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Parcours 3 Cours 11 27/01/2016 Dr Jacinta Bustamante [email protected] RT : BERTHERAT Irene BAUDELIN Camille BEN MOUL BLED Ademe BERD Ted RL : RAZAFINIMANANA Andry LOUBEYRE Elise Génétique des maladies infectieuses Plan : I. II. III. Généralités a. Modèle proposé b. Importance de lier les maladies infectieuses à des maladies génétiques c. Facteurs qui influencent l'expression clinique de la maladie d. Modèle humain ou animal e. Méthodes de recherche chez l'homme Déficits immunitaires a. Présentation des déficits immunitaires primaires typiques –ou classiques, conventionnels) et atypiques (non classiques, non conventionnels) b. Déficit immunitaire primaire c. Classification des déficits immunitaires primaires d. Branches du système immunitaire e. 2 exemples de déficits immunitaires primaires et classiques i. SCID ii. CID f. Méthode d'étude des déficits immunitaires non classiques Exemple de 2 microbes non opportunistes a. Streptococcus pneumoniae b. Herpes virus Introduction : Nous allons nous intéresser aux infections, à la génétique, tout ceci étant lié à l’immunologie. On va donc étudier des déficits immunitaires dont la porte d’entrée est généralement une infection. La cause de ce type de déficit immunitaire est généralement génétique. On va donc chercher la mutation causale, et pour pouvoir la classer en « mutation » et non plus « variation » nous devons l’étudier et la caractériser. La biologie cellulaire permet de caractériser les maladies en laboratoire de recherche ou hospitalier. I. Généralités Les maladies infectieuses sont des modèles pour l'étude des maladies génétiques. On relève 2 questions importantes concernant les maladies infectieuses : Pourquoi certains enfants développent des infections (parfois très graves) alors qu'ils reçoivent la même exposition que d'autres qui sont sains (parfois même dans une même famille) ? Quel est le rôle de chaque type cellulaire et molécules dans l’immunité qui va contrôler ces infections ? Il y a 2 réponses importantes : Pouvoir arriver au diagnostic de l’infection (il y a la partie diagnostic génétique, utile aux patients et à sa famille) A partir du microbe, identifier la voie de signalisation importante soit pour la susceptibilité soit pour la résistance à cette infection. Pouvoir trouver quelle est la maladie génétique et avoir un traitement. Il existe des maladies où il y a des individus qui peuvent avoir la même mutation, au même stade que le patient, et pourtant ils ne développent pas la maladie. Le traitement peut être ciblé : même si le patient est susceptible de faire une infection, en dehors du traitement qui va cibler l’infection (comme les antibiotiques ou les antiviraux), on peut ajouter d’autres types de molécules qui vont raccourcir la période active de l’infection. Certains patients ont une maladie génétique sévère entraînant une susceptibilité à plusieurs infections, une greffe de moelle osseuse étant alors nécessaire. Une mutation peut agir de plusieurs façons différentes, il faut donc la caractériser : Certaines maladies sont causées par plusieurs mutations sur le même gène et selon le type de mutation, on obtient des maladies complétement différentes. On cherche à expliquer ce qui se passe chez l’homme en utilisant l’homme comme modèle et non l’animal. a. Modèle proposé Les maladies infectieuses chez les enfants ont, souvent, des traits de transmission dits mendéliens. Ce sont des variations rares (mutations) dans le génome, qui sont responsables des maladies génétiques. En revanche, lorsqu’on va vers l'âge adulte, ces maladies infectieuses peuvent être expliquées par l’association de variations fréquentes, polymorphismes (moins rares) dans le génome, qui sont en cause, et les infections ne sont pas aussi sévères. Dans le cas d'une infection biliaire disséminée et sévère chez l'enfant, causée par un tuberculosis, on recherche des mutations, qui sont des variations très rares dans le génome. Cette maladie génétique passe en général par la voie d’interféron gamma. Alors que pour une infection moins sévère chez l'adulte (tuberculose pulmonaire), on cherche de variations plus fréquentes (polymorphisme) dans la population. On a alors une expression clinique complétement différente : un seul organe est touché (le poumon, alors que l’infection biliaire chez l’enfant est disséminée et plusieurs organes sont touchés). b. Importance de lier les maladies infectieuses à des maladies génétiques Les maladies infectieuses doivent être liées à des maladies génétiques, qui entraînent par la suite un impact sur le système immunitaire. Cela est important pour 2 raisons : Importance clinique Cela permet le diagnostic de la maladie, qui lie la partie génétique aux différentes manifestations cliniques. Ex : Des pathologies cliniquement assez sévères comme la méningite, peuvent être en lien avec un déficit de l'immunité innée, ou avec une asplénie (absence de rate), d'origine génétique. On veut alors identifier le gène causal et son mode de transmission, notamment pour réaliser un diagnostic génétique au sein de la famille (exemple : des frères et sœurs). Cela marche également dans l’autre sens : l’infection peut permettre de découvrir la voie altérée et ainsi de déterminer le gène en cause dans la maladie. Du point de vue du traitement, on sait selon le problème génétique de l'enfant à quels microbes il peut être susceptible, et on peut raccourcir la période active de la maladie, avec la recherche du microbe, un traitement ciblé à ces microbes (exemple : des antibiotiques, des antiviraux,…) et parfois d'autres molécules, comme l'interféron gamma (exemple : dans le cadre d’une infection à mycobactérie). Lorsque l’on connaît le gène en cause dans la maladie, il est également plus facile d’effectuer le traitement puisqu’on agit directement sur la mutation. NB : Certaines maladies infectieuses nécessitent parfois des traitements de fond, comme la greffe de moelle, la thérapie génique… Implications biologiques Utiliser les propres cellules du patient pour pouvoir caractériser sa maladie (modèle humain). c. Facteurs qui influencent l'expression de la maladie On propose la « Théorie de la Maladie infectieuse » pour expliquer la survenue de ces maladies. Plusieurs éléments (qui sont appelés « théories » dans le cours, mais qui sont en fait plus des « facteurs ») concourent à donner le phénotype clinique final de la maladie infectieuse. Les facteurs dus à l’environnement - Le milieu écologique à proprement parler - La microbiologie : l’exposition au microbe et sa virulence Les facteurs dus à l’hôte : - Le terrain immunologique - Le terrain génétique L’addition de tous ces facteurs va entrainer la naissance de la maladie clinique au niveau du phénotype. Il existe des facteurs génétiques et des facteurs non génétiques. On a donc d’un côté le phénotype clinique, et de l’autre le phénotype biologique, parfois exprimé parce que l’expression d’une protéine très réactive est nulle, ou qu’il n’y a pas de production des anticorps ou de cytokines pro inflammatoires. d. Modèle humain ou animal : avantages et inconvénients Pour étudier ces maladies, on peut utiliser deux types d’approches qui sont complémentaires : - Le modèle expérimental, qui peut être in vivo sur des animaux, ou même in vitro sur une lignée de cellules. On peut étudier ici directement pourquoi une certaine voie de signalisation est altérée dans une maladie particulière. Il est possible de moduler les informations mais le risque est de s’éloigner de la réalité. - Le modèle in natura c’est à dire qu’on étudie tout ce qui se passe chez un grand nombre d’individus : c’est une recherche dite observationnelle. Elle est très réaliste puisque représentative des conditions naturelles, mais de faite elle est limitée et ne permet pas d’études précises. Elle permet d’étudier les populations. Le modèle animal et le modèle humain présentent tous deux des avantages et des inconvénients. Avec le modèle humain, on peut choisir de faire une analyse selon les individus ou selon les populations (certaines étant plus sensibles que d'autres à certains microbes) dans l’environnement auquel ils appartiennent. On peut avoir une susceptibilité spécifique selon l’individu ou à un groupe d’individu. Avec le modèle animal au contraire, les observations sont parfois très éloignées de ce qu’on observe in natura. On examine toujours la transmission microbienne de manière naturelle pour l'homme, ce qui n'est pas forcément le cas pour le modèle animal, dans lequel on peut transmettre l'infection de manière différente. Ex : pour étudier certains types de myobactéries, la contamination chez l'homme se fait principalement par les voies aériennes, alors que chez l'animal, l'injection des myobactéries peut être intranasale ou intrapéritonéale, et se fait à dose fixe, ce qui pose des problèmes d'interprétation quant à la pertinence de ces données chez l'homme. Limites éthiques pour le modèle humain Exemple : On ne peut pas faire de biopsie de neurones dans le cas d'une encéphalite herpétique chez l'homme, mais cela est possible avec le modèle animal. On ne peut pas pratiquer de biopsie de la rate. En revanche, on peut parfois tenter de caractériser la maladie chez l'homme à l'aide de cellules sanguines périphériques, mais là encore, il y a des limitations éthiques à prélever beaucoup de sang à des enfants (ce sont généralement les cellules du sang qui sont étudiées dans les maladies infectieuses). De plus, on n’a pas toujours la certitude de l’origine ethnique des patients, pour comparer les populations. Au contraire, dans le modèle animal on a une grande liberté de choix : on peut choisir le nombre de sujets à étudier, le nombre de microbes inoculés, le mode d’infection (intra péritonéale, intra nasale, intra veineuse…), la voie d’administration, la dose etc. on essaye de combiner les 2 modèles Il faut toutefois rester vigilants, car les informations apportées par le modèle animal peuvent être très différentes des mécanismes effectifs chez l’Homme. Exemple : Chez la souris, la délétion du gène IRA4 donne une susceptibilité à différents micro organismes, tandis que chez l’Homme des mutations nulles sur ce gène donnent une susceptibilité aux infections à bactéries biogènes. e. Méthode de recherche chez l'homme On différencie : Maladies génétiques mendéliennes dues à des mutations, définies par leur fréquence (très rares, <1%) sévères, disséminées, parfois dues à des micro-organismes atypiques, et souvent déjà développées pendant l’enfance. Maladies génétiques dues à l’association de polymorphisme (fréquence >1%) dont l'impact dans l’expression clinique est mineur (par rapport aux maladies mendéliennes), (tuberculose pulmonaire, lèpre). C'est la combinaison d'un ensemble de variations retrouvées dans les gènes qui peut amener un problème. Les maladies monogéniques donnent l’expression d’un déficit immunitaire primaire. Caractéristique familiale : par interrogation on voit qu’il y a toujours des enfants décédés très jeunes Parfois il n’y a pas de récurrence, c’est causé à un microbe commun. Il y a des cas sporadiques = 1 seul individu au sein d’une famille, la personne n’a pas d’autres susceptibilités en dehors de cette infection. Lorsqu’on fait les tests classiques (Nombre, pourcentages lymphocytes T et K) Dans ce cours, on se focalisera plus particulièrement sur les maladies mendéliennes. II. Déficits immunitaires Pour passer d’un gène candidat à une mutation il faut un test fonctionnel avec des cellules humaines dans ce cas. a. Présentation des déficits immunitaires primaires typiques (ou classiques) et atypiques Les déficits immunitaires primaires se dévoilent surtout chez des enfants. Ils se manifestent souvent par une susceptibilité à des infections multiples, récurrentes et disséminées, induites par des microbes opportunistes (c'est à dire qu'ils ne sont pas pathologiques). Parfois, ces déficits immunitaires se présentent par des maladies auto-immunes ou parfois dermatologiques. Un exemple est celui des enfants bulles, pour lesquels une infection par n'importe quel microbe ou champignon, même courant, est potentiellement mortelle. Pendant très longtemps, on a pensé que les déficits immunitaires étaient uniquement dus à ces microbes opportunistes, et que les cas graves étaient la conséquence d’accumulation de différents microbes. Il faudra attendre les années 1990 pour que l’hypothèse de déficits immunitaires, révélés par un cas sporadique – une seule personne dans une famille, et la personne atteinte n’a pas d’autres susceptibilités - soit avancée. Les déficits immunitaires non conventionnels ou atypiques, la personne atteinte n’a pas d’anomalie témoignant d’une déficience immunitaire (pas de dépistage par test classique, par recherche du nombre et du pourcentage de lymphocytes T B… et étude de l’expression oxydative). b. Déficit immunitaire primaire On parle de déficit immunitaire primaire classique ou conventionnel dans le cas d'infections sévères, multiples, récurrentes, rares, opportunistes, familiales. Dans ce cas, on est intéressé par l'étude de grandes familles informatives qui comportent de nombreux individus touchés, notamment des familles consanguines. On parle de déficit immunitaire primaire non conventionnel ou atypique dans le cas d’une infection (parfois sévère, même si elle n'est intervenue qu'une seule fois) qui a été causée par un microbe commun chez un individu dont le système immunitaire semble en tout point comparable au contrôle dans le cadre des études visant à dévoiler un déficit immunitaire classique (selon les tests d’études d’un déficit immunitaire primaire et classique). On peut tout de même supposer qu'il a un problème au niveau de son système immunitaire dans ces conditions, à partir du moment où il y a infection. La caractéristique familiale implique qu’en interrogeant la famille, on avait toujours des enfants décédés dans la première année de vie. 2013 : >220 maladies génétiques identifiées qui correspondent à un déficit immunitaire primaire, pour à peu près 200 gènes touchés. Ces maladies affectent environ 1 naissance/5000. Identification des gènes en cause dans les déficits immunitaires primaires Il y a eu une explosion dans les années 2007 des découvertes de mutations, grâce à la survenue des nouvelles technologies qui autorisent le séquençage des régions codantes ou de tout le génôme. A partir de 2010, la plupart des déficits immunitaires qui sont identifiés vont se faire à partir d’un seul cas. c. Classification des déficits immunitaires primaires Classiquement, les déficits immunitaires ont été classés selon le défaut qu'ils engendrent. Classification des phénotypes immunitaires en 6 classes : 1) déficit immunitaire combiné sévère (affecte particulièrement les lymphocytes T et B) 2) déficit qui affecte principalement la production des anticorps. 3) défauts de la fonction des phagocytes 4) défauts du système immunitaire inné 5) défauts d'homéostasie 6) pathologies auto-inflammatoires Ce classement n'est pas parfait. Parfois, des gènes n'appartiennent pas strictement à une seule catégorie, mais correspondent à plusieurs à la fois. On a également identifié des phénocopies, c’et à dire des maladies qui ressemblent en tous points à des maladies inflammatoires, mais qui sont en faite dues à des auto-anticorps. Pour qu’il y ait expression clinique de la maladie, plusieurs facteurs doivent être réunis. La présence du microbe et l’infection de l’hôte par celui-ci est nécessaire mais il doit aussi y avoir réponse de l’hôte (plus ou moins vulnérable donc plus ou moins susceptible de développer une infection). Après exposition au micro-organisme infectieux, l’immunité adaptative de l’hôte se met en place et plusieurs composantes vont participer au fait qu’il y ait ou pas de phénotype clinique ou de phénotype biologique (sans signes clinique.) On retrouve 4 composantes : - Facteurs microbiens - Facteurs non microbiens - Facteurs génétiques de l’hôte - Facteurs non génétiques Selon la virulence du microorganisme et selon la vulnérabilité (génétique) de l’hôte, on a ainsi une limite entre une personne infectée saine ou infectée malade qui ne dépend pas seulement du microbe. En effet il existe des prédispositions génétiques donnant lieu à des déficits immunitaires. Pour mettre en évidence les séquences du génome responsables de ces vulnérabilités, il existe deux modèles : un modèle humain, un modèle animal ou combiner les deux. Chaque modèle a des avantages et des inconvénients. On peut étudier la réponse de l’hôte à l’infection dans la nature (in natura) : c’est une étude de type observationnelle, mais aussi en laboratoire in vivo ou en laboratoire in vitro : ce sont des études dites expérimentales. Dans les études in natura on étudie les populations dans la réalité, dans leur milieu naturel, dans les conditions de vies normales : c’est plus véridique. Dans le modèle humain : on observe des résultats propres à l’Homme, on élimine le biais que peut représenter une variabilité de réponse selon l’espèce. On obtient le reflet de ce qui se passe vraiment au sein de la population mondiale. De même on peut voir la réponse de chaque type cellulaire à l’infection et adapter notre analyse et notre recherche du gène causal. Cependant on ne peut pas réguler la dose de microbe reçu, on part de cas clinique de personnes immunodéficientes ayant été infectées par un microbe particulier et on recherche le gène causal. Par éthique expérimentale, on ne va pas injecter des doses variées d’un agent infectieux. Par ailleurs, une autre difficulté du modèle humain est l’éloignement physique des cas cliniques. Parfois les patients sont à de très longues distances les uns des autres et le transport de cellules ou de prélèvements biologiques sont compromis. On peut aussi étudier la variabilité selon l’âge, selon l’origine ethnique et familiale, selon le type d’infection ou selon la vaccination. Dans le cas du BCG, on peut étudier et mesurer la susceptibilité d’une personne à contracter la maladie et à réagir à l’infection. Dans le modèle animal : on a un nombre quasi-illimité de cellules ou d’organismes qui peuvent avoir des origines/races différentes, ce qui permet aux chercheurs de se constituer un panel de cas cliniques reflétant la variabilité interindividuelle d’une population. Cependant les modifications expérimentales de génome animal ne sont pas forcément un modèle fiable à 100% : une souris KO pour un gène donné ne va pas réagir exactement de la même manière qu’un humain n’ayant pas ce gène. On peut choisir la voie d’administration pour inoculer le microorganisme mais ce n’est pas toujours la même que chez l’homme. On peut également moduler la dose d’agent infectieux administrée (pas chez l’homme !). Par ailleurs il n’y a pas le problème de l’éthique expérimentale : on peut prélever tout type de cellule, on peut les exposer à différentes doses, faire de la culture cellulaire etc. A partir de 27 min sur l’enregistrement : Le premier gène identifié comme étant en cause dans une immunodéficience a été trouvé en 1980. Selon le rapport annuel de la commission d’expert en déficit immunitaire, on voit en 2007 un pic de diagnostiques et de découvertes de maladies génétiques d’immunodéficience dues aux progrès technologiques de l’époque : le séquençage de plus en plus courant de l’exome ou de tout le génome (y compris les introns). En 2015 on a identifié plus de 300 gènes connus donnant à peu près 350 maladies différentes. Ces maladies sont classées selon leur atteinte sur le système immunitaire, cependant certaines maladies font partie de plusieurs classes : 1) 2) 3) 4) 5) 6) Combined B and T Cell Immunodeficiencies Deficiencies predominantly affecting antibody production Defects of Phagocyte Function Defects of Innate Immune System Defects of homoestasis Immune System Autoinflammatory pathology A partir de 2010 la plupart des déficits immunitaires sont identifiés à partir d’un seul cas clinique. On se base sur des caractères connus et identifiés dans des bases de données pour trouver la variation génétique, puis on va étudier le déficit immunitaire avec une approche relative à la biologie cellulaire : on compare avec le génome de sa famille (parents et frères et sœurs) pour caractériser la continuité inter-générationnelle de la variation et le lien avec le phénotype. (mutation de novo ou variation présente chez d’autres individus sains) On fait appel à 2 caractérisations en laboratoire : - On utilise un système en sur-expression pour étudier l’impact de la protéine vis-à-vis de la maladie et étudier la fonction même de la protéine touchée par la variation. Puis on étudie l’impact de la variation sur des cellules immunitaires du patient (Lymphocytes B, T, NK ; cellules dendritiques) La méthode de base, aujourd’hui pour approcher un déficit immunitaire se base sur deux approches : - Tester notre hypothèse : on a un gène candidat, de là on s’appuie sur les données de la littérature en matière de biologie animale et humaine pour savoir si la variation a un effet sur une voie de signalisation connue comme étant responsable d’une réponse immunitaire ou connue comme causant des déficit immunitaire quand elle est perturbée. (approche limitée car on ne se base que sur ce qui est déjà connu) - Générer une hypothèse : On séquence l’exome du patient, on détermine les variations génomiques qu’il présente et on fait le lien avec sa maladie. Ainsi sans modèle prédéfini, on identifie la variation causale qui devient alors une « mutation ». On peut aussi associer les différentes méthodes pour déterminer la chaine causale. On a donc trouvé le gène candidat, pour l’identifié en tant que mutation : on fait des études fonctionnelles (sur cellules humaines dans notre cas). Ex : mimer ce qui se passe dans la nature en ce qui concerne la susceptibilité aux infections : à partir d’un échantillon sanguin du patient que l’on met en contact avec le BCG, on recherche une éventuelle production d’interféron gamma ou d’interleukine 12 (par des tests type ELISA) et si absence on recherche une mutation sur des gènes codant pour les protéines de ces voies de signalisation pour savoir s’il s’agit d’une défaut de réponse ou d’un défaut de production. Remarque : on peut être limité par la sensibilité du test. Une autre méthode est de partir d’une souris ayant un déficit connu, étudier sa réponse à une infection particulière que l’on connait (puisqu’on lui administre) et déterminer ainsi le lien cause-effet entre une mutation (ex : déficit en IRF8 qui cause une absence de production de cellule dendritique myéloïde) et une réponse immunitaire. Dès lors, on séquence le génome des patients présentant des infections à répétitions pour le même agent infectieux pour leur diagnostiquer ce déficit identifié. (méthode moins utilisée de nos jours) Avant le NGS (next generation sequencing), pour déterminer la cause des susceptibilités aux infections on amplifiait/séquençait par la méthode de Sanger ou par cytogénétique, on identifiait une anomalie dans la structure des chromosomes ou encore, dans des cas de famille large avec consanguinité, on pouvait étudier la dissémination (en homozygotie) de la mutation, déterminer la région du génome retrouvée chez les individus présentant la susceptibilité aux infections et déterminer ainsi la région de la mutation. La limite de la méthode par arbre généalogique est que l’on pouvait trouver plusieurs régions conservées et dans ces régions il pouvait y avoir plusieurs gènes. Exemple : on réalise un clonage positionnel dans un modèle autosomique récessif : on part d’une famille présentant une consanguinité, la mutation doit être homozygote avec pénétrance complète. Le clonage montre un pic qui correspondant à la région causale. (De la même manière dans une famille ou il n’y a que des garçons atteints, on suppose que la mutation est liée à l’X, et on obtient par le clonage des régions conservées chez les cas atteints : potentiels sièges de la variation. Si on a plusieurs générations atteintes, avec une même probabilité selon le sexe, on devine une transmission autosomique dominante) Quand on est à la recherche de la maladie génétique, il faut faire attention au choix du gène que l’on suppose causal car plusieurs allèles du même gène pouvant donner plusieurs phénotypes/prédisposition à l’infection. Certaines allèles donnent une perte de fonction phénotypes/prédisposition à l’infection. Certaines allèles donnent une perte de fonction complète ou partielle, la protéine est absente, etc. Aujourd’hui, on utilise toujours la cytogénétique et le séquençage SANGER quand on a de fortes suspicions vis-à-vis de la causalité d’une variation. Cependant on utilise plus fréquemment les méthodes d’étude du génome ou de l’exome (entier). On peut aussi utiliser les CNV pour identifier des anomalies de structure des chromosomes. Il existe également des moyens de séquençage ciblé avec des sondes correspondant à des régions connues comme étant en cause dans des déficits immunitaires. Remarque : l’ADN génomique extrait doit être de bonne qualité et en quantité suffisante. On classe ensuite les variations selon un modèle bio-informatique qui permet d’obtenir la liste de toutes les variations que présente un individu et pouvoir la comparer avec les variations d’autres individus atteint de la même maladie ou des bases publiques de données. PID gene network : méthode de mise en évidence des gènes impliqués dans le déficit immunitaire. Ces gènes sont des points rouges au milieu de tous les gènes de l’individu (points gris) Pour une maladie donnée, on peut constituer ce qu’on appelle le connectome : les gènes en cause dans l’expression de la maladie sont mis en relations avec tous les gènes avec lesquels ils interagissent dans diverses voies de signalisation et toutes les variations génomiques connues dans ces voies de signalisation. Le connectome permet de calculer la « distance » entre variation causale et gène dans la voie de signalisation donnée ce qui permet d’identifier des gènes candidats car reliés physiologiquement au déficit (logiquement ceux dont la distance est la plus faible). Pour choisir un nouveau gène, on va aussi se baser sur son expression (qualitativement et quantitativement): une mutation sur un gène bien exprimé dans le système immunitaire va être étudiée en première intention dans un déficit immunitaire (une mutation sur un gène cardiaque s’exprimant peu ne va pas être notre intérêt premier). Mais également si la mutation se trouve sur un gène très conservé au sein des espèces car cela prouve qu’il a une fonction essentielle au développement et que chaque acide aminé est important pour la fonction du gène. Remarque : Il est possible de combiner plusieurs des méthodes vues pour trouver le gène. Orientation pour le diagnostic d’un déficit immunitaire L’examen Clinique - Cassure de la courbe de croissance staturo-pondérale (témoigne de la sévérité d’une infection) - Examen des aires ganglionnaire, foie et rate (pas de ganglions, ou pas d’amygdale = défaut de l’immunité humorale) - Examen ORL : Tympans et cavité buccale (absence d’amygdales= trouble des lymphocytes B, muguet= Lymphocyte T ou TH17) Obstruction nasale - Examen pulmonaire : râles, crépitants ou sibilants - Examen cutané (eczéma ; cicatrices d’infections anciennes, cicatrice du BCG) L’examen permet d’orienter le diagnostic selon le type d’infection ou de déficit immunitaire. BILAN DE DEPISTAGE de DIH= HEMOGRAMME (très utile chez les enfants) 1) NFS Plaquettes • Hb (anémie), plaquettes • Nombre de PN • Nombre de Lymphocytes (interprétation en fonction de l’âge, enfant >>>adulte ) • Frottis sanguin 2) Dosage pondéral des immuno-globulines G, A, M (taux variable chez l’enfant) évaluation de la production d’anticorps 3) Sérologies vaccinales et/ou post-infectieuses évaluation de la production d’anticorps spécifiques Remarque : les nourrissons ont un taux élevé de lymphocytes. La leucopénie est donc diagnostiquée selon d’autres normes. Le NFS plaquettes nous donne le nombre de plaquettes mais aussi la taille. En cas de microplaquettes, le patient fait des infections récurrentes, a de l’eczéma, présente un taux très bas de plaquettes : on a déjà à 90% le diagnostique. De même les corps de Howel-Jolly sont très évocateurs d’une asplénie. (Souvent accompagnée d’une absence de rate + éventuelles malformations cardiaques) Explorations : immunité humorale On vérifie la fonction des anticorps et leur capacité à répondre à une infection - Avec des anti-antigènes protidiques (vaccinaux et/ou post-infectieux) ex : vaccin conjugué (pentacoq, prévenar…) - Avec des anti-antigènes polysaccharidiques (après 24 mois) : vaccin non-conjugué : Pneumo23 Allohémaglutinines de groupe sanguin En cas de suspicion forte de déficit immunitaire on peut réaliser des investigations supplémentaires en deuxième intention si anomalie au premier bilan. Ces investigations ont généralement lieu quand il y a persistance d’infections sévères et récurrentes ou retentissement important sur la qualité de vie du patient, sa croissance staturo-pondérale ou s’il y a atteinte pulmonaire. Ces investigations supplémentaires sont : - Le phénotypage lymphocytaire T(cd3,4,8), B et NK : examen quantitatif mais attention à bien connaitre les normes en terme de nombre et de pourcentage car on peut trouver un pourcentage correct de lymphocytes mais le patient a une lymphopénie sévère. - +/- Proliférations lymphocytaires T = examen qualitatif (Remarque : importance de l’interrogatoire, de la notion de consanguinité, des antécédents familiaux et personnels : susceptibilité à un ou plusieurs types d’infection, de l’hémogramme) Immunité cellulaire : Fonctions des lymphocytes T Ces tests sortent du cadre de la médecine générale et sont consacrés aux spécialistes. On étudie notamment : - la prolifération en réponse aux mitogènes ( PHA, anti-CD3) - la prolifération en réponse aux antigènes ( tétanos, polio, tuberculose..) i. DISC (déficit immunitaire combiné sévère) C'est une maladie génétique qui prédispose aux infections causées par des microbes opportunistes (fongique/virale), elle constitue une urgence immunologique, car c'est une forme très sévère. Elle se déclenche chez les enfants de manière très précoce (nourrissons, souvent de sexe masculin) Chez ces nourrissons, elle s’accompagne souvent de diarrhées très importantes, qui peuvent être létales. Effectuer le diagnostic est en définitive assez simple : Le microbe qui cause l’infection doit être assez rare Le principal signe est l'hémogramme (lymphopénie, soit <1500/mm3 lymphocytes). Les autres signes sont la courbe de croissance effondrée, des infections (notamment virus ou champignons), un mauvais état général, absence du thymus (+++) sur les radios du thorax (ou très diminué). NB : Le premier diagnostic différentiel est l’infection par le VIH, qu’il faut tout de suite écarter pour que le déficit immunitaire s’impose. Ces maladies sont causées par des mutations qui touchent différentes étapes du développement des cellules de l'immunité, essentiellement les LT, mais aussi les lymphocytes NK, parfois les LB, et qui peut aller jusqu'à l'absence totale de cellules hématopoïétiques en périphérie (dysgénésie réticulaire). Il existe des formes de cette maladie liées à l'X ou à transmission autosomique récessive. Retenir également ces quelques règles simples : La règle des 3 Un enfant de moins de 3 ans a besoin : D’un taux de lymphocyte = à 2/3 du taux de leucocyte D’un taux de T CD3+ = à 2/3 du taux de lymphocyte D’un taux de T CD4+ = à 2/3 du taux de T CD3+ ii. Forme intermédiaire (CID, immunodéficience combinée) Cette forme apparaît plus tardivement (souvent chez les adolescents), elle est moins sévère, car causée par des mutations hypomorphes, il y a alors une fonction résiduelle qui persiste, mais la mutation se retrouve généralement dans des gènes responsables des déficits immunitaires combiné sévères Elle se manifeste surtout par des infections récurrentes, notamment pulmonaires. III. Exemple de 2 microbes non opportunistes On va étudier plus particulièrement deux types de maladies qui constituent deux types de modèles : - Les infections à Pyogènes - L’herpès virus (encéphalite herpétique) : la mortalité est assez élevée, et les personnes qui restent vivantes présentent un grand handicap. Ici, les cellules hématopoïétiques ne montrent aucun déficit immunitaire, par contre on a un défaut des cellules du système nerveux. Pourquoi étudier ceux-là ? Car ils ne sont pas extrêmement sévères sauf chez certains individus pour lesquels ce sera très grave, mettant en évidence un déficit immunitaire qui n’as pas été identifié. - a) Les infections à Pyogènes Les maladies causée par des bactéries pyogènes sont, de la plus fréquente a la moins fréquente : - La granulomatose septique chronique -Le syndrome de Job/Buckley -Les défauts de production d’anticorps -Les déficiences du gène NEMO, MyD88 et IRAK-4 -Les défauts du complément Granulomatose septique Chronique : Elle fait partie des déficits héréditaire classiques et touche les cellules phagocytaire : le défaut fonctionnel se situe donc au niveau de polynucléaire neutrophile, cellules dendritiques, les monocytes et les macrophages Ces infections sont assez sévères, elles sont parfois récurrentes et touchent les nourrissons Elle est évoquée par deux type de microbes : les champignons et les bactéries à pyrogène Ces conséquences sont graves : d’énorme foyers d’inflammation, des granulomes persistants pouvant par exemple obstruer les voies urinaires, abcès, pneumopathie… L’anomalie se trouve au niveau de cette voie de signalisation : Gp91 est localisée au niveau de la membrane des cellules phagocytaire, mais également dans la membrane des granulocytes : il forme avec p22fox le cytochrome B558 Ces deux protéines transmembranaires sont en relation avec des protéines cytosoliques. Ce complexe produit des dérivés réactifs de l’oxygène afin d’éliminer les microbes. Dans le labo, on mesure donc la production de ROC à travers plusieurs techniques (test de la réduction du cytochrome C, test au DHR) ce qui permet le diagnostic La forme la plus fréquente est celle liée à l’X. C’est en effet un gène situé sur ce chromosome qui code la protéine gp91phox. Maladie invasive due au pneumocoque : Les enfants sont souvent colonisés par des pneumocoques. Cela devient dangereux quand l'infection est invasive. "Pneumocoque" doit faire penser à un déficit immunitaire, et plus précisément à 4 systèmes : 1) La rate Avec un hémogramme (présence des corps de Jolly) et un examen clinique (absence de rate à la palpation), on peut écarter l'asplénie. 2) Le système de l'immunité humorale (lymphocytes B) On peut vérifier le système de l'immunité humorale en demandant un phénotypage des lymphocytes B et un dosage des anticorps pour les enfants de plus d'un an. 3) Le système de l'immunité innée, voie du complément 4) Voie Nf-kappaB Mutations du gène NEMO Un problème dans ce système empêche de produire des cytokines. Les patients sont très sévèrement malades, mais la CRP (protéine C-réactive, marqueur de l'inflammation) est toujours nulle ou très basse. Ces enfants sont ainsi incapables d'avoir de la fièvre, car ils ne produisent pas cytokines pro inflammatoires. Ce déficit est dû à des mutations hypomorphes sur le gène NEMO, qui code pour la protéine NEMO, régulatrice du complexe IKK, qui permet d'induire la production des différentes cytokines pro-inflammatoires. Les patients sont susceptibles à un large spectre d'infections, notamment des infections pyogènes. Phénotype clinique rencontré quand il y a un problème sur le gène NEMO : peu de cheveux, pas de cils ni de sourcils, défaut au niveau des dents (pas de dents ou dents coniques), c'est-àdire ces patients ont un défaut du développement appelé dysplasie ectodermale anhydrotique (EDA). Le gène NEMO est situé sur le chromosome X, et donc les mutations sont à l'état hémizygote (chez les garçons), cette pathologie touche donc principalement les garçons. On peut confirmer l'existence de cette maladie au niveau cellulaire en étudiant le sang des patients, ou une biopsie de peau, dont on dérive les cellules en fibroblastes. Une fois en possession de fibroblastes, on peut tester l'activation des différentes protéines sous l'action de cytokines, comme le TNF-alpha ou l'interleukine 1-bêta. Cela permet de caractériser la maladie. Un problème sur le gène NEMO entraîne généralement un défaut de réponse au TNF-alpha. Il y a une autre maladie génétique, qui est causée par des mutations à l’état hétérozygote dans le gène IB, avec le même spectre des infections et d’ EDA Quand on est confronté à la caractérisation de la maladie, on doit se poser 2 questions : savoir comment la mutation impacte l'expression de la protéine et comment elle impacte la fonction. On peut étudier la présence et la quantité de la protéine NEMO à l'aide de Western blots ou de la cytométrie en flux. Selon les mutations impliquées, il existe 6 maladies possibles dues à des défauts de cette protéine, associées ou non à une dysplasie ectodermique anhydrotique (EDA), mais aucune de ces formes ne peut produire d'interleukine-6. Les mutations du gène NEMO sont hétérogènes cliniquement car elles sont à l'origine d'infections multiples (association d'infections bactériennes, fongiques et virales, parfois seulement une infection à pneumocoque). Une expression constante de la maladie est que les signes inflammatoires sont très bas, et la capacité de produire des anticorps est très réduite. Mutations de la voie des TLR On a pu decouvrir des immunodeficiences touchant la voie des TLR (recepteurs impliques dans la premiere partie des reponses immunitaires). Il existe 10 de ces recepteurs chez l'etre humain. Ainsi TLR-3 specifique pour le controle de l'herpes, Si ce recepteur mute, on aura une susceptibilite au groupe de l'herpes. La mutation des autres recepteurs entraîne une susceptibilite aux infections bacteriennes. MyD88 et IRAK-4 sont des genes et des phenocopies, c'est-a-dire qu'ils se comportent de la meme façon, la difference est la localisation de la mutation. Dans ces deficiences, on observe une diminution de la production d'interleukine 12. On remarque dans ces micro-arrays qu'une absence d'IRAK4/MYD88 entraîne le meme profil. Au point de vue cellulaire, on observe une absence de reponse a l'IL-1 beta. La mortalite est relativement precoce, survenant vers l'adolescence. Cependant on n’observe aucune susceptibilite aux infections, comme si l'immunite acquise reprend le travail de l'immunite innee. Il n'y a donc pas de susceptibilite aux infections virales et myco-bacteriennes. Ces immunodeficiences s'ameliorent avec l'age avec des signes inflammatoires faibles (CRP effondree, pas de fievre ni de neutrophilie). Les LB memoires sont deficitaires. Les defauts genetiques peuvent entraîner des resistances ou des susceptibilites. Ex : le virus d'Epstein-Barr entraîne une maladie X-liee lymphoproliferative. Le 5eme gene est en cours de caracterisation. Les tests de laboratoire cherchant des defauts classiques peuvent se retrouver negatif, pourtant les patients ont une predisposition a la maladie. HSE (Herpes Simplex Encephalitis) et déficiences primaires : Elles touchent les neurones et ses cellules associees. La plupart des patients n'ont pas la predisposition au HSE. Dans une etude retrospective faite en France, on a pu observer une mortalite importante ainsi qu'une consanguinite importante (14%). Il y a donc une possibilite que ces maladies genetiques entraînent l'HSE. Dans une autre etude, 2 patients avec HSE se retrouvent avec une deficience en interferon 1, 2 et en NEMO, avec une susceptibilite aux myco-bacteries. D'autres genes sont impliques dans ces immunodeficiences (avec TLR-3) : TRAFF, IRF-3... Cependant la deficience dans la voie TLR-3 n'entraîne pas de defauts peripheriques. Actuellement plusieurs strategies ont ete mis en places pour diagnostiquer ces immunodeficiences: – dissection moleculaire permettant une construction de l'exome pour identifier de nouvelles mutations – dissection de cellules du SNC : biopsie de peau → fibroblastes dermiques → creation d'IPS pour les deriver en neurones, astrocytes, ou oligodendrocytes pour etablir leurs reponses vis-a-vis du virus de l'herpes. La 1e forme genetique du virus de la grippe a ete identifiee grace a cette technique. Lors de maladies entraînant un deficit en cellules NK, on observe un defaut isole entraînant une susceptibilite aux virus (surtout EBV & HSV). La mutation se trouve sur le gene MCM4 qui participe au cycle cellulaire. Ce defaut est autosomique recessif et entraîne la creation d'une proteine tronquee. Les cellules sont principalement bloquees en G2/M, avec des cassures d'ADN plus frequentes. Dans les maladies pyrogenes, les defauts entraînent une diminution voire une absence de cytokines ou de derives d'ocygene. Déficience HOIL1 Cette deficience entraîne une susceptibilite aux infections pyrogenes avec une accumulation de polyglucoses au niveau cardiaque. Ici l'inflammation est plus elevee que d'habitude, devenant alors chronique, On observe egalement un defaut de production d'anticorps de type pneumocoque et HIB avec une augmentation des IgA et une diminution des LB memoire. La proteine HOIL est un des composants du complexe LUBA, une E3 ubiquitine ligase. Son absence entraîne un defaut de la voie NF-kB. Au niveau cellulaire, on observe une hyperactivation des monocytes et granulocytes. A retenir : devant une infection severe et recurrente, eliminer d'abord les maladies genetiques sous-jacentes meme si les tests se retrouvent normaux. FICHE RECAPITULATIVE I. Généralités : Les maladies infectieuses sont des modèles pour l'étude des maladies génétiques. 2 grandes questions : 1/ Pourquoi certains enfants développent-ils des infections par rapports à d’autres qui sont sains alors qu’ils reçoivent la même exposition ? 2/Quel est le rôle de chaque type cellulaire et molécules dans l’immunité qui va contrôler ces infections ? Pour répondre à ces questions, seul l’homme sera utilisé comme modèle. Dans les cas des maladies infectieuses, celles-ci peuvent être expliquées par des mutations rares et graves chez l’enfant (transmission mendélienne) tandis que chez les adultes par des polymorphismes moins sévères. Il est nécessaire de mettre en relation les maladies infectieuses avec les maladies génétiques car ces dernières ont impact sur le système immunitaire et on note 2 raisons importantes : 1/Une importance clinique : identifier le gène causal et son mode de transmission (et viceversa) afin de réaliser un diagnostic au sein de la famille et ainsi rendre plus facile la réalisation du traitement. 2/Une importance biologique : utiliser les cellules du patients afin d’affiner la caractérisation de la maladie Dans la « Théorie de la Maladie infectieuse » il existe 4 grands facteurs qui influencent l’expression de la maladie : • Les facteurs dus à l’environnement Le milieu écologique à proprement parler La microbiologie : l’exposition au microbe et sa virulence • Les facteurs dus à l’hôte : Le terrain immunologique Le terrain génétique On peut utiliser différents types d’approches qui présentent des avantages et des inconvénients mais qui peuvent être complémentaires pour la compréhension d’une maladie : -Le modèle expérimental : in vivo sur des animaux ou in vitro sur des cellules. L’étude est plus précise (en étudiant une seule voie de signalisation par exemple) mais on risque de s’éloigner de la réalité. -Le modèle in natura : on étudie dans les conditions naturelles on est donc dans la réalité. Elle permet d’étudier les populations dans leur milieu naturel. Cependant il est très complexe et ne permet pas d’études précises. On essaye de combiner le modèle humain et le modèle animal : Avec le modèle humain on observe ce qui se passe réellement, on peut faire des analyses selon les individus et leurs caractéristiques avec une transmission microbienne naturelle tandis qu’avec le modèle animal on infecte artificiellement et les observations sont assez éloignées de ce que l’on constate in natura. Cependant le modèle humain est soumis à de plus grandes limites éthiques tandis que dans le modèle animal on a une plus grande liberté de choix (races, quantités, voies d’administration) et aussi plus de cellules. Il y a 2 grands types de maladies génétiques : Maladies génétiques mendéliennes Fréquence <1% sévères dues à des micro-organismes atypiques Maladies génétiques polymorphiques fréquence >1% mineures Dues à des combinaisons d'un ensemble de variations II. Déficits immunitaires Pour passer d’un gène candidat à une mutation il faut un test fonctionnel avec des cellules humaines dans ce cas. Il en existe 2 grands types : Les déficits immunitaires primaires : Il s’agit des cas d'infections sévères, multiples, récurrentes, rares, opportunistes, familiales et induites par des microbes opportunistes. Les déficits immunitaires non conventionnels ou atypiques : la personne atteinte d’une maladie infectieuse ne présente pas d’anomalie témoignant d’une déficience immunitaire (mais on suppose tout de même qu’il y a problème concernant son immunité). Les déficits immunitaires primaires ont été classés selon le défaut qu'ils engendrent en 6 classes : 1) déficit immunitaire combiné sévère (affecte particulièrement les lymphocytes T et B) 2) déficit qui affecte principalement la production des anticorps. 3) défauts de la fonction des phagocytes 4) défauts du système immunitaire inné 5) défauts d'homéostasie 6) pathologies auto-inflammatoires En 2015 on a identifié plus de 300 gènes connus donnant à peu près 350 maladies différentes d’immunodéficience. Identification des maladies immunitaires A partir de 2010 la plupart des déficits immunitaires sont identifiés à partir d’un seul cas clinique. D’abord on recherche les variations génétiques en effectuant comparaison avec les bases de données et avec sa famille (s’il y a une continuité inter-générationnelle). Ensuite on étudie les variations suspectes dans un laboratoire sur 2 caractéristiques : 1/Sur-expression de la variation afin d’étudier son impact sur la maladie et sur la protéine ellemême. 2/Etude de l’impact de la variation sur des cellules immunitaires du patient. Aujourd’hui, la méthode de base pour approcher un déficit immunitaire se base sur deux méthodes : 1/Tester une hypothèse à partir d’un gène candidat 2/Générer une hypothèse par séquençage de l’exome On peut aussi associer ces deux méthodes afin de déterminer la chaîne causale. Il est possible aussi d’étudier la réponse à une infection particulière par un animal ayant déficit connu. (Méthode moins utilisée). Avant le NGS, dans les cas de maladies infectieuses, on étudiait les anomalies architecturales des chromosomes par amplification/séquençage (méthode de Sanger) ou encore la dissémination de la mutation chez les familles consanguines. Dans le choix d’un gène que l’on suspecte, il faut faire attention aux allèles qui peuvent donner des phénotypes et des prédispositions différentes face à l’infection. Connectome : les gènes en cause dans l’expression de la maladie sont mis en relations avec tous les gènes avec lesquels ils interagissent . Diagnostic déficit immunitaire Exam clinique : courbe croissance, aire ganglionnaires, ORL , pulmonaire , cutané Bilan de dépistage de DIH : 1) NFS Plaquettes 2) Dosage pondéral des immuno-globulines G, A, M (taux variable chez l’enfant) 3) Sérologies vaccinales et/ou post-infectieuses Vérification fonction des Ac via : Anti-Ag protidiques, anti-Ag polysaccharidiques, Allohémaglutinines de groupe sanguin Investigations supplémentaires si suspicion déficit immunitaire : Le phénotypage lymphocytaire T(cd3,4,8), B et NK +/- Proliférations lymphocytaires T = examen qualitatif DISC : maladie génétique qui prédispose aux infections causées par des microbes opportunistes (fongique/virale), urgence immunologique. Se déclenche de manière très précoce (nourrissons, souvent de sexe masculin) Diagnostique assez simple : Le microbe qui cause l’infection assez rare , Le principal signe=l'hémogramme, Courbe de croissance effondrée, des infections, mauvais état général, absence du thymus (+++) sur les radios du thorax (ou très diminué). Forme intermédiaire (CID) : plus tardivement, moins sévère, causée par des mutations hypomorphes III. Exemple de 2 microbes non opportunistes Infections à Pyogènes : -La granulomatose septique chronique : déficits héréditaire classiques et touche les cellules phagocytaire -Le syndrome de Job/Buckley -Les défauts de production d’anticorps -Les déficiences du gène NEMO (empêche de produire des cytokines. mutations hypomorphes sur le gène NEMO,), MyD88 et IRAK-4 -Les défauts du complément HSE (Herpes Simplex Encephalitis) et déficiences primaires : Touchent les neurones et ses cellules associées. Ex déficience HOIL1 entraîne une susceptibilité aux infections pyrogènes avec une accumulation de polyglucoses au niveau cardiaque.
