cultivation on embrionated eggs of some eimerial species from

Buletin USAMV-CN, 63/2006 (234-240)
ISSN 1454-2382
CULTIVATION ON EMBRIONATED EGGS OF SOME EIMERIAL
SPECIES FROM SHEEP
LA CULTURE DE QUELQUES ESPECES COCCIDIENNES DES
MOUTONS SUR DES OEUFS EMBRYONES
Cozma V.*, D. Turcu**, E. Şuteu*
*University of Agricultural Science and Veterinary Medicine, Faculty of Veterinary Medicine,3-5,
Mănăştur street, 3400, Cluj-Napoca, Romania
** INMV "Pasteur" Bucarest
Abstract: Experimentation regarding the inocuity of the suspension of lamb eimerial oocysts
multispecific, ultrasonated, on hen embryo led to the following: At microscopical controls made at 4 and 8 days
after inoculation there was found the presence of young eimerial trofozoits and schizonts in 20% from embryos
inoculated in conoalantoid and alantoid cavities. Embryos inoculated in amniotic cavity, vitelin bag and the
witness were negative. In histological sections there were identified: residual eimerial oocysts, non-viable and/or
viable with the sporozoïtes hypertrofiated and with clear structure and hypercromatic content; trofozoites and
even schizonts with diameters between 20-40 um, with granular structure and thin membrane. Through electron
microscopy trofozoites existence was confirmed on large beaches in the mass of corioalantoid cells or in the
stage of degeneration and also of schizonts in the moment of nuclear differentiation. Our experiments confirm
the possibility of maintenance and cultivation, up to young schizont stage and then forms regress, of eimeriosis
from Iamb on hen embryo inoculated at 10 days in alantoid and corioalantoid cavities and incubated at 41°C.
INTRODUCTION
La possibilité de cultiver des coccidies sur des embryons de poulet présente des
perspectives d’intérêt important pour: l’étude de la biologie du parasite, la connaissance des
modifications induites dans d’autres tissus que du trajet digestif chez les animaux receptifs,
l’observation de l’action des nouveaux coccidiostatiques contre les formes évolutives
coccidienne dans le but de la préparation des antigènes nécessaires dans les réactions
sérologiques, dans le cadre des actions d’immunoprophylaxie ou pour l’atténuation de la
virulence des souches pathogènes (2, 7).
Les coccidies sont cultivables in vitro sur des embryons de poulets dans la couveuse et
dans des cultures de cellules, auxquels l’inoculation de sporozoïtes a été effectuée. La culture
sur des embryons de poulets a été réalisée chez la quasitotalité des espèces coccidiennes des
poulets, avec des résultats differents en fonction de: l’espèce du parasite, la dose de
sporozoïtes, la souche coccidienne et la temperature. En ce qui concerne le passage des
espèces coccidiennes hétérologues sur des embryons d’oiseau (les coccidies des poulets sur
les embryons de dinde), on connait que si une diminution de la pathogenité des parasites se
produit, une reduction de leur pouvoir immunogène a lieu aussi (4).
Dans nos expérimentations on s’est proposé de vérifier l’efficacité des modalités
d’inoculation des sporozoïtes coccidiens de l’agneau sur des oeufs embryonés, d’une part, et
le test des possibilités d’entretien et cultivation de quelques stades d’évolution coccidiens de
l’agneau sur les embryons de poulets, d’autre part.
MATÉRIELS ET MÉTHODES
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Les expérimentations ont été effectués dans des conditions de laboratoire, à la
discipline de Maladies parasitaires de la Faculté de Médecine Vétérinaire de Cluj-Napoca et
dans le Laboratoire de Microscopie Electronique de l’Institut National de Médecine
Vétérinaire "Pasteur", Bucarest.
A. La préparation de l’inoculum d’oocystes d’Eimeria spp. provenant de l’agneau
Détermination de la structure coccidienne spécifique de l’inoculum.
Centrifugation de la suspension d’oocystes coccidiens à 1200 tours/minute dans la
centrifuge Janetszky, K23.
Reprise du sédiment dans PBS (tampon phosphate salin), avec pH 7,2.
Centrifugation sur sucrose 45%, dans un rotor basculant SW ("swing-out") dans 4
coupes x 100 ml, dans la centrifuge K23.
Recueillir la bande brune, au niveau de la séparation de l’interface entre la phase
aqueuse et la sucrose 45%.
Dilution de la suspension avec PBS 1:1.
Centrifugation de la suspension coccidienne, en parts égales avec solution de
sacharose 45%, 20 minutes, à 2000 tours/minute, dans la centrifuge K23.
Reprise de la bande brune de l’interface („puf”) et contrôle microscopique.
Centrifugation de dépôt, à 2000 tours/minute, 15-20 minutes.
Reprise du sédiment dans 10 ml PBS.
Préparation de l’inoculum par ultrasonification, 2 minutes, à 26 KHz, dans
l’ultrasonicateur UZDNA (Ucraine).
Contrôle microscopique de l’inoculum et détermination des formes coccidiennes
existentes.
Complétement de la suspension avec PBS jusqu’à 9 ml et avec gentamicine 1%, en
rapport de 1:10 et maintien à 4°C.
B. Inoculation des oeufs embryonés avec suspension coccidienne ultrasonée
Les oeufs ont été mis dans la couveuse, à 38,5°C.
Quand l’embryon a eu 10 jours, on a effectué le mirage des oeufs, en notant avec le
crayon sur la coquille de l’oeuf la position de l’embryon et le niveau de la chambre d’air.
On a badigeonné le lieu d’inoculation avec tincture d’iode, ensuite on a effectué
l’inoculation de 0,3 ml suspension de sporozoïtes, en mélange avec 1000 ui péniciline G et
1000 µg streptomicine per ml, dans 0,2 ml eau distillée: 10 oeufs, dans la cavité
corioalantoidienne; 10 oeufs, dans la chambre alantoidienne; 5 oeufs, dans la cavité
amniotique; 5 oeufs, dans le sac vitelin; 10 oeufs témoins, non-inoculés.
Après l’inoculation les oeufs ont été mis dans la couveuse à 41°C.
A 4 jours après l’inoculation on a effectué le contrôle de 3 oeufs embryonés/group,
pour dépister les formes évolutives coccidiennes et on a recueillit: tous les liquides
alantoidiens, les dépôts de la cavité alantoidienne et la membrane corioalantoidienne (MCA)
et le contenu du sac vitelin. On a effectué des préparations natives de ces structures et on les a
vérifié au microscope. On a réalisé des préparations des échantillons positifs pour effectuer
des sections histologiques et électronomicroscopiques.
Le 8-ème jour après l’inoculation on a effectué le contrôle de toutes les oeufs restés,
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après le même protocole du 4-éme jour.
RÉSULTATS ET DISCUSSIONS
Le résultat de l’examen microscopique de l’inoculum avant l’ultrasonification a relevé
l’existence des espèces suivantes: E. ovinoidalis (40%), E. crandallis (30%), E. parva (10%),
E. faurei (10%), E. bakuensis (6%), E. pallida et E. ahsata (2%). À la suite de
l’ultrasonification le matériel obtenu a été representé par des oocystes détruits, sporocysts et
sporozoïtes libres et une petite quantité d’oocystes évolués, non-modifiés.
Après le contrôle effectué le 4-ème jour après l’inoculation on a observé des
formations coccidiennes chez un seul embryon sur trois, qui a fait parti du groupe inoculé
dans la cavité corioalantoidienne. L’embryon a présenté une congestion de la membrane
chorioalantoidienne, son adhérence à la coquille et des dépôts de urates. Dans les cellules
épithéliales on a dépisté, par l’examen direct, des formations multinucléées, bien délimitées
avec l’aspect de schizontes, avec des diamètres variables, de 15-40 µm. Les embryons témoin
et aussi ceux qui ont été inoculés sur une autre voie, n’ont pas présenté des éléments
morphologiques semblables.
A l’occasion du contrôle du 8-ème jour après l’infection on a identifié des trophozoïtes
coccidiennes chez deux embryons inoculés dans la chambre alantoide et un trophozoïte chez
un embryon inoculé dans la cavité corioalantoidienne, tous les autres étant négatifs.
Prenant en considération tous les deux contrôles, on a constaté que des formations
morphologiques coccidiennes ont été présentes chez deux embryons inoculés dans la cavité
corialantoidienne (20%) et chez deux embryons inoculés dans la cavité alantoidienne (20%).
Les embryons témoins et aussi ceux inoculés dans la cavité amniotique et le sac vitelin ont été
negatifs (Tableau 1).
Dans tous les cas, dans les dépôts blancs-jaunâtres au niveau des deux membranes on a
observé, parmi les cristals de urates et restes cellulaires, d’une part, des formations rondes ou
ovales avec une membrane double, avec le diamètre de 20-40 µm et un contenu granulaire qui
suggèrent un début de schizogonie et d’autre part, des structures falciformes, avec une
membrane, une citoplasme et un nucléus, de 3-4 µm/2 µm en longueur, avec une morphologie
semblable aux sporozoïtes ou aux mérozoïtes coccidiens.
Dans les sections histopathologiques on a identifié des oocystes coccidiens résiduels,
sur les membranes alantoidienne et corioalantoidienne. Quelques-uns sunt viables, ayant les
sporozoïtes hypertrophiés, avec une structure précise, non-altérée, avec une membrane tendue;
entre le contenu et la membrane sporozoïdale il y a un espace bien précisé et le contenu est
granulaire, hyperchromatique. Auprès de ça, on peut observer des oocystes non-viables,
ratatinates, avec un contenu homogène, hialin.
Dans d’autres zones, la membrane de l’oocyste se détériore par l’usage et les
sporozoïtes commençent à se distancer l’un de l’autre et la structure de trophozoïtes se dessine
(Figure l).
On a remarqué des formations avec le diamètre de 20-40 µm et un aspect de schizont
jeune, à cause de la structure granulaire et avec une membrane mince (Figure 2).
On a constaté par l’électronomicroscopie, parmi les nucléus de type lympho-monocitaire, des
formations des trophozoïtes bien distinguées, avec une citoplasme, dont l’intérieur il y avait
un nucléus, avec des granules de chromatine, disposées dans toute la masse, rangées (Figure
3).
Sur la membrane corioalantoidienne, dans la masse de cellules épitheliales necrosées
et dans différentes phases de dégénérescence de type granulo-vacuolaire on peut observer des
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grandes plages qui représentent des mérozoïtes/trophozoites dans différents stades de
développement dans une transformation dégénérative (Figure 4).
L’image de détail a surpris un trophozoïte coccidien, avec un aspect caractéristique, falciform,
avec la distinction de quelques infrastructures représentatives - "les corps paranucléaires"
(Figure 5).
Les images microscopiques ont été confirmées par electrono-microscopie. On a
observé aussi une grande formation schizogonique, qui a une zone en plein processus de
densification, en surprenant le processus de distinction multinucléaire et la formation du
schizonte jeune (Figure 6).
Nos expérimenttions confirment les résultats obtenus par Nakai et al. (1982-1987), en
ce qui concerne la cultivation d’E. tenella sur des embryons de poule (5, 6, 7). Bien que les
coccidies provenant de l’agneau sont hétérospécifiques par rapport à l’embryon de poule, elles
sont viables et même évoluent jusqu’au stade de schizont jeune. On cite un exemple
semblable, par la cultivation d’E. tenella sur des oeufs de dinde (11).
Les modalités d’inoculation les plus efficaces se sont avérées d’être dans les cavités
alantoide et choriolantoidienne, la dernière préférée pour E. tenella (5). La technique
d’inoculation est identique avec celle qui se prète aux virus, dans la production de vaccins, sur
des oeufs embryonés (11).
À la suite des contrôles effectués on observe le fait que la suspension oocystale produit
des nécroses dans les cavités alantoide et chorioalatoidienne de l’embryon de poule. Dans la
masse de substance nécrosée, avec des traces de cellules de l’épithelium allantoïde, certains
oocystes ont resté viables et les autres ont involué.
Les sporozoïtes inoculés ou sortis des oocystes ont souffert une tuméfaction et
croissance en volum et ont donné naissance à des formations trofozoidales, avec des processus
de multiplication, probablement au schizont et ensuite des processus dégénératifs.
Par électrono-microscopie, on a confirmé l’existence des formations trofozoidales et le début
d’un processus de division asexuée, avec la formation de schizontes jeunes, avec une structure
multinucléée. Les images obtenues par nous, sur la voie électrono-optique, sont semblables à
ceux obtenues par autres auteurs, par l’examen des formations schizo- et gamétogoniques des
diverses espèces coccidiennes chez les animaux (3, 8, 9, 10).
CONCLUSIONS
Les expérimentations concernant l’inocuité de la suspension d’oocystes coccidiens
multispécifiques provenant de l’agneau, ultrasonés, sur l’embryon de poule, ont conduit aux
conclusions suivantes:
À la suite des contrôles microscopiques effectués le 4-ème et le 8-ème jour après
l’inoculation on a constaté la présence de trofozoites et schizonts coccidiens jeunes chez 20%
des embryons inoculés dans les cavités corioalatoidienne et alantoide. Les embryons inoculés
dans la cavité amniotique, dans le sac vitelin et les témoins non-inoculés ont été négatifs.
Dans les sections histologiques on a identifié: des oocystes coccidiens résiduels, nonviables et/ou viables, avec des sporozoïtes hypertrophiés et avec une structure claire et
contenu hyperchromatique; trofozoites et même schizonts, avec des diamètres de 20-40 µm,
avec une structure granulaire et une membrane mince.
On a confirmé par l’électrono-microscopie l’existence des trofozoites, sur des grandes
plages, dans la masse de cellules chorioalantoidiennes nécrosées ou en phase de
dégénérescence et aussi des schizonts au moment de leur distinction nucléaire.
Nos expérimentions confirment la possibilité de l’entretien et la cultivation, jusqu’au
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stade de schizont jeune. Ensuite, les formations des coccidies provenant de l’agneau sur
l’embryon de poule, inoculé à l’âge de 10 jours dans les cavités alantoidienne et
chorialantoidienne et mis dans la couveuse à 41°C, régressent.
Tableau 1 Les formes schizogoniques coccidiennes provenant de l’agneau entretenues
sur des oeufs embryonés, en fonction de la voie d’inoculation
Voie d’inoculation
Nombre Oeufs contrôlés
d’oeufs
à 4 jours
Total positifs
à 8 jours
Nombre %
Total
positifs
Total
positifs
Cavité
chorio- 10
alantoidienne
Chambre alantoide
10
3
1
7
1
2
20
3
7
2
2
20
Cavité amniotique
5
3
2
Sac vitelin
5
3
2
Martor, non-inoculé
10
3
7
Figure 1
Trofozoites coccidiens provenant de l’agneau
dans la cavité chorio-alantoidienne à l’embryon
de poule (H-E, x400)
Figure 2
Schizont jeune d’Eimeria spp. provenant de
l’agneau, obtenu sur un embryon de poule
(H-E, x400)
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Figure 3
Trofozoit coccidien – section transversale
(image électrono-optique) (x12000)
Figure 4
Membrane chorio-alantoidienne avec
des formations mérozoïdales/trofozoidales
coccidiennes, en processus dégénératif (x12000)
Figure 5
Trofozoit coccidien. Visualisation des corps
paranucléaires (x15000)
Figure 6
Formation schizogonique coccidienne
provenant de l’agneau obtenue sur
un embryon de poule (x30000)
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