Jean-Philippe MICHEL

PROPOSITION DE STAGE M2
Laboratoire : Institut Galien Paris Sud
UMR CNRS 8612
Adresse : Université Paris Sud, Faculté de Pharmacie,
5 rue J. B. Clément, 92290 Châtenay-Malabry Cedex
Responsable(s) de Stage : Jean-Philippe MICHEL
Téléphone : 01 46 83 59 93
Email :
[email protected]
N° et intitulé des écoles Doctorales de rattachement envisagées : ED425 ou ED107
Titre du stage : Etude à l’aide de modèles membranaires biomimétiques
des mécanismes de lyse de la membrane bactérienne par des peptides antimicrobiens.
1. Présentation et description du sujet
Ces vingt dernières années, la recrudescence de bactéries résistantes aux antibiotiques classiques a
renforcé les besoins de sources thérapeutiques originales. Les peptides antimicrobiens, substances
naturelles agissant au sein même du système immunitaire, apparaissent comme des candidats très
intéressants pour le développement de nouvelles molécules médicamenteuses de remplacement ou de
complément aux thérapies classiques. Ainsi, de nombreux peptides sont en développement dans des
entreprises pharmaceutiques et certains sont en phase d’essai clinique [1]. Mais la conception et le
développement d’un médicament est un processus long et complexe: nombre de molécules prometteuses
ne franchissent jamais le stade clinique II ou III. Une des raisons expliquant ces difficultés est liée à la
capacité des substances actives à perturber et traverser effectivement les membranes biologiques. Or, la
structure et la composition protéolipidique des membranes bactériennes sont complexes et diffèrent
selon le type bactérien (Gram négatif ou Gram positif). En outre, les méthodes classiques d’évaluation
de l’activité microbienne renseignent sur les concentrations minimales pour inhiber la croissance
bactérienne mais ne fournissent pas d’information spécifique sur les mécanismes de franchissement des
différentes strates composant les membranes bactériennes.
Pour surmonter ces difficultés, nous formons dans notre laboratoire des modèles biomimétiques des
membranes bactériennes à partir de systèmes tels que des monocouches, liposomes ou bicouches planes
supportées. Leur structure, leur composition lipidique et la densité des molécules peuvent être finement
contrôlées pour moduler leurs propriétés physico-chimiques et se rapprocher des conditions du vivant.
L’objectif principal de ce stage est l’étude des interactions entre des modèles membranaires
mimant la membrane externe des bactéries à Gram négatif et des peptides antimicrobiens afin
d’élucider leur mécanisme de pénétration dans celle-ci.
Les plasticines sont des peptides potentiellement très intéressants pour la lutte antibactérienne. En effet,
leur flexibilité conformationnelle leur confère un pouvoir antimicrobien par adaptation de leur structure
à la membrane de la cible [2]. Deux plasticines homologues, complémentaires et synthétisées à l’Institut
de Biologie Intégrative IFR 83 (Université Paris 6) sont actuellement étudiées dans notre laboratoire. La
première est un peptide naturel neutre, PTC-DA1, qui s’agrège fortement en solution et ne montre pas
d’activité antimicrobienne sur les souches classiques de laboratoire. La seconde, PTC-DA1-KF,
présente en revanche une très bonne activité antibactérienne. Elle est issue du peptide naturel neutre
modifié par remplacement des acides aminés en positions 8 et 12 par des lysines, et substitution de
l’acide aminé en position 18 par une phénylalanine. Ces modifications lui confèrent notamment une
charge électrique nette positive (+2) et une conformation en hélice  en solution. Le mécanisme d’action
de ces peptides sur la membrane bactérienne n’a pas encore été élucidé.
2. Techniques/méthodes utilisées
Dans le cadre de ce stage de Master 2, trois types de systèmes moléculaires organisés seront formés:
monocouches lipidiques étalées à l’interface air/eau, liposomes en volume et bicouches planes lipidiques
supportées sur surface solide.
Les monocouches seront formées sur la sous phase d’une balance de Langmuir et caractérisées par des
mesures de pression de surface. Leur morphologie sera étudiée par la microscopie à l’angle de Brewster
(BAM). Les plasticines seront alors injectées dans la sous phase sous la monocouche préformée pour
étudier leur capacité à interagir avec elle selon le taux de charge des lipides qui composent la couche.
Les liposomes seront formés par mise en suspension en phase aqueuse d’un film lipidique et caractérisés
par des mesures de diffusion dynamique de lumière (DLS) et mesure du potentiel zêta. Leur interaction
avec les plasticines sera étudiée par calorimétrie par titration isotherme (ITC) ainsi que par des
expériences de lyse membranaire par fuite de fluorescéine.
Les bicouches planes supportées seront formées sur le capteur de notre microbalance à cristal de quartz
avec mesure de dissipation (QCM-D) par transfert vertical de monocouches directement sur le capteur
de QCM-D et/ou par rupture de liposomes. Le QCM-D fonctionne en flux continu et permet de suivre
in situ l’adsorption de peptides injectés sur la bicouche formée sur le capteur. La caractérisation se fera
par des mesures de la déviation de fréquence et de dissipation de la vibration du cristal de quartz qui
permettront une quantification de cette adsorption ainsi que des modifications des propriétés
viscoélastiques de la bicouche (épaisseur, masse volumique, viscosité..). La spectroscopie d’impédance
électrochimique (EIS), couplée au QCM-D, permettra de suivre les modifications de la résistance,
capacité et de l’homogénéité de la bicouche avant et après interaction avec les peptides.
3. Résultats attendus
L’objectif du stage est de former, dans un premier temps, des systèmes dont la composition lipidique
sera modulée afin de varier leur taux de charge. Pour cela, nous utiliserons des lipides anioniques
typiques de la membrane externe Gram négative, tels que le lipopolysaccharide, le phosphatidylglycérol
ou la cardiolipine, et qui permettront d’obtenir des monocouches fortement anioniques. Le
dioléoyltriaminopropane, lui, sera utilisé comme lipide modèle pour former des couches cationiques.
L’étude de l’interaction des deux plasticines avec ces monocouches modèles à taux de charge variable
permettra de mieux comprendre le rôle des interactions électrostatiques dans leur mécanisme
d’interaction et de relier leur charge à celle des têtes polaires de la monocouche.
Dans un deuxième temps, l’interaction entre les plasticines et des liposomes à taux de charge variable
sera examinée par calorimétrie par titration isotherme afin de mesurer la chaleur produite ou absorbée
par l’interaction entre les peptides et lipides, puis de déterminer la constante d’affinité à l’équilibre, la
stœchiométrie de la liaison et l’enthalpie de la réaction.
Enfin, dans un troisième temps, des bicouches planes supportées seront formées sur le capteur du QCMD. La nature de la surface du capteur (SiO2, or cystéaminée..) sera judicieusement choisie en fonction
de la composition lipidique de la bicouche permettant l’adsorption de monocouches par transfert LB ou
la rupture de liposomes sur la surface. L’interaction des plasticines avec la bicouche plane sera évaluée
en fonction de la composition lipidique de la couche supportée. En particulier, nous chercherons à
étudier l’influence de la concentration, conformation ainsi que l’état d’agrégation du peptide sur les
propriétés viscoélastiques et électrochimiques de la bicouche (masse volumique, épaisseur, résistance,
capacité ou encore homogénéité).
Nous recherchons un étudiant à l’interface physique/biologie avec de bonnes connaissances en physicochimie des interfaces.
4. Références
1. Hancock et al., Nat. Biotechnol. 24: 1551-7, 2006 ;
2. P. Joanne et al., Biochemistry, 48: 9372–83, 2009 ;
3. W. Fischer et al., Med Microbiol Immunol 183:61–76, 1994.
4. H. Nikaido et al., Microbiol. Rev. 49(1), 1-32, 1985.
5. J. D. E. Young et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 3831-3835, 1983.