DE L`EMPIRISME AU RATIONNEL L`EXEMPLE DU VACCIN
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DE L’EMPIRISME AU RATIONNEL L’EXEMPLE DU VACCIN CONTRE LA TOXOPLASMOSE Pr Daniel Bout UMR Université-INRA Immunologie Parasitaire et Vaccinologie Université de Tours JUSTIFICATION DE LA VACCINATION (Rapport AFSSA, décembre 2005) Gravité potentielle chez Homme Impact économique chez Animal (filière ovine) Contamination humaine par Animal (chat, ovins…) TOXOPLASMA GONDII Hôte définitif : Chat Hôtes intermédiaires : Homme, Ovins, Porc… Trois formes infectieuses Tachyzoïtes Bradyzoïtes (kystes tissulaires) Sporozoïtes (oocystes) Modes d’infection (longueur 6-8 µm, largeur 2-3 µm) Voie orale Voie transplacentaire PREUVE DU CONCEPT DE LA VACCINATION CONTRE LA TOXOPLASMOSE Une 1ère infection par le toxoplasme protège contre une 2ème infection LES VACCINS VIVANTS ATTENUES LES VACCINS VIVANTS ATTENUES Approche empirique S 48 Souche dite « incomplète » LES VACCINS VIVANTS ATTENUES Approche rationnelle Toxo KO Invalidé pour gènes de virulence Toxo KO MIC 1-3 : approche rationnelle Micronèmes, réservoirs intracellulaires d’adhésines Initiation de l’invasion Formation de la vacuole parasitophore Maturation de la vacuole parasitophore ADHESINES : MIC3 MIC1 Seq Sig Propeptide RE-Golgi Lectine Micronèmes EGF TSP MIC4 Apple MIC3 Complexes membranaires MIC1 MIC8 MIC6 Domaine transmembranaire Domaine cytoplasmique Toxo KO : construction Cérède O, Dubremetz JF, Soete M, Vial H, Bout D, Lebrun M. Synergistic role of micronemal proteins in Toxoplasma gondii virulence; J. Exp. Med., 2005, 210:453-63 MIC1 MIC3 ORF MIC1 ORF MIC3 Mic1-3KO HXGPRT CAT Toxo KO : diminution de la virulence injection IP de 20 tachyzoïtes Souris OF1 Test de virulence in vivo 120 100 80 60 40 20 0 mic1KO KO KO Compl. HX % de mortalité 0 10 120 100 80 60 40 20 0 20 30 40 mic3KO 0 10 120 100 80 60 40 20 0 20 30 40 mic1-3KO : absence de mortalité mic1-3KO 0 10 20 30 jours après infection simples invalidés : retard de mortalité 40 Toxo KO : Vaccin efficace contre la toxoplasmose chronique murine Vaccination, 20 Toxo KO 1-3 i.p. 0 Epreuve orale 45 kystes de la souche 76K 71 Kystes cérébraux 101 Réponses immunes Forte réponse humorale Réponse cellulaire Th1 Protection Réduction du nombre de kystes cérébraux > 95% jours Toxo KO : Vaccin efficace contre la toxoplasmose congénitale murine Vaccination, 20 Toxo KO 1-3 i.p. 0 Mise au mâle Epreuve Orale (1♂/3♀) (J11 de la gestation) 60 Césarienne (J17 de la gestation) 77 71 Fin de la gestation 81 Diminution de la transmission materno-foetale non vaccinées % fœtus positifs 33,3 % Mortalité des souriceaux : non vaccinées 40 % Gain de poids normal (= témoins non infectés) Kystes cérébraux (1 mois après la naissance) Réduction du nombre de kystes cérébraux > 91% vaccinées 4.6 % vaccinées 0% jours Toxo KO : Vaccin efficace contre la toxoplasmose congénitale ovine Protocole expérimental 12 brebis pré-Alpes séronégatives témoins 12 brebis pré-Alpes séronégatives vaccinées par voie sous-cutanée avec 105 Toxo KO 1-3 Mise à la reproduction Infection per os à mi-gestation (400 oocystes PRU) Observation des avortements Réponse immunitaire DO J0 1.5 1.0 0.5 0.0 Témoin Toxo KO J 24 J 39 J 98 J 134 Protection Protection Avortements précoces Avortements tardifs (10-15 jours post infection) Non vaccinées 10 6 4 0% Vaccinées 10 0 1 90% Poids (kg) à la naissance Non vaccinées <1.5 Vaccinées >3 Toxo KO : conclusions Avantages Génétiquement défini Efficace Inconvénients A utiliser chez sujets à système immunitaire fonctionnel Stabilité de durée limitée C’est un « vaccin d’étape » LES VACCINS MOLECULAIRES LES VACCINS MOLECULAIRES Approche rationnelle, d’emblée - Ag moléculairement définis - Ag cibles de la R.I. Ce sont les vaccins de demain (ne présentent pas les inconvénients des vaccins vivants) VACCINATION PAR ADN injection Principe: Principe Promoteur eucaryote Gène sélectif pcDNA3 Gène d’intérêt Séquence de polyadénylation Origine de réplication bactérienne Vaccin bombardement instillation Hôte à vacciner VACCINATION par ADN Production des antigènes avec une configuration de protéines natives Forte induction de réponse Forte induction de réponse immunitaire immunitaire Avantages Absence de réversion Coût réduit Mise en œuvre facile VACCINATION par ADN MIC3 Initiation de l’invasion Formation de la vacuole parasitophore - MIC3 = adhésine - Exposition au système immunitaire - Fortement immunogène Maturation de la vacuole parasitophore Construction plasmidique codant pour MIC3 immature Promoteur eucaryote Gène sélectif I Gène MIC3 SS Séquence de polyadénylation Origine de réplication bactérienne pcDNA3-MIC3 immature (pMIC3i) PRO V Lectine EGF II III SS – PRO – MIC3 IV VACCINATION avec pMIC3, pGM-CSF Souris CBA/J contre la toxoplasmose chronique Réponse humorale sérique Analyse des IgG sériques anti-MIC3 à J14, J21 et J35 par ELISA 20 Titre IgG anti-MIC3 (Log2 ± ET) 18 16 J14 14 12 J21 10 J35 8 6 4 2 0 pcDNA3 pMIC3i pMIC3i+pGM-CSF Une forte réponse humorale spécifique Réponse cellulaire (1) Prolifération lymphocytaire splénique, à J45 60000 pcDNA3 pMIC3i pMIC3i+pGM-CSF ∆cpm 50000 40000 30000 20000 10000 0 0 1,88 3,75 7,5 15 TAg (µg/ml) Une prolifération spécifique et significative 30 60 Réponse cellulaire (2) Cytokines Cytokines (pg/ml) Lot pcDNA3 pMIC3i pMIC3i+pGM-CSF IL-2 IFN-γ (ng/ml) IL-4 27 ± 9 10 ± 1.3 11 ± 0.3 29 ± 10 32 ± 14 33 ± 10 210 ± 45 242 ± 57 112 ± 11 IL-10 281 ± 167 332 ± 228 343 ± 226 Absorbance à 405 nm Sous-classes d’IgG anti-MIC3 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 pcDNA3 pMIC3i pMIC3i+pGM-CSF IgG IgG1 IgG2a IgG2b Une réponse cellulaire spécifique Th1 IgG3 22/11/2004 Évaluation de la protection Moyenne du nombre de kystes ± ET Diminution de la charge parasitaire cérébrale 7000 6000 5000 4000 57% 3000 74% 2000 1000 0 pcDNA3 pMIC3i Protection efficace et significative pMIC3i+ pGM-CSF AUTRES CONSTRUCTIONS PLASMIDIQUES Promoteur eucaryote Gène d’intérêt Gène sélectif Plasmide pcDNA3 Séquence de polyadénylation Origine de réplication bactérienne GRA4 NQT SAG1 NAS QAS pcDNA3-GRA4 (pGRA4) Ancrage GPI pcDNA3-SAG1mut (pSAG1) Vaccination avec pGRA4, pSAG1, pGM-CSF C57BL/6 Contre la toxoplasmose aiguë Réponse immune et évaluation de la protection Réponse cellulaire proliférative ∆ CPM 30000 % survie pGRA4+pSAG1 + pGM-CSF 87% pGRA4+pSAG1 75% 15000 pGRA4 62% 10000 pSAG1 60% 25000 20000 5000 pcDNA3 0 0,9 1,8 3,7 7,5 15 30 60 ET µg/ml (Mévélec et al.,Vaccine, 2005) 0% Vaccination avec pGRA4, pSAG1, pGM-CSF Souris OF1 contre la toxoplasmose congénitale Évaluation de la protection Nb moyen de souriceaux vivants par portée Poids des souriceaux à J 30 Souriceaux nés de mères 16 14 non infectées 12 10 vaccinées infectées 8 6 infectées 4 0 5 10 15 20 Poids (g) 2 pcDNA3 infectées 0 0 2 4 6 8 10 12 14 16 Jours après la mise bas (Mévélec et al.,Vaccine, 2005) 25 30 STRATEGIES D’OPTIMISATION GM-CSF Vecteur bicistronique Ciblage des CPAs Lactadhérine : Tétraspanine (CD9) Lactadhérine CMH I Exosome de cellule dendritique Thé Théry et al. al. 1998 « Prime boost » ADN puis Ag protéique ) hsc73 CMH II B7.2 LES VACCINS MOLECULAIRES - Vaccins inertes (non vivants, non réplicatifs) (ne présentent pas les inconvénients des vaccins vivants) - Doivent encore être optimisés Ce sont les vaccins de demain
