IMAGERIE TISSULAIRE PAR MICROSCOPIE DE SECONDE

Université du Québec
Institut National de la Recherche Scientifique
Centre Énergie Matériaux et Télécommunications
IMAGERIE TISSULAIRE PAR MICROSCOPIE DE SECONDE
HARMONIQUE INTERFÉROMÉTRIQUE
Par
Maxime Rivard
Thèse présentée pour l’obtention du grade de
Philosophiae doctor (Ph.D.)
en sciences de l’énergie et des matériaux
Jury d’évaluation
Président du jury et Andreas Peter Ruediger
examinateur interne INRS-ÉMT
Examinateur externe Marie-Claire Schanne-Klein
Laboratoire d’Optique et Biosciences
École Polytechnique, France
Examinateur externe Caroline Boudoux
Département de Génie Physique
École Polytechnique de Montréal
Directeur de recherche François Légaré
INRS-ÉMT
© Droits réservés de Maxime Rivard , 29 mars 2016

iii
RÉSUMÉ
La microscopie optique non linéaire est un domaine qui a beaucoup évolué dans les derniers 25
ans. Ses applications en biologie pour l’étude des tissus sont nombreuses. Dans ce domaine, la
microscopie de génération de seconde harmonique (GSH) est une technique d’imagerie qui se
distingue des autres par son mécanisme de contraste unique, qui permet d’imager les structures
non centrosymétriques comme le collagène des tissus conjonctifs, la myosine des tissus
musculaires et certains cristaux optiques non linéaires.
Toutefois, la microscopie GSH ne mesure que l’irradiance du signal GSH et sa phase est perdue.
Cela pose problème puisque la phase du signal GSH contient de l’information sur l’orientation
des molécules non centrosymétriques dans la zone imagée. Il faut donc trouver un moyen de
mesurer la phase du signal GSH pour améliorer notre interprétation des images GSH dans les
tissus biologiques.
Cela est possible en combinant l’interférométrie et la microscopie GSH. L’objectif de ce projet
est donc de construire un microscope GSH interférométrique pour mesurer la phase relative du
signal GSH dans les tissus biologiques et utiliser ces nouveaux résultats pour faire une meilleure
interprétation des images obtenues en microscopie GSH dans ceux-ci.
Cette thèse présente une revue historique de la microscopie, de l’optique non-linéaire et de la
microscopie optique non-linéaire. La théorie de la génération de seconde harmonique y est
détaillée, dans un contexte de microscopie. La structure des tissus musculaires et des tissus
conjonctifs de collagène y est résumée, en mettant l’emphase sur leurs propriétés optiques non
linéaires. L’histoire et la théorie de la microscopie GSH interférométrique y sont également
abordées. La conversion d’un montage en microscope GSH interférométrique et le protocole à
suivre pour s’en servir y sont expliqués. Finalement, les résultats de la microscopie GSH
interférométrique dans un cristal de niobate de lithium périodiquement orienté (PPLN), dans un
tissu musculaire et dans différents tissus de collagène y sont présentés et interprétés. Pour les
tissus de collagène, les résultats des simulations réalisées dans un modèle que nous avons
développé y sont également présentés et interprétés.

iv
Le microscope GSH interférométrique a permis d’imager les domaines de polarités opposées
dans le cristal PPLN, dans les tissus musculaires et dans les tissus de collagène. Cela démontre
que le montage fonctionne correctement et peut servir à l’imagerie des tissus biologiques. Les
domaines dans les tissus musculaires sont similaires à ceux du cristal PPLN, tandis que les
domaines dans les tissus de collagène font plusieurs centaines de microns de long et quelques
microns à quelques dizaines de microns de large. Des images de la phase du signal GSH ont
également été obtenues.
Les résultats dans les muscles ont permis de mettre en évidence la bipolarité des filaments de
myosine. Un modèle a été mis au point pour expliquer les résultats dans les tissus de collagène.
Dans celui-ci, les fibrilles de collagène sont représentées par de longs cylindres ayant une
polarité χ(2) aléatoire qui est maintenue sur toute leur longueur. Des simulations réalisées à partir
de ce modèle donnent des résultats en accord avec ceux obtenus en microscopie GSH
interférométrique. La combinaison de tous ces résultats a permis d’établir une corrélation entre la
largeur de la distribution de la phase, le ratio de fibrilles ayant des polarités opposées dans une
région donnée (ratio f ) et l’irradiance du signal GSH dans les domaines des tissus de collagène.
La polarité aléatoire des fibrilles de collagène donne lieu à une structure complexe dans les tissus
qui permet d’expliquer les modulations importantes du signal GSH dans la direction avant. Les
longues et fines structures visibles dans les images GSH du signal avant ne sont pas des fibrilles
individuelles, mais sont causées plutôt par la variation du ratio f et de l’accord de phase lorsque
le point focal est déplacé dans le tissu. Les images GSH interférométrique et notre modèle
permettent donc de faire une meilleure interprétation des images GSH des tissus de collagène.
Finalement, certaines améliorations peuvent être apportées au montage pour augmenter la
sensibilité, accélérer l’acquisition des images et obtenir la phase en temps réel. D’autres tissus
biologiques, comme le cartilage (riche en collagène type II), devraient également être imagés
avec cette technique. L’approximation du ratio f à partir de la largeur de la distribution de la
phase dans les domaines des tissus de collagène doit être poussée plus loin.
Mots clés : Microscopie, seconde harmonique, GSH, interférométrie, optique non linéaire, laser,
collagène, tissus biologiques, phase, polarité, tendon, fascia, muscle.

v
ABSTRACT
Nonlinear optical microscopy is a field that evolved a lot in the past 25 years. It has many
applications in biology for tissue imaging. Within this field, second harmonic generation (SHG)
microscopy is a technique that differentiates itself from others by its unique contrast mechanism.
It allows imaging of noncentrosymmetric structures such as collagen in connective tissues,
myosin in muscular tissues and some crystals with nonlinear optical properties.
However, SHG microscopy can only measure the intensity of the SHG signal. Its phase is lost,
which is a problem since the SHG phase contains information on the orientation of the
noncentrosymmetric molecules in the imaged area. A mean to measure the phase of the SHG
signal must be found in order to improve our interpretation of SHG images taken in biological
tissues.
This can be achieved by combining interferometry and SHG microscopy. The goal of this project
is to build an interferometric SHG microscope that can measure the relative SHG signal phase in
biological tissues. These new results will then be used to find a more accurate interpretation of
the images obtained with SHG microscopy in these tissues.
This thesis contains a historical review on microscopy, on nonlinear optics and on nonlinear
optical microscopy. The theory behind second harmonic generation, in the context of
microscopy, is presented in details. The structure of muscle tissues and connective tissues rich in
collagen are explained, with an emphasis on their nonlinear optical properties. The history and
the theory behind interferometric SHG microscopy are also explained in details. The conversion
of a microscope setup into an interferometric SHG microscope and the protocol that must be
followed to use it are also presented in this work. Finally, this thesis presents and explains the
results obtained with interferometric SHG microscopy in a periodically poled lithium niobate
(PPLN) crystal, in muscular tissue and in different connective tissues rich in collagen. The
results of simulations performed with a model that we developed for collagen tissues are also
presented and explained.