Table des matières

Observer et manipuler à l’aide de faisceaux lumineux focalisés
1
Observer et manipuler à l’aide de faisceaux
lumineux focalisés
Nano-Optique du solide, Editeur Bernard Jacquier, Traité EGEM, série
Microsystèmes, p219 - Lavoisier (2012) ISBN 978-2-7462-1980-9
Hervé RIGNEAULT et Serge MONNERET,
équipe MOSAIC, Institut Fresnel UMR CNRS 6133, Marseille
7.1. Introduction
Observer à l’aide de la lumière : voilà une idée qui peut paraître bien banale
lorsqu’il s’agit d’une scène ou d’un objet macroscopique. Mais quand il s’agit de
comprendre les rouages de la vie à des échelles microscopiques, l’approche devient
particulièrement pertinente. En effet qui pourrait être moins invasif que la lumière
pour observer le fonctionnement intime d’une cellule sans la perturber ? Outre cette
innocuité, la lumière offre de plus les possibilités tout aussi essentielles de (1)
générer des mécanismes de contraste variés, dont certains peuvent même être
spécifiques aux molécules ciblées et (2) offrir une résolution micrométrique voire
nanométrique dans certaines conditions.
Manipuler à l’aide de la lumière : l’idée est cette fois ci nettement moins banale
bien que certains appareils historiques tel le radiomètre de Crookes 1 fonctionnent à
partir de forces optiques. Il est en effet possible d’utiliser les photons pour générer
des forces capables de faire bouger, sous certaines conditions, des objets
macroscopiques. Au niveau microscopique, ces conditions sont beaucoup plus
1
Le radiomètre de Crookes est un exemple où la lumière est capable de faire tourner une roue
de pales réfléchissantes d’un côté et absorbantes de l’autre. Son fonctionnement s’opère sous
vide et met en jeu de façon non triviale la pression de radiation qui est dissymétrique sur les
bords des pales entre les faces réfléchissantes et absorbantes. (voir A.E. Woodruff, ‘The
radiometer and how it does not work’, The Physics Teacher 6(4) 358-63 (1968)).
2
Nano-optique
souples, et nous verrons qu’il est possible de manipuler des objets nano ou
micrométriques relativement facilement. En particulier, les techniques de
manipulation optique commencent à prendre place de façon courante dans les
laboratoires de biologie, pour contrôler directement la position de cellules vivantes
individuelles, ou encore des microbilles de silice ou de polystyrène éventuellement
recouvertes de molécules biologiques capable d’activer des réponses cellulaires.
Dans tous les cas, ‘observer’ et ‘manipuler’ à des échelles micrométriques
nécessite de confiner la lumière spatialement. L’objet le plus simple permettant cela
est la lentille optique, spécialement destinée à transformer un faisceau parallèle en
un faisceau focalisé. En pratique, parce que l’on travaille dans un large domaine
spectral et/ou à l’intérieur d’un champ de vue étendu, on préfèrera utiliser un
objectif de microscope pour focaliser les faisceaux laser. Ces objectifs, au prix d’une
complexité de fabrication certaine, offrent en effet la possibilité de focaliser ces
faisceaux à la limite théorique de diffraction (une notion précisée dans les
paragraphes suivants), car ils sont généralement exempts d’aberrations optiques.
Ce chapitre a pour vocation première de traiter en détails des propriétés
fondamentales des faisceaux laser focalisés. Si l’optique géométrique peut déjà
donner une description simpliste de ces propriétés en termes de rayons convergents,
nous montrerons que c’est bien l’optique ondulatoire qui révèle toute la richesse de
ces champs optiques confinés spatialement. Un tel confinement sera recherché soit
pour limiter le volume d’excitation dans un échantillon et ainsi atteindre des
résolutions intéressantes (cas typique de la microscopie confocale de fluorescence),
soit pour augmenter la densité locale de photons et ainsi favoriser certains
phénomènes comme les interactions non linéaires ou les forces optiques.
Bien que fortement concentré sur ces aspects fondamentaux, ce chapitre a aussi
pour but de s’attarder sur certains systèmes et méthodes optiques particulièrement
utilisés en sciences du vivant et basés sur le confinement local de faisceaux laser. En
particulier, nous présenterons la microscopie de fluorescence, puis quelques
techniques d’ultra-résolution, ainsi que les principales techniques actuelles de
micromanipulation appliquées à la biologie. Nous conseillons au lecteur intéressé
par l’ensemble des applications des faisceaux focalisés à la biologie de se reporter à
des ouvrages plus spécialisés (Pawley 1995; Alberts, Johnson et al. 2002).
Ce chapitre est décomposé en deux parties. La première traite des champs
optiques focalisés par des systèmes optiques utilisés en microscopie. On s’attache
également à présenter comment se construisent les images en microscopie de
fluorescence et comment des techniques récentes permettent de dépasser le critère
de Rayleigh et d’accéder à une ultra-résolution optique. La deuxième partie traite
des forces optiques générées par des faisceaux focalisés, utilisées pour manipuler
des microparticules.
Observer et manipuler à l’aide de faisceaux lumineux focalisés
3
7.2. Description d’un champ optique focalisé
7.2.1. Montage optique de base - notion de PSF (« Point Spread Function »)
Le montage optique auquel nous nous réfèrerons tout au long de ce chapitre est
présenté sur la figure 7.1 ; il s’agit du montage de base d’un microscope
fonctionnant en régime de faisceau focalisé. Le faisceau incident, généré par un
laser, provient d’un point S (source) 1. Il est ensuite rendu parallèle par la lentille LF
puis envoyé sur la pupille d’entrée d’un objectif de microscope à l’aide d’un miroir
dichroïque MD. Le faisceau est alors focalisé sur l’échantillon au point E par
l’objectif. Le signal lumineux émis par l’échantillon (par exemple par diffusion, ou
par émission de fluorescence) est collecté par l’objectif puis focalisé à l’aide d’une
lentille de tube LT sur un détecteur 2 au point D (détection).
L’objectif de microscope est constitué d’un assemblage complexe de lentilles et
se caractérise essentiellement par son grandissement 3 G et son ouverture numérique
ON. Cette dernière est donnée par ON = n sin θ max où θmax est l’angle maximal que
peut prendre un rayon allant vers E (lors de l’excitation) ou provenant de E (lors de
la collection) tout en passant par l’objectif (voir figure 7.1) ; n est l’indice du milieu
dans lequel est plongé l’objectif.
Les points S et D sont alors conjugués du point E respectivement par les
systèmes optiques (LF, Obj) et (LT,Obj). L’axe des z est défini suivant l’axe optique
du système.
Les distances qui séparent les points géométriques considérés (S, D et E) des
éléments d’optiques (LF, LT et Obj) sont grandes devant la longueur d’onde. En
conséquence, seules des ouvertures angulaires limitées provenant des points E et S
pourront être collectées. Nous allons voir que cette limitation est à l’origine de la
structure spatiale non ponctuelle du faisceau focalisé en E ainsi que du pouvoir de
résolution fini accessible en D.
Plus précisément, la source ponctuelle placée en S sera imagée en une tache en E
dont la distribution spatiale d’intensité est appelée PSF d’excitation, notée PSFexcit.
De la même façon un point émetteur placé en D sera imagé autour de E avec une
1
Expérimentalement ce point peut être l’extrémité d’une fibre monomode, ou un point de
focalisation du faisceau obtenu par une lentille placée en amont.
2
On utilise généralement des détecteurs non imageurs de grande sensibilité comme des
photomultiplicateurs ou des photodiodes à avalanche.
3
Les objectifs modernes, corrigés des aberrations à l’infini, indiquent un grandissement
lorsqu’ils sont couplés avec une lentille de tube dont la focale dépend du constructeur (Leica :
200 mm ; Nikon : 200 mm ; Olympus : 180 mm ; Zeiss : 160 mm).
4
Nano-optique
distribution d’intensité appelée PSF de collection, notée PSFcoll(xE,yE). Nous allons
décrire dans les paragraphes suivant les structures de ces deux PSF 1.
Détecteur
D (xD,yD,zD)
Trou éventuel
(cas de la microscopie confocale)
LT
Faisceau
excitateur
LF
Signal généré
(Fluorescence,….)
S
(xS,yS,zS)
MD
Obj
xG
Echantillon
(cellule,…)
2θmax
E (xE,yE,zE=0)
0
z
Figure 7.1. Schéma optique du montage considéré dans ce chapitre
La PSF totale du système prenant en compte à la fois l’excitation et la collection
est notée PSFtot (xE,yE) ; elle est égale, dans le cas d’un processus incohérent 2, au
produit des PSF d’excitation et de collection :
PSFtot (xE,yE)= PSFexcit (xE,yE). PSFcoll(xE,yE).
[7.1]
7.2.2. La PSF d’excitation
Nous allons décrire ici la structure de la PSF d’excitation au point E, qui
concerne essentiellement les caractéristiques du faisceau laser incident sur le
système. Par souci de simplicité nous nous limitons ici à l’approximation paraxiale
qui considère que les rayons constituant le faisceau s’écartent peu de l’axe optique.
Dans ce cas le vecteur d’onde k=(kx,ky,kz) de chacune des ondes planes associées à
ces rayons est presque parallèle à l’axe z et les vecteurs d’onde transverses (kx,ky)
sont petits devant k = k de telle sorte que 3 :
1
On comprend maintenant la terminologie ‘Point Spread Function’ qui signifie ‘Fonction
d’Etalement du Point’.
2
C’est le cas du contraste de fluorescence par exemple. Pour les processus cohérents cette
simple multiplication n’est plus valable.
3
L’équation [7.2] constitue l’approximation paraxiale
Observer et manipuler à l’aide de faisceaux lumineux focalisés
k z = k 1 − ( k x 2 + k y 2 ) / k 2 ≈ k − ( k x 2 + k y 2 ) / 2k .
5
[7.2]
Expression du champ gaussien
Considérons en S un faisceau gaussien focalisé polarisé linéairement dont la
distribution spatiale de champ électrique est donnée par :
E( xS , yS , zS ) = E0 e
−
xS 2 + yS 2
ωS 2
,
[7.3]
où E0 est un champ vectoriel constant et ωS est le waist du faisceau focalisé en S.
Ce faisceau est imagé 1 par le système optique (LF, Obj) pour donner en E un
faisceau focalisé de waist ω0= ωS /G.
La distribution en ondes planes du champ est donnée par sa transformée de
Fourier spatiale. Ainsi, au point E choisi comme origine des z :
xE 2 + y E 2
+∞
−
ω0 2 − ( kx2 + k y 2 )
1
− i ( k x xE + k y y E )
ω02
ˆ (k , k , 0) =
=
E
E
e
e
dx
dy
E
e
0
0
x
y
E
E
∫
4π 2 ∫ −∞
4π
ω02
4
[7.4]
Pour avoir le champ au voisinage de E pour z ≠ 0 , il suffit de faire se propager
chacune des ondes planes suivant z
Eˆ (k x , k y , z ) = Eˆ (k x , k y , 0)eikz z ,
[7.5]
de telle sorte que 2
E( x E , y E , z ) = ∫
+∞
∫ Eˆ (k , k
x
y
, 0)e
(
i k x xE + k y y E + k z z
)
dk x dk y .
[7.6]
−∞
En injectant [7.4] dans [7.6] et en remplaçant kz par son approximation paraxiale
[7.2] nous obtenons
1
Dans notre approximation paraxiale toutes les fréquences spatiales (kx,ky) présentes en z=zE
sont collectées par le système optique (LF,Obj) pour former l’image de E en S.
2
Cette expression [7.6] n’est autre que la familière décomposition angulaire d’un champ sur
les fréquences spatiales (kx,ky)
6
Nano-optique
+∞
−(k
ω
E( xE , yE , z ) = E0 0 eikz ∫ ∫ e
4π
−∞
2
x
+ k y 2 )(
ω02
4
+
iz
)
2 k i ( k x xE + k y y E )
e
dk x dk y .
[7.7]
Expression qui s’intègre 1 pour donner l’expression paraxiale d’un faisceau
gaussien
E( xE , y E , z ) =
Ε0 e
e
(1 + 2iz / kω0 2 )1/ 2
ikz
−
( xE 2 + y E 2 )
ω02 (1+ 2 iz / kω02 )
,
[7.8]
qui prend une forme plus familière
ω −
Ε( ρ , z ) = E 0 0 e ω
ω ( z)
ρ2
2
2


( z ) i  kz −η ( z ) + k ρ / 2 R ( z ) 
e
,
[7.9]
avec le nouveau jeu de paramètres
2
ρ=
xE 2 + y E 2
z0 =
Coordonnée transverse
kω0 2
2
Distance de Rayleigh
ω=
( z ) ω0 1 + z 2 / z0 2
Rayon du faisceau
R( z=
) z (1 + z0 2 / z 2 )
Rayon de courbure du front d’onde
η ( z ) = arctan z / z0
Correction de phase
La dimension transverse du faisceau est généralement définie par la valeur de ρ
pour laquelle la valeur du champ a diminué d’un facteur 1/e. On peut montrer que la
surface définie par E ( ρ , z ) / E (0, z ) = 1/ e est une hyperboloïde bien approximée
pour les grands z par le cône de demi-angle au sommet θ = 2 / kω0 . Ainsi l’ouverture
numérique est-elle simplement
=
ON n=
sin θ 2n / kω0 .
1
L’expression [7.7] s’intègre à l’aide des expressions :
+∞
∫ exp(−ax
−∞
2
+ ibx
=
)dx
π / a exp(−b 2 / 4a) et
+∞
∫ x exp(−ax
−∞
2
+ ibx
=
)dx ib π exp(−b 2 / 4a ) /(2a 3/ 2 )
Observer et manipuler à l’aide de faisceaux lumineux focalisés
7
Le faisceau gaussien présente encore deux propriétés intéressantes. Tout d’abord
il reste plus ou moins collimaté sur une distance 2z0. En z=z0 (appelé distance de
Rayleigh), ω ( z0 ) = 2ω0 . De plus si le faisceau gaussien est en phase avec une onde
plane en z = −∞ , il est en opposition de phase avec cette même onde plane
en z = +∞ . En effet η ( z = +∞) − η ( z = −∞) = π ; ce saut de phase, appelé le saut de
phase de Gouy, a des conséquences importantes en microscopie non linéaire
(Muller, Squier et al. 1998).
La figure 7.2 illustre les principales caractéristiques d’un faisceau gaussien.
|E|
ρ
1/e
ρ
z
ω(z)
θ=2/(kω0)
2z0
Figure 7.2 : Illustration des caractéristiques principales d’un faisceau Gaussien paraxial.
Champ longitudinal dans la région focale
Afin d’évaluer la composante longitudinale associée à un faisceau gaussien nous
appliquons la condition de divergence ∇.E =
0 au champ gaussien polarisé suivant
x.
∂

Ez = − ∫  Ex dz
∂
x


[7.10]
En utilisant l’équation [7.7] nous obtenons
( x2 + y 2 )
− 2
2x
keikz
ω0 (1+ 2 iz / kω02 )
Ez ( x, y, z ) = −i
e
dz ,
2 ∫
2 2
kω0 z (1 + 2iz / kω0 )
[7.11]
où nous avons omis l’indice E. L’équation [7.11] peut s’intégrer en z=0 pour donner
Ez ( x, y, 0) = −i
2x
Ex ( x, y, 0) .
kω0 2
[7.12]
8
Nano-optique
Cette dernière équation indique que le champ longitudinal est déphasé de π/2 par
rapport au champ transverse et qu’il est nul sur l’axe optique (en x=0) ; par ailleurs
son amplitude est d’autant plus forte que le champ est focalisé (ω0 petit).
La figure 7.3 présente des cartographies du module au carré de Ex et Ez pour un
champ focalisé par un objectif de microscope d’ouverture numérique ON=1.2
travaillant dans l’eau (indice 1.33).
Figure 7.3. Cartographies spatiales des champs Ex et Ez pour un objectif d’ouverture
numérique ON=1.2 travaillant dans l’eau (waist ω0=0.3µm)
PSF d’excitation
Dans le paragraphe 7.2.1 nous avons défini la PSF d’excitation comme la
répartition d’intensité en E d’un point source placé en S. Il s’agit en fait du cas du
contraste de fluorescence à 1 photon où les fluorophores situés en E sont activés
suivant l’intensité du champ d’excitation. Dans ce cas
Fluorescence à 1 photon : PSFexcit
=
(ρ , z)
E=
(ρ , z)
I (ρ , z)
2
De façon plus générale, on place dans la PSF d’excitation (1) le mécanisme capable
de générer des émetteurs et (2) comment le système optique va générer spatialement
ces émetteurs en E. Ainsi suivant le mécanisme de contraste considéré, la PSF
d’excitation va dépendre différemment de E( ρ , z ) .
Dans le cas de la fluorescence 2 photons qui dépend du carré de l’intensité locale du
champ excitateur I ( ρ , z ) 2 :
Fluorescence à 2 photons : PSFexcit
(ρ , z)
=
(ρ , z)
E=
I 2 (ρ , z)
4
Observer et manipuler à l’aide de faisceaux lumineux focalisés
9
Dans le cas des effets non linéaires comme la génération du second harmonique
ou du troisième harmonique nous avons :
Second harmonique (SHG) : PSFexcit ( ρ , z ) = E( ρ , z ) 2
Troisième harmonique (THG) 1 : PSFexcit ( ρ , z ) = E( ρ , z )3
Un traitement plus rigoureux
Comme nous l’avons vu, la formule [7.9] utilise l’approximation paraxiale qui
considère des faisceaux peu ouverts autour de l’axe optique. Dans un objectif de
microscope de forte ouverture numérique on peut s’interroger sur la validité de cette
approche. En fait il est assez surprenant de constater que le traitement paraxial
donne des résultats très bons même dans un régime de forte focalisation.
Il est cependant possible de traiter rigoureusement le problème de la focalisation
par un système aplanétique. Un tel traitement donne accès à des détails fins du
champ vectoriel au voisinage du point focal. Le lecteur intéressé trouvera les détails
d’une telle analyse dans les articles (Richards and Wolf 1959; Wolf 1959; Novotny
and Hecht 2006).
7.2.3. La PSF de collection
Le traitement de la PSF de collection, liée à la lumière « émise » par
l’échantillon, est de nature similaire à celui de la PSF d’excitation. Le problème à
traiter est celui de la formation de l’image en D d’un point source placé en E (voir
figure 7.1) 2. Ce point source présente, par nature, un spectre angulaire très large 3.
Comme dans le cas de la PSF d’excitation, nous pouvons suivre une approche dans
le cadre de l’approximation paraxiale qui a le mérite de conduire à des équations
analytiques. Il existe également une description rigoureuse utilisant la théorie de la
focalisation par des systèmes aplanétiques.
Approche heuristique
1
Il faudrait en toute rigueur écrire le produit tensoriel E:E à la place de E2 pour le SHG et
E:E:E à la place de E3 pour le THG.
2
Ce point source peut être une molécule fluorescente, un diffuseur ou tout autre élément
émetteur dont la dimension est très inférieure à la longueur d’onde.
3
On peut s’en persuader à l’aide de la formule [7.6] : si E(x,y,0)=δ(x,y,0) alors sa
transformée de Fourier est à support non borné.
10
Nano-optique
Une source ponctuelle idéale placée en E comporte toutes les fréquences
ˆ (k , k , 0) ≠ 0 quels que soient kx et ky (voir Eq.
spatiales ; ainsi rigoureusement E
x
y
[7.6]). Le système optique (Obj ,LT) étant loin 1 de E, toutes les informations
contenues dans les ondes évanescentes pour lesquelles
k x 2 + k y 2 > k 2 seront
k 2 < n 2 k0 2 sin 2 θ max (avec
k0 = ω / c ) seront collectées par l’objectif d’ouverture numérique ON = n sin θ max et
participeront à la formation de l’image de E au point D. Ces basses fréquences
reconstruiront une tache dont la dimension latérale sera donnée par
∆x ≈ 1/ ( nk0 sin θ max / G ) =Gλ / ( 2π ON ) . Cette dernière équation est
perdues. Seules les fréquences spatiales vérifiant
approximative mais elle montre simplement l’origine de l’extension spatiale de la
PSF de collection.
Approche rigoureuse et approximation paraxiale
Le traitement rigoureux de la PSF de collection (notée PSFcoll ) utilise, comme
pour la description d’un champ très focalisé, la théorie de la focalisation par des
systèmes aplanétiques et on en trouvera une bonne description dans les articles
(Sheppard and Wilson 1982; Enderlein 2000). Il s’agit de traiter comment un dipôle
vectoriel µ, placé en E, est imagé en D (figure 7.4). L’exposé détaillé de ce
problème sort du cadre de ce chapitre. Néanmoins nous allons donner ici les
expressions dans l’approximation paraxiale pour discuter leur sens physique
(Novotny and Hecht 2006).
Obj
LT
n
xE
xD
n’
f
f’
D
µ
E
∆x
0
z
Figure 7.4. La PSF de collection est définie comme l’image en D d’un point source placé en
E.
Pour un dipôle orienté suivant l’axe x en E ( μ = µ x x ), c'est-à-dire perpendiculaire
à l’axe optique, on peut arriver à une expression analytique du module du champ
1
On veut dire ici à une distance bien plus grande que la longueur d’onde
Observer et manipuler à l’aide de faisceaux lumineux focalisés
11
électrique au carré 1 en D si on fait l’approximation d’une ouverture numérique
faible et d’une courte focale pour l’objectif de collection ( ON  1 et f  f ' ) 2. Les
focales de Obj et LT sont respectivement f et f’.
Suivant l’axe x on obtient la PSFcoll ( ρ , 0) transverse:
µ x 2 ON 4  J1  2π ON ρ / ( Gλ )  
PSFcoll ( ρ , 0) E
=
=
( xD , yD , 0)
2

ε 0 2 nn ' λ 6 G 2 
2π ON ρ / ( Gλ ) 
2
π4
2
[7.13]
où l’origine des z est prise en D, n et n’ sont respectivement les indices dans le
plan objet et image, λ la longueur d’onde d’émission du dipôle, G = (nf ') /(n ' f ) le
2
grandissement du système, ρ la coordonnée transverse ( ρ=
xD 2 + yD 2 ). La fonction
du type
( J1 ( x ) / x )
2
décrit la forme suivant x de la tache image de S et est connue
sous le nom de tache d’Airy 3. La demi-largeur de cette fonction, définie par rapport
à la valeur de x où elle s’annule est donnée par
∆x =0.6098
Gλ
ON
[7.14]
Suivant l’axe z on peut également évaluer la PSFcoll (0, z ) avec l’approximation
paraxiale ( ON  1 et f  f ' ).
2
2
µ x 2 ON 4  sin (π ON z /(2n ' G λ ) ) 


=
E
=
PSF
z
z
(0,
)
(0,
0,
)
coll
ε 0 2 nn ' λ 6 G 2  (π ON 2 z /(2n ' G 2 λ ) ) 
2
π4

2

[7.15]
La dépendance axiale est cette fois ci du type ( sin ( x ) / x ) et la demi-largeur de
2
cette fonction, définie par rapport à la valeur de z où elle s’annule, est connue sous le
nom de profondeur de champ. Elle est donnée par :
1
On choisit |E|2 car c’est généralement cette quantité qui est détectée.
Cette approximation est de type paraxiale, elle n’est pas nécessaire si le traitement reste
purement numérique.
3
Cette approximation de type paraxiale est en très bon accord avec les calculs rigoureux.
2
12
Nano-optique
∆z =2n '
G 2λ
ON 2
[7.16]
Cette profondeur de champ dépend du carré du grandissement et est inversement
proportionnelle au carré de l’ouverture numérique, elle sera donc en général
beaucoup plus grande que le rayon de la tache d’Airy.
La figure 7.5 donne les PSFcoll ( ρ , 0) pour un dipôle orienté perpendiculairement
puis parallèlement à l’axe optique.
Figure 7.5 PSF de collection dans le plan z=0 (point D de la figure 7.4) lorsque que le
dipôle est orienté (a) perpendiculairement (suivant yE) et (b) parallèlement (suivant z) à l’axe
optique. ON=1.3, huile d’immersion d’indice 1.518, grossissement 40.
Si le dipôle est maintenant orienté suivant l’axe z en E ( μ = µ z z ) on obtient une
dépendance en ( J 2 ( x) / x ) qui présente une valeur nulle en x=0 (Figure 7.5 b). On
2
retiendra donc que la PSF de collection dépend fortement de l’orientation du dipôle.
Nous avons jusqu’ici toujours considéré un dipôle situé en S sur l’axe optique.
En fait il y a toujours conjugaison au sens de l’optique géométrique entre S et D de
telle sorte que la tache de diffraction est toujours centrée sur l’image géométrique du
dipôle par le système optique (Obj,LT).
Il est possible d’obtenir une image un peu plus grande de la PSF de collection si
on défocalise légèrement l’image en D. Suivant ce principe, la figure 7.6 donne
l’image obtenue de molécules de Cy5 dans un polymère (polyvinyle alcool)
lorsqu’on a déplacé de 1µm l’objectif vers l’échantillon (d’après (Patra, Gregor et al.
2004)). On peut apprécier les différentes PSF associées aux différentes orientations
des molécules de Cy5 dans l’échantillon.
Observer et manipuler à l’aide de faisceaux lumineux focalisés
13
Figure 7.6 Exemple de PSF de collection de molécules individuelles de Cy5 placées dans un
polymère (polyvinyle alcool). L’objectif de collection (ON=1.2, G=100) a été déplacé de 1µm
vers l’échantillon (d’après (Patra, Gregor et al. 2004)).
Si maintenant il y a plusieurs dipôles situés au voisinage de E, la tache de
diffraction en D sera la somme des intensités des taches associées à chacun des
dipôles émetteurs si ces derniers sont incohérents entre eux (cas de la fluorescence).
Dans le cas où ces dipôles sont cohérents entre eux (cas de l’optique non linéaire), il
s’agit de sommer en D les champs associés à chacun des dipôles. L’intensité
détectée, égale au module du champ au carré peut alors prendre différentes valeurs
qui dépendent de l’état d’interférence de ces champs 1.
7.2.4. La limite de résolution
Limite de résolution transverse
Dans la section 7.2.3 nous avons vu comment un point source placé en S était
imagé en une tache en D. Intuitivement on conçoit que si deux points sources sont
situés très près l’un de l’autre en S il va être impossible de les séparer en D car les
taches de diffraction vont se chevaucher. La figure 7.7 donne une illustration de
cette limite de résolution transverse.
1
On peut même avoir un état d’interférence complètement destructif dans le cas de la
génération du troisième harmonique (THG) dans un milieu homogène. Il n’y a donc pas
d’émission de THG vers l’avant en microscopie dans un milieu homogène !
14
Nano-optique
Obj
LT
n
xE
xD
n’
f
f’
µ
D
∆x
G∆x
z
0
µ
E
Fig 7.7. Illustration de la limite de résolution transverse, deux points sources séparés de ∆x en
E génèrent des PSF de collection séparés de G∆x en D.
On considère deux dipôles situés en E, orientés suivant x et séparés de ∆x. Le
système (Obj, LT) forme de ces deux points deux PSF de collection séparées de
G∆x. Le critère de Abbe formulé en 1873 dans le cadre de l’approximation paraxiale
considère que la distance minimale à laquelle on peut détecter ces deux PSF
correspond au cas où le maximum d’une PSF est placé sur le premier minimum de
l’autre PSF 1. Cette distance est donc simplement donnée par le rayon du disque
d’Airy donné par la formule [7.13].
Min [ ∆x ] =
0.6098
λ
[7.17]
ON
Dans le cas où les deux dipôles ne sont plus orientés suivant x on conçoit que la
limite de résolution ne peut plus être définie sur ce simple critère 2.
Limite de résolution axiale : la microscopie confocale
Dans le cas axial il s’agit de considérer deux dipôles placés en E (ici choisis
orientés suivant x) séparés de ∆z (Figure 7.8.). Il est intéressant de noter que si on
évalue, au voisinage de D, l’intégrale de la PSFcoll dans un plan zD=constante 3 on
trouve un résultat qui est indépendant de z. Il s’agit tout simplement de la
conservation de l’énergie au cours de la propagation du faisceau provenant du dipôle
situé en E. Il est donc impossible de distinguer les deux images des dipôles suivant z
si l’on dispose d’un détecteur qui n’est pas limité transversalement dans le plan
1
Ce critère à l’avantage de ne pas dépendre de l’intensité relative des deux dipôles car le
maximum d’une PSF est toujours plus grand que le zéro de l’autre ; dans la pratique on est
néanmoins toujours limité par le bruit.
2
C’est en particulier le cas en microscopie non linéaire où le calcul exact de la PSFcollection
résulte de la sommation cohérente des dipôles émetteurs et peut être très différente de la
fonction d’Airy.
3
Il s’agit donc du flux du vecteur de Poynting exprimant l’intensité mesurée.
Observer et manipuler à l’aide de faisceaux lumineux focalisés
15
(xD,yD). Usuellement on appelle ‘microscopie confocale’ un montage qui utilise dans
le plan zD=0 un trou permettant ainsi de définir une extension transverse limitée au
travers de laquelle le flux est mesuré par le détecteur (situé derrière le trou).
Obj
xE
(n/n’)G2∆z
LT
n
n’
f
f’
z
µ
0
µ
trou
confocal
E
∆z
D
Fig 7.8. Illustration de la limite de résolution axiale, deux points sources séparés de ∆z en E
génèrent des PSF de collection séparées de (n/n’)G2∆z en D.
La dimension du trou confocal permet de définir ainsi le pouvoir de résolution
suivant z (Enderlein and Ambrose 1997). On peut avoir une bonne idée de la
résolution si on considère un trou confocal très petit qui ne laisse passer que le
champ sur l’axe optique (ρ=0). La formule [7.15] nous donne alors directement le
flux collecté et on constate cette fois-ci qu’il dépend de z ! Considérons qu’un des
deux dipôles soit placé de telle sorte que son image soit située dans le plan du trou
confocal en zD. Dans ce cas, la totalité de l’intensité émise puis collectée par (Obj,
LT) est détectée derrière le trou confocal. Déplaçons maintenant, au voisinage de E,
le deuxième dipôle de ∆z par rapport au premier. L’intensité I2(z) détectée derrière
le trou pour ce deuxième dipôle est donnée simplement en utilisant [7.15].
(
 sin π ON 2 ∆z /(2n ' G 2 λ )
I2 ( z) ≈ 
 π ON 2 ∆z /(2n ' G 2 λ )
(
)
) 

2
[7.18]
Lorsque cette fonction s’annule, on peut assigner la totalité de l’intensité au
premier dipôle dont l’image est située dans le plan du trou. Ainsi la distance
minimale ∆z entre les deux dipôles dans le plan objet est donnée par :
nλ
Min [ ∆z ] =
2
ON 2
[7.19]
Cette distance définit le pouvoir de résolution axial d’un microscope confocal.
Le pouvoir de résolution transverse est donné par [7.17] et vient essentiellement du
diamètre de la tache d’Airy correspondant au faisceau excitateur focalisé. En
16
Nano-optique
d’autres termes le pouvoir de résolution axial d’un microscope confocal vient de
PSFcoll alors que la résolution transverse vient de PSFexcit. A l’aide de ces deux
résolutions, un microscope confocal peut réaliser une image tridimensionnelle d’un
échantillon 1 (figure 7.9).
5µm
(a)
(b)
Fig 7.9. Rendu tridimensionnel d’images issues d’un microscope confocal ; le contraste
provient de la fluorescence endogène des échantillons (autofluorescence) (a) grain de pollen,
(b) racine de fougère.
7.3. L’ultra résolution en champ lointain ou comment dépasser le critère de
Abbe ?
D’après le paragraphe précédent il semble que le critère de Abbe (Abbe 1873),
résumé dans les formules [7.17] et [7.19], rende impossible la séparation de deux
points sources séparés d’une distance très inférieure à la longueur d’onde. En effet
cette information est contenue dans les ondes évanescentes pour lesquelles
k x 2 + k y 2 > n 2 k0 2 qui, par nature, ne se propagent pas jusqu’à l’objectif de
collection 2. Il est cependant possible d’avoir accès à ces ondes confinées au
voisinage de l’objet si on y approche une pointe dont le rôle va être de diffracter ou
de collecter les ondes évanescentes. Cette stratégie est celle mise en place dans les
techniques de champ proche optique présentées dans le Chapitre III de ce livre.
Cependant le champ proche nécessite d’approcher une pointe à quelques nanomètres
de l’échantillon et d’en contrôler le déplacement aux mêmes échelles. Il s’agit d’une
technique fondamentalement surfacique qui ne peut pas imager l’intérieur d’une
cellule par exemple. Le même argument s’applique également aux métamatériaux
présentant un indice de réfraction négatif (Pendry 2000) qui sont capables d’imager
1
Il s’agit de scanner l’échantillon avec la PSFtot (Eq. 7.1)
En effet dans ce cas kz est un imaginaire pur et le champ est exponentiellement décroissant
suivant z.
2
Observer et manipuler à l’aide de faisceaux lumineux focalisés
17
les ondes évanescentes (Smolyaninov, Yu et al. 2007). Dans ce cas encore,
l’échantillon à imager doit être placé à une distance nanométrique du métamatériau
pour que ce dernier ‘collecte’ les ondes évanescentes.
Nous allons voir dans ce paragraphe qu’il est possible d’avoir accès à une
résolution nanométrique en champ lointain, c'est-à-dire en utilisant le système
présenté sur la figure 7.1, si l’on cherche à imager des molécules qui peuvent être
dans deux états, un brillant et un noir. Les développements spectaculaires dans ce
domaine sont en train de révolutionner la microscopie optique (Hell 2007).
Comment dépasser le critère d’Abbe ?
Notons tout d’abord que le critère d’Abbe n’interdit pas de détecter la position
(xE,yE) d’une molécule (considérée ici comme une source ponctuelle) avec une
précision arbitraire si il n’y a pas de source similaire située à une distance λ/2n. 1 Ce
cas est celui de la figure 7.6 où le centre d’une molécule individuelle peut être
localisé avec une précision nanométrique. En revanche, le critère d’Abbe interdit la
distinction de deux molécules séparées de moins de λ/2n. Cependant rien n’empêche
de détecter ces deux sources de manière séquentielle. Par exemple en plaçant la
première molécule dans un état brillant A alors que la deuxième est dans un état noir
B, puis en inversant les rôles. La mesure successive des coordonnées des deux
molécules permet alors de reconstruire une image dont la résolution peut être très
inférieure à la longueur d’onde 2. Pour cela, il faut disposer d’un mécanisme
permettant une transition optique A→B pour toutes les molécules sauf celles situées
au point ri où l’on va mesurer très précisément la position des molécules dans l’état
brillant A. Une telle transition peut être réalisée si l’on éclaire l’échantillon avec une
répartition d’intensité I ( r ) présentant un minimum d’intensité en ri . Dans le cas
d’un processus à un photon, cette transition A→B s’opère avec le taux
k AB (r ) = σ I (r ) , où σ est la section efficace du processus. Ce taux k AB doit
dépasser ceux de tous les autres processus susceptibles de ramener B→A. C’est le
cas par exemple des processus d’émission spontanée s’opérant au taux 1/ τ B où
τ B est
le
temps
de
vie
du
niveau
B.
Ainsi,
la
condition
I (r )  1/(στ B ) = I s impose l’existence de l’état brillant A à la position
ri ± ∆r / 2 . Ce qui est remarquable c’est que ∆r / 2 peut être très inférieur
On a ici approximé la formule [7.17] par λ/2n où n est l’indice du milieu dans lequel la
source est située.
2
Cette résolution n’a pas de borne inférieure et est seulement limitée par le rapport signal sur
bruit avec lequel on repère la position de la molécule dans l’état brillant A.
1
18
Nano-optique
N A (t , r ) = N A (0, r )e −σ I ( r )t ce
qui montre une dépendance exponentielle entre I ( r ) et le lieu d’existence ∆r de
l’état brillant A (voir insert, fig 7.10). ∆r / 2 peut être ainsi réduit à une distance
bien inférieure à λ / 2n . En translatant ri sur l’échantillon on obtient alors une
à λ / 2n . En effet la déplétion de A→B impose
information sur la densité des molécules avec une résolution qui peut être aussi
petite que I s est fort.
Fig 7.10. Lecture par scanning (STED) et stochastique (PALM) de molécules fluorescentes
localisées dans un objet de dimension inférieure à λ/2n. Les molécules ont un état brillant A et
un état noir B. Dans le mode scanning STED, l’état A est induit par déplétion non linéaire de
la fluorescence par émission stimulée. La lecture s’opère sur un ensemble de molécules. Dans
le mode stochastique PALM, l’état A d’une molécule individuelle est induit par photoactivation tandis que les autres molécules restent dans l’état B. La molécule apparaît de
manière stochastique puis s’éteint par photo blanchiment.
La technique STED (Stimulated Emission Depletion) (Hell and Wichmann 1994)
utilise le niveau excité S1 d’un fluorophore comme état A et son niveau fondamental
S0 comme état B. La méthode consiste à vider l’état A par émission stimulée. Cette
déplétion est réalisée par un faisceau (dit faisceau STED) qui présente un minimum
d’intensité en son centre ri. Ainsi la déplétion A→B s’opère partout sauf en ri
Observer et manipuler à l’aide de faisceaux lumineux focalisés
(Figure 7.11). Il s’agit ensuite de détecter la fluorescence provenant de
En utilisant une intensité STED 1
19
ri ± ∆r / 2 .
I s = (στ A ) = 3x1025 photons/cm2=10MW/cm2 il
−1
est possible d’atteindre une résolution de ∆r=100nm dans les trois directions de
l’espace (Figure 7.11 C) en scannant l’échantillon (Figure 7.10). On obtient alors un
dispositif optique en champ lointain capable d’atteindre une résolution située bien en
dessous du critère d’Abbe !
(A)
(B)
(C)
Figure 7.11 Microscopie STED (A) Etats moléculaires, le faisceau STED vide l’état
brillant S1 (B) Le faisceau STED présente un minimum d’intensité dans son centre pour ne
laisser qu’un volume de 100 nm de diamètre où la fluorescence est toujours active. (C)
exemples d’images confocale et STED d’agrégats de Syntaxine dans des cellules PC12
(d’après Sieber et al., Science 317, 1073, 2007).
Dans les techniques PALM (Photo-Activated Localization Microscopy) (Betzig,
Patterson et al. 2006) et STORM (Stochastic Optical Reconstruction Microscopy)
(Rust, Bates et al. 2006) on utilise des molécules photo-activables qui passent de
l’état B à l’état A. Il s’agit alors de pointer la position du centre de la PSFcoll (Figure
7.4) associée à l’émission d’un molécule individuelle avant que celle-ci ne repasse
Le temps de vie du niveau fluorescent est de l’ordre de τA=10-9s et la section efficace
d’émission stimulée σ=10-16cm2
1
20
Nano-optique
dans un état noir B (STORM) où ne photo-blanchisse (PALM). Ce processus de
photo-activation est intrinsèquement stochastique (Figure 7.10) et l’image ultrarésolue est construite point par point en intégrant sur des temps relativement longs
(de quelques dizaines de minutes à plusieurs heures). La résolution obtenue est de
l’ordre de 30nm (Figure 7.12).
Champ Large
PALM
Figure 7.12 : Image en champ large (A) et PALM (B) de cellule COS-7 exprimant la protéine
transmembranaire CD63 marquée avec la protéine de fusion photoactivable PA-FP Kaede
(d’après Betzig et al., Science, 313, 1642 2006)
Après avoir vu que la lumière focalisée permettait de voir à des échelles microniques et
même sub-microniques, nous allons maintenant découvrir que cette même lumière peut servir
à manipuler des objets.
7.4. Les faisceaux focalisés pour manipuler
La manipulation optique de particules par forces optiques s’est considérablement
développée au cours des deux dernières décennies. Le champ d’investigation de
cette nouvelle technique est très vaste (Ashkin 2000), allant de l’échelle atomique
(refroidissement d’atomes par laser, condensation de Bose-Einstein) jusqu’à
l’échelle micrométrique avec des applications en physique des colloïdes et en
biologie. Ce dernier domaine est particulièrement concerné, puisque les
manipulations de cellules individuelles vivantes, d’organelles dans la cellule, ou
encore de molécules uniques (moteurs moléculaires) sont maintenant régulièrement
effectuées dans certains laboratoires de recherche, tout comme la mesure des forces
mécaniques ou élastiques exercées sur des cellules ou des macromolécules
individuelles (Hormeno and Arias-Gonzalez 2006).
Les photons, bien que de masse nulle, transportent de la quantité de mouvement.
En conséquence, un flux de photons, à savoir un faisceau lumineux, est capable de
transférer de la quantité de mouvement à la matière, et par là même donne lieu à une
Observer et manipuler à l’aide de faisceaux lumineux focalisés
21
force qui, rapportée à l’unité d’aire éclairée, représente une pression appelée
pression de radiation. Kepler fut probablement le premier à soupçonner cet effet, au
début du 17ème siècle, lorsqu’en observant les queues de comètes il constata que ces
dernières sont toujours orientées en opposition au soleil, laissant présager d’une
action mécanique de la lumière sur les poussières qui les constituent. La pression de
radiation fut ensuite déduite théoriquement par Maxwell en 1871 puis détectée
expérimentalement par Lebedev (Lebedev 1901), ainsi que par Nichols et Hull
(Nichols and Hull 1903).
Les forces optiques sont cependant d’intensité extrêmement faible, comme on
peut le montrer dans un cas simple. Sachant que la quantité de mouvement d’un
photon est donnée par hν/c, et qu’un faisceau lumineux de puissance P transporte
P/hν photons par seconde, on peut en déduire qu’un faisceau lumineux incident de
puissance P totalement réfléchi sur un miroir plan parfait va générer, par
conservation de la quantité de mouvement, une impulsion par seconde (donc une
force) sur le miroir de 2P/c. Pour une puissance P = 1 W, la force obtenue est de
l’ordre de 10 nN, typiquement négligeable devant le poids du miroir. Si, maintenant,
on considère non plus une onde plane, mais un faisceau laser de puissance 1W
focalisé sur une tache de diamètre 1 µm, dans laquelle on place une bille
microscopique parfaitement réfléchissante de diamètre également de 1µm et de
densité 1, on peut montrer que l’accélération de la bille produite par la force optique
sera alors de l’ordre du million de fois celle de la gravité. Ces considérations,
extrêmement simplistes, ne peuvent que laisser présager le potentiel de faisceaux
laser focalisés pour générer des pressions de radiation suffisantes pour engendrer le
mouvement de particules micrométriques (Ashkin 1970) et la possibilité de faire
léviter optiquement des particules dans l’air (Ashkin and Dziedzic 1971). Par contre,
elles ne peuvent en aucun cas expliquer les propriétés des pinces optiques actuelles.
En effet, les pinces optiques permettent non seulement de déplacer des
particules, mais aussi de les maintenir à un endroit donné, de façon stable dans le
temps. Cette stabilité implique qu’une autre force optique, conservative, appelée
force de gradient, soit associée à la pression de radiation qui, rappelons-le, est non
conservative et toujours dirigée suivant la direction d’incidence du faisceau. Cette
force de gradient, introduite par Arthur Ashkin en 1972, conduit les particules à se
diriger vers les zones de plus forte intensité du faisceau lumineux, en créant
l’équivalent d’un puit de potentiel harmonique centré sur le piège. La raideur
équivalente du « ressort de rappel » associé à ce puit de potentiel dépend du gradient
lumineux. Ainsi, pour un faisceau laser focalisé dans un liquide, la force de rappel
exercée sur une particule le long de l’axe longitudinal sera toujours nettement plus
faible que celle que l’on pourra observer latéralement. En conséquence, la stabilité
d’une particule dans un piège optique dépend de l’importance relative de la force
« radiative » (due à la pression de radiation) par rapport à la force longitudinale de
gradient (voir figure 7.13). En termes d’optique géométrique, les rayons paraxiaux
22
Nano-optique
d’un faisceau focalisé contribuent essentiellement à générer la pression de radiation,
alors que les rayons très écartés de l’axe optique induisent plutôt la force de
gradient. C’est pourquoi un piège stable peut être obtenu par un seul faisceau laser
dès lors qu’il est focalisé avec une ouverture numérique capable de créer un gradient
lumineux longitudinal suffisamment important pour que le puit de potentiel associé
puisse contrer les effets de la force radiative. Dans ce cas, une particule placée au
niveau de la tache de focalisation du faisceau peut rester piégée dans cette zone, à
condition néanmoins que le puit de potentiel soit plus profond que l’énergie
thermique de la particule due au mouvement brownien. Dans les applications
pratiques, les ouvertures numériques des faisceaux créant des pièges optiques à
gradient sont supérieures à 1. Ces pièges à faisceau unique sont nommés pinces
optiques, inventées et utilisées pour la première fois par Ashkin en 1986 pour piéger
des objets biologiques (Ashkin, Dziedzic et al. 1986). Il faut noter aussi que dans la
plupart des cas, ces pinces sont utilisées en milieu liquide pour lequel le poids des
particules piégées est compensé par la poussée d’Archimède. Les effets de la gravité
sont donc souvent considérés comme négligeables, expérimentalement comme
théoriquement. De plus, le fait de travailler dans des milieux liquides permet aussi
d’amortir les déplacements des particules piégées, permettant ainsi d’obtenir une
certaine stabilité des conditions de piégeage.
Figure 7.13: Compétition entre forces de gradient et de radiation, et zones d’intérêt pour le
piégeage optique. La position d’équilibre de la particule est définie dans le plan (si il existe)
pour lequel les forces de gradient et de radiation s’équilibrent. Cette position, toujours située
au dessus du plan de focalisation (pour lequel la force de gradient est nulle), dépend des
caractéristiques de la particule (taille et indice de réfraction).
Comme la stabilité, mais aussi l’efficacité du piège optique dépendent d’une
compétition entre une force de pression et une force de rappel liée au gradient
lumineux, il est essentiel pour assurer la fonctionnalité d’un piège de créer des
faisceaux laser focalisés à la limite de diffraction, avec des ouvertures numériques
les plus grandes possibles. C’est pourquoi la description théorique complète des
Observer et manipuler à l’aide de faisceaux lumineux focalisés
23
interactions entre un faisceau laser focalisé et une particule donnée est essentielle si
l’on veut espérer prédire correctement les propriétés du piège optique associé sur
cette particule.
7.4.1. Les forces optiques et leurs modèles
L’analyse des forces optiques exercées sur une particule relève de la théorie de
l’électromagnétisme, qui traite de façon générale de l’interaction d’un faisceau
lumineux avec la matière. Ces interactions peuvent être séparées en deux familles :
les effets de réflexion et de réfraction au niveau de la surface de la particule d’une
part, et les effets de diffraction liés au réarrangement du front d’onde après
l’interaction du faisceau avec la particule, d’autre part. Ces deux familles sont
d’origine
fondamentalement différentes.
Ainsi,
les phénomènes de
réflexion/diffraction sont essentiellement liés à l’indice de réfraction de la particule,
alors que la diffraction ne dépend surtout de sa géométrie.
Lorsque la particule est beaucoup plus petite que la longueur d’onde du faisceau,
la perturbation du front d’onde est minime et la particule peut être considérée
comme un simple dipôle induit, soumis aux lois classiques de l’électrostatique
(approximation dipolaire). A l’opposé, lorsque la particule est très grande devant la
longueur d’onde du faisceau, les lois de l’optique géométrique peuvent être utilisées
pour estimer la composante de réflexion/réfraction, alors que les effets dus à la
diffraction sont négligeables.
Ces deux familles de modèles couvrent en fait des domaines d’applications qui
ne correspondent pas du tout aux applications les plus courantes des pinces optiques,
qui sont liées à la manipulation de microbilles, de bactéries ou de cellules
biologiques qui ont des tailles caractéristiques de l’ordre de la longueur d’onde des
faisceaux utilisés. Pour ces applications, la modélisation des forces optiques mises
en jeu requiert d’estimer à la fois les composantes de diffraction et celles de
réflexion/réfraction. Ceci nécessite de résoudre les équations de Maxwell pour le
système faisceau/particule considéré, ce qui est particulièrement difficile lorsque le
faisceau est gaussien et focalisé à la limite de diffraction avec une très grande
ouverture numérique, ou lorsque la particule est de forme arbitraire.
7.4.1.1. Modèles reposant sur l’approximation dipolaire (Harada and Asakura 1996)
Considérons un faisceau lumineux paraxial de lumière polarisée rectiligne de
longueur d’onde λ qui illumine une particule diélectrique transparente sphérique de
rayon a. Si a est très petit devant λ, la particule voit un champ électrique
harmonique instantané uniforme qui lui donne un moment dipolaire, responsable de
l’émission d’ondes dans toutes les directions de l’espace. Ces ondes émises
24
Nano-optique
modifient la direction du flux d’énergie du système, induisant une modification de la
quantité de mouvement de la particule, et donc une force radiative donnée par :
2
  8
n  m2 − 1  
Frad (r ) = π k 4 a 6 m  2
 I (r ) zˆ ,
c m +2
3
[7.20]
où I(r) est la distribution d’intensité du faisceau, m le rapport ni/nm avec ni
l’indice de réfraction de la particule et nm celui du milieu environnant, k le nombre
d’onde moyen du faisceau et
faisceau incident.
z le vecteur unitaire dirigé suivant l’axe optique du
La particule polarisée subit aussi la force de Lorentz agissant sur les dipôles
induits, qui n’est autre que la force de gradient introduite plus haut :

 2π nm2 a 3  m 2 − 1 

Fgrad (r )
=
 2
 ∇I ( r ) .
c m +2
[7.21]
Bien que ce modèle ne soit valide que pour les particules nettement plus petites
que la longueur d’onde (atomes, protéines, virus), il permet de renseigner quelques
comportements typiques des forces optiques. En particulier, la valeur de m dans
l’équation ci-dessus donne le signe de la force de gradient. Si m est supérieur à 1
(particules de haut indice par rapport au milieu environnant), la force est dirigée
suivant le gradient, donc la particule est attirée vers le maximum d’intensité
lumineuse. Dans le cas des particules de faible indice de réfraction, l’effet est
inverse, ce qui nécessite de piéger ces particules avec des faisceaux non gaussiens
« creux » ou annulaires (de type « doughnuts »).
Les équations précédentes montrent aussi que la force de radiation varie avec le
volume au carré de la particule, alors que celle de gradient ne dépend que
linéairement de ce même volume. Ces deux forces sont par ailleurs proportionnelles
à la puissance laser incidente. En sachant que la force optique radiative due à
l’absorption est aussi proportionnelle au volume et dirigée selon l’incidence
moyenne du faisceau (Nieminen, Knoner et al. 2007), on peut en déduire qu’il est
plutôt facile de piéger des petites particules transparentes, mais que la difficulté
augmente rapidement en cas d’absorption car dans ce cas la force de gradient est
rapidement plus faible que les deux composantes radiatives. Cependant, même pour
des particules transparentes, le piégeage a des limites pour les particules de faibles
diamètres, qui sont soumises à l’énergie cinétique d’origine thermique kB.T (où kB
est la constante de Boltzmann et T la température absolue). Cette énergie,
responsable du mouvement brownien, peut excéder l’énergie limite du puit de
potentiel équivalent lié au piège optique lorsque la particule devient très petite, y
Observer et manipuler à l’aide de faisceaux lumineux focalisés
25
compris pour des puissances laser proches des puissances maximales acceptées par
ces particules. Ainsi, dans le cas ultime du piégeage d’atomes, ces derniers sont
placés dans le vide et à très basse température afin de minimiser au mieux leur
énergie cinétique d’origine thermique.
En effet, la manipulation optique de très petites particules a été étendue aux
atomes pour lesquels la pression de radiation peut devenir très importante, dans le
cas où la longueur d’onde du laser utilisé est au voisinage de résonances atomiques
spécifiques et engendre ainsi de grandes sections efficaces d’absorption (Ashkin
1978). Dans ces conditions, l’atome absorbe puis réémet spontanément la lumière de
façon isotrope, générant un transfert de quantité de mouvement important. Ainsi, on
peut accélérer comme refroidir des atomes (C. Cohen-Tannoudji, S. Chu et W.D.
Phillips, prix Nobel 1997), jusqu’à atteindre la condensation de Bose-Einstein (E.A.
Cornell, W. Ketterle, C.E. Wieman, prix Nobel 2001). A contrario, la réalisation de
pièges atomiques stables impose d'utiliser une fréquence optique très éloignée de
toute résonance, de façon à minimiser la force de radiation (O'Hara, Granade et al.
1999). Le lecteur intéressé aura un bon aperçu de l’application des forces optiques à
la manipulation d’atomes en lisant (Ashkin 2000).
7.4.1.2. Modèles reposant sur l’optique géométrique
Pour les particules grandes devant la longueur d’onde, le modèle proposé par
Ashkin, à partir d’un formalisme initialement développé par Roosen (Roosen and
Slansky 1979), repose sur les lois fondamentales de l’optique géométrique, à savoir
les lois de Snell-Descartes appliquées lors des réflexions/réfractions multiples de
rayons lumineux sur une particule sphérique. Ainsi, on montre qu’une onde plane
incidente sur une sphère diélectrique transparente produit une force, que l’on peut là
encore décrire en deux composantes. La première, F⁄⁄ , est dirigée suivant la direction
d’incidence de l’onde plane, alors que la seconde, F⊥, est orthogonale à cette
direction :
T 2 [ cos(2θ − 2r ) + R cos 2θ ] 
n P
θ
1
cos
2
+
−
R

 ,
1 + R 2 + 2 R cos 2r
c 

F⁄⁄ = m
T 2 [sin(2θ − 2r ) + R sin 2θ ] 
nm P 
F⊥
=
 R sin 2θ −
 ,
1 + R 2 + 2 R cos 2r
c 

[7.22]
[7.23]
où R et T sont les coefficients de réflexion et de transmission en amplitude de
l’onde plane sur la particule, θ et r sont les angles d’incidence et de réfraction de
l’onde plane sur la bille (Ashkin 1992).
26
Nano-optique
En sommant ces deux composantes pour chacune des ondes planes formant le
faisceau réel incident sur la particule, on obtiendra une composante parallèle égale à
la force de pression de radiation, et une composante perpendiculaire égale à la force
de gradient. Ces forces dépendent de la polarisation de la lumière par l’intermédiaire
des coefficients R et T.
Ce modèle ne prend en compte aucun effet lié à la diffraction, et n’est donc
valide que pour de très grandes particules, telles certaines cellules biologiques.
Néanmoins il a permis le développement du piège à faisceau unique pour les
particules micrométriques, fonctionnant grâce à la force de gradient, et
communément appelé pince optique aujourd’hui.
7.4.1.3. Les modèles électromagnétiques rigoureux
Les modèles permettant de résoudre correctement les équations de Maxwell au
niveau du système complet particule/faisceau focalisé sont toujours en
développement, car toujours plus rigoureux au niveau des approximations ou
hypothèses suivies. Il est en effet extrêmement difficile de résoudre rigoureusement
ces équations avec des conditions aux limites appropriées, pour des faisceaux laser
gaussiens extrêmement focalisés.
Les premiers travaux relatifs à la diffraction d’une onde plane par une particule
sphérique homogène sont ceux de Mie et Debye, qui se sont basés sur une théorie
existante donnée par Lorentz. On arrive alors à une théorie de Lorenz-Mie
fondamentalement correcte, valide pour des indices de réfraction, des tailles de
particules sphériques et des longueurs d’onde arbitraires. Une telle limitation à une
onde plane incidente simplifie alors considérablement les choses, puisque dans ce
cas les directions du flux lumineux et du flux de quantité de mouvement sont
identiques, ce qui permet d’écrire ce dernier flux sous forme d’un vecteur dont seule
la composante longitudinale est différente de zéro, par raison de symétrie. Par
contre, si ces directions ne coïncident plus, par exemple à cause d’une distribution
lumineuse non uniforme, il faut écrire le flux de quantité de mouvement à partir du
tenseur des contraintes de Maxwell d’ordre 3. En conséquence, même s’il existe
actuellement de nombreux codes de calculs électromagnétiques disponibles pour
calculer la diffraction de la lumière sur des particules, on ne peut pas espérer les
utiliser pour modéliser les pinces optiques sans faire de modifications conséquentes
pour s’adapter aux faisceaux focalisés.
Les premiers travaux complets allant dans ce sens sont ceux de Gouesbet et al.,
qui par une théorie de Lorenz Mie généralisée décrivent l’interaction entre un
faisceau arbitraire et une sphère homogène constituée d’un matériau isotrope, plongé
dans un milieu environnant supposé transparent (Gouesbet, Maheu et al. 1988).
Dans ce formalisme, les champs électromagnétiques incident et diffusé sont
Observer et manipuler à l’aide de faisceaux lumineux focalisés
27
développés en ondes partielles (Gouesbet, Lock et al. 1995), ce qui permet de
ramener la connaissance de ces champs à celle d’un double ensemble infini de
nombres complexes appelés coefficients de forme du faisceau (Gouesbet and Gréhan
1998). Ces coefficients peuvent être déterminés numériquement grâce à une
approximation dite localisée (Grehan, Maheu et al. 1986), étendue au cas général
d’une onde incidente désaxée (Gouesbet, Grehan et al. 1990) et justifiée
théoriquement de façon rigoureuse. Ainsi, les différentes composantes de la force
optique issues de la théorie de Lorenz-Mie généralisée sont données par :
  nm 2P



C (r ) xˆ + Cpr,y (r ) yˆ + Cpr,z (r ) zˆ  ,
=
F (r )
2  pr,x
c πω0
où les coefficients
[7.23]
Cpr,i sont les sections efficaces de pression de radiation
déterminées par (Gouesbet, Maheu et al. 1988).
Cependant, ces intégrations numériques sont très gourmandes en temps de
calcul, ce qui a probablement limité l’utilisation pratique de la théorie de LorenzMie généralisée jusqu’à maintenant. A noter cependant les deux articles de Nahmias
et al. qui ont repris ce formalisme pour éditer des abaques permettant d’évaluer les
forces axiales et latérales exercées par un faisceau laser focalisé sur des particules
diélectriques transparentes sphériques (Nahmias and Odde 2002; Nahmias, Gao et
al. 2004). Ces abaques sont présentés en vue d’être utilisés spécifiquement par les
utilisateurs de pinces optiques, sur une grande plage d’utilisation (diamètre des
particules sphériques, longueur d’onde du faisceau gaussien, matériaux utilisés).
Néanmoins, le développement de modèles permettant de prendre en compte des
faisceaux extrêmement focalisés, et/ou des particules de formes non sphériques ou
non isotropes, est toujours d’actualité.
7.4.2. Les forces optiques concrètement. Limites et contraintes associées.
En résumé, les forces optiques sont de faible intensité, ce qui limite en pratique
leurs domaines d’utilisation. Pour les particules trop petites, la limite vient de la
diffusion brownienne (voir plus haut). En ce qui concerne les molécules, leur
piégeage direct est d’autant plus compliqué qu’à cette diffusion brownienne s’ajoute
un effet d'absorption dû à leurs niveaux d’énergies internes vibrationnelle et
rotationnelle qui complique sérieusement les conditions de piégeage hors-résonance
utilisées avec succès pour le piégeage atomique. A l’autre extrémité, c'est-à-dire
pour les grosses particules, la limitation provient cette fois de la gravité qui devient
trop importante pour être contenue par les forces optiques. Par contre, entre ces deux
limites, les forces optiques sont en adéquation remarquable avec les forces mises en
jeu en biologie, au niveau des interactions moléculaires. C’est ce qui explique en
28
Nano-optique
grande partie leur intérêt, et donc le développement des pinces optiques dans ce
domaine.
Dans le cas de la manipulation de cellules biologiques individuelles vivantes,
une autre limitation est à prendre en compte, liée à la phototoxicité. Les densités de
puissance obtenues en focalisant un faisceau laser de quelques milliwatts à la limite
de diffraction avec de grandes ouvertures numériques peuvent très vite devenir
gigantesques et détériorer les cellules. C’est pourquoi les longueurs d’onde utilisées
en biologie sont situées dans le proche infrarouge (830nm ou 1064 nm
typiquement), qui correspond à un domaine de transparence de la plupart des
cellules. Par contre, il semble admis que l’eau, à la longueur d’onde de 1µm, subit
un échauffement local autour de la pince optique de l’ordre de 10 K/W, sachant
qu’une variation de son environnement d’un degré peut modifier dans certains cas la
réponse d’une cellule.
Le tableau 7.1 donne un ordre de grandeur des forces optiques applicables avec
quelques montages typiques de pinces optiques, extraites de la littérature pour
différents domaines d’applications. Ce tableau ne donne qu’un aperçu, néanmoins
suffisant pour apprécier la diversité des manipulations optiques effectuées jusqu’à
présent.
Exemples
d’applications
Physique des colloïdes
Dynamique des moteurs
moléculaires
Mécanique moléculaire,
mesure de rigidité de
macromolécules
Adhésion
cellulaire,
mobilité
Mécanique cellulaire
Objets d’intérêt
Arrangements de billes de
silice ou polystyrène de
diamètre < 1µm
Moteurs moléculaires se
déplaçant le long de chaînes
polymères
ADN,
ARN,
autres
macromolécules.
Bactéries, cellules
Cellules individuelles
Forces optiques typiques
mises en jeu
25 fN (démonstration)
0-1 pN (forces inter-particules)
5-7 pN (kinésine sur microtubule)
10-80 pN (ADN)
60-120 pN (titine)
25-30 pN (mycoplasma mobile)
50-600 pN (adhésion membranaire)
200-600 pN (globules rouges)
Tableau 7.1 : Forces optiques typiques mises en jeu dans quelques applications choisies des
pinces optiques. Très souvent dans ces expériences, les forces optiques sont exercées ou
mesurées à l’aide de microbilles de polystyrène ou silice sur lesquelles les objets d’intérêt
sont fixés. Ces billes ont un double intérêt : elles permettent d’obtenir un niveau de force
suffisant grâce à leur indice de réfraction élevé et leur volume micrométrique ; elles offrent
aussi la possibilité de calibrer précisément les forces exercées.
Utilisation de modes exotiques de faisceaux laser
Observer et manipuler à l’aide de faisceaux lumineux focalisés
29
L’absence de diffraction conduisant à des « lignes de focalisation », ainsi que la
petite taille de la région centrale des faisceaux de Bessel offrent des avantages pour
la manipulation optique et le guidage précis d’atomes (Arlt, Dholakia et al. 2001), de
même qu’ils permettent de stocker un ensemble de particules par empilement les
unes sur les autres dans le faisceau (Arlt, Garces-Chavez et al. 2001).
L’utilisation de faisceaux laser exotiques est aussi à la base d’un nouvel axe de
développement actuel du piégeage optique, concernant la mise en rotation de
particules. En effet, il ne faut pas oublier que la lumière peut non seulement
échanger de la quantité de mouvement avec la matière, mais aussi du moment
cinétique. Une lumière polarisée circulairement transporte un moment cinétique de
± par photon, permettant la réalisation de micro-machines actionnées par la
lumière (Friese, Rubinsztein et al. 2001). Cependant, cette technique n’est possible
que si les particules piégées sont biréfringentes ou absorbantes. C’est pourquoi on
préfère utiliser les faisceaux de Laguerre-Gauss qui présentent un moment cinétique
orbital intrinsèque distinct du moment cinétique lié à l’état de polarisation de la
lumière. Avec de tels faisceaux, le contrôle de la rotation des particules piégées est
relativement simple et ne dépend plus directement de leur morphologie (Paterson,
MacDonald et al. 2001).
Distance de travail
Une limitation importante des pinces optiques à faisceau unique est que la zone
de piégeage stable est limitée aux environs immédiats du point de focalisation. Avec
les ouvertures numériques nécessaires à la réalisation du piégeage, ceci implique
qu'en pratique la distance de travail est de l'ordre de 100 µm seulement. Une
alternative consiste à utiliser des objectifs d'ouverture numérique faible (environ 0.1)
qui produisent un effet de guidage laser le long de l'axe optique (la force de gradient
transversale est suffisante pour maintenir la particule sur cet axe). La combinaison
de deux faisceaux de guidage contra-propagatifs permet de réaliser des pièges
stables par l’équilibrage des forces de radiation de chacun des faisceaux, et ceci sur
des distances pouvant approcher le millimètre. Le système a été étendu à l'emploi de
fibres optiques (Constable, Kim et al. 1993); il semble particulièrement adapté au
piégeage de particules dans un environnement microfluidique.
Problème de calibration
La recherche de méthodes fiables et simples d'utilisation de calibration des forces
optiques est toujours d'actualité. En effet, les valeurs typiques de ces forces, souvent
de quelques pN, sont comparables aux forces liées aux fluctuations du milieu dans
lequel est plongée la particule piégée. En conséquence, la quasi-totalité des mesures
effectuées jusqu'ici concernent des microbilles sphériques, pour lesquelles il est
possible d'évaluer la force de viscosité qui relie la bille au milieu environnant,
30
Nano-optique
souvent liquide. On peut alors définir les équations dynamiques régissant le
mouvement d'une bille piégée dans un piège optique, et définir des méthodes
expérimentales de caractérisation du puit de potentiel équivalent (raideur du ressort
équivalent dans le modèle harmonique), ou de la force limite d'extraction du piège
optique. Le lecteur intéressé par ces aspects pourra se reporter à (Capitanio RSI
2002) pour obtenir une description des principales approches suivies.
Outre les difficultés de mesurer les effets des forces optiques sur la particule
piégée, une complication supplémentaire est liée à l'évaluation de la puissance
optique injectée sur l'échantillon à travers l'objectif de microscope. En effet, lorsque
l'ouverture numérique devient importante, cette mesure devient délicate et nécessite
des procédures particulières (Viana, Rocha et al. 2006).
7.4.3. Les principales techniques de pinces optiques
Les pinces optiques « conventionnelles »
La pince optique que l’on peut de nos jours qualifier de « conventionnelle » est
celle qui repose sur le piégeage par un faisceau unique fortement focalisé, grâce à la
force de gradient qui agit comme force de rappel autour de la position d’équilibre de
la particule piégée. La mise en place d’une telle pince sur un microscope est
relativement aisée, puisqu’il suffit de disposer d’un objectif ayant une ouverture
numérique suffisamment grande (généralement supérieure à 1.2), ainsi que de la
possibilité d’injecter un faisceau laser dans cet objectif (souvent par un des ports de
sortie du microscope). Le montage classique est donc équivalent à celui donné sur la
figure 7.1, dans laquelle on ne prend en compte que la mise en place du faisceau
laser incident. Pour des applications en biologie, les longueurs d’onde utilisées sont
situées dans le proche infrarouge (850 nm ou 1 µm) de façon à minimiser leur
absorption dans les milieux biologiques. Les puissances injectées pour réaliser les
pièges sont typiquement de quelques mW à quelques dizaines de mW par piège,
généralement obtenues avec des sources laser continues.
Les pièges multiples
La manipulation simultanée de plusieurs particules piégées fait partie des intérêts
exprimés par les biologistes souhaitant par exemple mettre en interaction plusieurs
cellules de façon contrôlée à la fois dans le temps et dans l’espace, ou encore par
certains physiciens s’intéressant aux interactions entre différentes particules
colloïdales placées dans un ensemble organisé.
Plusieurs voies ont été explorées (figure 7.14). La méthode la plus immédiate
consiste à partager une pince optique conventionnelle unique entre les particules à
Observer et manipuler à l’aide de faisceaux lumineux focalisés
31
piéger, par balayage du faisceau laser focalisé (figure 7.14-2). Si le balayage est
suffisamment rapide devant la fréquence caractéristique du mouvement brownien
des particules, il est alors possible de créer en moyenne un ensemble de pièges.
Ainsi, avec des miroirs piézoélectriques il est possible de piéger des particules de
diamètre 1 µm dans des suspensions aussi peu visqueuses que l’eau (Mio, Gong et
al. 2000). Cette méthode est cependant limitée au piégeage de particules multiples
dans un plan perpendiculaire à l’axe optique, le balayage rapide n’étant
généralement permis que dans des directions latérales.
Figure 7.14: les trois principales méthodes pour obtenir des pinces optiques
multiples. 1 : multiplication des sources, 2 : distribution temporelle par balayage
d’une pince unique, 3 : génération de faisceaux multiples par diffraction.
L’autre grande méthode pour obtenir des positions multiples de piégeage, mais
cette fois dans le volume d’un échantillon, est le recours à des éléments diffractants
tels les hologrammes de phase. On parle alors de pinces optiques holographiques
(Dufresne and Grier 1998), qui ont permis de piéger jusqu’à 400 particules
colloïdales simultanément (Grier 2003). Il s’agit ici de créer par diffraction un
ensemble de faisceaux indépendants orientés de façon à créer chacun un piège
optique après leur passage à travers l’objectif de microscope à grande ouverture
(figure 7.14-3). L’adressage du volume se fait soit par un calcul direct de la structure
diffractante au moyen d’algorithmes de calculs d’hologrammes spécifiques, soit par
l’ajout de lentilles de phase (lentilles de Fresnel) sur les hologrammes de phase ou
sous-unités spatiales d’hologrammes de phase dans le cas où plusieurs plans sont
adressés simultanément, ce qui ne nécessite alors aucun calcul spécifique à l’aspect
tridimensionnel (Belloni and Monneret 2007). Actuellement, l'association
d'algorithmes de calculs perfectionnés et rapides, avec des modulateurs de phase
dynamiques à cristaux liquides, permettent de réaliser des réseaux de pinces
optiques holographiques, non seulement dynamiques mais totalement interactifs, en
temps réel (Leach, Wulff et al. 2006).
On peut noter enfin la possibilité de multiplier les sources laser (figure 7.14-1),
en employant les cavités laser à émission verticale (VCSELs) pour la manipulation
32
Nano-optique
simultanée d’objets, y compris selon des motifs relativement dynamiques (Flynn,
Birkbeck et al. 2002).
7.5. Conclusion
Observer et manipuler avec des faisceaux focalisés sont deux ambitions
aujourd’hui possibles à l’aide des outils théoriques et technologiques présentés dans
ce chapitre. Il est bien évident que notre présentation, même si elle s’appuie sur des
concepts physiques fondamentaux, ne représente qu’une ‘photographie’ de l’état de
l’art en 2008 et que ce domaine est et restera en perpétuelle évolution. Il y a fort à
parier que les prochaines avancées permettront une meilleure description des forces
optiques, que de nouvelles applications verront le jour et que le critère de résolution
d’Abbe sera contourné de façon journalière dans de nombreux microscopes
commerciaux. Cependant il est remarquable de constater qu’il ne s’agit que du
problème de focalisation de la lumière par une lentille… Ce verre à feu, dont fait
référence pour la première fois Aristophane en 423 av. J.-C. dans sa pièce Les
Nuées, n’allait pas seulement embraser les brindilles…
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