BURKINA FASO *********** UNITE - PROGRES - JUSTICE UNIVERSITE DE OUAGADOUGOU Centre de Recherche Biomoléculaire Unité de Formation et de Recherche CERBA/LABIOGENE Sciences de la Vie et de la Terre (UFR-SVT) *********** Département de Biochimie MEMOIRE Présenté par KABORE R. Ibrahim Maître ès Substances Naturelles et Pharmacodynamiques Pour l’obtention du : Diplôme d'Etudes Approfondies en Biochimie/ Biologie Moléculaire SUR LE THÈME : Suivi de l’évolution des paramètres biologiques chez les patients séropositifs VIH traités au Centre de Recherche Biomoléculaire Pietro Annigoni (CERBA) et au Centre Médical Saint Camille (CMSC) de Ouagadougou Soutenu le 17/12/ 2010, devant le jury : Président : Pr. Odile NACOULMA, Professeur Titulaire, Université de Ouagadougou Membres : Pr. Jacques SIMPORE, Professeur Titulaire, Université d e Ouagadougou Dr. Virginio PIETRA, Università di Brescia, Italia, invité DÉDICACE À mon père, feu El Hadji KABORE Nobila Hamadou, À ma chère mère KABORE/OUEDRAOGO Zénabou, À mes frères et soeurs : Ousséni, Mariétou Mariam, Alizéta, Habibou À toutes les personnes qui vivent avec le VIH/SIDA et toutes celles qui s’investissent pour leur cause. i REMERCIEMENTS Ce travail a été réalisé dans les laboratoires d’immunologie et de biologie moléculaire du centre médical Saint Camille et du Centre de Recherche Biomoléculaire Pietro Annigoni (CERBA/LABIOGENE). Nous exprimons notre profonde gratitude : Au Pr Odile Germaine NACOULMA, responsable de l’école Doctorale (Département de Biochimie/Microbiologie) pour avoir accepté de présider notre jury ; Au Pr Jacques SIMPORE, directeur du CERBA/LABIOGENE, du laboratoire du CMSC et Recteur de l’Université Saint Thomas d’Aquin USTA pour avoir accepté la direction de ce DEA, pour le choix pertinent de ce thème, pour le support économique de cette étude et pour son encadrement exceptionnel ; Au Pr Boukaré ZEBA, chef du département de Biochimie/Microbiologie, Au Pr Jeanne MILOGO/RASOLODIMBY, et au Pr Jean-Baptiste NIKIEMA pour leur, disponibilité, leurs conseils, leurs encouragements, et leur assistance morale ; Au Dr Virginio PIETRA pour avoir accepté d’évaluer notre travail, Au Dr. W.M. Christelle NADEMBEGA pour ses conseils et pour l’aide qu’elle nous a apportée dans la réalisation de ce travail ; Au Dr. Charlemagne GNOULA pour ses conseils et pour nous avoir aidés dans nos recherches bibliographiques ; A tous les enseignants-chercheurs du département de Biochimie/Biologie Moléculaire Appliquée/ Substances Naturelles/ Plantes médicinales et Phytothérapie pour la qualité de la formation reçue ; Au Dr. Djeneba OUERMI notre aînée pour son aide et ses conseils, Au Dr. Korotimi SANOGO de l’ambulatoire des adultes du CMSC pour ses explications éclairées, A toute l’équipe du Laboratoire Saint Camille, en particulier mesdames Justine YARA, Angèle SANFO et monsieur Emmanuel BOUDA pour leurs précieux conseils et leur ii assistance apportée lors des manipulations ; A la Conférence épiscopale italienne (CEI), pour leur soutien financier dans la réalisation de nos travaux de mémoire de DEA ; A tous les étudiants de notre promotion pour la bonne ambiance, les conseils et les encouragements ; À nos oncles et tantes, cousins, cousines, amis et amies pour leurs encouragements ; À tous ceux qui nous ont soutenus dans nos études scolaires et universitaires. iii SOMMAIRE DÉDICACE................................................................................................................................ i REMERCIEMENTS ................................................................................................................ ii Liste des sigles et abréviations............................................................................................... vii RESUME ................................................................................................................................ viii Introduction .............................................................................................................................. 1 CHAPITRE I– GÉNÉRALITÉS ............................................................................................ 3 I. Structure des Virus de l'Immunodéficience Humaine ...................................................... 4 I. 1 – Morphologie .................................................................................................................... 4 I. 2 Organisation génomique ................................................................................................... 5 II. Variabilité génétique ........................................................................................................... 6 II.1 La variabilité de la glycoprotéine gp120 ......................................................................... 6 I.2. Diversité du VIH : .............................................................................................................. 7 IV. Les cellules cibles du VIH ............................................................................................... 11 IV .1. Les cellules lymphocytaires du sang........................................................................... 11 IV.1.1 Les lymphocytes T-auxiliaires (T-helpers ou Th) : .................................................. 12 IV.1.2 Les lymphocytes T-cytotoxiques (Tc) : ..................................................................... 12 IV.2 Réponse immunitaire de l'organisme de l’hôte au VIH : ........................................... 12 IV.2.1 Réponse Humorale : ................................................................................................... 12 IV.2.2 Réponse cellulaire : ..................................................................................................... 12 IV.2.2.1 immunité non spécifique : ....................................................................................... 12 IV.2.2.2 immunité spécifique :............................................................................................... 12 IV.2.3. L'épuisement du système immunitaire : .................................................................. 13 V. La transmission du VIH : ................................................................................................ 13 VI. Ethiopathologie ............................................................................................................... 14 VI.1. Les non-progresseurs à long terme : ........................................................................... 15 VI.2 La résistance à l'infection : ........................................................................................... 15 VII. Le diagnostic biologique ............................................................................................... 15 VII.1 : le diagnostic sérologique ............................................................................................ 16 VII.1.1 Cinétique des marqueurs de l’infection à VIH ....................................................... 16 VII.1.1.1 Les immunoglobulines ........................................................................................... 16 VII.1.1.2 La glycoprotéine p24 .............................................................................................. 16 iv VII.1.1 .3 L’ARN viral plasmatique ..................................................................................... 16 VII.1.2 Diagnostic sérologique : les tests de dépistage indirects ........................................ 17 VII.2.2. Diagnostic moléculaire ............................................................................................. 19 VIII. Marqueurs de l’évolution vers le SIDA ...................................................................... 19 VIII.1 Evaluation des lymphocytes CD4 .............................................................................. 20 3 VIII.1.1. Valeurs normales des T CD4 : entre 800 et 1200/mm ........................................ 20 VIII.1.2. Fréquences de comptage des CD4 : ....................................................................... 20 VIII.1.3. Cytométrie de flux .................................................................................................. 20 VIII.2.- Évaluation de la réplication virale : la charge virale plasmatique ...................... 20 VIII.2 .1 -La technique Quantiplex HIV RNA (Chiron) .................................................... 21 VIII.2.2 - La technique Nasba QR System (Organon Teknika)......................................... 21 VIII.2.3 -La technique Amplicor HIV-1 monitor (Roche Diagnostic Systems) ................ 22 VIII.2.4.1 Extraction de l’ARN plasmatique du VIH : ....................................................... 22 VIII.2.4.2. Prélèvement et conservation de l’échantillon biologique avant extraction des ARN : ....................................................................................................................................... 22 VIII.2.4.3. Méthodes de lyse et d’homogénéisation :........................................................... 23 VIII.2.4.4. Les méthodes d’extraction et de purification des ARN totaux : ..................... 23 VIII.2.4.4.1. Différences de propriétés physico-chimiques :............................................... 24 VIII.2.4.4.2. Différences d’adsorption sur support solide (résine, billes...) : .................... 24 VIII.3: PCR en temps réel de l’ADN du VIH sur papier buvard (DBS) .......................... 24 IX.3. les enzymes sériques : ................................................................................................... 25 IX.3.1. les transaminases ou aminotransférases : ................................................................ 25 IX.3.2. créatininémie : ............................................................................................................ 25 IX.3.3. amylasémie : ............................................................................................................... 25 X. Traitement .......................................................................................................................... 26 . CHAPITRE II : MATERIELS ET METHODES ............................................................. 27 1 – Présentation du cadre d’étude ........................................................................................ 28 2 - échantillonnage .................................................................................................................. 28 2.1 – Population cible ............................................................................................................. 28 2.2 – Prélèvements .................................................................................................................. 29 2.3 – Matériels ......................................................................................................................... 30 2.4 - Méthodes ......................................................................................................................... 32 2.4.1 Méthodologie pour la numération des CD4 et CD8 ................................................... 32 v 2.4.2 Méthodologie de la RT/PCR pour la quantification de l’ARN du virus du VIH .... 33 2.4 .3. Dosage des Transaminases GOT GPT ...................................................................... 37 2.4 .4. Type de balance ........................................................................................................... 37 ANALYSES STATISTIQUES .............................................................................................. 37 CHAPITRE III : RESULTATS ET DISCUSSION ............................................................ 38 A- RESULTATS :................................................................................................................... 39 Paramètres des patients : ....................................................................................................... 39 a) Répartition des patients par tranche d âge : ................................................................... 39 b) Evaluation du poids, TCD4, TCD8, et CV en fonction du traitement: ......................... 40 c) Distribution de lymphocytes TCD4 en fonction du niveau d’étude des patients ......... 42 d) Stade clinique en fonction de la perte du poids corporel : ............................................. 43 e) Taux de lymphocytes TCD4 et charge virale par rapport à l’âge : ............................... 44 f) Transaminase GOT ; poids ; TCD4 et TCD8 .................................................................. 45 g) Transaminase GPT ; poids ; TCD4 et CD8 ..................................................................... 46 h) Classes de lymphocytes TCD4i_2 : ................................................................................... 47 i) Classes de lymphocytes TCD4f_2 :.................................................................................... 48 j) efficacité du traitement ...................................................................................................... 49 B- DISCUSSION .................................................................................................................... 50 CONCLUSION ET PERSPECTIVES ................................................................................. 56 Conclusion ............................................................................................................................... 57 Perspectives ............................................................................................................................. 57 RÉFÉRENCES ....................................................................................................................... 58 vi Liste des sigles et abréviations 3TC: Lamivudine ADN: Acide désoxyribonucléique ARN: Acide ribonucléique ARV : Anti- rétroviral AZT : Azidothymidine (Zidovudine) CD4 : Classe de Différenciation CD8 : Protéine de surface et caractérise les lymphocytes CD8+ CDC: Center for diasease control (Atlanta) CERBA-LaBioGene: Centre de Recherche Biomoléculaire Pietro Annigoni - Laboratoire de Biologie Moléculaire et de Génétique CMSC: Centre Médical Saint Camille de Ouagadougou CRFs: Circulating recombinants form CVP: Charge virale plasmatique Env: Envelope Gag: group specific antigens Gp: Glycoprotéine HAART: Highly active anti- retroviral therapy HTLV: Human T cell leukaemia virus INNTI : Inhibiteur non nucléotidique de la transcriptase inverse INTI : Inhibiteur nucléotidique de la transcriptase inverse LTR: Long terminal repeat Lymphocyte B : Cellule Burso- dépendante Lymphocyte T : Cellule Thymo- dépendante NVP : Névirapine OMS : Organisation mondiale de la santé ONU : Organisation des nations unies RT/PCR : Reverse Transcriptase/Polymerase Chain Reaction SIDA : Syndrome de l’Immuno-Déficience Acquise VIH: Virus de l’Immuno-Déficience Humaine vii RESUME Depuis janvier 2010, la prise en charge des personnes vivant avec le virus de l’immunodéficience humaine (VIH), responsable du syndrome de l’immunodéficience acquise (SIDA) est gratuite sur toute l’étendue du territoire burkinabé. Ce fait ne met pas fin au problème du VIH car les traitements utilisés sont certes efficaces mais ils n'ont qu'une activité virostatique (ils n'éliminent pas le virus de l'organisme infecté) et implique donc un traitement à vie. Le suivi biologique permet d’évaluer l’efficacité du traitement pour prévenir les cas d’échec thérapeutique et de résistance qui peuvent être nuisibles pour les patients. Une étude rétrospective a concerné un total de 141 patients séropositifs pour le VIH sous traitement antiretroviral (TARV) depuis plus de trois mois afin d’évaluer l’efficacité de la thérapie. Des données sur ces patients ont été collectées de décembre 2008 à juillet 2009. Le suivi concernait principalement l’évolution des lymphocytes TCD4, de la charge virale plasmatique et du poids corporel. Ces patients avaient subis des tests de confirmation par ELISA, des tests de discrimination pour le VIH-1 par TRI-DOT. De ces patients, 106 étaient des femmes soit 75,2 % avec un âge moyen de 35,72 ± 6,73 ans et 35 étaient des hommes soit 24,8% avec un âge moyen de 42,60 ± 10,81 ans. Les femmes étaient plus jeunes que les hommes. Le protocole de traitement antirétroviral à (TARV) comprenant : l’AZT/3TC/NVP a concerné 57 (40,40%) des patients ; 60 (42,60%) avaient été soumis au protocole D4T/3TC/NVP et le traitement aux autres types de protocoles avait pris en compte 24 (17,00%) des patients. Selon les critères de l’OMS sur la perte de poids corporel des patients, 94 (66,66%) de ces patients avaient été classé type II et 46 (32,62%) étaient du type III. Un (01) seul patient, sous traitement ARV, avait gardé son poids stable donc appartiendrait à la classe I. La comparaison entre les taux de lymphocytes T de classe de différentiation 4 (TCD4) initiaux et finaux nous a permis d’évaluer l’efficacité immunologique du traitement. En effet, à la première numération des lymphocytes TCD4, trois mois après le début du traitement, 108 (76,60%) patients avaient un taux de CD4 supérieur à 200 cellules/µl contre 33 (23,4%) qui avaient un taux inférieur à 200 cellules/µl. Mais à la deuxième évaluation six mois après, 122 (86,50%) avaient les TCD4 >200 cellules/µl contre 19 (13,50%) des patients qui avaient leur taux de CD4<200 cellules/µl. Aussi, on a observé globalement une différence statistiquement significative (p=0,0094) en comparant la moyenne des lymphocytes TCD4i (321,43 ±174,04 cellule/μl) des patients de notre étude et celle des lymphocytes TCD4f (377,74 ±187,33 viii cellules/μl). Une discordance immuno-virologique a été observée chez la plupart de nos patients. Car, les valeurs de charge virale plasmatique obtenues étaient dispersées, à telle enseigne que nous n’avons pas pu établir de corrélation entre elles et le taux des lymphocytes TCD4. Notre étude confirme l’efficacité des traitements dans la prise en charge des patients infectés par le VIH, cependant le problème des effets indésirables freine beaucoup l’observance. Mots clés : VIH ; traitement ARV ; lymphocytes TCD4 ; efficacité. ix Liste des figures et tableaux LISTE DES FIGURES FIGURE 1: STRUCTURE DU VIH................................................................................................. 4 FIGURE 2: STRUCTURE DU GÉNOME VIRAL. .............................................................................. 6 FIGURE 3: VARIABILITÉ DU VIH-1. ........................................................................................... 8 FIGURE 4: GÉNOME VIRAL ET PROVIRAL. . ............................................................................... 9 FIGURE 5: CYCLE DE RÉPLICATION DU VIH. .......................................................................... 11 FIGURE 6: DIAGNOSTIC SÉROLOGIQUE: LES TESTS DE DÉPISTAGE INDIRECTS. .................... 17 FIGURE 7: CIBLES DES ANTIRÉTROVIRAUX............................................................................. 26 FIGURE 8: FACS COUNT ......................................................................................................... 30 FIGURE 9: REAL TIME PCR M 2000 (ABBOT) ..................................................................... 31 LISTE DES TABLEAUX TABLEAU 1: RÉPARTITION DES PATIENTS EN CLASSE D'ÂGE .................................................. 39 TABLEAU 2: SEXE PAR RAPPORT À LA TRITHÉRAPIE ............................................................... 41 TABLEAU 3: TRAITEMENT ARV ET LES PARAMÈTRES BIOLOGIQUES. ................................... 42 TABLEAU 4: DISTRIBUTION DE LYMPHOCYTES TCD4 EN FONCTION DU NIVEAU D'ÉTUDE. .. 43 TABLEAU 5: LES LYMPHOCYTES TCD4 EN FONCTION DE VARIATION DU POIDS. ................... 44 TABLEAU 6: TAUX DE LYMPHOCYTES TCD4 ET CHARGE VIRALE PAR CLASSE D'ÂGE. .......... 45 TABLEAU 7: PARAMÈTRE BIOLOGIQUES PAR RAPPORT AUX TRANSAMINASES GOT. ............ 46 TABLEAU 8: PARAMÈTRES BIOLOGIQUES ET TRANSAMINASES GPT. ..................................... 47 TABLEAU 9: PARAMÈTRES BIOLOGIQUES EN FONCTION DES CLASSES DE LYMPHOCYTES TCD4 INITIAUX. ................................................................................................................ 48 TABLEAU 10: PARAMÈTRES BIOLOGIQUES EN FONCTION DES CLASSES DE LYMPHOCYTES TCD4 FINAUX: .................................................................................................................. 49 x Introduction L’infection par le virus de l’immunodéficience humaine (VIH) atteint aujourd’hui, à des degrés variables, l’ensemble des pays du monde. Le continent africain est le plus touché par cette infection tant chez les adultes que chez les enfants : sur 34,3 millions de personnes vivant avec le VIH dans le monde, 24,5 millions vivent en Afrique sub-saharienne (ONU/SIDA, 2008). Le VIH affecte le système immunitaire en infectant les cellules lymphocytaires T de la classe de différentiation 4 saines, qui se transforment en véritables usines de production de nouvelles particules virales (MHAWEJ, 2007). L’infection à VIH détermine à terme une immunodépression définissant le SIDA. Les traitements ARV modernes permettent une maîtrise de la réplication virale suffisante pour obtenir une restauration immunitaire de qualité. Ils permettent aussi de diminuer le nombre de décès dus au SIDA, mais ne neutralisent pas le virus, qui se retrouvera sous forme de provirus dans l’organisme. A cause des traitements avec les ARV (TARV), le VIH/SIDA est devenu une maladie chronique en Europe et dans les pays d’Afrique où ces médicaments sont accessibles (BONNARD et coll., 2005). Le traitement aux ARV n’étant que virostatique, pour s’assurer de son succès chez les patients, le suivi des paramètres biologiques est nécessaire. Ceci dans le but d’évaluer l’efficacité du traitement ; de déterminer de façon précoce les échecs thérapeutiques ainsi que les toxicités significatives avant toute manifestation clinique nuisible et d’assurer une prise en charge efficace à temps. Ainsi notre recherche en biologie moléculaire a pour objectif général de contribuer à améliorer la prise en charge médicale des personnes vivant avec le VIH/SIDA au centre de recherche biomoléculaire (CERBA) et au centre médical Saint Camille (CMSC) de Ouagadougou. Les objectifs spécifiques visés de notre mémoire de DEA sont : i) confirmer la sérologie des patients par les tests VIH en ELISA ; ii) suivre l’évolution des paramètres biologiques et anthropométriques ; iii) maîtriser les outils de diagnostic immunologique à savoir la technique de cytophotométrie FACScount et FACS calibur ; iv) maîtriser les techniques de la PCR, la 1 RT-PCR et de la PCR à temps réel ; v) doser par le spectrophotomètre l’aspartate aminotransférase1 (ASAT) ou transaminase glutamique oxaloacétique (GOT) et l’alanine aminotransférase2 (ALAT) ou transaminase glutamique pyruvique (GPT) afin d’évaluer la toxicité des ARV sur le foie. Pour ce faire, ce document s’articule autour de quatre grands axes : o une revue bibliographique sur le VIH et les différentes méthodes identifications associées au VIH ; o Une description des matériels et méthodes utilisés ; o Une présentation et analyse des résultats obtenus ; o Une conclusion générale et des perspectives. 2 CHAPITRE I– GÉNÉRALITÉS 3 I. Structure des Virus de l'Immunodéficience Humaine L’étude de la structure génétique du VIH permet de comprendre la complexité de ce virus, certaines de ses manifestations cliniques et biologiques, et d’envisager des stratégies pour la recherche thérapeutique (SIMPORE, 2006). Le Virus de l’Immunodéficience Humaine (VIH) est un rétrovirus de 0,1 µm de diamètre, du sous groupe des Lentivirus, responsable du Syndrome d’Immunodéficience Acquise (SIDA). Il contient dans sa capside la transcriptase inverse, l’intégrase, la protéase, la ribonucléase et deux (02) molécules d’ARN identiques (comportant neuf gènes : gag, pol, env, vpu, vpr, tat, rev, nef, vif) et enveloppées par la nucléocapside. Figure 1: Structure du VIH ( source: http://annedecosterfreefr/d viro/vretrovhtml) I. 1 – Morphologie La morphologie et la structure de tout les VIH sont sensiblement identiques. Les particules virales mûres sont grossièrement sphériques. La capside a une forme en tronc de cône. On y distingue de l’extérieur vers intérieur : Une enveloppe dans laquelle sont incluses : Des spicules formés par l'association de deux glycoprotéines : La gp120 : glycoprotéine de surface de poids moléculaire 120 kilodaltons, il a une affinité avec les récepteurs CD4 des lymphocytes T ; 4 La gp41 : glycoprotéine de poids moléculaire 41 kilodaltons, liée à la gp120 et qui a un tropisme pour les corécepteurs CCR5 présents à la surface des monocytes/macrophages et les CXCR4 à la surface des lymphocytes T CD4. La gp41 est responsable de la fusion de l'enveloppe avec la membrane cellulaire ; Une couche de phospholipides. La matrice : C’est l’ensemble des protéines matrices qui tapissent la face interne de l'enveloppe. Elle est constituée de glycoprotéines p17. Une capside : C’est un assemblage de la protéine (glycoprotéine p24) en forme de tronc de cône. La capside contient le génome viral, les enzymes et joue le rôle d’enveloppe protectrice. Le génome : Le génome est diploïde c'est-à-dire constitué de 2 filaments d’ARN monocaténaires identiques d'environ 10 KB enveloppés par la nucléocapside (protéine p7) qui les associe étroitement et les protègent de l’activité des enzymes cellulaires et interviennent dans l'assemblage des virions. Bien que de polarité positive, ces ARN ne sont jamais utilisés directement comme ARN messagers. Des enzymes: La transcriptase reverse est impliquée dans la rétro-transcription de l’ARN viral simple brin en ADN double brin complémentaire (ADNc) qui s’intègrera ensuite facilement à l’ADN de la cellule hôte sous forme d’ADN proviral ; L'intégrase qui permet l’intégration de l’ADNc transcrit dans l’ADN cellulaire et forme le provirus ; Une protéase qui fragmente les protéines virales synthétisées qui pourront alors être assemblées pour la formation de nouveaux virions (particules virales) ; La ribonucléase : On trouve dans chaque virion une cinquantaine de molécule de chaque enzyme. I. 2 Organisation génomique 5 Figure 2: Structure du génome viral. (Source : http://www.multimania.com/microbio/virologie/monographies/HIV/HIV_sida.html) Le virus possède trois gènes codants pour les différentes protéines virales: Gag (groupe antigène) qui code pour des protéines de la capside, Pol (polymérase) qui code pour des enzymes nécessaires à sa réplication, Env. (enveloppe) qui code pour des glycoprotéines. Les gènes gag, pol. env. sont régulés par des séquences terminales répétitives ou Long Terminal Repeat (LTR) qui sont créées lorsque la transcriptase reverse synthétise l’ADN proviral. Le VIH possède également 6 autres gènes : Vpu (Viral protein U), Nef (Negative factor), Tat ( Transactivator of transcription), Rev et (Regulator of viral expression), Vif (Viral infectivity factor) et Vpr (Viral protein R) (HASELTINE, 1991 ; WANG et coll., 2000). II. Variabilité génétique La grande variabilité du VIH s’explique par des mutations aléatoires dues à la transcriptase inverse incapable de détecter les erreurs de transcription. II.1 La variabilité de la glycoprotéine gp120 L'analyse comparative des glycoprotéines gp120 isolées à partir de nombreuses souches de 6 virus a permis de définir des régions constantes (C) et des régions variables (V). Le gène codant la gp120 a été modifié par les erreurs commises par la transcriptase reverse impliquée dans la rétro-transcription de l’ARN viral simple et les protéines correspondantes présentent de légères différences en fonction du virus infectieux. Les régions constantes sont conservées car elles sont essentielles à la survie du virus. Quand, dans le gène codant la molécule gp120, le site de liaison à la molécule CD4 est modifié, le virus ne peut plus se fixer aux cellules-cibles et disparaît, puisqu'il a perdu tout pouvoir infectieux : il a subi une mutation létale. I.2. Diversité du VIH : Une des caractéristiques essentielles du VIH est sa très grande diversité génétique. On distingue deux types viraux majeurs, les VIH-1 et VIH-2, résultats de deux transmissions zoonotiques différentes, à partir de chimpanzés pour le VIH-1 et de Sooty mangabey pour le VIH-2 (LEMAHIEU et DECOSTER, 2006). Le VIH-1 est très largement répandu à travers le monde. Il est la cause de la pandémie et pose un problème majeur de santé publique dans tous les continents. Tandis que le VIH-2 a une diffusion beaucoup plus limitée. Il est essentiellement présent en Afrique de l’ouest, en particulier en Guinée-Bissau, en Gambie, au Sénégal, en Côte d’Ivoire, au Burkina-Faso et a atteint le Mozambique et l’Angola, à partir de la Guinée-Bissau. On le retrouve également hors d’Afrique, en Inde et au Brésil (LEMAHIEU et DECOSTER, 2006). Il est moins pathogène et moins transmissible que le VIH-1. L’infection à VIH-2 ne s’est pas développée sous une forme épidémique. Le VIH-2 est naturellement résistant aux inhibiteurs non nucléosidiques de la transcriptase inverse (INNTI) (LEMAHIEU et DECOSTER, 2006). L’analyse phylogénétique a permis de décrire quatre groupes pour le VIH-1 : M pour Majeur, N pour Nouveau ou Non O Non M, O pour Outlier et P. Les souches du groupe M représentent presque toutes les souches circulantes. Les virus du groupe O ne représentent qu’une minorité de souches circulantes. Ils sont trouvés en Afrique centrale et plus spécialement au Cameroun où ils représentent 2 % des VIH-1. Le groupe N a été identifié chez une quinzaine de patients camerounais. Le groupe M est actuellement subdivisé en neuf sous-types: A, B, C, D, E, F, G, H, J, dits «purs» et de nombreuses formes recombinantes dites mosaïques de différents sous-types. Certains virus mosaïques jouent un rôle majeur dans l’épidémie mondiale de SIDA, d’où leur appellation de «Circulating Recombinants Forms» ou CRFs ; c’est l’exemple de la forme recombinante entre les sous-types A et G, dite CRF02 ; 7 responsables d'un grand nombre d'infections en Afrique de l'Ouest (ROQUEBET, 2009). Les différents sous-types prédominants du VIH-1 se répartissent ainsi suivant les régions : Afrique de l’ouest (A), Afrique de l’est et du sud (C), Afrique centrale (A, C, D, CRF_01AE, F, CRF_02AG, H, J), Inde (C), Asie du sud-est (B, CRF_01AE), Amérique latine : B, F. Des situations d’échec des anticorps anti-VIH liées à des mutations de certains isolats ont été rares, mais régulièrement rapportées. Les tests moléculaires de détection et de quantification de l’ARN viral plasmatique sont également affectés par la diversité génétique du VIH-1. Le VIH-1 du groupe O est naturellement résistant aux INNTI. Figure 3: Variabilité du VIH-1. Source : http://www.multimania.com/microbio/virologie/monographies/HIV/HIV_sida.html III. Cycle de vie du VIH-1 Une fois dans l’organisme de son hôte, le VIH suit un cycle de vie qui lui permet de se multiplier : La fixation par gp120 La gp120 du virus se fixe au récepteur cellulaire qui est la molécule CD4. La molécule CD4 + caractérise les lymphocytes auxiliaires (les lymphocytes Th ou CD4 ). Elle est également présente sur les macrophages, les cellules dendritiques des ganglions, de la rate et de l'épiderme (les cellules de Langerhans) ainsi que sur les cellules microgliales du cerveau (qui 8 sont les macrophages résidents du système nerveux central) (REVILLARD et coll., 2001 ; KIM et coll., 2009). La pénétration par fusion Après s'être fixée à la molécule CD4, la gp120 du virus doit trouver un second récepteur cellulaire, qui est un co-récepteur ; il se forme un complexe trimérique CD4-gp120corécepteur indispensable pour permettre à la glycoprotéine gp 41 d'exercer son activité fusionnante. Ces co-récepteurs du VIH sont des récepteurs cellulaires à diverses chimiokines (cytokines) attirantes et recrutant les leucocytes au cours des réactions immunitaires : Ce sont les CCR5 sur les macrophages et les CXCR4 sur les lymphocytes Th (T). La région de gp120 qui se fixe au co-récepteur s'appelle la boucle variable V3 (REVILLARD et coll., 2001 ; KIM et coll., 2009). Une infection par le VIH s'établit avec une souche à tropisme macrophage, puis des variants vont apparaître au cours de l'infection, dotés d'un double tropisme macrophage et lymphocyte T CD4+. Mais à la phase terminale, la majorité des virus ont un tropisme pour les lymphocytes T CD4+. La décapsidation Dans le cytoplasme, la capside se désagrège et libère le génome du virus. La réplication Dans le cytoplasme de la cellule hôte, la transcriptase inverse virale copie l'ARN en ADN simple brin, grâce à son activité RNAase H, elle dégrade le brin d’ARN hybride ADN-ARN et copie l'ADN simple brin pour former un ADN bicaténaire. La réplication suit un mécanisme très complexe qui conduit à la création de séquences particulières aux extrémités de l'ADN proviral : les LTR (Long Terminal Repeat) Figure 4: Génome viral et proviral. (Source : HURAUX, 2007). 9 Bien que ces séquences soient identiques, elles ne vont pas jouer le même rôle. En effet, à l’extrémité 5' le LTR est un promoteur puissant de la transcription et en 3' le LTR fournit le signal de coupure qui précède la polyadénylation (ARNm). C'est aussi un promoteur potentiellement capable d'activer un gène cellulaire situé à proximité. La circularisation L’ADN viral est transporté dans le noyau, avec l'intégrase virale. Il se circularise. L'intégrase se fixe au niveau des LTR L’intégration L’intégrase coupe les deux brins de l'ADN cellulaire pour introduire l'ADN viral. L'intégration semble pouvoir se faire dans de multiples sites de l'ADN cellulaire. L’intégration dépend aussi de l'activation des cellules infectées. L’activité de la transcription inverse est lente et incomplète dans les cellules au repos. Il se forme un ADN incomplet qui pourra être éventuellement complété si l'activation de la cellule ne survient pas trop tardivement. Sinon, l'infection avortera. La traduction Après avoir été transcrits par l'ARN polymérase de la cellule, les ARN messagers viraux sont traduits en trois précurseurs protéiques. Ces précurseurs sont clivés par des protéases, pour donner les différentes protéines virales. L’assemblage Les protéines virales et l'ARN viral sont associés pour former de nouvelles particules virales infectieuses. Les protéines virales membranaires sont intégrées à la membrane du lymphocyte. Le bourgeonnement Le virus bourgeonne, emportant un fragment de la membrane plasmique du lymphocyte sur laquelle sont intégrées les protéines membranaires virales. La libération Les nouveaux virus sont libérés dans le milieu intérieur. Ils peuvent infecter de nouveaux lymphocytes T CD4 (HURAUX, 2007). 10 Figure 5: Cycle de réplication du VIH. (Source : http://anne.decoster.free.fr/d1viro/vretrov0.html) IV. Les cellules cibles du VIH Les cellules cibles sont essentiellement les cellules du système immunitaire : les lymphocytes T-auxiliaires (T helper) et les macrophages qui expriment à leur surface la protéine CD4. La protéine CD4 est le récepteur de la cellule que le virus reconnaît. Le récepteur CD4 a une forte affinité avec la glycoprotéine gp120 de l’enveloppe du VIH. Toutes ces cellules sont principalement concentrées dans les organes lymphoïdes, en particulier les ganglions. C'est donc dans ces organes que le VIH se multiplie. Le sang périphérique ne contient que 2 % des lymphocytes totaux (HURAUX, 2007) IV .1. Les cellules lymphocytaires du sang Comme toutes les cellules du sang, les lymphocytes et les macrophages proviennent de la moelle osseuse. On distingue deux classes de lymphocytes : certains se différencient dans la moelle osseuse en lymphocytes B (cellule Burso-dépendante) à vie généralement courte (4 à 5 jours) qui produiront des anticorps (agents de l’immunité humorale) ; d'autres migrent vers le thymus où ils se différencient en lymphocytes T (T pour Thymus ou Thymo-dépendante) supports de l’immunité cellulaire, dont la vie est généralement plus longue (5 à 6 mois), dont on peut distinguer deux populations d'après la présence de protéines ancrées dans leurs membranes 11 cytoplasmiques : IV.1.1 Les lymphocytes T-auxiliaires (T-helpers ou Th) : Ils sont caractérisés par la présence de la protéine CD4 à leur surface (ce sont des lymphocytes TCD4+ ou T4). Sans lymphocyte Th, toute réponse immunitaire à un antigène (bactérie, virus, parasite) est déficiente, d'où leur appellation de lymphocytes T auxiliaires. Sans lymphocytes Th, on observe donc une immunodéficience. IV.1.2 Les lymphocytes T-cytotoxiques (Tc) : Sont caractérisés par la présence de la protéine CD8 à leur surface (ce sont des lymphocytes + TCD8 ou T8). Ils reconnaissent spécifiquement les cellules infectées par des virus et les détruisent avant que le virus ne se soit multiplié, d'où leur appellation de lymphocytes T cytotoxiques. IV.2 Réponse immunitaire de l'organisme de l’hôte au VIH : IV.2.1 Réponse Humorale : Elle se manifeste avec l'apparition d'anticorps anti-VIH. Parmi ces anticorps, les anticorps anti-gp120 se fixent aux spicules et empêchent la fixation des particules virales aux cellulescibles. IV.2.2 Réponse cellulaire : IV.2.2.1 immunité non spécifique : Cette réponse est assurée par les neutrophiles et les macrophages qui phagocytent les antigènes viraux. IV.2.2.2 immunité spécifique : Elle se manifeste avec l'apparition de lymphocytes T-cytotoxiques qui reconnaissent les cellules infectées (en particulier les lymphocytes Th) et les détruisent avant que celles-ci n'aient fabriqué de nouvelles particules virales. Mais comme les Th sont indispensables à l'activation des Tc, leur destruction affaiblit progressivement l'efficacité de la réponse immunitaire. Si les Th diminuent, la réponse immunitaire de l'organisme diminue également, tant vis-à-vis du VIH que des autres agents 12 infectieux (bactéries, virus et parasites). IV.2.3. L'épuisement du système immunitaire : On a longtemps cru que le VIH (Lentivirus donc virus lent) entrait en latence peu après l'infection, ce qui expliquait la phase de latence clinique de très longue durée, mais ce qui ne permettait pas de comprendre la disparition inexorable des lymphocytes Th dans le sang. (HURAUX, 2007). En fait, le VIH engendre une infection chronique, il ne cesse de se reproduire. Dès la primoinfection, une multiplication intense du virus a lieu. Chaque jour, un individu infecté produit 8 9 cent millions (10 ) à un milliard (10 ) de virus tandis qu'en même temps plusieurs centaine de millions de lymphocytes Th sont détruits et remplacés. Puis, dans les semaines qui suivent la primo-infection, on observe une diminution progressive, mais incomplète du nombre de virus dans le sang, liée aux effets de la réponse immunitaire. (HURAUX, 2007) En effet, les lymphocytes TCD8 cytotoxiques détruisent les lymphocytes Th infectés avant qu'ils ne libèrent des virus. Les anticorps neutralisants empêchent l'infection des lymphocytes Th par les virions libérés. Tout au long de la latence clinique, des variant apparaissent : l'un des variant échappe à la réponse immunitaire initiale et prolifère. Le système immunitaire reconnaît cette nouvelle souche et réagit spécifiquement contre elle par de nouveaux lymphocytes Tc et de nouveaux anticorps. Mais d'autres variant vont à nouveau apparaître et parmi eux certains vont échapper à la nouvelle réponse immunitaire. Le système immunitaire doit à nouveau les reconnaître puis les éliminer. Le cycle se répète et le VIH fini par entraîner une infection chronique, rendant ainsi l'éradication du virus impossible. Chaque nouveau variant entraîne la destruction des lymphocytes Th, qui se raréfient progressivement. Au bout de plusieurs années, les variations incessantes du VIH finissent par épuiser le système immunitaire. Il s'en suit une réplication incontrôlée du virus et la disparition complète des lymphocytes Th. La longue période de latence clinique masque la lutte permanente entre le VIH et le système immunitaire. L'apparition du SIDA est la conséquence de la destruction du système immunitaire par le VIH. V. La transmission du VIH : 13 Le virus peut être isolé dans la plupart des liquides biologiques : sang, sperme, sécrétions vaginales, lait maternel, salive, larmes, LCR, urine. Mais le VIH, virus enveloppé, est un virus fragile qui ne peut se transmettre qu'à l'occasion de contacts interhumains "rapprochés". Le VIH peut donc se transmettre par voie sexuelle, par voie sanguine ou par voie verticale de la mère à l’enfant. VI. Ethiopathologie La maladie évolue en trois phases successives : 1° la phase de primo-infection Elle est symptomatique ou asymptomatique, c'est à dire cliniquement silencieuse. Elle a lieu entre 1 à 3 semaines après le contact avec le virus. Mais, comme ces symptômes ressemblent à ceux qu'on observe au cours de diverses affections virales aiguës (mononucléose infectieuse), la primo-infection risque souvent de passer inaperçue. Les premiers signes de primo-infection apparaissent en moyenne 20 jours après la contamination. La primo-infection dure de 1 à 7 semaines. Cette phase correspond à une multiplication virale intense et à la dissémination du virus et est caractérisée par une forte virémie. Cette période est dite dangereuse car on estime que 52 à 90% des personnes contaminées l’ont été par une personne en phase de primo-infection. L’évolution vers le Sida est plus rapide après une primo-infection symptomatique (on constate en effet une charge virale très élevée). Le système immunitaire réagit à l'infection et, en quelques semaines, des anticorps apparaissent dans le sérum, dirigés contre l'ensemble des protéines du VIH : c'est la séroconversion. Le sujet infecté devient séropositif. 2° la phase asymptomatique La deuxième phase est asymptomatique (phase de séropositivité) et peut être très prolongée (10 à 15 ans). Elle dure 8 à 11 ans en moyenne dans le cas du VIH-1 et peut durer 15 ans dans le cas du VIH-2. Mais peut être brève, 3 ans seulement. Le virus se réplique continuellement dans les gîtes lymphoïdes. Les lymphocytes TCD4 vont lentement, mais inexorablement, diminuer. Il peut y avoir des adénopathies (tuméfaction d’un ou plusieurs ganglions lymphatiques) disséminées. 14 3° la phase clinique La phase clinique correspond au SIDA proprement dit. Pendant cette période le nombre de 3 lymphocytes TCD4 devient inférieur à 200 cellules / mm . Le syndrome d'immunodéficience apparaît et ses manifestations les plus fréquentes sont les infections opportunistes sévères. Une infection opportuniste est une infection grave provoquée par un micro-organisme, habituellement non pathogène mais qui profite de l'opportunité offerte par l'immunodéficience. La mort survient entre 9 mois à 2 ans en absence de traitement. VI.1. Les non-progresseurs à long terme : Dans la majorité des cas, les signes cliniques de déficit immunitaire apparaissent pendant les dix années suivant la séroconversion. Néanmoins, un nombre restreint de sujets (5 à 10 %) demeurent cliniquement sains et immunologiquement normaux (avec un taux de lymphocytes CD4 supérieur à 500 /mm3) audelà d'une décennie (jusqu'à 18 ans, à ce jour) : ce sont les sujets dits "non-progresseurs à long terme". Les critères retenus pour les non-progresseurs à long terme sont en général, une séropositivité depuis au moins huit ans, un état clinique asymptomatique, un taux de CD4 stables > à 500/ mm3 et pas de traitement antirétroviral. Chez ces sujets, la charge virale plasmatique est basse voire indétectable, mais elle persiste (LEMAHIEU et DECOSTER, 2006). VI.2 La résistance à l'infection : On a remarqué que dans des groupes de sujets à haut risque (homosexuels dont les partenaires étaient morts du Sida, hémophiles ayant reçu du sang contaminé), quelques sujets n'étaient pas cliniquement atteints du Sida. Ces sujets sont homozygotes pour une mutation portant sur le gène codant le co-récepteur CCR5. La protéine ainsi mutée perd le domaine transmembranaire. Avec cette perte, elle ne peut donc plus jouer le rôle de co-récepteur pour l'entrée du VIH. Cette anomalie atteindrait environ 1 % de la population de race blanche.(LEMAHIEU et DECOSTER, 2006) VII. Le diagnostic biologique L'infection par le VIH entraîne une réponse immunitaire qui fait apparaître des anticorps 15 dirigés contre toutes les protéines virales. La présence d'anticorps anti-VIH est le témoin de l'infection, un individu qui les possède est déclaré séropositif. Le diagnostic biologique se fait par la sérologie VIH lors du dépistage. Le diagnostic sérologique s'opère en deux étapes : VII.1 le diagnostic sérologique C’est un test de sensibilité, qui consiste à déterminer les anticorps ou immunoglobulines produits en réponse à l’infection liée à un antigène. VII.1.1 Cinétique des marqueurs de l’infection à VIH Après la contamination, le virus est détectable sous la forme d’acide nucléique (ARN) dès les 10 e -12 e jours et sous sa forme d’antigène p 24, vers les 12e -14e jours (PLANTIER et coll., 2002). Les premiers anticorps sont détectables vers le 21ème jour (séroconversion). VII.1.1.1 Les immunoglobulines Un certain temps s'écoule entre la contamination par le virus et l'apparition des anticorps. Pendant cette période, le sujet contaminé est infectieux mais la sérologie est négative. Cette période est appelée la "fenêtre sérologique", plus les techniques de détection s'améliorent plus la fenêtre sérologique diminue. Actuellement, la fenêtre sérologique est de 22 jours en moyenne (avec des écarts de 6 à 38 jours). VII.1.1.2 La glycoprotéine p24 Encore appelée antigène p24, c’est un marqueur direct de l’infection à VIH utilisé dans le diagnostic direct, car sa présence correspond à la présence de la particule virale. Sa détection intervient dans le diagnostic précoce de l’infection, résolvant ainsi le problème de l’indétectabilité des anticorps à cette phase de l’infection. VII.1.1.3 L’ARN viral plasmatique Sa présence indique qu’une réplication virale constante a lieu dans l’organisme. Par ailleurs, dans la progression normale du VIH constatée chez la plupart des patients, la charge virale augmente dès la contamination avant de régresser. Une charge virale est généralement détectable dès le 10e et 12e jour suivant la contamination (PLANTIER et coll., 2002). Ce test peut rentrer dans le cadre du diagnostic et peut être pratiqué dans certain cas pour une 16 détection précoce d'une séropositivité. Si une valeur positive est significative, une charge virale indétectable n'est absolument pas significative. Figure 6: Diagnostic sérologique: les tests de dépistage indirects. (Source : Réseau VIH, Revi- hop 06, 2005) VII.1.2 Diagnostic sérologique : les tests de dépistage indirects Dans un dépistage, il est important d'éviter des résultats faussement négatifs. On utilise pour cette raison, une technique sérologique sensible selon l’algorithme de diagnostic qui prévoit l’utilisation de tests rapides à lecture de bandes visuelles (Determine ® et Génie II ®), dont le second est effectué pour confirmation et discrimination des VIH seulement si le résultat du premier est positif. La sensibilité et la spécificité de ces deux tests rapides sont confrontées à celui de la méthode ELISA sur spectrophotomètre dans le cas où ces deux tests rapides fournissent des résultats discordants. Ces tests sont capables de dépister à partir d’un sérum ou d’un plasma humain, les anticorps anti-VIH1 et anti-VIH2 (MAIGA et coll., 1992). a.) Le test de TRI- DOT C’est un test qualitatif et discriminatoire, visuel et rapide de détection des anticorps antiVIH-1 et/ou VIH-2 dans le sérum ou plasma humain qui permet de spécifier le type I ou II du 17 VIH. Ce test a lieu après que celui du « Determine » ait donné un résultat positif. Son principe est le suivant: Les antigènes (Ag) VIH à savoir les protéines représentant les régions immunodominant du VIH-1 de du VIH-2. Ce sont entre autre la gp 41 et la région cterminale de la gp 120 pour le VIH 1 ; la gp 36 pour le VIH 2 sont immobilisées sur une membrane poreuse d’immunofiltration. Si l’échantillon du patient à tester traversant la membrane contient des anticorps (AC) anti-VIH 1 et/ou anti-VIH 2, ils se lient aux antigènes qui y sont fixés. Le conjugué se lie par la suite à la partie Fc des anticorps pour donner un point rosacé. b.) Le test ELISA Principe : consiste en la recherche des anticorps anti-VIH à l'aide d'une technique ELISA (Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay) : De nos jours, deux types de tests ELISA sont utilisés pour le dépistage : Le test ELISA ‘‘Sandwich’’ où la révélation de la réaction entre Ag du kit et Ac anti-VIH du patient se fait par un Ag marqué se fixant sur les sites Ac restés libres. Le test ELISA ‘‘indirect’’ où la fixation des Ac du patient sur les Ac du kit est révélée par une anti-globuline humaine anti IgG marquée par une enzyme. c.) le Western Blot (WB) Une autre technique, le Western Blot (WB) est une méthode directe utilisée comme test de confirmation de référence (PLANTIER et coll., 2002; KLIMKAIT et coll., 2008). Le WB est une technique de transfert sur nitrocellulose, après migration électrophorétique sur gel de polyacrylamide, de protéines d'un lysat viral VIH-1 ou VIH-2. Sur la bandelette de WB, différentes protéines constitutives des virus seront reconnues par des anticorps spécifiques anti-VIH-1 ou VIH-2 et révélée par une technique ELISA. Le recours au WB pour une confirmation de sérologie VIH positive n'est pas vulgarisé dans tous les laboratoires en Afrique à cause de sa complexité technologique. Critères de positivité du WB définis par l'OMS: Le WB doit révéler au moins deux bandes correspondant aux produits du gène env., (pour VIH-1 : les produits de ces gènes sont gp 160, gp 120, gp 41), et ceci quelle que soit la réactivité des bandes correspondant au produit des gènes gag ou pol. 1° - Chez un sujet séropositif, le Western blot est "complet" : il met en évidence des anticorps 18 dirigés contre l'ensemble des protéines virales. 2° - L'apparition de bandes colorées ne correspondant pas aux critères d'un WB positif définit un WB indéterminé. Ceci peut traduire : • une séroconversion en cours pour le VIH-1 : elle sera affirmée par l'examen d'un nouveau sérum prélevé après un délai de 2 à 4 semaines au cours duquel les anticorps spécifiques vont atteindre un taux détectable. • une infection par le VIH-2 : qui devra être confirmée par un test spécifique de ce virus (ELISA et W-B). • une réactivité non spécifique : si, sur un autre prélèvement pratiqué 2 à 4 semaines plus tard et à fortiori 2 à 3 mois plus tard, le profil du WB reste identique, il s'agit d'une réactivité non spécifique : il n'y a pas d'infection par le VIH. (http://www.who.int/hiv/pub/guidelines/adult/en/index.html; http://www.unaids.org.) VII.2.2. Diagnostic moléculaire On procède à amplification génique à l’aide de sondes spécifiques des séquences les plus conservées (gag et pol). On peut rechercher, soit les séquences intégrées (l'ADN proviral cellulaire), soit l’ARN plasmatique du virus après rétrotranscription (RT-PCR). VIII. Marqueurs de l’évolution vers le SIDA L'infection à VIH est une infection chronique dont les manifestations cliniques n'apparaissent qu'après une période plus ou moins prolongée, généralement plusieurs années. Pour évaluer le pronostic de l'infection on fait appel à l'interprétation de deux marqueurs biologiques: La quantification de l'ARN plasmatique du VIH et la numération des lymphocytes T4 ou CD4, sont les principaux examens du suivi infectieux du patient. 1° - la numération sanguine des lymphocytes T CD4 : ce sont des globules blancs qui assurent la coordination de la défense immunitaire. Leur taux normal est compris entre 800 et 1200 cellules/ µl. Si ce taux est inférieur ou égal à 200 cellules/µl, on entre en phase SIDA. A partir de 350CD4/ µl, on estime qu’il faut commencer à envisager un traitement aux antirétroviraux (ARV). 2° - la mesure de la charge virale : elle mesure la virémie et est indétectable, si le traitement ARV est efficace. Elle s’exprime en nombre de copies/ml. 19 VIII.1 Evaluation des lymphocytes CD4 Le seul paramètre immunologique utile pour surveiller et prendre en charge les patients infectés par le VIH, est le nombre absolu de lymphocytes CD4 circulants dans le sang. Pour les distinguer des autres lymphocytes, on pratique un immuno-marquage avec des anticorps anti-CD4 fluorescents et on compte les cellules marquées par cytométrie de flux (technique de numération automatique). 3 VIII.1.1. Valeurs normales des T CD4 : entre 800 et 1200/mm Il y a normalement 1500 à 4000 lymphocytes/µl dont 70 % de lymphocytes T (dont 60 % de TCD4 et 40 % de TCD8). Ainsi, le taux de T CD4 est normalement supérieur à 600/ µl Le taux de lymphocytes T CD4 peut varier d'une mesure à l'autre en raison de la variabilité du nombre de lymphocytes circulants. La numération des lymphocytes T CD4 est le paramètre irremplaçable du déficit immunitaire (OMS, 2007). VIII.1.2. Fréquences de comptage des CD4 : Si CD4 < 350 cellules/ µl, on recommande les numérations des CD4 chaque 3 à 4 mois Si CD4 > 350 cellules/ µl ont plaide pour chaque 3 à 6 mois VIII.1.3. Cytométrie de flux C’est une technique de référence et qui consiste à marquer des cellules à l’aide de fluorochrome. Les cellules ainsi marquées sont ensuite passées dans le cytomètre au travers d’une gaine fluide qui permet d’égrainer ces cellules une à une devant un rayon laser. Ce passage permet de déterminer sa taille et son contenu cellulaire (granulométrie) sur la base de la diffraction du rayon incident. VIII.2.- Évaluation de la réplication virale : la charge virale plasmatique La charge virale plasmatique désigne la quantification de l'ARN plasmatique du VIH, réalisée par RT-PCR. Celle-ci est exprimée en nombre de copies/ml ouen Log (base 10). Il existe, comme dans tout système de quantification biologique, un seuil en dessous duquel la RT-PCR ne peut quantifier le virus, on dit alors que la charge virale est indétectable. Le seuil dépend des appareils et des kits utilisés. En dessous de ce seuil, l'indétectabilité ne signifie en aucun 20 cas que le virus n'est pas présent dans l'organisme et qu'il n'est pas infecté, mais juste qu'il est présent en quantité infime. La mesure de la concentration plasmatique de l'ARN du VIH (ou charge virale) évalue l'intensité de la réplication du virus dans l'organisme qui se situe en fait non dans le sang mais dans les organes lymphoïdes. Le niveau de réplication du virus, évalué par la charge virale, est le paramètre le plus précis et le plus précoce pour prédire l'évolution clinique ultérieure. Différentes techniques sont proposées pour évaluer la charge virale : Les trois premières méthodes utilisent des techniques différentes d'amplification pour la mesure de l'ARN plasmatique. Elles permettent de quantifier les VIH du groupe M, elles ne détectent ni le VIH2, ni le VIH1 groupe 0. VIII.2 .1 -La technique Quantiplex HIV RNA (Chiron) Elle utilise une amplification du signal d'hybridation moléculaire. L'ARN viral contenu dans l'échantillon à tester, après libération, est capturé sur une microplaque de 96 cupules par des sondes constituées d'oligonucléotides de synthèse complémentaires du gène pol. Par utilisation de sondes d'ADN branchées, marquées à la phosphatase alcaline, on obtient une amplification d'environ 1 800 fois par molécule d'ARN viral. Après adjonction de substrat, la réaction de chimioluminescence est mesurée par un luminomètre, le nombre de photons émis est proportionnel à la quantité d'ARN. Chaque échantillon est analysé en double et le résultat n'est pas validé quand le coefficient de variation entre les duplicates est supérieur à 30 %. Une courbe d'étalonnage est obtenue à partir de quatre étalons. La quantité d'ARN de l'échantillon est calculée par un Logiciel à partir de cette courbe. Il n'y a pas de contrôle interne à chaque échantillon testé. (http://apps.who.int/medicinedocs/es/d/Js5523f/2.12.html) VIII.2.2 - La technique Nasba QR System (Organon Teknika) Cette technique utilise une amplification isotherme de l'ARN. L'ARN extrait de l'échantillon est retranscrit en ADN par la transcriptase inverse du virus de la myéloblastose aviaire, en utilisant des amorces qui reconnaissent 149 paires de bases du gène gag et une partie du gène pol. L'ARN est ensuite détruit par la RNase H, puis l'ADN viral est transcrit en ARN par une T7 21 RNA polymérase qui génère quelques 100 copies d'ARN à partir d'une copie d'ADN. Ces trois étapes aboutissent en quelques cycles à une amplification d'environ 109 fois la quantité d'ARN présente dans l'échantillon. L'amplification s'effectue en présence de trois contrôles internes qui diffèrent de l'ARN du VIH par 20 nucléotides. En utilisant des sondes oligonucléotidiques différentes marquées par électroluminescence, les contrôles internes et le produit d'amplification sont détectés séparément. Le nombre de copies d'ARN VIH est calculé par un logiciel à partir du rapport signal/bruit de chacun des trois contrôles internes. (http://apps.who.int/medicinedocs/es/d/Js5523f/2.12.html) VIII.2.3 -La technique Amplicor HIV-1 monitor (Roche Diagnostic Systems) Elle est basée sur la technique classique de RT-PCR, utilisant une ADN polymérase thermostable (activité polymérase et transcriptase) avec des amorces reconnaissant 1 42 paires de bases du gène gag et dont l'une est biotinylée en 5'. L'extraction de l'ARN du plasma s'effectue en présence d'un contrôle interne dont le nombre de copies d'ARN est connu et qui sert de standard de quantification. Après transcription inverse et amplification par PCR, la détection des produits amplifiés VIH et du contrôle interne s'effectue dans des micropuits où sont fixées des sondes spécifiques de chacun d'entre eux. La lecture s'effectue sur un spectrophotomètre, après révélation par un système avidine-biotine, Le nombre de copies de chaque échantillon est calculé par rapport à son propre standard interne par un logiciel. (http://apps.who.int/medicinedocs/es/d/Js5523f/2.12.html) VIII.2.4.1 Extraction de l’ARN plasmatique du VIH : Elle comprend quatre étapes : la lyse cellulaire, la séparation des acides nucléiques, la purification de l’ARN et l’élution. Cette phase est précédée d’une étape de prélèvement et de conservation des échantillons. VIII.2.4.2. Prélèvement et conservation de l’échantillon biologique avant extraction des ARN: Le prélèvement : Les prélèvements ont lieu dans des tubes contenant un anticoagulant comme l’EDTA triphosphate. L’héparine n’est pas conseillée car, elle pourrait être à l’origine de l’inactivation de la Taq polymérase au même titre que le hème pendant l’amplification (BIENVENU et 22 coll., 1999). Conservation : Il est nécessaire de stocker l’échantillon biologique immédiatement dans de l’azote liquide ou à moins 80° C avant l’extraction. Ceci dans le but d’éviter des modifications du profil d’expression des gènes qui pourraient intervenir par dégradation spécifique et non spécifique des ARN et par induction transcriptionnelle. Pour cela, des réactifs de stabilisation immédiate de l’ARN par perméabilisation rapide des cellules ont été développés. Les échantillons ainsi traités peuvent être conservés plusieurs jours à la température ambiante (1 jour à 37°C ; 7 jours à 18-25°C) voire plusieurs semaines à -20° C ou -80°C (après 24h à 4°C) sans dommage pour l’ARN (BASTARD et coll., 2002). VIII.2.4.3. Méthodes de lyse et d’homogénéisation : Toute méthode d’extraction des acides nucléiques comprend une étape préalable de lyse et d’inactivation des nucléases afin de préserver l’intégrité des ARN contenus dans chaque cellule. A l’exception des tissus qui subiront une étape préalable de pulvérisation avant toute lyse, lyse et homogénéisation seront menées en parallèle dans tous les autres cas. Il existe différentes méthodes de lyse cellulaire (mécanique ou enzymatique) selon les types de cellules. Si les méthodes mécaniques sont plus dévolues aux cellules et aux tissus, les méthodes enzymatiques sont réservées aux bactéries, aux levures et aux virus afin de dissoudre des structures inaccessibles à la rupture mécanique telles que : les capsides, membranes bactériennes etc. en outre, la plupart des agents dénaturants disponibles pour la lyse, sont de puissants inhibiteurs des RNAses. La plupart des coffrets commerciaux reposent sur ces deux principes avec des pourcentages de thiocyanate de guanidinium et de phénol chloroforme qui leur sont propres (BASTARD et coll, 2002) VIII.2.4.4. Les méthodes d’extraction et de purification des ARN totaux : Après la lyse ; les ARN protégés de l’action des RNAses peuvent être extraits. Cette extraction peut être réalisée selon deux grands principes : Les différences de propriétés physico-chimiques entre les différents acides nucléiques et protéines. 23 L’adsorption sélective des acides nucléiques sur support solide (résine ; billes...) VIII.2.4.4.1. Différences de propriétés physico-chimiques : Le gradient de densité au chlorure de césium (CsCl) est considéré comme la méthode de référence, elle sépare ARN, ADN et protéines en fonction de leurs densités relatives. Les acides nucléiques et protéines présentent des différences de solubilité dans les solvants polaires. Cette propriété est mise à profit dans l’utilisation du phénol saturé en eau. Ce qui permet la séparation spécifique des ARN qui restent en phase aqueuse et des protéines qui précipitent à l’interface solvant eau. Les traces de phénol sont ensuite éliminées par des extractions chloroformiques. Les ARN présents dans la phase aqueuse sont précipités par de l’isopropanol (1v pour 0,5v de phase aqueuse) puis lavés par différentes solutions éthanoliques plus ou moins concentrées. Le culot d’ARN est finalement dissous dans un tampon adéquat ou dans l’eau diéthylpyrocarbonate (DEPC) en bloquant éventuellement l’action des RNAses (BASTARD et coll, 2002). VIII.2.4.4.2. Différences d’adsorption sur support solide (résine, billes...): Ces méthodes sont basées sur la propriété qu’ont les particules de silice à adsorber les ARN en présence de sels comme l’iodure de sodium (NaI) et le thiocyanate de guanidine. Ces sels en milieu acide et alcoolique attirent les molécules d’eau entraînant une réaction adsorption des acides nucléiques sur la silice. Les particules de silices sont disposées en colonne sur le filtre ou recouvrent des billes aimantées. La séparation est opérée par centrifugation ou par tri magnétique. Après lavage élimination les inhibiteurs, les sels et les résidus d’éthanol ; l’élution est réalisée à l’aide d’une solution aqueuse alcaline très peu saline. Des coffrets sont de nos jours commercialisés à cet effet. (BASTARD et coll, 2002). C’est l’exemple du Abbot rt2000 qui est exploité dans notre étude VIII.3: PCR en temps réel de l’ADN du VIH sur papier buvard (DBS) C’est une méthode basée sur la recherche d’ADN proviral. La DBS (Dried Blood Sopt) est donc une technique de diagnostic précoce de l’infection par le virus du VIH. 24 IX.3. les enzymes sériques : IX.3.1. les transaminases ou aminotransférases : Il en existe plusieurs variétés dont les mieux connues sont les transaminases glutamiqueoxalacétiques (GOT), appelées maintenant aspartate-aminotransférases (ASAT) et les transaminases glutamique- pyruviques (GPT), appelées aussi alamine-aminotransférases (ALAT). Au cours des hépatites toxiques et infectieuses, ces enzymes sont libérées dans le sang à des taux supérieurs à la normale (inférieur ou égal à 30 unités internationales/litre). Elles permettent donc d’évaluer l’état d’altération du foie (ASAT, ALAT) due à des coinfections virales (VHB, VHC etc.) ou à la toxicité des antirétroviraux, l’altération du rein (Créatinémie) et du pancréas (Amylasémie). IX.3.2. créatininémie : Elle correspond à la présence de la créatinine (base forte, dérivé cyclisé de la créatine) dans le sang. Son taux normal moyen est compris entre 6 à 15 mg/litre de sérum soit entre 60 à 130μmol/litre. Son dosage renseigne sur l’état de santé du rein du patient. IX.3.3. amylasémie : Présence d’amylase dans le sang. Le taux normal est de 30 à 60 UI/L de sérum. L’amylasémie est normalement élevé dans les pancréatites aigues ; donc sa mesure renseigne sur l’état du pancréas du patient. 25 X. Traitement Figure 7: Cibles des antirétroviraux. (Source :http://anne.decoster.free.fr/d1viro/vretrov0.html) Depuis l'apparition de la première molécule antirétrovirale en 1986, (AZT = Rétrovir), la palette des antirétroviraux n'a cessé de s'élargir. Les molécules actuellement disponibles sont essentiellement rassemblées en 4 familles : les inhibiteurs nucléosidiques de la transcriptase inverse (INRT), les inhibiteurs non nucléosidiques de la transcriptase inverse (INNRT), les inhibiteurs de la protéase (IP) et les inhibiteurs de fusion. Les objectifs des traitements actuels sont de réduire la réplication virale le plus possible et le plus durablement possible en évitant la sélection de mutants résistant aux médicaments employés. En pratique, on associe au minimum trois molécules d’où le nom de trithérapie (2 INRT, 1 IP). De nos jours, il y’a des associations de quatre ou cinq molécules. Bien que ces médicaments puissent avoir des effets secondaires passagers ou permanents qui peuvent conduire à l'arrêt ou surtout la modification du traitement, ils ont une efficacité relativement importante lorsqu’ils sont correctement suivis. Ces traitements sont efficaces mais ils n'ont qu'une activité virostatique (ils n'éliminent pas le virus de l'organisme infecté) et implique donc un traitement à vie (GARRAIT, 2001). 26 . CHAPITRE II : MATERIELS ET METHODES 27 1 – Présentation du cadre d’étude Le Centre Médical Saint Camille de Ouagadougou a été choisi à l’occasion pour l’étude pour plusieurs raisons : Il dispose de services nécessaires à la mise en place du programme de la prévention de la transmission mère-enfant du VIH (PTME): un service conventionné de santé (8000 accouchements/an) un laboratoire qui pratique déjà le dépistage du VIH et un service de pathologie néonatale expérimental dans le suivi de l’allaitement (600 enfants en 2000). Il est l’un des sites << sentinelles >> nationaux de surveillance épidémiologique chez la femme enceinte, et reçoit en moyenne plus de 4000 femmes enceintes par an en consultation prénatale. Il remplit les conditions éthiques pour une telle action en termes de confidentialité du dépistage et du suivi médical de la mère et de l’enfant infectée. Il dispose d’un laboratoire d’analyses biologiques et d’examens biochimiques équipé aux besoins : L’automate Cell_Dyn Ruby pour la numération formule sanguine, bioRad Genie II rapid Test (USA) et Abbott m2000rt pour la RT- PCR à temps réel (réaction de polymérisation en chaîne) pour le dépistage et diagnostic du VIH et du VHB, chromatogramme à gaz HP 5890, d’un FACScount (Becton Dickinson, San Jose, CA) pour la numération des lymphocytes CD4, etc. Une partie de notre étude s’est déroulée au CERBA qui abrite le laboratoire de biologie et de génétique (LABIOGENE) de l’Université de Ouagadougou au profit de la formation des jeunes médecins, pharmaciens et biologistes ; ainsi que pour les recherches fondamentales, pharmacologiques et de biologie moléculaire. C’est une antenne de recherche liée au CMSC. 2 - échantillonnage 2.1 – Population cible Il s’agit d’une étude transversale menée sur 141 patients séropositifs pour le VIH-1 sous thérapie antirétrovirale depuis au moins trois mois afin d’évaluer l’efficacité du traitement. Au début du traitement tous les patients avaient un taux de lymphocytes TCD4 inférieur à 200 cellules/μl. 28 Critères d’inclusion : Mères incluses dans le programme de PTME ou référées au Centre Médical Saint Camille avant ou après l’accouchement, ainsi que tous les membres de leur famille. Tous ces patients sont suivis par les médecins de l’ambulatoire des adultes du CMSC ou du CERBA. Personnes, hommes ou femmes ayant le VIH-1 et sous traitement ARV. Critères d’exclusion : personnes, hommes ou femmes qui ont le VIH-2 (car la charge virale est non disponible) ou le VIH-1 n’ayant pas débuté le traitement ARV. Ainsi de décembre 2008 à juillet 2009, à partir des femmes VIH-1 positifs intégrées dans le programme PTME, on est arrivé à étendre les services du programme à toute leur famille (enfants et maris). A partir de l’ambulatoire des adultes du CMSC et du CERBA, structures en charge du suivi de ces patients adultes, nous avons disposé des informations nécessaires sur nos 141 patients que nous avons recruté pour la numération de leur lymphocytes TCD4, TCD8 et leur charge virale (CV). Ces patients avaient été auparavant testés positifs selon l’algorithme de dépistage du VIH/SIDA en vigueur au Burkina Faso, qui prévoit l’utilisation de tests rapides (Determine ® et Génie II ® SD BIOLINE®), dont le second est effectué pour confirmation et discrimination des VIH seulement si le résultat du premier est positif. La sensibilité et la spécificité de ces deux tests rapides ont été confrontées à celui de la méthode ELISA sur spectrophotomètre dans le cas où ces deux tests rapides fournissaient des résultats discordants. 2.2 – Prélèvements Les prélèvements ont eu lieu le mardi et vendredi entre 7 heures et 9 heures du matin sur des patients VIH-1 qui sont sous traitement ARV et qui viennent pour des examens biologiques de suivi de l’évolution de la maladie : Le sang veineux du pli du coude de chaque patient est prélevé dans deux tubes de 4ml contenant de l’EDTA triphosphate (tube à bouchon violet) ; Celui destiné à la numération des CD4 est homogénéisé, et 50 microlitres de chaque tube sont introduites dans les doubles kits CD4-CD8 mixé au vortex et perforé ; le mélange est ensuite incubé à l’obscurité pendant 1 heure. Après l’ajout du fixateur, l’échantillon peut être conservé pendant 72 heures ; Pour la charge virale, le sang total est centrifugé à 10.000 rpm pendant 10 minutes, le 29 plasma est ainsi prélevé et conservé à moins 80°c. Cette opération est répétée avant l’extraction de l’ARN plasmatique du VIH ; Les informations sur les malades sont tenues dans la confidentialité, seuls les âges, les sexes, les poids sont communiqués dans ce travail ; 2.3 – Matériels Les lymphocytes T CD4 ont été comptés par le FACSCount (Becton Dickinson, San Jose, CA); et la charge virale plasmatique a été déterminée pour ceux dont le taux de lymphocytes T CD4 était inférieur ou égal à 350 cellules par µl en utilisant un Real Time PCR, le M2000 (ABBOTT). Numération des lymphocytes T CD4 : - Des Tubes K3 EDTA de 4ml ; - Une Centrifugeuse ; - Un Vortex, une Perforeuse ; - Cytomètre à flux : le FACSCount et son kit comprenant le tampon CD4-CD8 et un fixateur. Figure 8: FACS Count (Becton Dickinson, San Jose, CA) Charge virale plasmatique : Equipements et consommables - Tube K3 EDTA de 4ml ; 30 - Tubes de 12×75 mm à polypropylène et de 1,5ml à plaques chauffantes à 50°C pour les tubes 12×75 mm et 75°C pour les tubes de 15ml ; - Vortex ; - Plaque de réaction optique à 96 puits ; - Un stratcooler 96 ; - Une centrifugeuse à tube et d’une centrifugeuse de plaque à 96 puits ; - Une hotte ; - Des supports à capture magnétique rouge pour les tubes de 12×75 mm et bleu pour les tubes de 1,5ml ; - Portoirs non- magnétiques ; - Pipette à embouts, pipettes pasteurs stériles jetables et pipette à répétition ; - Les embouts de pipettes étendus munis de protection contre les aérosols ; - Tube d’usage unique sans RNase/DNase ; - Gants ; - Appareil Abbott m2000rt pour la RT- PCR à temps réel. 9: Real Time PCR M 2000 (ABBOT) Réactifs etFigure solutions 31 Réactifs et solutions - Tampon mLysis ; - Des calibrateurs et contrôles internes et externes VIH-1 négatif ; VIH-1 faiblement positif ; VIH-1 fortement positif ; - Les microparticules mMiropartiules ; - Tampons de lavage mWash-1 et mWash-2; - Le master mix : coffret réactifs contenant le réactif d’activation VIH-1 (réactif 1), thermostable rTth DNA polymérase Enzyme (réactif 3) et le réactif d’oligonucléotides VIH-1 (réactif 2); - Hypochlorite de sodium 1%, Eau distillée, Alcool 2.4 - Méthodes 2.4.1 Méthodologie pour la numération des CD4 et CD8 a.) Principe de numération : Cette technique consiste à diriger des anticorps monoclonaux couplés à des fluorochromes contre des antigènes de surface des lymphocytes TCD4 ou TCD8 dans deux tubes différents. Par la diffraction des rayons laser, Le FACScount (cytomètre) arrive à exciter ces cellules marquées et à faire une numération des lymphocytes TCD4 ou TCD8 - b.) Processus : Préparation des échantillons cliniques : - Prélever du sang total veineux du pli du coude des patients dans des tubes contenant de l’EDTA (bouchon violet) et homogénéiser ; - Inscrire le numéro d’indentification du patient sur l’étiquette de la paire de réactifs contenant les billes CD4 - CD8 ; - vortexer la paire de tube en position renversée pendant 5 secondes et en position droite également pendant 5 secondes ; - Perforer la paire de tube CD4 - CD8 à l’aide de la station de perçage ; - Mélanger le tube de sang total du patient en le renversant 5 fois ; 32 - Dans chaque tube, ajouter par pipetage 50 μl du sang total du patient ; - Reboucher les deux tubes et passez-les au vortex pendant 5secondes, en position droite ; - Procéder ensuite à l’incubation pendant 1 heure à l’obscurité pour permettre le marquage au fluorochrome ; - Déboucher les tubes et ajoutez par pipetage 50 μl de solution de fixation dans chaque tube ; - Reboucher les tubes et passez-les au vortex en position droite pendant 5 secondes avant de les passé au FACScount par aspiration. - Analyse des échantillons cliniques par le FACScount: Passer la paire de tube contenant les réactifs au vortex pendant 5 secondes en position droite ; - Déboucher le tube CD4 et placer la paire de tubes de réactifs dans le port-échantillons, le tube CD4 étant en position d’analyse ; - Appuyer sur la touche « RUN» ; - Retirer la paire de tubes et rebouchez le tube CD4. Débouchez le tube CD8 et remettez la paire de tubes dans les port-échantillons, le tube CD8 étant cette fois en position d’analyse ; - Appuyer sur la touche « RUN» ; - Sortir la paire de tubes, rebouchez le tube CD8 et jetez-la dans un récipient convenable ; - On passe l’ensemble au cytomètre qui compte les cellules marquées du sang et par comparaison avec un contrôle interne (billes), le FACScount donne le nombre des lymphocytes CD4 ; CD8 et le ratio CD4 /CD8. 2.4.2 Méthodologie de la RT/PCR pour la quantification de l’ARN du virus du VIH a.) Principe de la technique : Cette méthode est basée sur la rétrotranscription de l’ARN du VIH en ADN grâce à une transcriptase reverse. Cet ADN est ensuite polymérisé suivant des cycles à plusieurs états de température en présence d’oligonucléotides marqués et de primers dans un thermocycleur. La 33 fluorescence des nouveaux brins hybridés permet de quantifier à la fin de chaque cycle le nombre d’ARN viral présent dans le plasma par comparaison avec un standard interne. b.) Procédé : L’extraction de l’ARN du VIH : Cette phase comprend quatre étapes, à savoir la lyse des membranes et capsides virales, la séparation des acides nucléiques, la purification de l’ARN et enfin l’élution de l’ARN. C’est à cette phase que l’ARN viral plasmatique est extrait selon le protocole décrit dans le kit d’extraction. Lyse : - Ajouter 500 μl de contrôle interne par flacon de tampon de lyse (mlyse) et mélanger doucement en retournant le flacon 5 à 10 fois ; - Ajouter 100 μl de microparticules mMicroparticles à chaque tube de 12 x 75 mm à l'aide d'une pipette à répétition ; - Ajouter 2,4 ml de tampon mLysis contenant du contrôle interne à chaque tube de lyse ; - Mélanger 600 μl. De chaque échantillon avec du tampon de lyse par aspiration en n’ouvrant qu'un tube à la fois ; - Incuber à 50 °C pendant 20 minutes les tubes de lyse dans le bain chauffant ; - Retirer les tubes du bain chauffant et placez-les dans le support de capture magnétique (Rouge) pendant 2 minutes ; - Retirer soigneusement le lysat de chaque tube à l'aide de pipettes Pasteur stériles jetables. Séparation : Elle s’effectue par deux lavages avec la solution mWash-1 1er lavage (Wash 1) : - Ajouter 700 μl de solution mWash 1 dans chaque tube de 12 x 75 mm avant de Transférez le liquide de lavage et les particules dans un tube à vis de 1,5 ml étiqueté, puis les transférer vers un support non- magnétique ; - Placer les tubes de 1,5 ml dans un support de capture magnétique (Bleu) pendant 1 minute ; 34 - Retirer avec soin la solution mWash 1 de chaque tube à l'aide d'embouts de pipettes étendus munis de protection contre les aérosols. 2nd lavage (Wash 1) : - Ajouter 700 μl de solution mWash 1 dans chaque tube de 1,5 ml et remettez les particules magnétiques en suspension par aspiration avant de les vers un portoir nonmagnétique ; - Placer les tubes de 1,5 ml dans un support de capture magnétique (bleu) pendant 1 minute ; - Retirer la solution mWash 1 et jetez le liquide et changez de gants. Purification de l’ARN : 1er lavage (Wash 2) : - Ajouter 700 μl de solution mWash 2 et remettez les particules magnétiques en suspension par aspiration avant de transférez les tubes de 1,5 ml vers un portoir nonmagnétique ; - Placer ensuite les tubes de 1,5 ml dans un support de capture magnétique (bleu) pendant 1 minute ; - Retirer la solution mWash 2 et jetez le liquide. 2nd lavage (Wash 2) : répéter les mêmes opérations que le 1er lavage Wash 2 Elution : - Ajouter 25 μl de tampon mElution dans les tubes de 1,5 ml avant de Transférez vers un portoir non-magnétique ; - Placer les tubes de lyse dans le bain chauffant à 75 °C pour Incubation pendant 20 minutes ; - Transférer les ensuite vers un portoir non-magnétique après avoir ajouté 63 μl de solution mWash 2 et remettre les particules magnétiques en suspension par aspiration ; - Placer ensuite les tubes de 1,5 ml dans un support de capture magnétique (bleu) pendant 1 minute ; - Retirer l'éluât (ARN viral) et le transférer dans un tube neuf de 1,5 ml sans RNAse étiqueté ou dans un plateau de réaction en polypropylène à 96 puits. 35 Préparation du master mix pour la rétrotranscription : - Ajouter 271 μl du réactif d'activation VIH-1 (HIV-1 Activation Reagent) ou le réactif 1 dans le flacon d'enzyme ADN rTth polymérase thermostable (Thermostable rTth DNA Polymerase Enzyme) ou le Réactif 3 ; - Ajouter 949 μl du réactif d'oligonucléotides VIH-1 (HIV-1 Oligonucleotide Reagent) ou le réactif 2 dans le flacon d'enzyme ADN rTth polymérase thermostable (Thermostable rTth DNA Polymerase Enzyme) ou le Réactif 3 REMARQUE : Le m2000rt (zone d'amplification) doit être allumé et initialisé pendant au moins 15 minutes préalablement à l'amplification ; - Placer une plaque de réaction optique à 96 puits Abbott dans un Strata-Cooler ; - A l'aide d'une pipette réservée à cet usage, distribuer des aliquotes de 50 μl de master mix d'amplification dans la plaque à 96 puits ; - Vérifier visuellement le niveau de remplissage ; - Transférer la plaque à 96 puits placée sur le Strata- Cooler 96 vers la zone de préparation des échantillons. Préparation de l'amplification pour les dosages Abbott RealTime HIV-1 : - Addition de l'ARN par Transfère de 50 μl d'éluât d'échantillon vers la plaque à 96 puits placée sur le StrataCooler 96 ; - Homogénéiser le mélange réactionnel en aspirant et rejetant la solution 3 à 5 fois Sceller la plaque à 96 puits ; - Retirer la plaque à 96 puits du Strata- Cooler 96 et la placer sur la base de support anti-éclaboussures Abbott ; - Transférer la plaque à 96 puits placée sur la base de support anti-éclaboussures vers la zone d'amplification ; - Centrifuger la plaque à 96 puits placée sur la base de support anti-éclaboussures pendant 5 minutes à 5000 g ; - Assurer-vous que l'appareil Abbott m2000rt est été allumé et initialisé au moins 15 minutes avant ; - Placer la plaque à 96 puits sur le m2000rt ; - Démarrer retrotranscription de l’ARN en ADN, l'amplification et la détection qui ont lieu simultanément dans le Abbott RealTime HIV-1 a consisté à : Étape 1: la rétrotranscription (RT) a lieu comme suit en un (1) cycle: 36 - 65°C°/ 5mn - 42°C/60mn Étape 2:amplification a consisté en 50 cycles - Dénaturation de l’ADN à amplifier en 2 brins monocaténaires à 95ºC pendant 10s ; - Hybridation des amorces aux extrémités 3’ de chaque brin, c’est l’appariement des primers à 60ºC pendant 60s ; - Extension de l’amorce à 72°C par la Taq polymérase pendant 60 secondes ; Étape 3:Une extension finale en 1 cycle à 72°C pendant 10mn et la conservation à 4°C met fin la RT/PCR. Amplification est effectuée par la répétition (50 fois) des ces cycles qui assure une duplication exponentielle de chaque brin. La RT/PCR se termine par une extension finale à 72°C pendant 15 minutes suivi d’une stabilisation à 4°C. 2.4 .3. Dosage des Transaminases GOT GPT Les réactifs suivants ont été utilisés pour leur dosage : GOT U.V Kinetic test code HBE06 IFCC; GPT U.V Kinetic test code HBE07 IFCC; Toutes les mesures ont étés effectuées à l’aide d’un spectrophotomètre de marque Mina plus RAC 040 Aind.C. 2.4 .4. Type de balance La balance utilisée pour prendre le poids des patients dans l’ambulatoire des adultes de CMSC et au CERBA de Ouagadougou est type << Under>> (Max Kg ; 50 : g 500). ANALYSES STATISTIQUES Les données démographiques et cliniques ont été saisies et analysées par le logiciel standard Statistical Package for Social Sciences (SPSS) version 12 pour Windows et par le logiciel EpiInfo version 6. Le seuil de signification statistique a été fixé à p<0,050. 37 CHAPITRE III : RESULTATS ET DISCUSSION 38 A- RESULTATS : Paramètres des patients : Cette étude a concerné un total de 141 patients ayant subit des tests de confirmation par ELISA et de discrimination pour le VIH-1 par TRI-DOT. De ces patients, 106 étaient des femmes soit 75,20 % avec un âge moyen de 35,72±6,73 ans et 35 étaient des hommes soit 24,8% dont l’âge moyen était de 42,60±10,81 ans. Les femmes sont plus jeunes que les hommes, on a trouvé que la différence était statistiquement significative entre les moyennes d’âge des deux sexes (p= 0,001), avec un sexe ratio (F/H) de 3,028. L’âge moyen de cette population concernée de façon générale était de 37,43±8,44 ans. En outre les femmes sont plus nombreuses que les hommes avec une différence qui était statistiquement significative (p<0,050). Parmi les patients de notre étude, 21,30% étaient non scolarisés ; 25,50% avaient un niveau primaire, 34,0% avaient un niveau secondaire et 5,70% un niveau supérieur. a) Répartition des patients par tranche d âge : Les patients de notre étude ont été regroupés par classe d’âge. La tranche d âge la plus représentative était celle entre 30 et 37 ans avec un taux de 32,60%, et un âge moyen de 33,15±2,08 ans; la moins représentée était la tranche inférieure à 30 ans représentant 16,30% du total et un ’âge moyen de 25,74±4,94 ans. L’âge moyen général des patients était de 37,43±8,44 ans (tableau 1). En outre, nous n’avons trouvé aucune différence significative entre ces classes d’âge avec des p>0.050. Tableau 1: Répartition des patients en classe d'âge Classes d’age Effectifs Pourcentages Ages moyens(ans) En année Age<30 23 16,30% 25,74±4,95 30< âge <37 46 32,60% 33,15±2,09 37< âge <44 39 27,70% 39,59±1,96 Age≤44 33 23,40% 48,97±4,11 Total 141 100% 37,43±8,44 p (1→2)>0,05 ;p(1→3)> 0,05 ;p(1→4) > 0,05 ; p(2→3 ) > 0,05 ;p(3→4) > 0,05. 1= âge <30 ans ; 2=30< âge <37 ans ; 3=37< âge <44 ans ; 4= âge >44 ans 39 b) Evaluation des paramètres biologiques en fonction du traitement: On a regroupé les patients de notre étude en fonction de trois types de protocoles de traitements. Le protocole de traitement comprenant la Zidovudine-Lamivudine-Névirapine (AZT/3TC/NVP) a concerné 57 (40,40%) des patients. 60 (42,60%) patients avaient été soumis au protocole Stavudine-Lamivudine-Névirapine (D4T/3TC/NVP). Le traitement avec d’autres ARV avait pris en compte 24 (17,00%) des patients. On n’a pas trouvé de différence statistiquement significative entre les trithérapies utilisées (p>0,050). Par ailleurs, on a identifié une différence statistiquement significative entre les deux sexes pour les traitements utilisé, puisque p (F→H)=0,021 (Tableau 2) En outre, on a remarqué une légère augmentation du poids chez la majorité de nos patients. Mais ces augmentations ne laissent paraître aucune différence statistiquement significative entre les poids initiaux et finaux pour les classes de traitement avec des p > 0.050. Les patients sous le protocole de traitement AZT/3TC/NVP avaient un taux moyen de lymphocytes TCD4i (336,26±181,91 cellules/µl) et de lymphocytes TCD4f (357,67±191,86cellules/µl), avec des valeurs médianes de CV1 (81632,50 copies/ml) et CV2 (00.00). On n’a pas identifié de différence statistiquement significative entre les deux moyennes de taux de TCD4 (p=0,542). Ceux sous le protocole D4T+3TC+NVP avaient une moyenne de lymphocytes TCD4i (330,80±172,85 cellules/µl) et TCD4f (404,33±196,95 cellules/µl) avec des médianes de CV1 (40,00 copies/ml) et CV2 constantes. La différence est statistiquement significative entre ces deux moyennes avec p=0,031. Ceux sous d’autres protocoles trithérapiques (TDF/ABC/LPV ; AZT/3TC/EFV ; D4T/3TC/EFV ; AZT/3TC/DDI/LPV) avaient un taux moyen de lymphocytes TCD4i (249,87±140,64 cellules/µl) et de TCD4f (361,83±148,43 cellules/µl) avec des valeurs médianes de CV1 (119.00) et CV2 (1880.67). Les valeurs de TCD4f sont en augmentation avec des gains statistiquement significatifs avec p=0,010. Aussi, des protocoles de traitement : 1→2, nous n’avons pas identifié de différences statistiquement significatives (p=0,868) pour les taux de lymphocytes TCD4i. Cependant nous avons trouvé successivement des protocoles 1→3; 2→3 une différence statistiquement 40 significative pour la moyenne initiale de TCD4 avec p(1 →3)=0,0418 et p(2→3)=0,047. Des protocoles de traitement : 1→2 ; 1→3 et 2→3 aucune différence statistique significative n’a été déterminée pour les taux de lymphocytes TCD4f (p>0,050) Pour les protocoles de traitement comprenant respectivement le D4T/3TC/NVP et autre TARV, nous avons identifié des différences statistiquement significatives pour les moyennes de lymphocytes TCD4i et TCD4f (p=0,0316 et p=0,010). Mais aucune différence statistiquement significative n’a été apparent pour le protocole de traitement comprenant l’AZT/3TC/NVP (p>0,050). En outre, pour ces protocoles de traitements, on observe globalement une différence statistiquement significative quand on part de la moyenne de lymphocytes TCD4i vers celle des lymphocytes TCD4f (p=0,009). Des protocoles de traitement 1→3; 2→3 pour les lymphocytes TCD8i, on a identifié aucune différence statistique significative (p>0,05) mais significative des protocoles 1→2 (p=0,007). En outre, des protocoles 1→2 ;1→3 et 2→3 pour les lymphocytes TCD8f on a déterminé aucune p(1→3)>0,050; différence statistiquement significative p(1→2)>0.050 ; p(2→3 )>0,050 (Tableau 2). Par ailleurs, la comparaison de la moyenne globale des lymphocytes TCD8i avec celle des lymphocytes TCD8f n’a révélé aucune différence statistiquement significative (p>0,050). Globalement, il y’a une augmentation légère du poids des patients de notre étude quand on quitte du poids initial au final pour toute les trithérapies utilisées. Mais ces différences ne sont aucunement statistiquement significatives (p>0,050), voir tableau 3 Tableau 2: Sexe par rapport à la trithérapie Sexe Traitement Total AZT/3TC/NVP D4T/3TC/NVP Autres ARV F 36 51 19 106 H 21 9 5 35 Total 57 60 24 141 41 Tableau 3: Traitement ARV et les paramètres biologiques. ARV Poids i Poids f CD8i CD8f CD4i CD4f p 1 61,89 63,61 809,19± 347,27 825,32± 434,77 336,26± 181,91 357,67± 191,86 0,542 NS CV1 CV2 81632,5 00,00 2 58,25 69,65 1009,63 ±437,73 935,72± 445,36 330,80± 172,85 404,33± 196,95 0,031 S 40,00 const 3 58,02 61,13 939,21± 381,32 938,17± 415,93 249,87± 140,64 361,83± 148,43 0,010 S 119,00 1880,67 Total 59,77 65,79 891,50± 436,59 916,62± 401,71 321,43± 174,04 377,72± 187,34 0,009 S 65,00 00,00 AZT/3TC/NVP=1 ; D4T/3TC/NVP=2 ; Autres TARV =3 ; 00,00= indétectable ; NS= non significatif ; S= significatif Le t test statistique donne : TCD4i TCD4f P P p 1→2 0,868 0,197 1→3 0,041 0,924 2→3 0,047 0,343 c) Distribution de lymphocytes TCD4 en fonction du niveau d’étude des patients Les patients qui avaient un niveau d’étude supérieur avaient les moyennes de lymphocytes TCD4i (370,63±255,87 cellules/μl) et TCD4f (453,00±255,11 cellules/ μl) les plus élevées. Cette distribution différente des moyennes de lymphocytes TCD4 entre les niveaux d’étude n’était aucunement significative (p>0,050) pour les patients non scolarisés, ceux qui ont un niveau primaire et ceux qui ont un niveau supérieur. Mais significative pour ceux qui ont un niveau secondaire dans notre échantillon (p=0,019). Par contre les patients qui étaient non scolarisés avaient les plus faibles moyennes de lymphocytes TCD4i (308,93±169,79 cellules/μl) et TCD4f (330,10±173,14 cellules/μl) (tableau 4). 42 Tableau 4: Distribution de lymphocytes TCD4 en fonction du niveau d'étude. Niveau TCD4i TCD4f P 0 308,93±169,79 330,10±173,14 0,639 1 343,10±200,28 407,03±216,06 0,231 NS 2 314,54±144,68 396,09±181,98 0,019 S 3 370,63±255,87 453,00±255,11 0,527 NS Total 321,43±174,04 377,74±187,33 0,009 NS S 0= non scolarisés ; 1= niveau primaire ; 2= niveau secondaire et 3= niveau supérieur L’application du t test donne : TCD4i TCD4f P p 0→1 0,480 NS 0,134 NS 0→2 0,878 NS 0,123 NS 0→3 0,421 NS 0,117 NS 1→2 0,469 NS 0,811 NS 1→3 0,744 NS 0,607 NS 2→3 0,462 NS 0,445 NS d) Stade clinique en fonction de la perte du poids corporel : Les 141 patients de notre étude ont été classés en stade clinique II ou III selon que la perte du poids soit <10% du poids corporel ou >10% du poids corporel. Le type I désignant les patients asymptomatiques suivis n’ayant pas encore été soumis au traitement ARV selon les critères de l’OMS, donc (non éligible) faisant objet de critère d’exclusion pour notre étude. Ainsi, 94 (66,66%) de ces patients avaient été classé type II et 46 (32,62%) étaient classés type III. Un seul patient avait gardé son poids invariable sous traitement ARV. La différence d’effectif entre les deux autres classes II→III était statistiquement significative ρ (0,001). Au niveau des lymphocytes T de classe de différenciation 4 (TCD4), la comparaison de la moyenne des lymphocytes TCD4i et TCD4f pour la classe clinique II a révélé une différence statistique significative (p=0,007), mais non significative pour la classe clinique III dans notre 43 échantillon (p=0,400) (Tableau 5). Tableau 5: Les lymphocytes TCD4 en fonction de variation du poids. Groupe Poids CD4i CD4f p 2 305,70±160,61 377,22±197,66 0,007 S 3 348,50±124,11 380,65±168,12 0,400 NS Total 321,43±174,04 377,74±187,34 0,009 S P 0,171 NS 0,919 NS 2= (Pi-pf)/Pi<0.1;3= (Pi-Pf)/Pi>0,1 e) Evaluation du Taux de lymphocytes TCD4 et charge virale par rapport à l’âge : Les taux des lymphocytes TCD4 de nos 141 patients variaient aux premières mesures (TCD4i) de 28 à 914 cellules par microlitre de sang avec une moyenne de 321,43±174,04 cellules/μl. Aux deuxièmes mesures, ils variaient (TCD4f) de 60 à 1077 cellules par microlitre avec une valeur moyenne de 377,74±187,34 cellules/μl. Quant aux charges virales (CV), elles allaient d’un niveau indétectable à 289.246 copies par millilitre de plasma pendant les premières mesures (CV1) avec une médiane de 65,00. Pendant les secondes mesures, elles partaient (CV2) d’un niveau indétectable à 1.937.174 copies par ml avec une médiane indétectable (0,00) .Ces valeurs de charge virale obtenues étaient tellement disparates, à telle enseigne que nous n’avons pas pu établir de corrélation entre elles et le taux des lymphocytes TCD4. Nous présenterons donc les médianes des CV pour chaque groupe de lymphocytes TCD4i (CD4i_2), de lymphocytes TCD4f (CD4f_2), groupe âge (AGE_2) et traitement (trithérapie). Nos observations sur les moyennes de lymphocytes TCD4 dans les différentes classes d’âge indiquent que la tranche d’âge inférieur à 30 ans avait la moyenne de lymphocytes TCD4i (342,22±208,27 cellules/µl) la plus hausse avec une valeur médiane de CV1 (8402,50copies/mml) et CV2 (20,00 copies/mml). C’est la même classe qui avait la moyenne de lymphocytes TCD4f (406,83±239,01 cellules/µl) la plus élevée. En comparant les moyennes des lymphocytes TCD4i des quatre classes d’âges d’une part et 44 les lymphocytes TCD4f d’autre part, nous n’avons pas déterminé de différences statistiquement significative (P>0,050) dans notre échantillon, (tableau 6). Tableau 6: Taux de lymphocytes TCD4 et charge virale par classe d'âge. AG TCDi CD4f p CV1 CV2 342,22 406,83 0,333 8402,5 20,00 ±208,27 ±239,01 NS 0 334,04 399,91 0,094 00,00 C ±176,04 ±197,91 NS 318,18 378,10 0,126 54,00 596,5 ±168,04 ±174,18 NS 293,18 326,12 0,366 ±154,69 ±139,57 NS Tota 321,43 ± 377,74± 0,009 l 174,04 187,34 S E 1 2 3 4 0 40,00 00,00 65,00 00,00 1= âge <30 ans ; 2=30< âge <37 ans ; 3=37< âge <44 ans ; 4= âge >44 ans f); Evaluation du poids ; TCD4 et TCD8 en fonction desTransaminases GOT Nous avons regroupé les patients de notre étude selon que le taux de transaminase GOT soit inférieur ou supérieur à 46 UI/L. Nous avons trouvé une différence statistique significative d’une classe de GOT à une autre en comparant les moyennes du taux de GOT (p=0,045). Aussi, en comparant les moyennes de lymphocytes TCD4i et TCD4f de chaque classe de GOT, seule la classe 1 présente une différence statistiquement significative (p=0,018) (tableau 7). En outre, 25 (17 ,73%) patients de notre étude ont une transaminase GOT élevée > 46 UI/L avec une moyenne de 79,40±58,34 UT/L et un âge moyen de 39,24±8,12 ans. 116 (82,27 %) avaient un taux de GOT <46 UI/L avec une moyenne de 27,55±8,99UT/L et un âge moyen de 37, 03±8,49 ans. Des deux groupes GOT (GOT_2), il n’existe pas de différence statistiquement significative pour les âges (p>0,050) ; mais significative pour les moyennes du niveau de GOT (p=0,045). Par ailleurs, la moyenne générale des GOT est égale à 36,74±32,32UT/L, valeur proche de la normale. L’étude croisée entre trithérapie et classes de GOT n’est pas significative. La trithérapie 45 n’aurait pas une influence sur le niveau de la transaminase GOT dans notre échantillon (p=0,136). Tableau 7: Paramètre biologiques par rapport aux transaminases GOT. GOT_2 Poids i Poids f P 1 59,35± 67,05± 12,58 2 P CD4i CD4f p GOT٭ Age٭ >0,050 327,93 385,46 0,018 30,05 36,94± 53,05 NS ±189,91 S ±9,315 7,24 61,30± 59,98± >0,050 282,20 345,64 0,170 78,94 39,56 14,50 10,51 NS ±142,26 ±178,15 NS ±67,369 ±8,69 >0,050 >0,050 0,234 0,338 0,045 >0,050 NS NS NS NS S NS ±179,12 1= GOT<46; 2=GOT> 46; GOT=٭moyenne de GOT; Age = ٭âge moyen g); Evaluation du poids ; TCD4 et CD8 en fonction des transaminases GPT Aucune différence statistique significative n’a été observée quant on quitte d’une classes de GPT (GPT_2) à une autre pour les lymphocytes TCD4i, TCD4f (p>0,050). Mais la comparaison des moyennes des lymphocytes TCD4i et TCD4f laisse entrevoir une différence statistiquement significative dans la classe 1 uniquement (p=0,013). Aussi, le dosage des transaminases GPT donne 21 (14,89%) patients ayant un taux élevé (GPT> 46 UI/L) avec une moyenne d’âge de 40,48±8,00 ans et une moyenne de GPT de 73,43±37,249UI/L. Contre 119 (85,11 %) qui avait un taux de GPT < 46 UI/L avec une moyenne d’âge de 36,89±8,44 ans et une moyenne du taux de GPT de 23,47±9,10UI/L. D’un groupe de GPT à l’autre, il n’existe aucune différence statistiquement significative pour les moyennes d’âge (p=0,072). Mais, il existe une différence dans la distribution des GPT entre les deux classes de GPT ; des classes de GPT on a donc identifié une différence statistiquement significative pour les moyennes du taux de GPT (p=0,022) dans notre échantillon. D’autre part, la valeur moyenne des GPT de façon générale est 30,91±24,23UI/L, valeur très proche de la normale (< 31UI/L). Les valeurs des paramètres biochimiques, anthropométriques et immunologiques sont résumées dans le tableau 8. 46 Tableau 8: Paramètres biologiques et transaminases GPT. GPT_2 Poids i Poids f P CD4i CD4f 1 59,71± 66,93± ˃0,005 329,14 389,04± 0,013 12,66 52,25 NS ±176,83 191,77 S 9,10 59, 59± 59,26± ˃0,005 266,62 ˃0,005 73,43 ± 40,48 14,59 8,27 NS ±146,08 ±154,16 NS 37,24 ±8,00 ˃0,005 ˃0,005 ˃0,005 ˃0,005 0,072 0,022 NS NS NS NS NS S 2 P 317,76 p GPT٭ Age٭ 23,47 ± 36,89 ±8,44 1= GPT<46 ; 2=GPT> 46 ; M=moyenne ; GPT = ٭moyenne de GPT ; Age = ٭âge moyen ; NS= non significatif h) Classes de lymphocytes TCD4i_2 : La numération des lymphocytes T de classe de différenciation 4 initial (CD4i) révèle que sur les 141 patients de notre étude, 33 (23,45%) patients ont un taux < 200 cellules/µl, 60 (42,50%) entre 200 et 350 cellules/µl et 48 (34,00%) ont plus de 350 cellules/ul. On a déterminé une différence statistiquement significative en comparant toutes les moyennes des lymphocytes TCD4i d’une classes de lymphocytes TCD4i (CD4i_2) à l’autre (p(1→3)<0,001),. D’autre part, on n’a déterminer des différences statistiquement significatives en comparant respectivement les classes de lymphocytes TCD4i (CD4i_2) 1→3 et 2→3 pour les moyennes des lymphocytes TCD4f (p(1→3)=0,0122 ; p(2.→3)=0,035). Mais non statistiquement significative des classes 1→2 (p=0,346) (Tableau 9). 47 Tableau 9: Paramètres biologiques en fonction des classes de lymphocytes TCD4 initiaux. CD4i_2 Poids i Poids f P CD4i CD4f p CV1 CV2 1 59,98± 58,69± ˃0,050 138,73 326,00 <0,001 12363, 00,00 14,70 9,14 NS ±44,31 ±154,68 S 00 59,55± 70,80± ˃0,050 266,73 359,58 40,00 00,00 12,09 72,47 NS ±42,85 ±168,51 S 59,67± 64,37± ˃0,050 514,57 439,06 93.00 596.50 12,87 13,78 NS ±146,05 ±217,68 NS 59,76± 65,79± ˃0,050 321,43 65,00 00,00 12,89 48,32 NS ±174,04 ±187,33 S 2 3 Total 377,74 0,001 0,051 0,009 1=CD4<200 cellules/ul ; 2=200< CD4<350 cellules/ul ; 3=CD4>350 cellules/ul L’application du t test donne : TCD4i TCD4f P P 1→2 <0,001 0,346 1→3 <0,001 0,012 2→3 <0,001 0,035 i) Classes de lymphocytes TCD4f_2 : Les 141 patients de notre étude ont été classés par groupe du taux de lymphocyte T CD4 finaux (CD4f_2). Ce qui nous permet de montrer que 19 (13,50%) patients ont un taux de lymphocytes TCD4f<200 cellules/µl, 54 (38,30%) ont un taux compris entre 200 et 350 cellules/µl, et 68 (48,20%) ont un taux > 350 cellules/μl. Des classes de lymphocytes TCD4f 1→3 respectivement 2→3 nous avons identifié des différences statistiquement significatives pour les lymphocytes TCD4i avec p=0,080 respectivement p=0,020 ; mais non significative de 1→2 (p=0,714). En outre, toutes les classes de lymphocytes TCD4f (CD4f_2) ont montré une différence statistique les unes avec les autres successivement pour les lymphocytes TCD4f (p(1→2)<0,001 ; p(1→3)<0,001 ; p(2→3)<0,001).et CD4f (p(1→2)<0,001 ; p(1→3)<0,001 ; p(2→3)<0,001) (Tableau 10) : 48 Tableau 10: Paramètres biologiques en fonction des classes de lymphocytes TCD4 finaux: CD4f_2 Poidsi Poidsf P CD4i CD4f p CV1 CV2 1 57,63± 57,57± ˃0,050 272,05 145,79 0,095 1979,00 00,00 13,18 10,32 NS ±175,36 ±34,95 S 60,51± 62,01± ˃0,050 286,32 266,74 0,305 40.00 00.00 14,56 13,70 NS ±132,98 ±38,84 NS 59,62± 71,03± ˃0,050 359,16 530,32 <0,001 119.00 1193.00 11,52 67,91 NS ±193,36 ±151,95 S 59,76± 65,79± ˃0,050 321,43 377,74 0,009 65,00 00,00 12,89 48,32 NS ±174,04 ±187,33 S 2 3 Total 1=CD4<200 cellules/μl ; 2=200< CD4<350 cellules μl ; 3=CD4>350 cellules/ μl Le test t statistique donne TCD4i TCD4f P P 1→3 0,714 NS <0,001 S 2→3 0,080 NS <0,001 S 2→3 0,020 S <0,001 S j) Efficacité du traitement La comparaison des taux des lymphocytes TCD4 initiaux avec les lymphocytes TCD4 finaux nous a permis d’évaluer l’efficacité immunologique du traitement. En effet, à la première numération des lymphocytes TCD4 trois mois après le début du traitement, 108 sur 141 (76,60%) des patients avaient un taux de lymphocytes TCD4 supérieur à 200 cellules/ul contre 33 sur 141 (23,40%) qui avaient un taux inférieur à 200 cellules/μl ; donc en phase SIDA toujours. Mais à deuxième évaluation, 122 sur 141 (86,50%) avaient leurs taux de lymphocytes TCD4 >200 cellules/μl contre 19 sur 141 (13,50%) des patients qui avaient leurs taux de lymphocytes TCD4<200 cellules/μl. Globalement, la moyenne des lymphocytes TCD4i (321,43 ±174,04 cellule/μl) des patients de notre étude est plus faible par rapport à celle des lymphocytes TCD4f (377,74 ±187,33 cellules/μl). Ce gain moyen en lymphocytes TCD4 entre les deux mesures est d’ailleurs statistiquement significative dans notre échantillon (p=0,009). 49 B- DISCUSSION Dans notre étude, 106 patients étaient des femmes soit 75,20 % et 35 étaient des hommes soit 24,80%. Cette différence pourrait s’expliquer par le cadre particulier des centres d’étude concernés qui recrutent majoritairement parmi les femmes enceintes référées par le programme PTME, puis élargie à toute leur famille. Ce fait se heurte le plus souvent à la réticence des maris à se joindre à la prise en charge après leur séropositivité avérée ; ou au fait que les femmes ont peur d’informer leur conjoint de leur séropositivité. En outre les hommes seraient en majorité septiques pour fréquenter d’eux même les centres en cas de sérologie avérée ou pour chercher à connaître leur statut sérologique. Par ailleurs, le même constat a été rapportées par BUELLI et coll., en 2010 (81,40% de femmes contre 18,60% d’hommes) au Burkina Faso. Aussi, les travaux de NADEMBAEGA et coll. en 2006 au Centre Médical Saint Camille de Ouagadougou confirment ce constat (68,23% de femmes et 30,77% d’hommes). Des proportions différentes ont été observées dans la ville de Ouagadougou par OUEDRAOGO et coll. en 2001 (57,77% de sexe masculin et 42,23% sexe féminin). Les patients de notre étude avaient un âge moyen de 37,43±8,44, valeur proche à celle de NKOGHE et coll. en 2002 (39±10 ans) en Europe; de OUEDRAOGO et col. en 2001 (40 ans) et de NADEMBAEGA et coll. en 2006 (35,87±7,55 ans) dans la ville de Ouagadougou. La moyenne d’âge des femmes était de 35,59±5,96 ans et celle des hommes était de 45,44±8,65ans. L’âge moyen des femmes (35,59±5,96 ans) correspond au pic de la période de la procréation. En effet, elles se marient plus jeunes que les hommes et la majorité des contaminations en Afrique se produisent au sein des couples hétérosexuels et ne sont révélés que pendant la grossesse (AHMED et LATOUNDJI ; 2007). On devrait donc avoir un sexe ratio de un (1) si tous les conjoints étaient mobilisés. L’utilisation des ARV serait globalement fonction du sexe des patients (p=0,021). Il y aurait un lien entre la trithérapie utilisée et le sexe des patients. Cette différence pourrait s’expliquée souvent par l’utilisation exclusive de la molécule Efavirenz (EFV) chez les hommes. Car cette molécule aurait des effets thétratogènes dans le modèle animal et pourrait provoquer des malformations congénitales, voire des avortements chez les femmes qui la prenait. L’Efavirenz risque aussi d’affaiblir l’efficacité des contraceptifs hormonaux (pilules, implants et injections) (CATIE ; 2006). En effet, notre étude a porté en majorité sur des femmes référées par le programme PTME, donc probablement désireuses d’avoir toujours des enfants 50 ou même toujours en grossesse. L’EFV est utilisée néanmoins chez des femmes ménopausées ou celles qui n’aimeraient plus avoir d’enfants. Il faut aussi noter que des cas de grossesses avérées après l’utilisation de EFV ont été constaté chez certaines de nos patientes qui ont pu mener leur grossesse à terme (SANOGO, 2010 Commun. Pers.). Les patients sous le protocole Zidovudine-Lamivudine-Névirapine (AZT/3TC/NVP) ; avaient un taux de lymphocytes TCD4i moyen d’environ 336,26 ± 181,90 cellules/µl et de TCD4f (357,67±191,85). Aucune différence statistique n’est apparente entre ces deux moyennes (p=0,542), mais ces valeurs sont à peu près égales à celle donnée dans le protocole de traitement de l’OMS (350 cellules/µl). Des valeurs initiales proches de nos données ont été trouvées dans le même centre en 2006 par NADEMBAEGA et coll. (336,82±100,14 cellules/μl) et au Centre Hospitalier Universitaire de Liège pour les patients mis sous la HAART (352±244) (NKOGHE et coll., 2002). La combinaison Zidovudine-LamivudineNévirapine formant une trithérapie, constitue un des protocoles de traitement antirétroviral hautement actif (HAART: Highly Active Antiretroviral Treatment) recommandé par l’Organisation Mondiale de la Santé (OMS). Les patients sous le protocole de traitement comprenant : Stavudine-Lamivudine-Névirapine (D4T+3TC+NVP) avaient environ une moyenne de lymphocytes TCD4i égale à 330,80±172,85 cellules/µl et celle des lymphocytes TCD4f égale à 404,33±196,95 cellules/ul. La différence entre ces deux moyennes est statistiquement significative (p=0,031). Aussi, ces moyennes restent largement supérieures à celles trouvées précédemment avec l’AZT/3TC/NVP, à la moyenne de NADEMBAEGA et coll. en 2006 ; à celle de l’étude de NKOGHE et coll.en 2002 et du protocole de l’OMS. Pour les autres TARV utilisées, la moyenne des lymphocytes TCD4i était de 249,87±140,64 cellules/ul et celle des TCD4f était environ de 361,83±148,43 cellules/ul, valeur relativement en hausse par rapport à la première avec une différence statistiquement significative entre les deux moyennes (p=0,009). En outre, cette seconde moyenne est relativement proche de celle donnée dans le protocole de traitement de l’OMS (350 cellules/µl) et à celle de NADEMBAEGA et coll. en 2006 (336,82±100,14 cellules/.μl). Les patients qui avaient un niveau d’étude supérieur avaient les moyennes de lymphocytes TCD4i (370,63±255,87 cellules/μl) et TCD4f (453,00±255,11 cellules/ μl) les plus élevées. 51 Mais ces différences de moyennes de lymphocytes TCD4 entre les niveaux d’étude n’étaient aucunement significatives (p>0,050) dans tous les cas. Par contre ceux qui étaient non scolarisés avaient les plus faibles moyennes de lymphocytes TCD4i (308,93±169,79 cellules/μl) et TCD4f (330,10±173,14 cellules/μl). Aussi, seul chez les patients qui ont un niveau secondaire on a identifié une différence statistiquement significative en comparant la moyenne initiale et finale des lymphocytes TCD4 (p=0,019). Ce résultat pourrait s’expliquer par fait que c’est dans cette tranche qu’on trouve les 34% des patients de notre étude. 46(32,70%) des 141 patients de notre étude serraient au stade SIDA contre quatre-vingt-dix pourcent (90 %) des patients qui ne le sont pas selon la définition du CDC d’Atlanta de 1993 dans l’étude de AHMED et LATOUNDJI en 2007. Cependant, 94 (67,30%) connaîtraient une évolution anthropologique voir sanitaire avec le traitement selon les critères sur le stade clinique en fonction des critères de la perte de poids corporel de l’OMS. On a déterminé une différence significative entre ces deux groupes avec un p inférieur à 0,001. Par ailleurs, notre étude n’a pas révélée l’influence statistiquement significative de la trithérapie sur l’évolution du poids de nos patients (p>0,050) ; malgré les légères augmentations constatées entre les poids initiaux et finaux. Aussi, il n’existe pas une différence dans la distribution des lymphocytes TCD4 initiaux comme TCD4 finaux entre les deux stades cliniques pris en compte dans cette étude ( II et III) en fonction de la perte du poids corporel de l’OMS (p>0,050). Cependant, il existe une différence statistiquement significative entre la moyenne de lymphocytes TCD4i et TCD4f de la classe I (p=0,007). Un constat contraire a été fait dans l’étude de AHMED et LATOUNDJI en 2007, où Il existerait une différence dans la distribution des lymphocytes TCD4 entre les trois stades cliniques selon la définition du CDC d’Atlanta de 1993 (p = 0,009). Par ailleurs, l’absence de différence statistiquement significative (p=0,153) entre la moyenne globale initiale (59,75±12,89 ans) et finale (65,79±48,32 ans) des poids des patients de notre étude pourrait être due au fait que nous n’avons pas différentié dans notre échantillon les femmes enceintes des autres patients dans les analyses. En effet, les récupérations peuvent être limitées par les infections opportunistes en cours, les effets secondaires précoces des ARV, ou d’un syndrome d’immunorécupération dans les trois premiers mois de grossesse. Pour la plupart des patients de notre étude, d’une classe d’âge à une autre, nous n’avons pas trouvé de différence statistiquement significative entre les taux de lymphocytes TCD4 52 (p>0,050). La variation du taux de lymphocytes TCD4 parmi nos patients dépendrait plutôt du stade clinique atteint. Mais ne serait pas fonction de la perte de poids corporelle (p>0,050). Le taux normal des transaminases ASAT (GOT) et ALAT (GPT) est égal ou inférieur à 30UI/L. Mais si cette valeur venait à dépasser 40UI/L, cela traduirait une insuffisance hépatocellulaire (JACQUES et coll., 2006). En effet, dans notre étude, 25(17,73%) des patients avaient une moyenne de GOT égale à 79,40±58,34 UI/L avec un âge moyen de 39,24±8,12 ans. 21(14,89%) d’un âge moyen de 40,48±8,00 ans, avaient une moyenne de GPT égale à 73,43±37,24 UI/L. On a pu donc conseiller aux patients concernés des tests de diagnostics des différentes infections du foie. Cependant, YOUNG en 1997 suggéra qu’une augmentation des transaminases pourrait avoir une autre cause virale, telle que l’absorption d’alcool et de produit pharmaceutiques. Notre étude révèle des moyennes globalement normales de GOT (36,74±32,32UI/L) et de GPT (30,91±24,23UI/L). Mais, GERVAIS et coll. en 2000 dans leur étude, avaient mentionné une diminution du taux des transaminases chez les femmes enceintes traitées. Par ailleurs, aucune augmentation de la GOT et de la GPT, n’a été observée dans l’étude de SIMPORE et coll. en 2004. L’analyse portée sur les trithérapies utilisées et les classes de GPT montre qu’il existe globalement une relation significative entre elles. La trithérapie aurait une influence sur le niveau de la transaminase GPT (p=0.016). Celle entre trithérapies et les classes de GOT n’est pas statistiquement significative (p=0,136). Cette dernière valeur pourrait être améliorée si la taille de notre échantillon augmentait. Dans notre étude, 25 (17,73%) ont une transaminase GOT élevée et 21 (14,89%) patients ont un taux de GPT élevé. Ces proportions sont relativement proches à celle trouvée (19%) dans l’étude d’AHMED et LATOUNDJI en 2007 sur le dosage des GOP et GPT. Dans notre étude, le traitement serrait efficace chez 122/141 patients (86,50%) contre 71% dans l’étude de AHMED et LATOUNDJI en 2007 .19/141 (13,50%) présenteraient un échec immunologique contre 16 % dans celle de AHMED et LATOUNDJI en 2007. Aussi, cette efficacité s’explique mieux par la différence statistiquement significative établie globalement en comparant la moyenne des lymphocytes TCD4i (321,43 ±174,04 cellule/μl) des patients de notre étude avec celle des lymphocytes TCD4f (377,74 ±187,33 cellules/μl) (p=0,009). Cela correspond à un taux d’accroissement de 117,52%. On note une discordance immuno-virologique chez la plupart de nos patients vu que les 53 valeurs de nos charges virales étaient très disparates. En effet, les écarts étaient très considérables entre les valeurs minimales et maximales des charges virales des patients de cette étude, à tel enseigne que seules les médianes ont été considérées comme critères d’analyse d’une part. D’autre part, nous n’avons pas disposé dans cette étude de la charge virale de tous les patients à cause de la présence de cas d’échec lors des différentes mesures de charge virale. En effet, les tests de discrimination TRI DOT utilisés, permettent seulement d’identifier le VIH-1 du VIH-2; mais ne nous renseigne pas sur le type de souche M, N, O et P du VIH-1. Aussi, si les cas indétectable peuvent s’expliquer par les traitements efficaces encours qui fais que la charge virale devient inférieure au seuil de sensibilité analytique de la trousse utilisée ; les cas d’échec pourraient s’apparenter aux souches O et/ou P du VIH-1. En effet, il demeure qu’un certain nombre d’échecs de dépistage de certaines trousses, chez des patients infectés par des VIH-1 du groupe O, a été rapporté à l’Afssaps ces dernières années. (KARA-MOSTEFA et coll., 2005). Cependant, notons que le test Abbot real-time PCR permet de quantifier l’ARN VIH-1 du groupe O avec une fiabilité satisfaisante ; il est néanmoins préférable de contrôler la pertinence des résultats en se référant à une technique spécifique du VIH-1 du groupe O (GUEUDIN et coll., 2007). La quantification de l'ARN plasmatique du VIH est, avec la quantification des lymphocytes T CD4, les principaux examens du suivi biologique de l’évolution de l’infection à VIH chez un patient (HU et coll., 2001; SCHNEIDER, 2003); ils permettent de déterminer le moment où il devient nécessaire de débuter un traitement antirétroviral et de suivre son efficacité et sa tolérance (CHAPLAIN et coll., 2006 ; BELAN et coll., 2008). La charge virale, indique le nombre de virions dans l'organisme (DEHEE, 2003) et par conséquent la vitesse de réplication du VIH dans l'organisme. La différence entre deux mesures de charge virale espacées dans le temps permet d'évaluer la vitesse de réplication du VIH et par voie de conséquence la progression de l'infection (HU et coll., 2001). Il y a un lien direct entre la charge virale et le niveau du déficit immunitaire, occasionné principalement par la disparition des lymphocytes T CD4 (FRIPPIAT et coll., 1999). Le rebond viral constaté chez certains des patients de notre étude serait lié à un relâchement de l’observance plutôt qu’à une sélection de virus mutant. Par contre, il n’est pas exclu de rechercher une résistance éventuelle, d’où l’intérêt du test génotypique de résistance. Il est important de juguler précocement une situation d’échec (LORENZI, 1999; HAVLIR et coll. 2000).Par ailleurs, les premières manifestations de l’infection par le VIH les plus fréquemment diagnostiqués dans l’étude de FOCA et coll. de 2001 à 2010 chez certains 54 patients du CMSC de Ouagadougou se présentent comme suit : 16,20% de pneumonie, la candidose oesophagienne (22,529%), la tuberculose (16,20%), la toxoplasmose du cerveau (13,83%), et la rétinite (3,95%). Par contre, des prévalences différentes ont été observées au Bénin (AHMED et coll., 2004) sur les principales maladies opportunistes présentées à l’initiation du traitement, à savoir : candidose (51%), bronchopneumonies (11,70%), toxoplasmose (2,70%), une tumeur oculaire (0,9%). D’autre part, la prévalence des effets indésirables sous TARV identifiés chez certains patients de l’échantillon de FOCA et coll., en 2010 (Nanoro ; CMSC), est de 75,65% et proche successivement de celles AHMED et coll., en 2004 ; AKAKPO en 2004 (84% et 74,4%) au Bénin. Mais différent de celle de LAURENT et coll. en 2002 au Sénégal (49%). Il faut noter que la majorité de ces évènements sont d’ordre digestif et neuropsychique comme au Bénin (AHMED et coll., en 2004 ; AKAKPO, 2004) et au Sénégal (LAURENT et coll., 2002). La toxicité hématologique serait surtout marquée par l’anémie, qui serait liée à la prise de la Zidovudine (AZT). Dans tous ces cas, plusieurs patients sous AZT ont été transfusés. En effet, l’AZT provoquerait une anémie centrale macrocytaire (AHMED et coll., en 2004). 55 CONCLUSION ET PERSPECTIVES 56 Conclusion Dans cette étude, la variation des CD4 a été pratiquement le seul critère d’appréciation de l’efficacité biologique du traitement chez les patients. La comparaison entre les lymphocytes T classe de différenciation 4 (TCD4) initiaux et ceux finaux nous a permis d’évaluer l’efficacité du traitement. En effet, à la première numération des CD4 trois mois après le début du traitement, 108/141 (76 ,60%) des patients avaient un taux de CD4 supérieur à 200 cellules/μl contre 33/141 (23,40%) avaient taux inférieur à 200 cellules/μl ; donc en phase SIDA toujours. Mais à la deuxième évaluation, 122/141 (86,50%) avaient les CD4 >200 cellules/μl contre 19/141 (13,50%) des patients qui ont leur taux de CD4<200 cellules/μl. Aussi, on a observé globalement un gain moyen en lymphocytes TCD4 statistiquement significatif (p=0,009) ; donc d’une croissance de 117,52% entre les deux mesures dans notre étude. Par contre l’évaluation de la charge virale n’a pas été considérée comme critère d’appréciation de l’efficacité biologique car nos valeurs étaient très dispersées et beaucoup de résultats non valide (échecs) de nos échantillons dus probablement au long temps de conservation de nos échantillons ou à des problèmes techniques liés au faite que le m2000rt utilisé ne reconnaît pas toute les souches de VIH-1. Cette étude biologique nous montre donc que la thérapie antirétrovirale est efficace à 86,50% à l’ambulatoire des adultes du Centre médical saint Camille. Taux qui pourrait être revu en hausse si les patients suivaient rigoureusement l’observance. Perspectives Identifier les facteurs influençant la réponse à un traitement antiretroviral ; Rechercher la corrélation entre CV et CD4 Déterminer les facteurs responsables d’une variation initiale des CD4 et charge virale ; Identifier les souches responsables des échecs ou résistance thérapeutique. 57 RÉFÉRENCES AHEMED A. A. et LATOUNDJI S. 2007. Etude pilote de la thérapie antirétrovirale à Djibouti. La revue de santé de la Méditerranée orientale. vol.13. N°6. AKAKPO J. 2004. Effets indésirables des thérapies antirétrovirales chez les patients traités à Cotonou [Thèse de médecine]. Cotonou, N° 1087 : 87. BASTARD J.P., CHAMBERT S., CEPPA F., COUDE M., GRAPEZ E., LORIC S., MUZEAU F., SPYRATOS F., POIRIER K., COPOIS V., TSE C., BIENVENU T., 2002. Evaluation des techniques d’extraction et de conservation de l’ARNm à partir d’échantillon biologiques. Annales de Biologie Clinique. Vol.60, Numéro 5, 513-23, revues générales. BELAN A. G., CHAPLAIN C., BOUSSAIRI A., 2008. 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