienne étudiée S81.
Suivie la cinétique de la croissance de trois souche étudiée (S70, S75, et
S81).
33
33
Figure 14
Index d’émulsion E24 de tensioactif produit par S70 en présence de
glucose.
Index d’émulsion E24 de biosurfactant produit par S70 en présence de
pétrole.
Index d’émulsion E24 de biosurfactant de S70 en présence de glucose.
Index d’émulsion E24 de biosurfactant de S70 en présence de glucose.
Index d’émulsion E24 de biosurfactant produit par S81 en présence de
glucose.
34
Figure 19
Index d’émulsion E24 de biosurfactant produit par la S81 en présence de
pétrole.
36
Figure 20
pouvoir émulsifiant de S70, S75 et S81en présence du glucose ou du
pétrole additionnées de 20 g/l de NaCl.
37
Figure 15
Figure 16
Figure 17
Figure 18
I
35
35
35
36
Liste des photos
Photo 01
Pré-culture du trois souches sélectionnées.
28
Photo 02
La production de biosurfactants par les trois souches sélectionnées
28
en présence du pétrole brut.
Photo 03
Spectrophotométrie d’absorption atomique.
30
Photo 04
L’agitation par vortex.
31
Photo 05
Index d’émulsion E24 des souches étudiées en présence du pétrole
34
comme substrat d’émulsification.
Photo 06
Préparation de milieu de culture.
Annexe
II
II
Liste des tableaux
Tableau I
La distribution structurale des phospholipides majeurs.
12
Tableau II
Source microbienne et principaux types de biosurfactants.
13
Tableau III
Composition élémentaire d’un pétrole brut.
17
Tableau IV
Les matériaux et les équipements utilisés dans ce travail.
III
Annexe I
Liste des abréviations
ADSA-P
Axysymmetric Drop Shape Analysis by Profile
C
Carbone
CE
Conductivité électrique
CMC
Concentration Micellaire Critique
DO
Densité Optique
E24
Index d’émulsification
g/l
gramme par litre
GN
Gélose Nutritive
H
Hydrogène
HAP
Hydrocarbures Aromatiques Polycycliques
HCP
Hydrocarbures pétroliers.
HLB
Balance Lipophile-Hydrophile
IR
Infrarouge
l
Litre
MS
Spectrométrie de masse
NaCl
Chlorure de sodium
PH
potentiel d’hydrogène
PPGAS
Proteose Peptone-Glucose-Ammonium Salts.
RMN
Résonance magnétique nucléaire
SI
Sophorolipides
T
Temps
TK
Température de Krafft
TS
Tension superficielle
UV-Vis
Lumière ultra-violette et visible
IV
Effets de la salinité sur la stabilité des biosurfactants produits par des
souches bactériennes telluriques en présence de pétrole brut
Résumé :
L’objectif de notre étude est de rechercher l’effet de la salinité sur la production et la
stabilité
de
biosurfactants
produits
par
des
souches
bactériennes
telluriques
hydrocarbonoclastes en présence de deux substrats carbonés (le glucose ou le pétrole).
Dans la majorité des biosurfactants produits l’index d’émulsion augment en présence
du pétrole et de concentrations croissantes de NaCl allant jusqu’à 20 g/l et à 15 g/l en
présence du glucose. Au-delà de cette concentration cet index diminue considérablement.
Un pouvoir émulsifiant maximal de 46,23% est enregistré pour le biosurfactant
produit par S70 en présence de glucose et de 15 g/ l de sel. Cet index atteint sa valeur
maximale de 15,20% en présence de pétrole et de 20 g/l de NaCl. Le biosurfactant de la
souche bactérienne 75 présente un index d’émulsion de 35,56% en présence de glucose et de
15 g/l de sel et de 31,27% en présence de pétrole et de 20 g/l de sel.
La meilleure souche productrice de biosurfactant est la souche 81 qui a pu produire en
présence de pétrole brut et de 20 g/l de sel un surfactant ayant un index d’émulsion de 43,97
%, alors qu’en présence de glucose et de 15 g/l de NaCl, le E24 maximal enregistré est de
34,44%.
Mots clés: la salinité, propriété émulsifiante, biosurfactants, pétrole brut, bactéries telluriques.
V
‫آثبر الملىحة على استقرار جزيئبت السطح التي تنتجهب السالالت البكتيرية األرضية في وجىد‬
‫النفط الخبم‬
‫الملخص‬
‫انهذف يٍ دساستُب انتذقيق في تأثيش انًهىدخ عهى إَتبج و استقشاس‬
‫‪ biosurfactants‬انتي تُتجهب انسالالد‬
‫انجكتيشيخ األسضيخ ‪ hydrocarbonoclastes‬في ظم وجىد اثُيٍ يٍ سكبئض انكشثىٌ ( انجهىكىص أو انجتشول انخبو )‪.‬‬
‫في انغبنجيخ انعظًى يٍ يُتجبد‬
‫‪ biosurfactants‬يؤشش انًستذهت يضيذ ثذضىس انُفط‬
‫و تشكيض كهىسيذ‬
‫انصىديىو تصم إنى ‪20‬غشاو ‪ /‬نتش و ‪15‬غشاو ‪ /‬نتشفي وجىد انجهىكىص‪ .‬و هزا انتشكيض يقهم انًؤشش إنى دذ كجيش‪.‬‬
‫تصم قىح االستذالة ثذذهب األقصى إنى ‪ ٪46,23‬يتى تسجيههب ل ‪ biosurfactant‬انتي تُتجهب انسالنخ ‪ 70‬في‬
‫وجىد انجهىكىص و ‪ 15‬غشاو‪/‬نتش يٍ انًهخ‪ .‬ثهغ هزا انًؤشش قيًخ انذذ األقصى ة‪ ٪15.20‬ثىجىد انُفط و كهىسيذ انصىديىو‬
‫‪20‬غشاو ‪ /‬نتش ‪ biosurfactant,‬يٍ انسالنخ انجكتيشيخ ‪ 75‬نذيهب يؤشش االستذالة ‪ 35,56%‬و رنك ثىجىد انجهىكىص و‬
‫‪15‬غشاو ‪ /‬نتشيٍ انًهخ و‪ ٪31,27‬في وجىد انُفط و ‪20‬غشاو ‪ /‬نتشيٍ انًمح‪.‬‬
‫يعظى انسالالد تقىو ثئَتبج ‪ biosurfactant‬و انسالنخ األفضم إَتبجب ل ‪ biosurfactant‬هي انسالنخ ‪، 81‬‬
‫وانتي يًكٍ أٌ تُتج في وجىد انُفط انخبو و ‪20‬غشاو ‪ /‬نتش يٍ انًهخ يع يؤشش يستذهت يصم إنى ‪ ، %43,97‬في ديٍ أَه‬
‫في وجىد انجهىكىص و ‪15‬غشاو ‪ /‬نتش كهىسيذ انصىديىو‪ ،‬يتى تسجيم انذذ األقصى ل ‪ E24‬ثـ ‪.٪34,44‬‬
‫الكلمبت الذالة ‪ :‬انًهىدخ‪ ,‬انخبصيخ انخهطيخ‪ ,biosurfactant ,‬انجتشول انخبو‪ ,‬ثكتيشيب انتشثخ‪.‬‬
‫‪VI‬‬
Effects of salinity on the stability of biosurfactants produced by telluric
bacterial strains in the presence of crude oil
Abstract:
Objective of our study was to investigate the effect of salinity on the production and
stability of biosurfactants produced by bacterial strains hydrocarbonoclastes ground in the
presence of two carbon substrates (glucose o roil).
In the vast majority of products biosurfactants index higher than the emulsion in the
presence of oil and sodium chloride concentration sup to 20g / l and 15g / l in the presence of
glucose. This reduces the concentration to a large extent to the index
Emulsifiers by limiting the power of up to 46,23% maximum are recorded
biosurfactant produced by the S70 in the presence of glucose and 15 g /liter of salt. This
indicator reached a maximum value of 15,20% to the existence of oil and sodium chloride20g
/ l, biosurfactant from 75 bacterial strains has emulsion index 35,56%, and the presence of
glucose and 15g / l of salt and 31,27% oil and 20g / l of salt.
Most of the strains produce biosurfactant strains 81, which can occur in the presence
of crude oil and 20g / l of salt to the surface, with the index emulsion up to 43,97%, whereas
in the presence of glucose and 15g / l sodium chloride, is recorded to reduce maximum of
34,44% in E24.
Key words: salinity, emulsifying property, biosurfactants, crude oil, soil bacteria.
VII
Introduction
Introduction
Depuis la révolution industrielle, au siècle dernier, l'homme n'a pas cessé de proposer
de nouvelles sources d'énergie. La découverte du pétrole a donné un essor considérable à
l'industrie. Depuis, les réserves naturelles de pétrole ont été utilisées sans limite et risquent
d'être épuisées à court et à moyen terme (SOLTANI, 2004).
Cependant, les effets dévastateurs de cette industrialisation et leur impact ont été
évalués sur l’environnement. En effet, de nombreux dégâts réels ont été constatés lors
d’accidents (par exemple fuite de pétrole), de rejets ou de déversements volontaires, pouvant
entraîner des catastrophes écologiques irréversibles. Les conséquences de ces pollutions
écologiques, peuvent avoir un impact soit direct ou indirect, sur la santé humaine et sur
l’équilibre des écosystèmes (GABET, 2004).
La Bioremédiation est définie comme un processus d'élimination complète ou de
conversion des produits récalcitrants toxiques en des produits non toxiques par des bactéries
ou un ensemble de microorganismes (DAS et al., 2009).
Sachant que ces ressources ne sont pas renouvelables, il est indispensable de songer à
une meilleure exploitation des gisements et à une récupération maximale du pétrole, aussi
bien des puits que des containers. De là est née la nécessité d'utiliser des substances, « les
surfactants chimiques », qui permettent une récupération totale du pétrole.
La production mondiale actuelle de surfactants chimiques se chiffre à plus de 3
millions de tonnes par année (BANAT et al., 2000). La plupart des surfactants
commercialement disponibles sont d'origine chimique et sont des produits dérivés du pétrole.
Ils présentent un risque pour l'environnement car ils sont généralement toxiques et non
biodégradables (PARRA et al., 1989 ; HEALY et al., 1996 ; PAGE et al., 1999;
VIPULANANDAN et REN, 2000). C'est pourquoi, depuis plusieurs années, et grâce à l'essor
de la biotechnologie, les scientifiques se sont intéressés à des surfactants produits par des
organismes vivants : les tensioactifs biologiques ou biosurfactants.
Ceux-ci possèdent les mêmes propriétés tensioactives que leurs homologues
chimiques, mais ont l'avantage d'être biodégradables, non toxiques et qui sont également
efficaces, dans le cas de micro-organismes extrêmophiles, à des températures, des pH et des
salinités extrêmes (BANAT et al., 2000). Cependant, leurs coûts de production demeurent
encore assez élevés et freinent leur utilisation (BOGNOLO, 1999). Les substrats de croissance
pour les micro-organismes producteurs de biosurfactants sont peu coûteux, mais le faible taux
1
Introduction
de production et les procédures de purification font que leurs coûts peuvent être parfois
supérieurs à ceux des tensioactifs chimiques (VAN DYKE et AL., 1991 ; FIECHTER, 1992).
Le problème majeur rencontré dans les sols saharienne pollués par les hydrocarbures
c’est leur hyper salinité.
L’objectif de notre étude était double. D’abord nous nous sommes intéressés à la
production de biosurfactants par des souches bactériennes telluriques en présence du pétrole
brut, et par la suite de tester l’effet de la salinité (Nacl) sur la stabilité d’émulsions des
substrats hydrophobes par ces biosurfactants produits.
Le présent mémoire se subdivise en trois parties : la première représente une analyse
du littérateur scientifique où sont exposées les données relatives sur les hydrocarbures dans
les milieux souterrains et une description générale des tensioactifs (classification, propriétés,
structure, mode d’action…). Cette partie comprend également les notions fondamentales sur
la salinité et l’effet sur la stabilité du biosurfactants produits par les souches bactériennes
sélectionnées en présence de pétrole brut.
La seconde partie, est réservée à la présentation de la méthodologie adoptée pour la
réalisation de notre travail.
La troisième partie de ce mémoire est consacrée à la présentation et la discussion des
résultats obtenus.
Le tout complété par une conclusion générale qui intègre l’essentiel des résultats
obtenus dans le cadre de cette recherche et des perspectives.
2
Partie I
Etude Bibliographique
Etude bibliographique
Partie I
L’objectif de ce premier chapitre est de présentation générale sur des hydrocarbures
dans les milieux souterrains.
Dans ce chapitre, nous abordons, d’après la littérature, une description générale des
tensioactifs (classification, propriétés, structure, mode d’action…).
Ce chapitre comprend également les notions fondamentales sur la salinité et l’effet sur
la stabilité du biosurfactants produits par les souches bactériennes sélectionnées en présence
de pétrole brut.
I-Généralité sur les hydrocarbures
I-1-Définition et caractéristiques
Les hydrocarbures d’origine organique se forment à partir de débris d’algues, de
résidus de la faune marine et de plancton. Alors le vieillissement, la température et la pression
(qui s’exerce sur les fonds marins) transforment cette substance organique en hydrocarbures.
Les hydrocarbures (pétrole brut et gaz naturels) sont des molécules composées
uniquement d’atomes de carbone (C) et d’hydrogène (H), ils ont pour formule brute CnHm où
n et m sont deux entiers naturels (FRANENNEC et al., 1998).
I-2-Origine des hydrocarbures
Les rapides transformations chimiques et mécaniques du pétrole déversé dans
l’environnement terrestre et du fait des mécanismes d’altération (évaporation, dissolution,
photo oxydation, biodégradation…), sont souvent un obstacle à la détermination de son
origine. Par conséquent, si un pétrole ne peut être rapidement analysé après son introduction
dans le milieu naturel, son identification devient très difficile (BOCARD, 2006).
Les hydrocarbures dans l’environnement peuvent avoir plusieurs origines :
 Les hydrocarbures fossiles, qui proviennent de la décomposition d'une grande quantité
de matière organique coincée entre deux couches sédimentaires. Cela demande des
caractéristiques géologiques passées spécifiques ce qui explique la faible quantité de
ressources disponibles.
 Les hydrocarbures actuels, qui sont produits par des bactéries décomposant la matière
organique. Cette production a lieu essentiellement dans les zones humides (tourbières,
3
Etude bibliographique
Partie I
marais) et en quantité limitée. Le changement climatique pourrait accroitre cette
production dans les zones actuellement gelée et relâcher de grandes quantités de
méthane dans l'atmosphère terrestre ce qui accentuerait d'autant plus l'effet de serre.
 Les rejets industriels et urbains, qui sont les sources d’hydrocarbures pétroliers
pyrolytiques (SOLTANI, 2004).
I-3-Classification
Selon SOLTANI (2004), les hydrocarbures pétroliers peuvent être classés en quatre
familles principales qui sont présentés en proportions variables selon l’origine: les
hydrocarbures saturés (30 à 70 %), les hydrocarbures aromatiques et polyaromatiques (20 à
40 %), les composés polaires (5 à 25 %) et les asphaltènes (0 à 10 %).
I.3.1. Hydrocarbures saturés
Parmi les hydrocarbures saturés on distingue:
a- Alcanes linéaires
Les alcanes linéaires (n-alcanes, CnH2n+2), dont la longueur de leur chaîne varie de 7
à 40 atomes de carbone constituent une des classes les plus abondantes (10 à 40 % des
hydrocarbures totaux d'un brut pétrolier).
b- Alcanes ramifiés
Les alcanes ramifiés les plus abondants sont les iso-alcanes (groupement méthyle en
position 2). Les autres composés ramifiés antéiso (groupement méthyle en position 3) ou
polyramifiés tels que les isoprénoïdes (exemple: pristane, phytane) sont beaucoup moins
nombreux. Ces composés se trouvent dans le pétrole brut à des proportions sensiblement
égales à celles des n-alcanes.
c- Cycloalcanes
Les cycloalcanes renferment des composés cycliques (à 5 ou 6 atomes de carbone)
saturés et le plus souvent substitués. Quelques dérivés polycycliques sont aussi présents et
certains d’entre eux tels que les stéranes et les triterpanes sont caractéristiques d’un pétrole
brut. Cette famille peut représenter entre 30 et 50 % des hydrocarbures totaux d’un pétrole
brut.
4
Etude bibliographique
Partie I
I.3.2. Hydrocarbures aromatiques
Plusieurs familles d'hydrocarbures aromatiques et polyaromatiques dont le nombre de
noyaux varie de 2 à 6 sont présentes dans les pétroles bruts. Ces composés sont dominés par
des composés mono-, di- et tri-aromatiques. En général, les hydrocarbures aromatiques sont
moins abondants que les alcanes, et ne représentent que 10 à 30 % des hydrocarbures totaux
d'un brut pétrolier.
I.3.3. Composés polaires
Les composés polaires correspondent à des molécules hétérocycliques, telles que:
 Des composés oxygénés: phénols, acides carboxyliques, alcools, aldéhydes,…
 Des composés soufrés: mercaptans, sulfures, disulfures,…
 des composés azotés: pyridines, quinoléines,…
 Les dérivés soufrés sont dans la plupart des cas plus abondants que les composés
oxygénés ou azotés.
I.3.4. Asphaltènes
Les asphaltènes correspondent à une classe de composés de hauts poids moléculaires,
insolubles dans le pentane ou l’hexane. La structure de ces composés est mal connue du fait,
d’une part de leur composition chimique complexe (à base de cycles aromatiques condensés,
de naphtéo-aromatiques, de ramifications et d’hétéroatomes (O, N, S), et d’autre part de
méthodes analytiques difficilement utilisables.
II- Généralité sur le biosurfactants
II-1- Définition
Les biosurfactants sont des molécules amphiphiles constituées d'une partie hydrophile
polaire et d'une partie hydrophobe non polaire (figure n°01). Généralement, le groupement
hydrophile est constitué d'acides aminés, peptides ou de polysaccharides (mono ou di) ; le
groupement hydrophobe est constituée d'acides gras saturés ou non saturés (DESAI et
BANAT, 1997).
La portion hydrophile de la molécule permet de distinguer quatre types chimiques de
biosurfactant:
5
Etude bibliographique
Partie I
 les cationiques qui possèdent une charge positive ;
 les anioniques, agents de surface possédant un ou plusieurs groupes fonctionnels
s'ionisant en solution aqueuse pour donner des ions chargés négativement ;
 les non ioniques, sans charge ;
 les amphotères (zwitterioniques) qui possèdent deux groupements hydrophiles
différents: l'un anionique et l'autre cationique. Selon le pH de la solution, ils peuvent
agir en tant qu'espèce anionique, cationique ou neutre (WEST et HARWELL, 1992).
La portion hydrophobe, quant à elle, influe sur la chimie du biosurfactant par son
aromaticité, son nombre de carbones ou son degré de ramification (WEST et HARWELL,
1992).
Figure 01: Représentations les plus utilisées pour illustrer les deux parties
(hydrophile et hydrophobe) des molécules amphiphiles
des surfactants (LARPENT, 2000).
II-2- Type de biosurfactant
Contrairement aux surfactants synthétisés chimiquement, qui sont généralement
classés en fonction de la nature de leurs groupes polaires, les biosurfactants sont généralement
classées principalement par leur composition chimique et leur origine microbienne.
Rosenberg et Ron ont classés les biosurfactants en deux classes :
 Les biosurfactants à faible poids moléculaire qui sont efficace dans l’abaissement de la
tension interfaciale.
 Les biosurfactants à poids moléculaire élevé qui sont très efficace comme agents
émulsifiants et stabilisateurs (KAPPELI et FINNERTY, 1979).
6
Etude bibliographique
Partie I
Les principales classes de biosurfactants à faible poids moléculaire sont : les
glycolipides, les lipopeptides et les phospholipides, tandis que ceux à poids moléculaire élevé
comprennent les polymériques.
La plupart des biosurfactants issus de diverses sources microbiennes sont soit
anionique, cationique ou neutre et la fraction hydrophobe est basée sur une longue chaîne
d'acides gras ou dérivés d'acides gras, tandis que la portion hydrophile peut être un glucide,
acides aminés, phosphate ou peptide cyclique (NITSCHKE, et COAST, 2007).
a- Les surfactants anioniques : dissocié dans l'eau à un anion amphiphile et un cation
qui est en général un métal alcalin de (Na +, K +) ou un ammonium quaternaire. Ils sont les
surfactants les plus couramment utilisés. Ils comprennent des alkylbenzène sulfonates
(détergents), acides gras (savons), (acides gras) de savons, de lauryl sulfate (agent moussant),
sulfosuccinate de di-alkyl (agent mouillant), lignosulfonates (dispersants) etc....Les
surfactants anioniques représentent environ 50% de la production mondiale.
b- Les surfactants non ioniques : venir comme une seconde près avec environ 45%
de la production industrielle globale. Ils ne s'ionisent pas en solution aqueuse, en raison de
leur groupe hydrophile est d'un type non dissociable, tel qu'un alcool, phénol, éther, ester, ou
amide. Une grande proportion de ces surfactants non ioniques sont rendu hydrophile par la
présence d'une chaîne de polyéthylène glycol, Obtenu par la polycondensation de l'oxyde
d'éthylène. Ils sont appelés non ioniques polyéthoxylés.
c- Les surfactants cationiques : sont dissociées dans l'eau en un amphiphile
cationique et un anion, le plus souvent de type halogène. Une très grande proportion de cette
classe correspond à des composés azotés tels que les sels d'amines grasses et les ammoniums
quaternaires, avec un ou plusieurs longue chaîne du type alkyle, souvent provenant d'acides
gras naturels. Ces biosurfactants sont en général plus.
II-3- Nature chimique et classification des biosurfactant
Les biosurfactants sont classés suivant la nature biochimique du surfactant produit par
le micro-organisme. On distingue cinq grandes classes de biosurfactants : les glycolipides, les
lipopeptides, les phospholipides, les liposaccharides et les lipides neutres (HEALY et al.
1996).
7
Etude bibliographique
Partie I
II.3.1. Les glycolipides
Les glycolipides sont constitués d'hydrates de carbone en combinaison avec une
longue chaîne d'acides aliphatiques ou d'acides hydroxyaliphatiques. Les glycolipides les plus
étudiés sont les rhamnolipides, les tréhalolipides et les sophorolipides (RON et
ROSENBERG, 2002).
Beaucoup de bactéries telles que Pseudomonas, Streptococcus produisent des
Glycolipides.
a) Les rhamnolipides
Ces glycolipides, dans lequel un ou deux des molécules de rhamnose sont liés à une ou
deux molécules d’acide β hydroxydecanoique, sont les mieux étudié. Alors que le groupe OH
de l'un des acides est impliqué dans la tringlerie liaisons glycosidiques avec la réduction fin
du rhamnose disaccharide, le groupe OH du deuxième acide est impliqué dans la formation
d'ester. La production de rhamnose contenue dans les glycolipides a été décrite pour la
première fois dans P. aeruginosa par JARVIS et JOHNSON, 1949 (figure n°02).
Récemment, THANAMSUB et al. (2006) ont déterminé deux types de rhamolipides
produits par Pseudomonas aeruginosa isolée à partir de perte d’usine de lait (lactosérum). Ces
deux biosurfactants ont été identifiés comme Lrhamnopyranosyl- L- rhamnopyranosyl-βhydroxydecanoyl-β-hydroxydecanoate ou Rha-Rha C10-C10 et L-rhamnopyranosyl-Lrhamnopyranosyl-β-hydroxydecanoyl-β- hydroxydecanoate ou Rha-Rha C10-C12.
Figure 02 : structure de rhamnolipide.
b) Les tréhalose-lipides
Plusieurs types structurels microbiens de biosurfactants Trehalolipidique ont été
signalés. Disaccharide tréhalose lié à C-6 et C-6’ d'acide mycolique est associé à la plupart des
espèces de Mycobacterium, Nocardia et Corynebacterium. Les acides mycolique ont une
8
Etude bibliographique
Partie I
longue chaîne, α-ramifiées-β-hydroxyle acides gras. Les tréhalolipides provenant de différents
organismes diffèrent par la taille et la structure de l’acide mycolique, le nombre d'atomes de
carbone et le degré d'insaturation (ASSELINEAU, et ASSELINEAU, 1978). Le tréhalose
lipides à partir de
Rhodococcus erythropolis et Arthrobacter sp Abaissé la tension
interfaciale et superficielle dans le bouillon de culture de 25 à 40 et 1 à 5 mNm,
respectivement (ASSELINEAU, et ASSELINEAU, 1978) (figure n°03).
Figure 03 : structure de tréhalose-lipides.
c) Les pentasaccharides-lipides
D'après certains auteurs, le pentasaccharide-lipide le plus connu est celui produit par
Nocardia corynebacteroïdes SM1 cultivée sur les n-alcanes (WAGNER et LANG, 1996).
d) Les sophorose-lipides
Les sophorolipides (ou SI) sont produits par Candida bombicola et Torulopsis après
leur culture dans un milieu à base de glucose et de composés lipophiles (WAGNER et LANG,
1996).
D'après ces mêmes auteurs, les sophorolipides sont produits sous forme d'un mélange
de composés à base de dérivés de sophoroses acylés dont chacun est lié à un acide gras
hydroxylé (figure n°04).
D'après STUAWER et al. (1987), la modification de la composition du milieu de
culture par un apport d'un substrat le n-hexadecane, conduit à la production de 0,46 g de
sophorolipides constitué en majorité d'acide gras, en utilisant la levure Candida apicola Met
43747.
9
Etude bibliographique
Partie I
Figure 04: Structure de sophorolipide produit par
Candida bombicola ATCC 22214 (WAGNER et LANG, 1996).
II.3.2. Lipopeptides et lipoprotéines
Les lipopeptides sont composés d'un lipide attaché à une chaîne polypeptide
(ROSENBERG et RON, 1999). Parmi les biosurfactants bactériens de nature lipopeptidique,
on distingue:
a) La surfactine
La surfactine est une lipopeptide cyclique produites par Bacillus subtilis ATCC 21332.
Elle est l'un des plus puissants biosurfactants. Elle est composée de sept acides aminés : LGlu1-Leu2-D-Leu 3-L-Val4-L-Asp5-D-Leu6–L-Leu7 structurés en anneau couplé à une
chaîne d’acide gras via cycle lactonique. Elle abaisse la tension de surface de 72 à 27,9 mNm
à des concentrations aussi faibles que 0,005 % (ARIMA et al ., 1968) (figure n°05).
Figure 05 : structure de surfactine.
10
Etude bibliographique
Partie I
b) La lichenysine :
Bacillus licheniformis Produit plusieurs biosurfactants qui agissent en synergie et
présentent une excellente stabilité en température défavorable, pH et les conditions de sel.
Elles sont également similaires à structurelles et propriétés physico-chimiques au Surfactine
(MCINERNEY et al ., 1990).
Les agents tensioactifs produits par B. licheniformis Sont capables de diminuer la
tension superficielle de l'eau à 27mNm et la tension interfaciale entre l'eau et n-hexadecane à
0.36 mNm.
c) Les lipoamino-acides (l’ornithine) :
Un lipide qui contient un seul amino-acide l’ornithine provoquant l’émulsion est
produite par Pseudomonas rebescens (LAURILA, 1985).
II.3.3. Les phospholipides :
Les phospholipides sont formés de groupements alcool et phosphate et de chaîne
lipidique (HEALY et al., 1996). BOGNOLO (1999) indique que bien que présents dans tous
les micro-organismes, il y a peu d'exemples de production extracellulaire.
Divers phospholipides sont isolés à partir de culture de cellules libres de Thiobacillus
thiooxidans. Ces phospholipides se lient à l'élément souffre qui est nécessaire à la croissance
cellulaire (ROSENBERG et RON, 1999).
De sa part, Corynebacterium alkanolyticum est induite à produire des phospholipides
extracellulaires en enrichissant le milieu de culture de pénicilline ou de céphélosporine
(LAURILA, 1985).
Selon les auteurs, la composition et le type de phospholipides produit par les
différentes espèces de bactéries, levures et fungi, dépendent de la source de carbone utilisée et
des conditions de culture de croissance, à savoir la valeur de pH du milieu de culture.
Le tableau I donne la distribution des phospholipides majeurs chez les bactéries, par
exemple : chez les bactéries gram négatives, le phophatidyl-ethanolamine prédomine; par
contre chez les bactéries Gram positives, on retrouve différents types de phospholipides.
11
Etude bibliographique
Partie I
Tableau I : La distribution structurale des phospholipides majeurs
(ZAJIC et MOHAMEDY, 1984).
II.3.4. Les lipopolysaccharides ou polymériques, sont constitués d'une ou plusieurs unités
saccharides et d'acides gras (HEALY et al., 1996).
II.3.5. Les acides gras et lipides neutres, sont les biosurfactants qui possèdent la masse
molaire la plus élevée (HEALY et al., 1996).
Du fait de leur forte production et de leurs propriétés tensioactives importantes, les
biosurfactants les plus communs et les plus étudiés sont les glycolipides et les phospholipides
(DESAI et BANAT, 1997).
On résumer tous les types de biosurfactants et les microorganismes produits dans le
tableau II :
12
Etude bibliographique
Partie I
Tableau II : Source microbienne et principaux types de biosurfactants
(DESAI et coll., 1997).
13
Etude bibliographique
Partie I
II-4- Biosynthèse et rôle physiologique
La production de biosurfactants est un phénomène communément observé lors de la
croissance d’un microorganisme sur des substrats insolubles dans l’eau et la réduction de la
tension superficielle du milieu ainsi que la formation d’une émulsion stable indiquent une
production efficiente (PRUTHI et coll., 1995). Selon ADAMSON (1990), la présence de
surfactant est nécessaire pour obtenir une émulsion stable entre deux liquides purs non
miscibles (KREPSKY et coll., 2007).
CAMEOTRA (2009) explique ce phénomène comme étant l’un des comportements
des microorganismes pour augmenter la biodisponibilité de plusieurs substrats hydrophobes,
qui sont peu utilisés à cause de leur insolubilité dans l’eau.
En effet, ces bactéries synthétisent les biosurfactants qui sont soit des molécules
intracellulaires, extracellulaires ou localisées à la surface de la cellule (PRABHU et coll.,
2003) pour faciliter la diffusion des hydrocarbures ou leurs dérivés à l’intérieur de la cellule
bactérienne à fin de les dégrader (AL-ARAJIL et coll., 2007).
Il est intéressant de savoir aussi que les produits intermédiaires d’oxydation des
hydrocarbures ne persistent pas dans le sol comme polluants, mais seront potentiellement
réabsorbés et métabolisés par les même microorganismes prédominants, comme l’a révélé
l’étude de DASHTI et ces collaborateurs en 2008.
Cependant, les biosurfactants peuvent avoir d’autres rôles aussi importants que
l’émulsification, par exemple : l’adhésion aux surfaces solides et la formation de biofilms
(Alasan d’Acinetobacter), la régulation du niveau énergétique cellulaire (sophorose de T.
bombicola), l’activité bactéricide (gramicidine, polymexine, surfactine), la pathogénicité de
certaines bactéries (rhamnolipides de Pseudomonas), ainsi que le piégeage des métaux lourds
(VANDECASTEELE, 2008).
II-5- Utilisation des biosurfactant
Les biosurfactants sont reconnus pour être non toxiques, biodégradables et peuvent
être utilisés dans des conditions extrêmes (BANAT et al., 2000). C'est pourquoi ils peuvent
être utilisés dans de nombreux domaines. Cependant, il semblerait que les biosurfactants
soient principalement utilisés par l'industrie pétrochimique (CHRISTOFI et IVSHINA, 2002).
Dans le domaine de la protection de l'environnement et la remédiation, les
biosurfactants (rhamnolipides) sont utilisés dans la dépollution marine et des sols contaminés
par les hydrocarbures (LANG et WALLBRANT, 1999).
14
Etude bibliographique
Partie I
En agriculture, les biosurfactants sont utilisés, en particulier, dans la formulation
d'herbicides et de pesticides (LANG et WALLBRANT, 1999).
D'autres part, les biosurfactants de structure glycolipides peuvent avoir des
applications pharmaceutiques, cosmétiques et alimentaire (LANG et WALLBRANT, 1999;
BANAT, 2000).
II-6- Potentialité des biosurfactants
Les biosurfactants peuvent être aussi efficaces et plus avantageux que les surfactants
synthétiques. Ils sont hautement spécifiques, biodégradables, biocompatibles avec
l’environnement (MULLIGAN, 2009), moins sensibles aux biotopes de températures, pH et
salinité extrêmes (SUWANSUKHO et coll., 2008), moins toxiques et peuvent être synthétisés
en grandes quantités, sur des sources d’énergie coûteuses, comme les produits pétroliers
(SARUBBO et coll., 2006), mais aussi sur des ressources renouvelables.
Un autre avantage des biosurfactants, est la possibilité de leur modification par
biotransformation à fin de générer de nouveaux produits pour des besoins spécifiques
(SAMADI et coll., 2007). Avec l’introduction de certains groupements fonctionnels, les
biosurfactants fournissent de nouvelles propriétés, surpassant ainsi les surfactants chimiques
dans beaucoup d’applications (HUANG et coll., 2010).
Ces biomolécules présentent une large gamme de propriétés fonctionnelles qui
permettent leur exploitation dans divers domaines (PROMMACHAN, 2002). Cependant, il
n’est pas facile de rationaliser la différence entre leurs rôles naturels et nos applications
(CAMEOTRA et coll., 2004; HAMME et coll., 2006, MARQUES et coll., 2009).
Leur capacité à modifier les propriétés interfaciales et leur auto-assemblage en
micelles ou autres nanostructures est cruciale pour plusieurs processus industriels tels que la
formation de couches, la diffusion, la formation de mousse, la détergence, la catalyse
micellaire, etc. (XIAOYANG et coll., 2009).
Ces biomolécules peuvent aussi induire la formation d’émulsion, la séparation de
phases, la solubilisation, le mouillage, la réduction de viscosité (OCHSNER et coll., 1995), la
floculation, l’agrégation, la désorption (KARANTH et coll., 1999) ainsi que la stabilisation et
la déstabilisation d’émulsions (HUANG et coll., 2010).
15
Etude bibliographique
Partie I
II-7- Les différentes applications des biosurfactants
Une grande attention a été portée vers les biosurfactants en raison de leur vaste gamme
de propriétés fonctionnelles et de diverses capacités synthétiques de microbes. Le plus
important est leur acceptabilité pour l'environnement, car ils sont facilement biodégradables et
ont une faible toxicité que les surfactants chimiques. (DESAI et BANAT, 1997).
Ces propriétés uniques de biosurfactants permettre leur utilisation et le remplacement
possible du surfactants synthétisés chimiquement contenus dans un grand nombre d'opérations
industrielles. En outre, ils sont sans danger pour l'environnement et peut être appliqué dans la
biorestauration et le traitement des eaux usées. (DESAI et BANAT, 1997).
Figure 06: Les fonctions des biosurfactants les plus demandées pour usage industriel.
16
Etude bibliographique
Partie I
III- Production des biosurfactants
Le principal frein à l'utilisation des biosurfactants est leur coût. En effet, BOGNOLO
(1999) indique que les prix varient de 8 €.mg-1 pour de la Surfactine purifiée à 98 %
(utilisations biomédicales) à 1 à 3 €.kg-1 pour des formulations d'Emulsan utilisées dans les
années quatre vingt (80) pour le nettoyage des cuves. De récentes estimations indiquent un
coût de revient de 2 à 16 €.kg-1.
LANG et WULLBRANDT (1999) indiquent que pour la production de rhamnolipides
en grande quantité dans des fermenteurs de 20 à 100 m3, les coûts diminuent de 16 à 4 €.kg-1.
Par comparaison, les coûts de surfactants chimiques sont de l'ordre de 0,5 à 2 €.kg-1. Ainsi, le
succès de l'utilisation et la production des biotensioactifs passe par une diminution des coûts
de production. Cette diminution pourra être atteinte grâce à la valorisation de substrats de
croissance de produits à faible coût. Par exemple, MAKKAR et CAMEOTRA (2002)
indiquent qu'il est possible d'utiliser des déchets et des produits agricoles, d'une part, pour
diminuer les coûts mais aussi pour diminuer les quantités de déchets à traiter de diverses
entreprises (huiles de moteurs usagées…).
Une étude réalisée par MERCADE et MANRESA (1994) reporte des taux de
production de rhamnolipides de 1,4 g.L-1 pour des Pseudomonas cultivées sur des sousproduits industriels.
Dans notre étude nous avons utilisés de substrat (Pétrole brut) pour effectuée la
production de biosurfactant dont la composition est représentée dans le tableau suivant :
Tableau III : Composition élémentaire d’un pétrole brut (BOCARD, 2006)
Composants
*
Poids %
Carbone
84 à 87
Hydrogène
11 à 14
Soufre
0à6
Azote
0 à 1*
Oxygène
0à 8**
Souvent ‹ 0.1
**
Souvent‹ 1
III-1- Microorganismes producteurs
Les biosurfactants sont principalement produits par des micro-organismes se
développant de manière aérobie (MULLIGAN et al., 2001) dans un milieu aqueux contenant
une ou plusieurs sources de carbone, comme des hydrates de carbone, des huiles ou des
17
Etude bibliographique
Partie I
hydrocarbures (BOGNOLO, 1999 ; MULLIGAN et al., 2001). Ces organismes sont, en
général, des levures, des champignons ou des bactéries.
Le principal rôle physiologique du tensioactif est de permettre aux microorganismes
de se développer sur des substrats insolubles en réduisant la tension interfaciale entre l'eau et
le substrat, rendant ce dernier plus facilement accessible (FIECHTER, 1992 ; MATASANDOVAL et al., 2000).
Les bactéries utilisées pour produire les biosurfactants sont, en général, issues de sols
contaminés par des molécules hydrophobes telles que les hydrocarbures aromatiques
polycycliques (HAP). Elles sont donc isolées de leur milieu naturel et sont cultivées en
laboratoire. Ceci permet de faire des tests pour choisir la meilleure source de carbone et
d'optimiser les milieux de culture afin d'obtenir un taux de production maximum. Dans tous
les cas, le biosurfactant obtenu est un mélange de plusieurs molécules. Par exemple, dans le
cas du biosurfactant produit par une souche de Pseudomonas aeruginosa UG2, on obtient un
mélange de deux, voire quatre rhamnolipides (VAN DYKE et al., 1993). ABALOS et al.
(2001) indiquent que sept homologues de rhamnolipides ont été identifiés dans des cultures de
Pseudomonas aeruginosa AT10.
Bien que de nombreuses espèces produisent des biotensioactifs, la régulation de leur
synthèse est encore mal connue, sauf pour les souches de Pseudomonas aeruginosa et
Bacillus subtilis qui sont actuellement les bactéries les plus étudiées (BANAT et al., 2000).
La biosynthèse des rhamnolipides par des souches de Pseudomonas aeruginosa se réalise
pendant la phase exponentielle de croissance et est due à un transfert séquentiel glycosyl
catalysé par des transférases rhamnosyl spécifiques : il y a intervention de donneurs
rhamnosyl, les TPD transférases. Deux transférases différentes permettent la formation de
quatre rhamnolipides différents (KOCH et al., 1991). Les molécules de biosurfactant sont
associées aux membranes des bactéries et sont aussi secrétées dans le milieu
(THANGAMANI et SHREVE, 1994).
Les bactéries produisent des molécules de faible masse molaire, qui diminuent
efficacement les tensions interfaciales, ainsi que des polymères de masses molaires élevées,
qui se lient fortement aux surfaces (RON et ROSENBERG, 2002). Les biosurfactants de
faibles masses molaires sont généralement des glycolipides, alors que ceux de masses
molaires élevées sont constitués de polysaccharides, de protéines, de lipopolysaccharides ou
des lipoprotéines. Ces derniers sont moins efficaces pour réduire les tensions interfaciales,
mais plus efficaces pour entourer les gouttes d'huiles et empêcher leur coalescence.
18
Etude bibliographique
Partie I
Une des techniques utilisées pour suivre la production de biosurfactant est l’ADSA-P
("Axysymmetric Drop Shape Analysis by Profile") qui détermine simultanément l’angle de
contact et la tension de surface du liquide grâce au profil d’une goutte restant sur une surface
de solide. Les gouttes contenant les microorganismes producteurs sont placées sur une surface
en fluoroéthylènepropylène et le profil de la goutte est déterminé.
D’autres méthodes ont été décrites comme l'hémolyse du sang, qui est une
caractéristique connue de certains biosurfactants et un index d'émulsification (E24) obtenu sur
kérosine (BANAT, 1995). Le test du "drop-collapsing" est utilisé pour voir les colonies
bactériennes produisant les biosurfactants : des gouttes contenant des cellules en suspension
sont placées sur une surface recouverte d'huile ; si la goutte reste stable, cela démontre
l'absence de tensioactif (JAIN et al., 1991).
III-2- Identification des biosurfactants
Une fois les produits (biosurfactants) sont purifiés, il faut déterminer leur structure.
Parmi les différentes analyses qualitatives on utilise le plus fréquemment:
 La spectrométrie d'adsorption en lumière ultra-violette et visible (UV-Vis) qui détecte
la présence de chromophore (SPOECKNER et al., 1999),
 La spectrométrie infrarouge (IR) qui détermine les groupements fonctionnels
(PEYPOUX et al., 1999),
 La spectrométrie de masse (MS) qui donne le poids moléculaire, des indications sur la
structure et qui, à haute résolution, fournit l'analyse élémentaire de la molécule
(DANIELS et al., 1999).
 La résonance magnétique nucléaire à haut champs (RMN de proton et de carbone 13)
indique la structure et la conformation des composés à analyser (DANIELS et al.,
1999).
III-3- Propriétés physico-chimiques des biosurfactants
a- Abaissement de la tension superficielle
La tension superficielle (TS) est définie comme étant la force existant à la surface d'un
liquide dû à l'attraction entre les molécules qui s'opposent à la rupture de la surface
(HOLMBERG et al., 2001).
La tension superficielle s'exprime en Dyne. Cm-1 (= mN.m-1). Les biosurfactants
diminuent considérablement la tension superficielle de l'eau, même dans les solutions très
diluées. Ceci apparaît dans l'exemple: la tension superficielle de l'eau pure est de 62.80 mN/m
19
Etude bibliographique
Partie I
à 20°C et en présence d'un biosurfactant, elle peut atteindre approximativement une valeur de
30 mN/m (HOLMBERG et al., 2001).
L'adsorption des biosurfactants et la diminution de la tension superficielle sont
responsables de la formation de mousses.
b- Abaissement de la tension interfaciale
La tension interfaciale est la force nécessaire pour rompre la surface entre deux
liquides immiscibles (NEINDRE, 1993).
La tension interfaciale de l'eau contre un alcane (n-octane) est de 50.81 mN/m à 20°C
et en présence d'un biosurfactant, elle diminue jusqu'à moins de 1 mN/m (HOLMBERG et al.,
2002).
c- Solubilisation des biosurfactants dans l'eau
Les agents tensio-actifs, au-dessus de leur concentration micellaire critique
augmentent, de façon significative, la solubilité des produits insolubles ou peu solubles dans
l'eau. Ce phénomène est appelé "solubilisation" (MARCOU, 1989).
La solubilité des biosurfactants dans l'eau ou dans les hydrocarbures dépend du
nombre de laisons C-C présentes dans la partie lipophile de la molécule du biosurfactant
(Mimouni, 1995), c'est-à-dire:
 Si la longueur de la chaîne (de la partie lipophile) est inférieure à 12 liaisons C-C, le
surfactant est soluble dans l'eau,
 Si la partie non polaire (lipophile) a plus de 16 liaisons C-C, le surfactant est non
soluble dans l'eau.
Cette propriété de solubilité devient aisée quand il y a formation de micelle, car la
molécule individuelle du biosurfactant est relativement peu soluble dans l'eau, du fait qu'elle
renferme une partie hydrocarbonée importante insoluble dans l'eau, par contre la micelle
réalise des conditions meilleures de solubilité puisque les parties hydrocarbonées sont
soustraites à l'eau et que sa surface est recouverte par l'ensemble hydrosoluble (MIMOUNI,
1995).
Selon LARPENT (2000) la solubilité des biosurfactants dans l'eau ou dans les
hydrocarbures est fonction de l'importance relative de leur partie hydrophobe et hydrophile ou
plus précisément de leur "balance lipophile-hydrophile (HLB)".
20
Etude bibliographique
Partie I
d- Concentration Micellaire Critique (CMC)
La CMC est par définition la concentration en solution d'un agent de surface au-dessus
de laquelle une partie des molécules dispersées au sein de la solution se rassemblent pour
former des micelles (PORE, 1992).
Les micelles se forment lorsque les portions hydrophobes, incapables de former des
liaisons hydrogène en phase aqueuse, créent une forte augmentation de l'énergie libre du
système. Une façon d'abaisser cette énergie est d'isoler la partie hydrophobe de l'eau par
adsorption sur des matrices organiques ou de former des micelles (HAIGH, 1996).
En effet, dans les micelles, les parties hydrophobes se regroupent vers le centre, et les
portions hydrophiles restent en contact avec l'eau (Figure n°07).
La CMC peut également être définie comme étant la concentration pour laquelle la
tension superficielle devient minimale (environ 30 mN.m-1en solution aqueuse). Pour de
nombreux biosurfactants, la tension superficielle minimale est à peu près identique mais la
CMC varie en fonction de leur structure. Les CMC obtenues pour les biosurfactants varient de
1 à 200 mg.L-1(ABALOS et al., 2001).
La CMC d'un biosurfactant varie avec sa structure, la température de la solution, la
présence d'électrolytes ou de composés organiques (EDWARDS et al., 1991).
Les effets des électrolytes sur la CMC sont plus prononcés pour les biosurfactants
ioniques. La variation de la taille de la région hydrophobe est un facteur important et en
général, la CMC diminue lorsque le caractère hydrophobe du surfactant augmente (HAIGH,
1996).
Figure 07 : Représentation schématique d'une micelle de biosurfactant
(GABET, 2004).
21
Etude bibliographique
Partie I
e- Solubilité des biosurfactants en fonction de la température
Pour les biosurfactants ioniques, la courbe représentant la solubilité en fonction de la
température fait apparaître un comportement irrégulier : à partir d'une certaine température
Tk, dite température de Krafft, la solubilité augmente brusquement. Sur ce même graphe, la
courbe représentant la CMC en fonction de la température a été ajoutée. (SHINODA et
FONTELL, 1995).
En dessous du point de Krafft, la solubilité est faible ; elle est uniquement due aux
monomères présents en solution. Lorsque ces derniers atteignent la saturation (à la CMC), le
biosurfactant précipite sous forme de solide hydraté. Au-dessus de Tk, la solubilité croît
rapidement avec la température : ceci est lié à la formation de micelles puisque l’activité des
micelles reste constante (SHINODA et FONTELL, 1995).
Ce sont les micelles qui font croître la solubilité. Le biosurfactant se retrouve à la fois
sous forme de micelles et de monomères (GABET, 2004).
Les biosurfactants non ioniques ne présentent pas de température de Krafft, mais se
caractérisent par une température appelée point de trouble (GABET, 2004).
III-4- Paramètres influençant la production des biosurfactants
Le type et la quantité de biosurfactants produits varient avec la composition du milieu
(source de carbone ou autres nutriments) et les conditions de culture (température, agitation,
pH, etc.).
a. Influence de la source de carbone
La source de carbone est l’un des paramètres influençant le plus la production des
biosurfactants, soit par induction, soit par diminution de la quantité produite. Les sources de
carbone solubles dans l'eau (glycérol, glucose, mannitol ou éthanol) sont utilisées pour
produire des rhamnolipides. Cependant, les rendements semblent être inférieurs à ceux
obtenus sur des substrats insolubles, comme des n-alcanes ou de l'huile d'olive (DESAI et
BANAT, 1997). En effet, les bactéries ont la capacité de croître sur des substrats hydrophobes
(CAMEOTRA et MAKKAR, 1998).
b. Influence de l'azote
De nombreuses études ont montré que la synthèse de rhamnolipides se produisait
lorsqu'il y avait un excès de carbone dans le milieu ou lorsque l'azote était en quantité
limitante. L'azote peut être apporté sous différentes formes selon les bactéries productrices
(LANG et WULLBRANDT, 1999).
22
Etude bibliographique
Partie I
Pour avoir des rendements de production optimum, il est donc nécessaire d'avoir un
rapport C/N idéal, et surtout que l'azote soit un facteur limitant (stress) pour favoriser la
production de biosurfactant (GABET, 2004).
c. Influence du pH
Pour une souche de Pseudomonas aeruginosa, le pH du milieu de culture doit se situer
entre 6,0 et 6,5. A des pH inférieurs ou supérieurs, la production de biosurfactants chute
rapidement. D'autres souches comme Norcardia corynbacteroides sont inaffectées par des pH
variant de 6,5 à 8,0 (ARINO et al., 1996).
d. Influence des sels minéraux
Il semblerait qu'une concentration limitant en ions magnésium, calcium, potassium
sodium ou éléments traces induise une augmentation de production (GUERRA SANTOS et
al., 1986).
e. Influence de l’oxygène
La disponibilité de l'oxygène peut également affecter la production à travers son effet
sur l'activité cellulaire ou la croissance (GABET, 2004).
f. Influence de la vitesse d’agitation
Les milieux de culture sont agités lors de la production de biosurfactant. Pour les
bactéries, une augmentation de la vitesse d'agitation induit une augmentation des vitesses de
cisaillement et donc un rendement moindre. L'effet inverse est observé lorsque les organismes
producteurs sont des levures (DESAI et BANAT, 1997).
IV- Généralités sur la salinité
IV-1- Définition
Plusieurs auteurs ont défini la salinité des sols comme étant la présence de
concentration excessive de sels solubles, ou lorsque les concentrations en Na, Ca, Mg sous
formes de chlorures, carbonates, ou sulfates sont présentes en concentrations anormalement
élevées (ASLOUM., 1990). Un sol salé indique la prédominance de NaCl.
La salinité des sols et des eaux, constitue un obstacle majeur sur la croissance des
végétaux, dans les régions arides et semi-arides.
La salinité est un facteur limitatif majeur de la productivité agricole, ces charges en
sels soumettent les plantes à un stress permanent (GUPTA et ABROL., 1990 in BENNABI.,
2005).
La liste des sels en cause varie selon le cas de salinité, le plus fréquent en zone semiaride d’avoir des chlorures ou des sulfates de sodium ou de magnésium (FORGES, 1972).
23
Etude bibliographique
Partie I
IV-2- Définition de la salinisation
La salinisation est un processus d’accumulation de sels à la surface du sol et dans la
zone racinaire qui occasionne des effets nocifs sur les végétaux et le sol, il s’en suit une
diminution des rendements, et à terme, une stérilisation du sol (MERMOUD, 2006).
La salinisation est un processus d’enrichissement d’un sol en sels solubles qui aboutit
à la formation d’un sol salin (USDA en ligne).
IV-3- Mesure de la salinité
La salinité globale du sol peut être exprimée de différentes manières, soit :
 Par la somme des ions de l’extrait aqueux;
 En gramme par litre de NaCl;
 En pour-cent de sel dans le sol;
 En terme de conductivité électrique (CE) déterminée sur l’extrait de pâte saturée à
25°C (RICHARD et al., 1954 cité par ADI, 2001); l’unité d’expression est le millimho
(mmhos/cm) ou le millisiemens (ms).
IV-4- Effet de la salinité
La salinité diminue le nombre de micro-organismes dans le sol. Elle ralentit les
processus de l'humification et de la minéralisation des matières organiques. En effet, de tous
les processus biologiques, la nitrification est la plus touchée, ainsi que le dégagement de CO2
(MALLOUHI, 1989).
Les fortes salinités constituent une barrière naturelle pour la biodégradation des
hydrocarbures. BERTRAND et al, (1993) ont étudié l’influence de la concentration en
chlorure de sodium sur la biodégradation des hydrocarbures par deux communautés
microbiennes.
Des chercheurs ont trouvé que la biodégradation des hydrocarbures est
maximale pour une concentration en sel de 0,4 M et diminue lentement pour des valeurs
supérieures et inférieures à celle-ci (SOLTANI, 2004).
WARD et BROCK (1978) ont montré que la vitesse de la biodégradation des
hydrocarbures décroit lorsque la salinité passe de 3,3 à 28,4%, et ils ont attribué ces résultats à
une réduction générale des vitesses métaboliques des microorganismes.
Ces facteurs sont particuliers à des écosystèmes spéciaux comme les lacs salés et les
grands fonds océaniques. WARD et BROCK (1978) ont étudié la biodégradation des
hydrocarbures dans des environnements hyper salés. Ils ont conclu que le taux de dégradation
est élevé pour une salinité approximative de 20%.
24
Etude bibliographique
Partie I
JANNASH et al, (1971) ont montré que dans les zones benthiques profondes, la
dégradation du pétrole par les microorganismes est extrêmement réduite.
BERTRAND et al, (1993) ont étudié l’influence de la concentration en chlorure de
sodium sur la biodégradation des hydrocarbures par deux communautés microbiennes, ils ont
trouvé que la biodégradation est maximale pour une concentration de 0,4 M et diminue
lentement pour des valeurs supérieures et inférieures à celle-ci.
L’effet de la concentration en NaCl sur la biodégradation dépend de la nature du
substrat utilisé comme source de carbone (BERTRAND et al., 1993); FERNANDEZ et al.
(1996) ont montré que la souche Marinobacter hydrocarbonoclasticus, bactérie marine
halotolérante dégrade l’eicosane, avec un taux de biodégradation de 90% pour des
concentrations en chlorure de sodium comprises entre 0,2 et 2,5 M.
Il semblerait que la salinité n‘ait que peu d‘impact sur la dégradation des
hydrocarbures. Le métabolisme de ces molécules est compatible avec des salinités très faibles
(eaux douces) ou plus élevées (eau de mer) puisqu‘il concerne, dans ces deux types de
milieux, des microorganismes adaptés à ces salinités. Seules de très fortes salinités comme
celles des marais salants seraient un frein à la dégradation en raison du manque d‘oxygène
régnant dans ces zones (WARD et al. 1978).
25
Partie II
Matériel et méthodes
Partie II
Matériel et méthodes
L’objectif de ce chapitre est de présenter tout d’abord les matériaux et les dispositifs
expérimentaux utilisés dans ce travail. Par la suite, les différentes méthodes d’analyses
physico-chimiques employées pour suivre l’évolution du traitement et quantifier la production
des biosurfactants. L’étude l’effet de la salinité sur l’émulsification des substrats hydrophobes
par les biosurfactants produits et sur leur tension superficielle.
La partie expérimentale de notre étude a été réalisée au niveau du Laboratoire
pédagogiques de la Faculté SNV/STU de l’Université de Ouargla.
I- Situation de la région d’étude : (OUARGLA)
‫ورقلة‬
ouargla
Figure 08 : Localisation des sites d’étude (google maps 2011).
26
Partie II
Matériel et méthodes
II. Matériel et méthodes
II. 1 Matériel
II. 1. 1 Matériel biologique
Pour la réalisation de nos expérimentations, nous avons utilisé des souches
bactériennes isolés à partir des sols contaminés par les hydrocarbures :
a. Origine des souches bactériennes utilisées
18 souches bactériennes ont été isolées à partir d’un sol contaminés par les
hydrocarbures parmi les quelles nous avons sélectionnées 3 souches bactériennes productrices
de biosurfactants pour effectuer notre expérimentation qui sont notées souche 70, 75 et 81.
b. Milieux et conditions de culture
Le choix d’un milieu de culture dépend des espèces à cultiver et l’objectif de l’étude à
réaliser, pour cela nous avons utilisé des milieux de cultures spécifiques : PPGAS, Kay et
GNO dont les compositions sont données dans l’Annexe II.
Le pH est ajusté par une solution d’HCl 10 M et autoclaver à 120°c pendant 15 min.
II. 2 Méthodologie de travail
II. 2. 1 Etude microbiologique
II. 2. 1. 1 Repiquage des souches isolées
Un échantillon de chaque type de colonie est prélevé et ensuite purifié par repiquages
successifs selon la méthode de stries pour obtenir des colonies bien distinctes (DELARRAS,
2008).
Cette opération consiste à prendre une colonie bien isolée et la déposer dans un boite
de Pétri contient gélose nutritive ordinaire. Ensuite les boites sont incubées pendant 24 heures
à 37°c.
II. 2. 1. 2 Conservation des souches bactériennes
Après l’apparition des colonies sur les milieux solides(GN), nous avons conservées les
souches à 4 °C.
II. 2. 2 La production des biosurfactants par les souches sélectionnées
II. 2. 2. 1 Pré-culture :
27
Partie II
Matériel et méthodes
Prélever une colonie à partir d’un milieu gélosé et la mettre dans un tube à essai
contenant 3,5 ml du milieu Kay. Incubation à 30°C pendant 24h sous agitation rotative (180
tour /min).
Gherbal. A (2014)
Photo 01 : Pré-culture du trois souches sélectionnées.
II. 2. 2. 2 Les cultures
La méthodologie utilisée pour évaluer la production de biosurfactant consiste à
réalisée des incubations en milieu liquide (milieu PPGAS) en utilisant le glucose et le pétrole
brut comme source de carbone (à 2% du volume de milieu). (VANDECASTEELE et al,
2001).
Dans des Erlenmayer de 1000 ml contenant 350 ml de milieu PPGAS on les
ensemence par 1% de la pré-culture de chaque souche sélectionnée sur le milieu Kay.
L’incubation est effectuée à 30°C avec une agitation à 180 rpm pendant 4 jours (SIFOUR et
al., 2007).
Gherbal. A (2014)
Gherbal. A (2014)
Photo 02 : La production de biosurfactants par les trois souches sélectionnées en
présence du pétrole brut.
La production des biosurfactants par les souches sélectionnées est résumée dans la figure
suivante :
28
Partie II
Matériel et méthodes
Pré-culture
Chaque tube : 3.5
ml de milieu Kay
+ colonie (souche
70, 75 et 81)
Chaque tube : 3.5
ml de milieu Kay
+ colonie (souche
70, 75 et 81)
70
75
81
70
Chaque erlen :
350 ml de
milieu PPGAS
+ pétrole
75
81
Chaque erlen :
350 ml de
milieu PPGAS
Incubation à 30 °c, 180 rpm pendant
04 jours.
Figure 09 : La production des biosurfactants par les souches sélectionnées.
29
Partie II
Matériel et méthodes
II. 2. 2. 3 Suivi de la cinétique de croissance des souches sélectionnées
Le suivi de la croissance bactérienne est réalisé en mesurant la densité optique (DO)
au moyen d’un spectrophotomètre UV- visible à une longueur d’onde de 600 nm. Cette
mesure est considérée comme indicateur biologique direct de la biodégradabilité.
Pour la mesure de la densité optique, on se base sur la loi de Beer-Lambert :
A= log (I0 / I) = ε.l.C
A : densité optique.
I0 : intensité de la lumière incidente.
I : intensité de la lumière émergente.
ε: absorption molaire (absorption d’une solution c = 1 mole/l dans une cuvette de dimension
de l = 1 cm) [l / mole. cm].
C : concentration molaire [mole/l].
l : épaisseur de la cuvette [cm].
La loi de Beer- Lambert est valable seulement pour les solutions suffisamment diluées.
Dans ces conditions la courbe obtenue est une droite (la densité optique est proportionnelle au
nombre de molécules absorbantes.
Gherbal. A (2014)
Photo 03: Spectrophotométrie d’absorption atomique.
30
Partie II
Matériel et méthodes
II. 2. 3 Etude de l’effet de la salinité sur les propriétés tensioactives des biosurfactants
produits par les souches bactériennes sélectionnées en présence de pétrole brut
II. 2. 3. 1 L’index d’émulsion E24
a) Détermination de l’index d’émulsion et test de la salinité
L’index d’émulsion permet de vérifier la capacité des souches à émulsionner une
phase hydrophobe (le pétrole brut) dans une phase hydrophile (le milieu de culture).
L’objectif de cette opération est de voir l’effet du sel sur l’émulsification des substrats
hydrophobes par les biosurfactants produits.
Des différentes solutions de biosurfactants produits ont été préparées avec des
différentes concentrations en sel (Nacl), (0, 5, 10, 15, 20, 30 g/l).
Le test consiste à mélanger 3 ml du milieu de culture (de fermentation) avec 3 ml de
pétrole brute et le sel selon la concentration précise dans des tubes stériles. Les tubes sont
agités au vortex pendant 2min.
Après homogénéisation des deux phases, les tubes sont laissés au repos pendant 24
heures à température ambiante (BODOUR et al ., 2004).
b) Calcul de l’index de l’émulsion E24 :
Après 24 heures on mesure la hauteur de l’émulsion et on calcule l’E24 :
E24 = (he / ht) x 100
-
he : hauteur d’émulsion.
-
ht : hauteur totale.
Gherbal. A (2014)
Photo 04 : L’agitation par vortex des tubes à essai.
31
Partie III
Résultats et discussion
Partie III
Résultats et discussion
III. Résultats et discussion
III. 1. Résultats
III. 1. 1. Cinétique de croissance des souches bactériennes sélectionnées (S70, S75 et S81)
La cinétique de croissance des souches sélectionnées sur milieu PPGAS additionné de
2% de pétrole brut ou de glucose comme source de carbone, a été suivie en mesurant la
concentration microbienne en fonction du temps ; ce qui nous a permis de tracer les courbes
représentées par les figures 10, 11 et 12.
Les biomasses bactériennes contenues dans les milieux d’incubation des trois souches
sont variables. En effet, la lecture des DO de ces milieux révèle que certaines souches
présentent une biomasse élevée alors que d’autres ne sont que faiblement représentées
(figures 10, 11 et 12).
III. 1. 1. 1. Cinétique de croissance de S70
Pour la souche bactérienne étudiée (S70), nous pouvons observer dans la figure 10 que
les deux courbes (pétrole brut et glucose) sont similaires, on remarque donc une augmentation
dés T0 de la croissance jusqu'à 7 heures justifie par une phase de latence courte. Ce résultat
démontre une adaptation plus ou moins rapide de cette souche à la source de carbone utilisé
(le pétrole brut et le glucose). Au-delà, on observe une augmentation exprimée par une phase
de croissance exponentielle entre 7 et 24 heures, phase durant laquelle la dissolution du
substrat (pétrole) suffit aux besoins métaboliques. Au-delà de 24 heures, la concentration
microbienne augmente légèrement. Cette augmentation ralentie correspond à la phase
stationnaire observée à partir 24 h jusqu’à 94 h.
En présence du glucose, on remarque une augmentation importante de la concentration
bactérienne exprimée par l’augmentation de la densité optique ayant atteint la valeur de 8,35
après 24 heures. Cette DO atteint son maximum à la fin de l’incubation pour une valeur de
8,67 (figure 10).
En présence du pétrole brut, une forte augmentation de la concentration bactérienne
dont les valeurs de la DO atteingent 8,41 au bout de 24 heures, ce qui explique une courte
phase de latence suivie d’une phase exponentielle. Cependant, on remarque une augmentation
lente presque stable de la biomasse bactérienne ente 27 et 94 heures. Ceci correspond à la
phase stationnaire (figure 10).
32
Partie III
Résultats et discussion
III. 1. 1. 2. Cinétique de croissance de S75
La figure 11 fait ressortir l’évolution de la biomasse bactérienne de la souche S75 en
présence du pétrole brut ou de glucose.
En présence de glucose, la biomasse bactérienne connait une augmentation importante
exprimée par la valeur importante de la DO, 7,18 atteintes au bout de 9 heures. Ces valeurs
de DO continuent d’augmenter pour atteindre une valeur maximale de 9,23 au bout de 94
heures (figure 11).
En présence de pétrole brut, la biomasse bactérienne de cette souche augmente
rapidement entre T0 et T12. La DO relevée à T12 étant de 7,64. Au-delà, une légère
augmentation de la DO est enregistrée pour atteindre 8,45 à T30, et une légère diminution est
constatée vers la fin de l’expérimentation (8,37) (figure 11).
III. 1. 1. 3. Cinétique de croissance de S81
La variation de la biomasse bactérienne de la souche 81 en culture additionné de
pétrole brut ou de glucose est présentée dans la figure 12.
D’après les résultats obtenus, on remarque une similarité de la croissance bactérienne
pour la souche qui est cultivée dans les deux cultures additionnées de pétrole brut ou du
glucose comme source de carbone pendant le temps d’incubation.
En présence de glucose, les valeurs de la DO démontent une forte augmentation de la
biomasse. Sa valeur étant de 8,36 au bout de 24 heures. Cette DO continue d’augmenté pour
atteindre une valeur de 8,90 vers la fin de l’expérimentation (figure 12).
En présence de pétrole brut, on observe une augmentation importante de la DO
pendant les première 24 heures qui atteint 8.23. Au-delà, une légère augmentation presque
stable ente T27 et T94 qui atteint 8,27 et 8,57 respectivement (figure 12).
Il apparait d’après la figure 13 que la croissance des 03 souches sélectionnées est
similaire en présence des deux substrats utilisés. Ces souches présentent une légère différence
de croissance en présence de glucose où les DO sont légères représente pour S75 (9.23) contre
le pétrole (8.37) et S81(8,90) en présence du glucose contre (8,57) en présence de pétrole.
33
Partie III
Résultats et discussion
III. 1. 2. Index d’émulsification (E24) et test de la salinité (NaCl)
A fin de confirmer et d’estimer la production des biosurfactants par les souches
bactériennes étudiées, nous avons réalisé le test d’émulsification (E24) par l’homogénéisation
de 3 ml de mout de fermentation avec 3 ml de pétrole.
Le résultat obtenu (Photo 05) démontre une production de biosurfactant par les
souches bactériennes (S70, S75 et S81) en présence de pétrole brut avec un index
d’émulsification variable.
La couche
Émulsifiante
Gherbal. A (2014)
Gherbal. A (2014)
Photo 05: Index d’émulsion E24 des souches étudiées en présence du pétrole comme
substrat d’émulsification.
III. 1. 2. 1. Evaluation du pouvoir émulsifiant des souches étudiées (S70, S75 et S81) en
présence du pétrole
Les résultats obtenus dans cette étude sont représentés sous forme d’histogrammes
dans les figures 14, 15, 16, 17,18 et 19. L’évaluation de l’index d’émulsion est suivie en
présence de différentes concentrations de NaCl dans le milieu d’incubation.
III. 1. 2. 1. 1. Pouvoir émulsifiant de biosurfactant produit par la souche 70
L’activité émulsifiante de biosurfactant produit par S70 en présence de glucose
connait des variations provoquées par le NaCl. En effet, le E24 initialement faible 6,56% en
absence du sel atteint en présence de 15 g/l de NaCl la valeur de 46,23% et diminue pour
atteindre les valeurs de 4,33% en présence de 20 g/l de NaCl. La valeur du E24 relève en
présence de 30 g/l de NaCl (6,42%) reste inferieur à celle relevé en absence du sel (Figure
14).
34
Partie III
Résultats et discussion
En présence de pétrole brut, on observe des variations dans les valeurs de l’index
d’émulsion comparable à celle obtenue en présence du glucose. Le pouvoir émulsifient atteint
une valeur de 15,20% en présence de 20 g/l de NaCl. Au-delà, de cette concentration 30 g/l la
diminution du E24 est enregistrée de 4,30% (figure 15).
Il est constaté une différence de la réponse de S70 au traitement salin en fonction
da la source carbonée disponible (glucose ou pétrole). En effet, le pouvoir émulsifiant de
S70 atteint son maximum en présence de 15g/ l de sel dans le milieu enrichi de glucose
alors qu’en présence de pétrole, le E24 maximal est enregistré lorsque le milieu
d’incubation est additionné de 20 g/l de NaCl. Cependant, les valeurs de E24 de la S70
en présence du glucose et de 15 g/l de NaCl sont prés de quatre fois plus élevées qu’en
présence de pétrole et de 20g/l de NaCl.
III. 1. 2. 1. 2. Pouvoir émulsifiant de biosurfactant produit par la souche 75
En présence de glucose, on observe que le biosurfactant de la souche bactérienne 75
enregistre un meilleur index d’émulsion pour une valeur de 35.56 % en présence de 15 g/l de
sel. Au-delà, une faible diminution en présence de 20g/l du NaCl est enregistrée (34,44%). La
forte salinité (30g/l) entraine un déclin important conduisant de pouvoir émulsifiant qui atteint
une valeur de 2.15% (figure 16).
En présence de pétrole, l’activité émulsifiante de S75 connait une augmentation
importante proportionnelle à la concentration de NaCl dans le milieu. Sa valeur maximale est
de 31,27% en présence de 20g/l de sel. Cependant, cette valeur diminuée considérablement
(8,88%) lorsque le milieu contient 30 g/l de NaCl. (figure 17).
La souche bactérienne 75 présente un index d’émulsion E24 comparable
lorsqu’elle est en présence du glucose et de sel ou de pétrole et de sel, exception faite en
présence de 30 g/l de NaCl où cet index est trois fois plus important en présence de
pétrole qu’en présence de glucose.
35
Partie III
Résultats et discussion
III. 1. 2. 1. 3. Pouvoir émulsifiant de biosurfactant produit par la souche 81.
L’activité émulsifiante de surfactant de S81 en présence de glucose connait des
variations provoquées par le NaCl. En effet, le E24 initialement de 13,05% en absence du sel
atteint un maximum de 34,45% en présence de 15 g/l de NaCl. Au-delà, un pouvoir
émulsifiant est constaté sa valeur est de 7,63% en présence de 30 g/l de sel (figure 18).
D’après la figure 19, on constate que l’index émulsifiant de tensioactif produit par la
souche microbienne S81 est proportion à la concentration de NaCl dans le milieu d’incubation
en présence du pétrole. Sa valeur maximale est 43.97 % en présence de 20g/l. Au-delà, une
diminution de l’activité émulsifiante est notée en 30 g/l de NaCl (8,88%) (Figure 19).
Il est constaté une différence de la réponse de S81 au traitement salin en fonction
da la source carbonée disponible (glucose ou pétrole). En effet, le pouvoir émulsifiant de
S81 atteint son maximum en présence de 20g/ l de sel dans le milieu enrichi de pétrole
alors qu’en présence de glucose le E24 maximal est enregistré lorsque le milieu
d’incubation est additionné de 15 g/l de NaCl.
On constate donc que la souche microbienne S81 possède un plus grand pouvoir
émulsifiant en présence de pétrole qu’en présence du glucose.
36
Partie III
Résultats et discussion
Il ressort de la figure 20 que le pouvoir émulsifiant des trois souches soumises à 20
g/l de NaCl varie considérablement en fonction de la source de carbone disponible. En effet,
une meilleure activité émulsifiante de biosurfactant produit par la souche 70 est révélée en
présence de pétrole (15,20%). Le biosurfactant de S75 semble indifférente à la source de
carbone. Son pouvoir émulsifiant est comparable en présence de glucose (34,44%) ou de
pétrole (31,27%), alors que la S81 semble préférer le pétrole où elle développe une forte
activité émulsifiante (43,97%).
37
Partie III
Résultats et discussion
III. 2. Discussion
La production de biosurfactants est un phénomène communément observé lors de la
croissance d’un microorganisme sur des substrats insolubles dans l’eau ainsi que la formation
d’une émulsion stable indiquent une production efficiente. Les bactéries synthétisent les
biosurfactants qui sont soit des molécules intracellulaires, extracellulaires ou localisées à la
surface de la cellule pour faciliter la diffusion des hydrocarbures ou leurs dérivés à l’intérieur
de la cellule bactérienne afin de les dégrader (PRUTHI et al, 1995 ; KREPSKY et al, 2007).
L’utilisation du glucose comme source de carbone, permet d’obtenir un rendement
plus élevé en biosurfactants. D’une part, les bactéries acidifient le milieu en consommant le
glucose, ce qui rend le pH favorable à la production d’autre part la biomasse bactérienne sera
importante pour assumer la dégradation. (SAMADI et coll., 2007 ; KREPSKY et coll., 2007),
Les variations des densités optiques constatées dans les milieux de culture des trois
souches bactériennes étudiées (S70, 75 et 81) peuvent être dues à la distribution différente de
ces bactéries entre les deux phases de notre culture, ou par leur vitesse d’adaptation au
substrat utilisé Pétrole ou glucose (AKMOUCI-TOUMI, 2009).
Il est à noter qu’il existe une relation entre l’augmentation de la biomasse, la
production de biosurfactant, l’index d’émulsion et la salinité par notre souches ceci peut être
expliqué par la phase prolongée de la croissance microbienne (DAS et al., 2009). Ce qui
confirme que la production de biosurfactant s’effectue pendant la phase exponentielle de
croissance, et qui suggère qu’il est produit comme métabolite primaire (AMIRIYAN et al.,
2004). La croissance bactérienne associée à la production de biosurfactant pourrait faciliter
l’adhérence des cellules bactériennes aux molécules de substrats hydrophobes et les
métaboliser (BARATHI et VASUDEVAN, 2001).
Selon ATLAS, (2011), plus les produits pétroliers sont légers, plus leur diffusion est
rapide et plus vite seront biodisponibles.
Les phases de latence démontre une adaptation plus au moins rapide des souches
étudiées à la source de carbone utilisée (le pétrole brut et glucose). Par ailleurs,
l’augmentation de la biomasse microbienne correspondrait à la phase exponentielle, phase
durant laquelle la dissolution du substrat (pétrole brut ou glucose) suffit aux besoins
métaboliques des souches. Ainsi, la stabilisation de la concentration microbienne au-delà de
24 heures pour les deux souches (70 et 81) et T9 h pour la souche 75 montre que le niveau des
38
Partie III
Résultats et discussion
exigences nutritionnelles surpassent la vitesse de dissolution du substrat, la biodisponibilité
deviendra alors limitante, c’est donc la phase stationnaire (ROCHA et al., 2007). D’après
CALVO et al. (2004), cette croissance pourrait être expliquée par la présence de Substances
comme les biosurfactants qui faciliteraient l’assimilation des hydrocarbures (pétrole brut).
D’après, HOMMEL, (1994); GOSWANI et SINGH, (1991); HUSAIN et al., (1997),
in SOLTANI, (2004) et (LAITH et al., 2007), certaines bactéries peuvent interagir avec les
hydrocarbures dissous dans la phase aqueuse par les facteurs de solubilisation extracellulaires,
d’autres peuvent mettre en jeu des stratégies comme l’excrétion des vésicules extracellulaires,
la production de biosurfactants ou une augmentation de l’hydrophobicité de la paroi externe
de la bactérie, ce qui permet à cette dernière d’introduire facilement les hydrocarbures au
niveau de la cellule.
Selon DESCHENE (1995), Parmi les propriétés des surfactants biologiques peuvent
donc augmenter la solubilité apparente des composés hydrophobes, ce qui explique
l’augmentation de l’index d’émulsification (E24) obtenue lors de notre expérimentation. La
différence d’indice (E24) qui existe entre les trois souches avec les différents substrats
s’expliquerait par le fait que la diversité des bio-émulsifiants entre nos souches qui ont la
capacité d’émulsionner le pétrole brut (RAZA et al., 2007).
La capacité d’émulsion a été déterminée en fonction de différentes concentrations de
NaCl. On a observé que l’index d’émulsion augmente dés les faible la concentration de NaCl
jusqu'à la concentration 20g/l de sel en présence du pétrole et 15 g/l en présence du glucose.
D’autre part on remarque la diminution de l’index d’émulsion en présence la
concentration 30 g/l, ces résultats peuvent être expliqués par l’effet du NaCl qui engendre
une diminution de la solubilité des hydrocarbures ce qu’est conforme que l'ajout de NaCl
conduit à une augmentation du diamètre des gouttelettes d'huile lors de la formation de
l‘émulsion. Des écrits sur certains biosurfactants produits par des bactéries mentionnent une
stabilité de c’est dernier en présence de haute concentration en sel (OBAYORI et al. ,2009;
SARUBBO et al., 2007).
Il ya des rapports que la présence de sels provoque des perturbations des émulsions
d’huile-eau, affectant ainsi la tension de surface et la capacité d'émulsification de tensioactifs
(JUNG et al., 1995).
Cela indique également que les biosurfactants produits par les souches sélectionnées
sont efficaces dans en présence d'ions monovalents (Na+) qui expliquerait par la formation
39
Partie III
Résultats et discussion
d'une monocouche très condensée, provoquée par le fait que la charge négative est protégée
par (Na+) dans la double couche électrique en présence de NaCl, bien que la concentration 20
et 30 g/l de sel est souvent suffisante pour désactiver les tensioactifs chimiques (ABURUWAIDA et al., 1991; BANAT , 1995). Cette tolérance de la force ionique spécial propose
les biosurfactants plus adéquats pour des applications liées au pétrole, dont la plupart sont en
conditions très salines (SHAVANDI et al., 2011).
Il existe peu de rapports dans le littérature qui indique que la solution dans le sol salin,
par rapport aux sols non salins, la dégradation total du parathion et le pétrole brut a été réduite
(REDDY et SETHUNATHAN, 1985; MINAI - TEHRANI et al., 2009).
40
Conclusion
Conclusion
Conclusion
L’objectif fixé par notre travail est de mettre en évidence le pouvoir émulsifiant de
trois souches bactériennes telluriques codées 70, 75 et 81 isolées à partir des soles contaminés
ou non par les hydrocarbures en présence de deux substrats, le glucose et le pétrole et de
rechercher la stabilité des biosurfactant produits dans des conditions salines.
Il ressort des résultats obtenus qu’en présence de deux sources de carbone utilisées
(glucose et pétrole) les bactéries expriment une cinétique de croissance variable au cours du
temps.
Le pouvoir émulsifiant des trois souches en absence de sel varie considérablement en
fonction de la source de carbone disponible (pétrole brut ou glucose).
La production de biosurfactant s’est révélée positive pour les trois souches
bactériennes étudiées (S70, S75 et S81). Un pouvoir émulsifiant maximal de 46,23% pour le
biosurfactant produit par S70 en présence de 15g/ l de sel dans le milieu enrichi de glucose est
enregistré alors qu’en présence de pétrole, l’index d’émulsion maximal de 15,20% est
enregistré lorsque le milieu d’incubation est additionné de 20 g/l de NaCl.
Le surfactant produit par la souche bactérienne 75 présente un index d’émulsion E24
comparable lorsqu’elle est en présence du glucose 35,56% à 15 g/l de sel ou en présence de
pétrole 31,27% à 20 g/l de sel , exception faite en présence de 30 g/l de NaCl où cet index est
trois fois plus important en présence de pétrole qu’en présence de glucose.
Il est constaté une différence de la réponse de S81 au traitement salin en fonction da la
source carbonée disponible (glucose ou pétrole). En effet, le pouvoir émulsifiant maximal de
la tensioactif produit par S81 est de 43,97% en présence de 20g/ l de sel dans le milieu
enrichi de pétrole alors qu’en présence de glucose le E24 maximal de 34,44% est enregistré
lorsque le milieu d’incubation est additionné de 15 g/l de NaCl. On peut donc conclure que la
souche microbienne S81 possède un plus grand pouvoir émulsifiant en présence de pétrole
qu’en présence du glucose.
La variabilité dans le pouvoir émulsifiant montre que les souches que nous avons
étudiées présentent un intérêt industriel certain et important grâce à leur production de ces
composés à activité émulsifiante en présence de concentrations en sel non négligeables.
A la lumière des résultats obtenus, il est souhaitable de compléter cette étude par des
approches plus approfondies à savoir :
41
Conclusion
 L’optimisation des paramètres de production du biosurfactant par l’essai d’autres
substrats et d’autres fractions pétrolières ;
 identification moléculaire des souches présentant de grande activité émulsifiante ;
 recherche de nouvelle souche à pouvoir biodégradant et émulsifiant.
 essai d’étudiée l’influence des conditions environnementaux (PH, température, …etc.)
sur la production des biosurfactants.
 Ainsi, il existe un besoin pour des études approfondies dans le but d'évaluer l'efficacité
des processus de bioremédiation des sites pollués par les hydrocarbures ayant
différents niveaux de salinité.
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54
Annexes
Annexes
Annexe I : Matériel et équipements
Les matériaux du labo comptent les équipements, appareillages, verreries, matériel en
plastique, solutions, réactifs et des milieux de cultures qui figurent dans le tableau ci-après :
Tableau IV: les matériaux et les équipements utilisés dans ce travail
Appareillage et
Verreries et matériels
Solutions et réactifs
équipements
Milieux de
cultures
*Agitateur
*Boite de pétri en
 NH4CL
*Gélose nutritive
magnétique
plastique
 KcL
ordinaire (GNO)
*Autoclave
*Erlen Meyer
 Tri-HcL
*KAY
*Bain marie
*Fioles
 Glucose
*PPGAS.
*Balance
*Pipettes graduées
 Protease peptone
*Bec bunsen
*Pipettes pasteur
 MgSO4
*Centrifugeuse
*Tubes à essais
 Eau distillée
*Etuve
*Des flacons
 NH4 H2 PO4
*Incubateur à
*Coton cardé
 K2 H PO4
agitation
*Papier aluminium
 FeSO4
*Vortex
*Cuvettes de
 Hcl
*PH mètre
spectrophotomètre.
 NaCl
*Spectrophotomètre *Bêcher.
 Gélose nutritive
d’absorption
 Pétrole.
atomique
*Four pasteur.
55
Annexes
Annexe II: Composition chimique des milieux de cultures
1- Milieu gélose nutritive ordinaire (GNO)
La gélose nutritive est un milieu non sélectif qui permet systématiquement la poussée
de toutes les bactéries peu exigeantes à 37°C en aérobiose .Elle a été utilisée pour l’isolement
des différentes colonies, définie lors du repérage (à partir des boites utilisées pour le
dénombrement), (JOFFIN et LEYRAL, 2006), elle est composée de :
Gélose nutritive ordinaire (GNO)
Ingrédients
Quantité
L’extrait de viande
1, 0 gr
L’extrait de levure
2, 5 gr
Peptone
5 ,0 gr
Chlorure de sodium
5, 0 gr
L’agar
15, 0 gr
Eau distillée
1 litre
Remarque : Le pH est ajusté à une valeur de 7,4 par une solution d’HCl 10 M et autoclaver à
120°c pendant 15 min.
Photo 06 : préparation de milieu de culture.
56
Annexes
2- Milieu Kay : pour pré-enrichissement.
Milieu Kay
Ingrédients
Quantité
NH4 H2 PO4
3g/l
K2 H PO4
2g/l
Glucose
2g/l
FeSO4.7H2O
0,0005g/l
MgSO4.7H2O
1g/l
Eau distillée
1 litre
Remarque : Autoclaver à 120°c pendant 15 min.
3- Milieu PPGAS: pour production des biosurfactants
Milieu PPGAS
Ingrédients
Quantité
NH4cL
1 g/l
KcL
1, 5 g/l
Tri-HcL
19 g/l
Glucose
5 g/l
Protéase peptone
10 g/l
Mg SO4
0, 2 g/l
Eau distillée
1 litre
Remarque : Le pH est ajusté à une valeur de 7,2 par une solution d’HCl 10 M et autoclaver à
120°c pendant 15 min.
57
Effets de la salinité sur la stabilité des biosurfactants produits par des souches bactériennes telluriques
en présence de pétrole brut
Résumé :
L’objectif de notre étude est de rechercher l’effet de la salinité sur la production et la stabilité de
biosurfactants produits par des souches bactériennes telluriques hydrocarbonoclastes en présence de deux
substrats carbonés (le glucose ou le pétrole).
Dans la majorité des biosurfactants produits l’index d’émulsion augment en présence du pétrole et de
concentrations croissantes de NaCl allant jusqu’à 20 g/l et à 15 g/l en présence du glucose. Au-delà de cette
concentration cet index diminue considérablement.
Un pouvoir émulsifiant maximal de 46,23% est enregistré pour le biosurfactant produit par S70 en
présence de glucose et de 15g/ l de sel. Cet index atteint sa valeur maximale de 15.20% en présence de pétrole
et de 20 g/l de NaCl. Le biosurfactant de la souche bactérienne 75 présente un index d’émulsion de 35,56% en
présence de glucose et de 15 g/l de sel et de 31,27% en présence de pétrole et de 20 g/l de sel. La meilleure
souche productrice de biosurfactant est la souche 81 qui a pu produire en présence de pétrole brut et de 20 g/l
de sel un surfactant ayant un index d’émulsion de 43.97 %, alors qu’en présence de glucose et de 15 g/l de
NaCl, le E24 maximal enregistré est de 34,44%.
Mots clés: la salinité, propriété émulsifiante, biosurfactants, pétrole brut, bactéries telluriques.
‫آثبر الملىحة على استقرار جزيئبت السطح التي تنتجهب السالالت البكتيرية األرضية في وجىد النفط الخبم‬
‫الملخص‬
‫ في ظم‬hydrocarbonoclastes ‫ انتي تُتجهب انسالالد انجكتيشيخ األسضيخ‬biosurfactants ‫انهذف يٍ دساستُب انتذقيق في تأثيش انًهىدخ عهى إَتبج و استقشاس‬
‫ يؤشش انًستذهت يضيذ ثذضىس انُفط و تشكيض كهىسيذ‬biosurfactants ‫ في انغبنجيخ انعظًى يٍ يُتجبد‬.) ‫انخبو‬
‫وجىد اثُيٍ يٍ سكبئض انكشثىٌ ( انجهىكىص أو انجتشول‬
.‫ و هزا انتشكيض يقهم انًؤشش إنى دذ كجيش‬.‫ نتشفي وجىد انجهىكىص‬/ ‫غشاو‬15 ‫ نتشو‬/ ‫غشاو‬20 ‫انصىديىو تصم إنى‬
‫ ثهغ هزا‬.‫نتش يٍ انًهخ‬/‫ غشاو‬15 ‫ في وجىد انجهىكىص و‬70 ‫ انتي تُتجهب انسالنخ‬biosurfactant ‫ يتى تسجيههب ل‬٪46,23 ‫تصم قىح االستذالة ثذذهب األقصى إنى‬
‫ و رنك‬35.56% ‫ نذيهب يؤشش االستذالة‬75 ‫ يٍ انسالنخ انجكتيشيخ‬biosurfactant, ‫ نتش‬/ ‫غشاو‬20 ‫ ثىجىد انُفط و كهىسيذ انصىديىو‬٪15.20 ‫انًؤشش قيًخ انذذ األقصى ثـ‬
‫ و انسالنخ األفضم إَتبجب ل‬biosurfactant ‫ يعظى انسالالد تقىو ثئَتبج‬. ‫ نتشيٍ انًهخ‬/ ‫غشاو‬20 ‫ في وجىد انُفط و‬٪31.27 ‫ نتشيٍ انًهخ و‬/ ‫غشاو‬15 ‫ثىجىد انجهىكىص و‬
‫ في ديٍ أَه في وجىد‬، %43,97 ‫ نتش يٍ انًهخ يع يؤشش يستذهت يصم إنى‬/ ‫غشاو‬20 ‫ وانتي يًكٍ أٌ تُتج في وجىد انُفط انخبو و‬، 81 ‫ هي انسالنخ‬biosurfactant
.٪34.44 ‫ ثـ‬E24 ‫ يتى تسجيم انذذ األقصى ل‬،‫ نتش كهىسيذ انصىديىو‬/ ‫غشاو‬15 ‫انجهىكىص و‬
. ‫ ثكتيشيب انتشثخ‬,‫ انجتشول انخبو‬,‫ جضيئبد انسطخ‬,‫ انخبصيخ انخهطيخ‬,‫ انًهىدخ‬: ‫الكلمبت الذالة‬
Effects of salinity on the stability of biosurfactants produced by telluric bacterial strains in the presence
of crude oil
Abstract:
Objective of our study was to investigate the effect of salinity on the production and stability of
biosurfactants produced by bacterial strains hydrocarbonoclastes ground in the presence of two carbon
substrates (glucose o roil). In the vast majority of products biosurfactants index higher than the emulsion in the
presence of oil and sodium chloride concentration sup to 20g / l and 15g / l in the presence of glucose. This
reduces the concentration to a large extent to the index
Emulsifiers by limiting the power of up to 46,23% maximum are recorded biosurfactant produced by
the S70 in the presence of glucose and 15 g /liter of salt. This indicator reached a maximum value of 15.20%
to the existence of oil and sodium chloride20g / l, biosurfactant from 75 bacterial strains has emulsion index
35.56%, and the presence of glucose and 15g / l of salt and 31.27% oil and 20g / l of salt.
Most of the strains produce biosurfactant strains 81, which can occur in the presence of crude oil and
20g / l of salt to the surface, with the index emulsion up to 43,97%, whereas in the presence of glucose and
15g / l sodium chloride, is recorded to reduce maximum of 34.44% in E24.
Key words: salinity, emulsifying property, biosurfactants, crude oil, soil bacteria..