Une méthode de production simple, adaptable et à rendement élevé

L-11993
Une méthode de production simple,
adaptable et à rendement élevé de
l’interféron humain recombinant
RÉSUMÉ
Les interférons sont des cytokines ayant actuellement de grandes possibilités
d’application en médecine. Jusqu’à maintenant, la production des cytokines
recombinantes par des systèmes mammifères n’avait pas encore explorée en
profondeur en raison des limitations de la productivité volumétrique. La présente
technologie procure un clone stable dérivé de la lignée de cellules mammifères
HEK293 qui produit de grandes quantités d’interféron alpha-2b (IFN-α2b)
glycosylée humaine biologiquement active, ainsi qu’un procédé de récupération
rapide et efficace offrant un rendement élevé et une grande pureté. De concert,
elles permettent la production efficiente d’un IFN-α2b biologiquement plus actif
que la forme non glycosylée produite par Escherichia coli.
ont été utilisés afin de produire des clones producteurs d’IFN (no CNRC 11565 et
11266). Un clone produisant de manière stable de grandes quantités d’IFN-α2b
tout en maintenant un taux de croissance élevé a été choisi. À l’aide d’un essai
faisant appel à un gène rapporteur, il a été établi que ce clone produisait un IFNα2b biologiquement actif. En outre, un procédé de purification offrant une grande
pureté et à un haut rendement a été mis au point. Selon ces résultats, il est possible
de produire de manière rentable de l’IFN-α2b à partir de cellules humaines et de
purifier une forme active glycosylée.
APPLICATIONS
Opportunités de marché importantes
• Production et purification volumétrique élevée de l’IFN-α2b humain glycosylé
recombinant.
• Possibilité de production à grande échelle d’autres interférons et cytokines.
CONCEPT
En raison de leur activité antivirale, antiproliférative et immunomodulatoire,
les interférons sont utilisés en tant qu’agents thérapeutiques. Dans la famille
des interférons, l’interféron alpha-2b (IFN-α2b) est le sous‑type prédominant.
Parmi les nombreuses maladies traitées par l’IFN-α2b, seul ou en association,
citons l’hépatite B et C et plusieurs cancers. Actuellement, l’IFN-α2b humain
recombinant utilisé en médecine est synthétisé par des systèmes bactériens. L’un
des inconvénients majeurs de ces systèmes est la nécessité de recourir, d’une
part, à une étape de repliement protéique qui confère à l’IFN-α2b recombinant
une structure tridimensionnelle la rendant active et, d’autre part, à une étape de
couplage au PEG pour atténuer les conséquences négatives associées à la forme
non glycosylée de la protéine. Non seulement ces processus additionnels diminuent
le rendement (généralement < 20 %), mais ils peuvent également réduire l’activité
spécifique et induire une réponse immunitaire. Pour pallier les inconvénients des
systèmes d’expression bactérienne, une lignée de cellules mammifères HEK293
exprimant de manière constitutive la protéine EBNA1 du virus EBV (clone 6E)
ainsi qu’un plasmide dérivé du vecteur pTT contenant le gène de l’IFN-α2b humain
Lavage
Élution
5.5
1200
5.0
1000
IFN-α2b
800
600
4.5
4.0
400
3.5
200
0
kDa
200
116
97
66
55
6.0
1400
pH
Absorbance (mAU, 280 nm)
Écoulement
200
400
600
800
Volume (mL)
1000
1200
2
3
4
5
6
37
31
On estime que le marché mondial de l’interféron alpha est actuellement d’environ
2,5 milliards de dollars américains. L’incidence en hausse de certains cancers et
hépatites virales ainsi que les recherches en cours sur les nouvelles applications
thérapeutiques de l’IFN-α2b ont pour effet d’augmenter les besoins en IFN-α2b
humain recombinant. Le marché des médicaments génériques pourrait aussi
connaître une croissance importante puisque la protection conférée par un brevet
pour l’IFN-α2b est récemment arrivée à échéance.
Production et rendement d’IFN-α2b supérieurs
La production volumétrique et le rendement de l’IFN-α2b fabriqué par les cellules
HEK293 sont comparables à certains lots d’IFN-α2b non glycosylé produits par
E. coli et la levure méthylotrophique Pichia pastoris. La production volumétrique
d’IFN-α2b réalisée par le clone HEK293 cultivé pendant moins de 8 jours était
reproductible et avait largement dépassé 200 mg/L dans un milieu de culture sans
sérum. La méthode simple, rapide et rentable mise au point pour la récupération
de l’IFN-α2b produit par les cellules HEK293 a donné de l’interféron pur à 98 %
avec un rendement supérieur à 75 %. En outre, la productivité en IFN-α2b de ce
clone est demeurée stable en absence d’une pression de sélection pendant plus de
9 mois de culture.
Modifications post-traductionnelles appropriées
et bonne activité biologique
L’une des principales raisons pour lesquelles on utilise des cellules mammifères
pour produire l’IFN-α2b à des fins thérapeutiques est l’obtention de protéines
glycosylées ayant une bonne activité biologique. L’IFN-α2b produit par les
cellules HEK293 est 0‑glycosylé et considérablement sialylé. L’O‑glycosylation
est semblable à celle de l’IFN-α2b produit par les leucocytes du sang périphérique
humain. De plus, il a été montré que le peptide signal était correctement traité, et
un essai faisant appel à un gène rapporteur a démontré que la protéine est au moins
aussi active que l’IFN-α2b d’origine bactérienne.
Hôte approprié pour la production à grande
échelle d’autres interférons et cytokines
22
14
6
3.0
0
1
CARACTÉRISTIQUES ET AVANTAGES
3.5
Purification de l’IFN- α 2b. Le milieu de culture cellulaire a été acidifié, clarifié
par centrifugation, et filtré. Le milieu clarifié a été chargé sur une colonne
échangeuse de cations et le matériel retenu a été élué avec un gradient de pH.
Figure de droite: ligne 1: milieu de culture cellulaire recueilli; ligne 2: précipité
acide; ligne 3: milieu clarifié après acidification; ligne 4: Écoulement durant le
chargement de la colonne; ligne 5: fractions de lavage; ligne 6: Pic d’élution de
l’interféron à pH 4.5-5.0.
Hormis le clone cellulaire HEK293 mentionné précédemment, les systèmes
d’expression mammifères produisent généralement des quantités beaucoup plus
faibles de cytokines recombinantes. Par conséquent, la capacité des cellules
HEK293 à s’adapter à une cytokine inhibant la croissance laisse croire que cellesci pourraient être des hôtes appropriés pour la production à grande échelle d’autres
interférons et cytokines.
PROPRIÉTÉ INTELLECTUELLE
Production et purification d’interférons recombinants (no CNRC 11993).
CONTACTS
Yves Quenneville
Tél. : (514) 496-8507
Agent de développement des affaires
Courriel : [email protected]
Daniel Desmarteaux
Tél. : (514) 496-5300
Agent de développement des affaires
Courriel : [email protected]
Dr Yves Durocher
Tél. : (514) 496-6192
Groupe Technologies des cellules animales
Courriel : [email protected]
IPSO 11993 14/04/09