dry Les endozépines, ligands endogènes des - iPubli

II)IS
SYNTHÈSE
médecine/sciences 1 994 ; J O :
433-43
Les endozépines,
ligands endogènes
des récepteurs des
benzodiazépines
Marie-Christine Tonon
Fatima Smih-Rouet
Marek Lamacz
Estelle Louiset
Georges Pelletier
Hubert Vau
dry
ADRESSES
-------
M.-C. Tonon : directeur de recherche à l'Inserm.
F. Smih-Rouet : aUocataire d 'enseignement et de
recherche. M. Lamacz : maître de conférence.
E. Louiset : chargée de recherche à l 'Insenn.
G. Pelletier : professeur à l 'u niversité Laval,
Qy,ébec. H. Vaudry : directeur de recherche à
l1nsmn. Institut européen de recherches
multidisciplinaires sur les peptides, labora­
toire de neuro-endocrinologie cellulaire et
moléculaire, I nserm U.4 1 3, UA Cnrs uni­
versité de Rouen, 7682 1 Mont-Saint-Aignan,
France.
TIRÉS A PART
------
H. Vaudry.
m/s
n° 4
vol. / 0, avnl 94
Les benzodiazépines, en raison de leurs propriétés anxio­
lytiques, sédatives et myo-relaxantes, représentent l'une des
catégories de médicaments les plus utilisées au monde.
L'action des benzodiazépines est relayée par deux classes
de récepteurs, les récepteurs associés au complexe GABAA­
canal chlore, encore appelés récepteurs de type central,
et les récepteurs localisés sur la membrane mitochondriale,
également connus sous le nom de récepteurs de type péri­
phérique. L'existence de sites de liaison bien caractérisés
pour les benzodiazépines a naturellement incité plusieurs
équipes à postuler l'existence de ligands endogènes sus­
ceptibles d'interagir avec les récepteurs des benzodiazé­
pines. Ces recherches ont conduit à l'identification d'une
nouvelle famille de neuropeptides appelés endozépines.
L
' acide y-amin obutyrique
( GABA) est consi déré
comme le principal neuro­
transmetteur inhibiteur du
système nerveux central ;
environ 35 % des terminaisons ner­
veuses son t GABA-ergiques. Le
GABA intervient dans un grand
nombre de processus physiologiques
tels que la régulation de l'appétit et
de la pression sanguine, la thermo­
régulation, le sommeil et l'adapta­
tion au stress. Un dysfonctionne­
ment des systèmes GABAergiques est
associé à diverses maladies neurolo­
giques : épilepsie, encéphalopathie
d'origine hépatique, maladie de Par­
kinson, chorée de Huntington . . .
D e nombreuses données comporte­
mentales, pharmacologiques et élec­
trophysiologiques suggèren t que les
benzodiazépines sont capables de
moduler une grande partie des
effets induits par le GABA. Les étu­
des de liaison réalisées avec le
[3H] diazepam, chef de file des ben­
zodiazépines, ont mis en évidence,
dans le cerveau des mammifères,
l'existence de sites de reconnais­
sance spécifiques, saturables et de
forte affinité pour les benzodiazépines [ 1 ] . La synthèse de nombreuses
---•
433
RÉFÉRENCES
-----
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204 1 5-2 1 .
benzodiaz é p i n e s a permis d e
démontrer que ces récepteurs pou­
vaient être classés en deux catégo­
rie : les sites dits de type central,
présents dans le cerveau et liant spé­
cifiquement le clonazepam et le flu­
mazenil, et les sites dits de type péri­
phérique, en raison de leur pré­
sence dans différents organes, et
liant le Ro 5-4864 et le PK 1 1 1 95 [2] .
L'occupation des récepteurs cen­
traux par les benzodiazépines aug­
mente l'affinité du GABA pour les
sites GABAA mais reste sans effet
sur l 'affinité des sites GABA8 [3] .
Les récepteurs de type périphérique
ont été également identifiés dans
certaines structures cérébrales mais
ils diffèrent des récepteurs de type
cen tral notamment par le fait qu'ils
n'interagissent pas avec les sites liant
le GABA. Par ailleurs, les récepteurs
périphériques, contrairement aux
sites de type central localisés sur la
membrane ectoplasmique, semblent
être principalement associés aux
membranes mitochondriales [ 4] .
1
Organisation structurale
du comp lexe récepteur
GABAA/benzodiazépines
Le réce pteur GABAA-benzodia­
zépines est un complexe macropro­
téique associé à un canal chlore
(m/s n° 8, vol. 6, p. 773). La dissection
moléculaire du récepteur révèle
l'existence de quatre types de sous­
unités (a, �. y et ù) qui elles-mêmes
sont constituées de différents sous­
types. Chez le rat, on ne compte pas
moins de six sous-unités a, cinq
sous-unités � et trois sous-unités y
différentes. Le site GABAA propre­
ment dit est localisé sur la chaîne P
du com plexe macromoléculaire
récepteur. L'expression sélective des
différentes sous-unités dans une cel­
lule donnée confère des caractéris­
tiques pharmacologiques spécifiques
aux récepteurs GABAA-benzodiazé­
pines présents dans ce type cellu­
laire. La transfection simultanée des
ADNe codant pour les chaînes a et
� permet l'expression d'un récep­
teur associé à un canal chlore dont
la probabilité d'ouverture est aug­
mentée par le GABA [5] et modu­
lée positivement ou négativement
par les neurostéroïdes [6] . Cepen­
dant, ce type de récepteurs ne posm/s n° 4 vol. 10, amil 94
Q P S QDE LKDNTTVFTRI LDRLLDGYDNRLRPGLGE
• •D
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35
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95
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*
35
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39
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153
159
154
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215
• • • HV • G T E • I R • •
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• E • P • E S • S • L • • • • I • • • • S • E T I K • N • • • • • I • • VY
240
• • • • • K • • • I • S • • LG K N K •
• P K S • M I • T • • KG • E K •
• • PNS • • V • V • • NGS TK •
• P K S • I I • T • KK G • LY •
215
213
2 19
2 14
FHLKRKI GYFVI QTYLPC IMTVI LS QVS FWLNRE SVPARTVFGVTTVLTMT T L S I SA .
275
• • • • • • • I •K• •
•I• •
273
•I• •
274
275
300
279
F i g u re 1 . Séquences partielles des différentes sous-unités a du récepteur des benzodiazépines connues à ce
jour. L'alignement des régions N-terminales de six sous-unités a du récepteur GABAA. benzodiazépines montre la
conservation de nombreux résidus (points rouges). Le résidu glycyl en position 200 de la chaine a1 (astérisque) confère
au site de liaison des benzodiazépines associé au complexe aJI32y2 un profil pharmacologique de type 1. L 'insensibi­
lité au diazepam du complexe aJ32y2 est liée au remplacement d'une histidine par une arginine en position 100
de la chaine a6 (astérisque).
m/s
n° 4 vol.
10, avril 94
435
RÉFÉRENCES
-----
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(diazepam-binding inhibitor ( 1 7-50) ) con­
tains an a-helix, which allows discrimina­
tion between benzodiazepine binding site
subtypes. Mol Pharmacol 1 990 ; 37 : 1 64-72.
46.
sède pas toutes les propriétés phar­
macologiques du complexe natif. En
particulier, la modulation de la
réponse au GABA par les benzodia­
zépines nécessite la cotransfection
d'ADNe codant pour les sous­
unités a, � et y2 [7, 8] , suggérant
que, par analogie avec le récepteur
nicotinique, le complexe GABAA­
benzodiazépines présente une struc­
ture pentamérique de type 2��1y2 •
L'existence de deux sous-classes de
récepteurs GABAA a été démontrée
par des techniques de liaison de
GABA tritié à des préparations
membranaires. Les sites de forte affi­
nité ( 1 5-20 nM) ne correspondent
qu'à 15 % à 2 0 % des sites GABAA
totaux au niveau du cortex céré­
bral [9] et présentent une distribu­
tion comparable à celle de la sous­
unité 8 [ 1 0] . Ces récepteurs pour­
raient correspondre aux récepteurs
GABAA insensibles aux benzodiazé­
pines. Les sites GABAA de basse
affinité ( 1 00-1 40 nM) sont étroite­
ment associés aux récepteurs des
benzodiazépines [ 1 1 ] .
De ce fait, les récepteurs GABAA
de faible affinité sont plus généra­
l e m e n t assi milés au complexe
GABA-benzodiazépines-canal chlore.
Propriétés
physico-chimiques
et pharmacologiques
des sites de liaison
des benzodiazépines
associés
aux récepteurs GABAA
Des études électrophysiologiques ont
montré que les benzodiazépines tel­
les que le diazepam potentialisent
l'action du GABA sur le canal
chlore en déplaçant la courbe d'acti­
vité vers les faibles concentrations de
GABA. Cet effet potentialisateur
connu sous le terme de << phéno­
mène de GABA-shift correspond à
une augmentation d' affi nité du
récepteur pour le GABA. La modu­
lation allostérique de la liaison du
GABA par les benzodiazépines se
ferait via les récepteurs de type cen­
tral ( RBZc) et serait à l'origine de
leurs effets anticonvulsivants, anxioly­
tiques, myorelaxants et sédatifs.
Les RBZc sont constitués de plu­
sieurs sous-types : les récepteurs de
type 1, qui possèdent une affinité
»
m/s
n° 4 vol.
10, avril 94
nanomolaire, et les récepteurs de jours un site de liaison pour les ben­
type Il, qui présentent une affinité zodiazépines [ 1 2] . En outre, l'effet
micromolaire. La densité des récep­ potentialisateur des benzodiazépines
teurs de type 1 et II varie selon les sur le courant chlore induit par le
régions du cerveau. Ainsi par exem­ GABA est dix fois plus important
ple, chez le rat, 90 % des récep­ dans les structures de type a.,. P2Y2
teurs de type 1 sont localisés au que dans celles de type <X,.�1Y2 [ 1 3] .
niveau du cervelet alors que les L'isolement du complexe récepteur
récepteurs de type II sont fortement GARA/benzodiazépines par immu­
exprimés dans les parties superfi­ noprécipitation à l'aide d'anticorps
cielles du colliculus supérieur. Dans monoclonaux spécifiques dirigés
d'autres régions comme le cortex contre les sous-unités a1 , a3 ou a5
et l' hippocampe, les deux types de révèle que les complexes macromo­
récepteurs coexistent (m/s n° 8, léculaires ainsi obtenus lient tous le
vol. 6, p. 773).
flunitrazepam et le GABA. En outre,
L'étude de l 'expression des ARNm 90 % d'entre eux possèdent une
codant pour les différentes sous­ chaîne a1 dans leur composition et
unités du récepteur GABAA a mon­ seules les combinaisons de type
tré que les complexes composés des a1�xY2 présentent les caractéristiques
chaînes a, � et y2 possèdent tou- pharmacologiques du récepteur de
type 1 [ 14] . Les sites des benzodiazé­
pines de type II constituent une
population hétérogène à laquelle
appartiennent les complexes de
type � � xY2 ' a3�xY2 et as� xY2 [ 1 5, 1 6] .
L'ensemble de ces données indique
que la pharmacologie des récepteurs
des benzodiazépines dépend très lar­
gement du type de sous-unité a mis
en jeu. La comparaison des structu­
res
sous­
primaires
des
unités a (figu re 1) révèle que la
chaîne a1 diffère des autres, notam­
ment par la présence d'un résidu
glycyl en position 200. Le simple
remplac e m e n t , dans la sous­
unité a3, de l'acide glutamique 225
par une glycine permet la conver­
sion d'un récepteur des benzodiazé­
pines de type I I (a3�2Y2 ) en un
Benzodiazépines
Cytoplasme
�
lsoquinolines
carboxamides
Cholestéro
0
V
v
ADC
Matrice
�
Prégnénolone
ATP
Figure 2. Représentation schématique des sites de liaison mitochondriaux des benzodiazépines. Les récep­
teurs mitochondriaux des benzodiazépines sont formés de trois sous-unités : une protéine liant les isoquinolines
carboxamides (IBP), un canal anionique dépendant du voltage (VDAC) liant les benzodiazépines et un transporteur
de nucléotides à adénine (AOC), ce dernier étant localisé sur la membrane interne de la mitochondrie. L 'activation
du récepteur favorise la translocation du cholestérol à l'intérieur de la mitochondrie où il est transformé en pré­
gnénolone par le cytochrome P-45Dscc·
m/s n° 4 vol. 10, auril 94
437
RÉFÉRENCES
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delivery 1s mediated by the peripheral ben­
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binding inhibitor) functions as a procon­
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type I ( Gly225-a3�2y2 [ 1 7] . La sous­
unité a6 est uniquement exprimée
au niveau du cortex cérébelleux. La
co-expression des sous-unités a6, �2
et y2 conduit à la formation d'une
population de récepteurs des benzo­
diazépines dont les propriétés phar­
macologiques sont très particulières.
En effet, ces sites sont insensibles
aux benzodiazépines telles que le
diazepam et lient uniquement Je
Ro 1 5-45 1 3. La sensibilité des com­
plexes de type a1�2y2 au diazepam
est due à la présence d'un résidu
histidyl en position 1 0 1 sur la chaîne
a 1 : la chaîne a6 possède en posi­
tion 1 00 une arginine dont Je rem­
placement par une histidine permet
la formation d ' un complexe
H i s 1 00-a6 � 2y2 sensible au diaze­
pam [ 1 8] . De l'ensemble des don­
nées de la littérature il ressort que
les combinai ons de type U 1 �2 Y2
représentent les formes les plus fré­
quentes du complexe récepteur
GABAA/benzodiazépines. Ce type
de combinaison associe le site de fai­
ble affinité pour le GABA et celui
de forte affinité pour les benzodia­
zépines (récepteur des benzodiazé­
pines de type II) .
1
Structure moléculaire
des sites de liaison
mitochondriaux
Les études pharmacologiques ont
révélé l'existence d'un autre type de
récepteurs des benzodiazépines qui
ne reconnaissent pas le clonazepam
ni le flumazenil ( ligands possédant
une grande affinité pour les RBZc)
mais qui, en revanche, lient spécifi­
quement certains composés comme
le Ro 5-4864 et le PK 1 1 1 95. Ces
sites de liaison ont été nommés
récepteurs périphériques ( RBZp)
car ils ont été initialement décou­
verts dans des glandes endocrines
telles que la surrénale et le testicule,
et dans d'autres organes comme le
rein, le poumon et le foie [ 19] . Les
RBZp sont généralement associés à
la membrane externe des mitochon­
dries [ 4] . Cependant, quelques étu­
des font état de récepteurs de type
RBZp au niveau de la membrane
plasmique [20, 2 1 ] . En outre, les
sites dits de type << périphérique ,,
sont également présents dans certai­
nes régions du système nerveux cenm/s n° 4 vol. 10, avril 94
tral comme le plexus choroïde et le
bulbe olfactif chez le rat [22] . Des
études de liaison du Ro 5-4864 sur
des cellules gliales en culture révè­
lent que les astrocytes possèdent
aussi une forte den sité de
RBZp [23] . Les différentes tentatives
de purification du RBZp ont con­
duit à l'isolement de plusieurs pro­
téines de 32, 30 et 1 8 kDa. L'AD c
codant pour la molécule de 1 8 kDa
a été cloné chez le rat, l 'homme et
le bœuf [24-26] . La protéine corres­
pondante est constituée de
1 69 acides aminés et présente cinq
domaines transmembranaires poten­
tiels. Sa structure primaire est bien
conservée d'une espèce à l'autre et
montre une certaine analogie de
séquence avec la protéine bacté­
rienne CrtK. Selon les espèces, la
protéine 1 8 kDa possède ou non des
sites potentiels de phosphorylation
dans sa partie COOH terminale.
Curieusement, ces molécules ne pré­
sentent pas d'enchaînement en aci­
des aminés pouvant correspondre à
la séquence consensus d'ancrage de
protéine dans la membrane mito­
chondriale. La protéine 1 8K a une
grande affinité pour les isoquinoli­
nes carboxamides telles que le
PK 1 1 1 95 ou le PK 1 4 1 05 . A
l'inverse, elle présente une très fai­
ble affinité pour les benzodiazépines
spécifiques des RBZp. Le flunitraze­
pam, le Ro 5-4864 et son dérivé iso­
thiocyanate, le AH 086, se lient
préférentiellement aux protéi­
nes 30K et 32K, correspondant res-
1
+
r DB I
t DB I
+
60
+
80
+
• • • • • • • • • • • • KN • • • • • A • D • • • • • • S • • • • • • • • • • • • • - • • • I • • L K • • • • • • • • • G • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • •
• • • D • D • • • • • • K R • • • Q • T • • • • • • • • S • F • • • • • • • V • • D - • • • L • • L K • • • • • • S • • K • • • • • • • N • • • T • VE • • • • • • • • • • •
pDB I
y DB I
40
• • • • •D• • • • • •K• • • • • •A• • • • • • • • S • • • • • • • • • • • • • - • • • • • • •K• • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • • •D • • • • • • • • • • •
bD BI
dDB I
+
1
SQAEFE KAAEEVRHLKTKPSDEEMLFI YGHYKQATVGDINTE - RPGMLDFTGKAKWDAWNE LKGTS KEDAMKAY INKVEELKKKYGI
hDB I
mD B I
20
pectivement à un canal anionique pines en raison de leur capacité de
dépendant du voltage ( voltage depen­ déplacer les benzodiazépines de
dent anion channel, VDAC) et un leurs sites de liaison.
transporteur de l'adénosine ( adenine
nucleotide carrier, ADC) [27] . L'affi­ Les �-carbolines
nité des RBZp pour le Ro 5-4864 est En 1 980, Braestrup et al. [ 30] ont
variable d'une espèce à l'autre et isolé à partir de 1 'urine et du cer­
dépend largement de la pro­ veau humains un composé, l'éthyl­
téine 1 8K exprimée [28] , ce qui �-carboline-3-carboxylate ( �-CCE) ,
montre que les trois protéines sont qui présente une affinité nanomo­
laire pour les récepteurs des benzo­
étroitement associées (figure 2).
Le rôle des RBZp est encore mal diazépines. Par la suite, il a été
connu. L'activation de ces récep­ montré que cette molécule n'était
teurs produit divers effets tels que qu'un artéfact apparu au cours du
l 'augmentation de la conversion du processus d'extraction. Cependant,
cholestérol en prégnénolone et de ces travaux ont eu le mérite de con­
la synthèse de stéroïdes, l'inhibition duire au développement d'une nou­
de la prolifération cellulaire, la velle classe de ligands pour les
modulation de la production de récepteurs des benzodiazépines. Les
cytokines, une activation de la libé­ méthyl-�-carboline-3-carboxylate ( �­
ration hormonale par des cellules CCM) et méthyl 6,7-diméthoxy
an téhypophysaires
tumorales -4-éthyl-�-carbo l i ne-3-carboxylate
(ATt20) , la régulation de l'activité (DMCM) comptent parmi les �­
cardiaque ou encore la production carbolines les plus étudiées à ce
d'un état proconflictuel et anxio­ jour. Administrées par voie intracé­
rébroventriculaire ou intrapérito­
gène [ 19, 29] .
néale ces substances produisent des
effets opposés à ceux des benzodia­
Les ligands endogènes
zépines, à savoir anxiété et convul­
des récepteurs
sions [3 1 ] . Elles possèdent égale­
des benzodiazépines
ment, à faible dose, une activité
psychostimulante. Les �-carbolines,
L'existence de sites de liaison spéci­ qui inhibent l'action du GABA en
fiques pour les benzodiazépines a diminuant la fréquence d'ouverture
conduit naturellement plusieurs des canaux chlore [32] , agissent
groupes à rechercher les ligands comme des agonistes inverses des
endogènes de ces récepteurs. Trois benzodiazépines au niveau des
familles de molécules ont ainsi été RBZc.
identifiées : les �-carbolines, les ben­
zodiazépines endogènes et une Les benzodiazépines endogènes
famille de peptides appelés endozé- Plusieurs groupes ont envisagé l'exis-
• • • • • D • • • • • • KR • • • Q • DT • • • • • • • S • F • • • • • • • V • • D - • • • L • • L K • • • • • • S • • K • • • • • • • S • • • T
T L • • D • DE • • • • • KK • • • R • T • • • L K EL • • F • • • • • • • • • • I • - C • • • • • L K • • • • • E • • • L K • • I • • • • • • N •
M S L • E Q • D Q • • SN • • N • • S L • • • NDL • E L • A L F • • • SA • • AD P A N • • • L • • L K • • • • F • • • H K KA • L • • • • • Q • •
VSQ L • • E K • K A • NE • P • • • • T D • L • E L • A L • • • • • • • • N D K • - K • • I FNMKDRY • • E • • EN • • • K • Q • • • E • E
• VE • • D • • • • • • • •
• • S • A K TMV E • • • •
• • A • • • S • I A S L GL Q
• • A L • DQ • I A • • S S
F ig u re 3. Comparaison des séquences en acides aminés du précurseur des endozépines, l e diazepam­
binding inhibitor (DB/} de différentes espèces. Les points rouges correspondent aux acides aminés conservés.
h : homme ; b : boeuf; p : porc ; r : rat ; m : souris ; d : canard ; t : tabac ; y : levure.
m/s n° 4 vol.
10, avril 94
439
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locyte/macrophage colony-stimulating fac­
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440
tence de composés structuralement
apparentés aux benzodiazépines
dans le cerveau des mammifères. A
l'aide d'anticorps monoclonaux diri­
gés contre les benzodiazépines,
l'équipe de De Bias a isolé, par
chromatographie d'affinité, des com­
posés capables de déplacer les ben­
zodiazépines de leurs sites de liaison .
L'analyse par HPLC et spectrométrie
de masse a montré que la structure
de ces substances était chimique­
ment apparentée à celle des benzo­
diazépines [33, 34] . Plusieurs obser­
vations plaidaient en faveur d'une
synthèse endogène de ces molécules.
Ainsi, la présence de composés
benzodiazepin-like dans des tissus
humains conservés dans la paraffine
depuis 1 940, c'est-à-dire quinze ans
avant la synthèse de la première
benzodiazépine, a été mise en évi­
dence par des techniques immuno­
histochimiques [35] . En outre, des
lignées cellulaires, cultivées trois
mois dans un milieu défini, produi­
sent des molécules qui s'apparentent
par leur structure aux benzodiazépi­
nes [36] . Toutefois, des études plus
récentes ont révélé que les micro­
organismes tels que Penicillium cyclo­
pium ou Streptomyces refuineus produi­
sent des benzodiazépines et que ces
molécules sont également présentes
dans de nombreux végétaux ( céréa­
les, riz et pommes de terre) ainsi
que dans divers produits d'origine
animale [37] , ce qui tendrait à mon­
trer que les benzodiazépines endo­
gènes pourraient être d'origine ali­
mentaire ou provenir de contamina­
tions accidentelles.
Les endozépines
Le nom d' endozépines est un terme
générique qui désigne une famille
de peptides endogènes capables de
se lier aux récepteurs des benzodia­
zépines. Toutes les molécules con­
nues à ce jour dérivent d'un poly­
peptide de 1 0 kDa appelé diazepam­
binding inhibitor (DBI) initialement
isolé à partir du cerveau de rat en
raison de sa capacité à déplacer de
façon comp étitive les benzodiazépi­
nes et les l:i-carbolines de leurs sites
de liaison [ 38] .
• Structure des endozépines
Des séquences peptidiques partielles
du DBI de rat ont été déterminées
et, à partir de ces séquences, l'ADNe
codant pour le DBI a été cloné chez
un
certain nombre d ' espè­
ces [39-43] . Ces ADNe codent pour
des polypeptides (86 acides aminés
environ) hydrophiles et dépourvus
de peptide signal. La structure pri­
maire du DBI a été également
déterminée par le séquençage de
peptides purifiés à partir de divers
tissus périphériques. La comparaison
des séquences en acides aminés du
DBI de rat et de souris, deux espè­
ces qui ont divergé il y a 50 à
1 00 millions d'années, révèle 97 %
d'analogie entre elles (figure 3). Les
séquences bovine et humaine ont
respectivement 85 % et 78 % d'ana­
logie avec celle du DBI de rat.
L'endozépine isolée à partir du cor­
tex surrénalien de bœuf est une
molécule de 84 acides aminés qui
diffère du peptide d'origine céré­
brale par l'absence des 2 acides ami­
nés C-terminaux (glycine et isoleu­
cine) . L'existence de ce des(Gly­
Ile) DBI pourrait résulter, soit d'une
maturation post-traductionnelle spé­
cifique du précurseur dans la surré­
nale, soit d'un artéfact lié à la tech­
nique d'extraction . Par ailleurs, le
DBI bovin présente 60 % de simili­
tude de séquence avec la région
NH2 terminale d'une protéine trans­
membranaire de 533 acides aminés
( membrane associated protein-DBI, MA­
D BI) , clonée à partir d'une banque
de cerveau de bœuf [ 44] . Chez le
rat et l 'homme, la recherche des
séquences génomiques par Southern
blot a révélé la présence de six frag­
ments de restriction dont la taille
serait compatible avec l'existence de
plusieurs gènes codant pour le DBI.
Cependant, une sonde correspon­
dant à l 'extrémité 5' non traduite
de l 'ADNe du DBI ne s'hybride
qu'avec un seul fragment de restric­
tion de l 'ADN génomique, ce qui
suggère l'existence d'un seul gène
actif et de plusieurs pseudogènes.
Chez l'homme, ces gènes ou pseu­
dogènes se trouvent principalement
sur la région q 1 2-2 1 du chromo­
some 2 mais aussi sur les chromoso­
mes 5 et 6 [39, 45] .
La présence de plusieurs acides ami­
nés basiques, susceptibles de corres­
pondre à des sites de clivage poten­
tiels, indique que le DBI pourrait
être le précurseur de peptides bio­
logiquement actifs (figure 4). Le DBI
m/s n° 4 vot. 10, avril 94
K
K
R K
K
R
K
R
K
K K KK
K
K
KK
OBI
TIN
Fig u re 4. Schéma de maturation du diazepam-binding inhibitor (OBI}
Toutes les endozépines connues à ce jour dérivent d'un polypep­
tide de 10 kDa appelé d i azepam-bi n d i n g i n h i bitor (081), capable de déplacer
de façon compétitive les benzodiazépines et les {3-carbolines de leurs sites
de liaison. Le clivage du OBI au niveau des lysines 32 et 50 produit /'octa­
décaneuropeptide (ODNJ ; le clivage au niveau des lysines 16 et 50 produit
le triakontatétraneuropeptide (TTNJ.
de rat.
Fig u re 5. Localisation par immunofluorescence des endozépines dans
Les cellules gliales bordant le ventricule laté­
ral du télencéphale sont spécifiquement marquées par des anticorps dirigés
contre /'octadécaneuropeptide (ODN) (x 750).
le cerveau de la grenouille.
m/s n° 4 vol. 10, avril 94
donne naissance, par protéolyse
enzymatique, à plusieurs fragments
dont un triakontatétraneuropeptide
(DBI 1 7-50 connu sous le terme de
TI ) et un octadécaneuropeptide
(DBI 33-50 désigné par le sigle
ODN) (figure 4) qui possèdent des
propriétés physicochimiques très dif­
férentes. Le TI
présente une
séquence hydrophobe, dans sa
région C-terminale, qui lui permet
d'adopter une structure secondaire
en hélice a dans un environnement
apolaire. Cette configuration semble
jouer un rôle important dans la
électivité des sites de liaison : le
TIN possède une affinité plus
grande pour les RBZp que pour les
RBZc [ 46] . A l'inverse, l'ODN se lie
préférentiellement au site des ben­
zodiazépines associé au complexe
récepteur GABAA /benzodiazépi­
nes [ 47] .
• Distribution anatomique et localisation
cellulaire des endozépines
Le développement d'anticorps diri­
gés contre les endozépines a permis
de montrer que ces peptides sont
largement distribués dans l'ensemble
du système nerveux central et dans
de nombreux tissus périphériques .
Les concentrations les plus fortes
ont été mesurées dans l 'hypothala­
mus, le cervelet, le foie, le rein et
le duodénum. Des études immuno­
histochimiques indiquent que, dans
le cerveau, l 'immunoréactivité est
essentiellement associée à des élé­
ments de type gliaux ; en particulier,
de nombreux astrocytes immuno­
réactifs sont observés dans les diffé­
rentes couches du cortex céré­
bral [ 48] . En revanche, au niveau de
la substance blanche, seules quel­
ques cellules gliales localisées dans
le corpus callosum son t m ar­
quées [ 49] . Dans l 'hypothalamus, les
endozépines son t localisées dans les
cellules épendymaires qui bordent le
troisième ventricule, les astrocytes
des noyaux paraventriculaires, arqué
et supraoptique, ainsi que dans les
tanycytes de l ' éminence médiane
(figure 5). Les endozépines sont éga­
lement synthétisées dans les pituicy­
tes au niveau du lobe postérieur de
l 'hypophyse et dans quelques cellu­
les du lobe i n te rmédiaire ; à
l'inverse, le lobe antérieur en est
totalement dépourvu [50 ] . Les étu­
des réalisées en microscopie électro441
nique ont montré que, dans le cer­
velet, les endozépines sont exclusive­
ment exprimées dans les cellules de
Bergmann et qu'elles sont distri­
buées de façon diffuse dans le cyto­
plasme. Le fait que les endozépines
ne soient pas empaquetées dans des
grains de sécrétion est en accord
avec l'absence de peptide signal
dans la séquence du DBI. Paradoxa­
lement, la présence d'endozépines a
été observée dans des vésicules au
niveau d'éléments neuronal-lx dans
plusieurs régions du cerveau telles
que l'hippocampe, le cervelet et
l 'hypothalamus [ 49, 5 1 ] . La nature
des cellules qui expriment les endo­
zépines semble avoir changé au
cours de l'évolution puisqu 'un pep­
tide apparenté à l'OD est présent
dans les cellules gliales chez la gre­
nouille [52] , alors que chez le pois­
son, la localisation du peptide est
strictement neuronale [53] .
Au niveau des organes ou tissus
périphériques, les endozépines sont
stockées dans des cellules spéciali­
sées : les cellules épithéliales du trac­
tus gastroin testinal [54] , les cellules
de Leydig du testicule [ 55, 56] , les
cellules a et 8 du pancréas [57, 58]
et les cellules acineuses de la pros­
tate [ 59] . Au niveau de la surrénale
la localisation des endozépines est
strictement limitée à la zone glomé­
rulée du cortex [ 60 ] . L'analyse par
Northem blot ou par hybridation in
situ montre toujours une bonne cor­
rélation entre la localisation du DBI
et les sites d'expression de son
ARNm.
•
A ctivités biologiques des endozépines
Administrés par voie intracérébro­
ventriculaire, le DBI et l'OD indui­
sent des comportements de type
proconflictuel et un état d'anxiété
comparables à ceux observés après
l'injection de (3-carbolines [ 6 1 , 62] .
Les effets du DBI et de l'OD sont
totalement bloqués par l 'administra­
tion de flumazenil, un antagoniste
spécifique des RBZc. Au niveau cel­
lulaire, le DBI réduit l'amplitude du
courant chlore induit par le GABA
sur les cellules de moelle épinière
de souris [ 63] . De même, dans les
cellules mélanotropes de l ' hypo­
physe, l' ODN bloque l'effet inhibi­
teur du GABA sur la sécrétion hor­
monale (figure 6) [ 64] et abolit tota­
lement l'action du GABA sur le cou442
rant chlore [65] . En modulant néga­
tivement la transmission GABAergi­
que, le DBI et son fragment 33-50 se
comportent donc comme des ago­
nistes inverses des benzodiazépines
et l'action inhibitrice des endozépi­
nes serait à l'origine de leurs effets
anxiogènes et convulsivants.
Au niveau des organes périphéri­
ques, il existe une bonne corrélation
entre le taux d'expression des endo­
zépines et celui des RBZp. Ainsi, la
surrénale, qui est l'un des organes
les plus riches en DBI, présente une
concentration élevée de récepteurs
mitochondriaux des benzodiazépi­
nes. Il est in téressant de noter que
le DBI est exprimé dans divers types
de cellules stéroïdogènes (cellules
du cortex surrénalien et cellules de
Leydig) . L'activation des récepteurs
mitochondriaux par les benzodiazé­
pines ou le DBI stimule la synthèse
des stéroïdes [ 66, 67] . Le TIN
mime les effets du DBI dans deux
lignées de cellules tumorales, les
lignées Y- 1 (cellules du cortex sur­
rénalien) et MA- 1 0 (cellules de Ley­
dig) tandis que I'ODN est beaucoup
moins actif. L'étape limitante de la
stéroïdogenèse est le transport du
cholestérol dans la mitochondrie où
il est ensuite converti en prégnéno­
lone par le cytochrome P-4505cc
(side-chain cleavage). Il est bien établi
que le passage du cholestérol vers la
mitochondrie, qui est inhibé par le
cycloheximide, nécessite la synthèse
d'une protéine à renouvellement
rapide. La demi-vie du DBI est trop
longue, trois à six heures, pour qu'il
puisse correspondre à cette protéine
labile. En outre, les facteurs endo­
crines qui stimulent la stéroïdoge­
nèse n'affectent pas la synthèse
d'endozépines. Néan moins, une
étude récente très élégante a mon­
tré que des oligonucléotides antisens
dirigés contre les ARNm du DBI
inhibent à la fois la synthèse de DBI
et la production de prégnénolone
induite par les gonadotropines dans
les cellules MA-l 0 [ 68] . Ces oligonu­
cléotides antisens étant sans effet sur
l'activité du cytochrome P-4505cc• il
est clair que les endozépines, via
l'activation des RBZp, jouent un rôle
clé dans les premières étapes de la
biosynthèse des stéroïdes.
Les cellules gliales, qui expriment la
majorité des RBZp du système ner-
veux central [ 69] , montrent une
fo rte capac i te de l iaison du
TIN [ 70] . Par ailleurs, les cellules
gliales synthétisent une série de neu­
rostéroïdes ( prégnénolone sulfate,
dihydroépiandrostérone sulfate, 3a­
hydroxy-5a-p regn a n 2 0-o n e
ou
3a-2 1-dihydroxy-5a-pregnan-20-one)
qui sont capables de moduler posi­
tivement ou négativement le fonc­
tion n e m e n t
récepteur
du
GABAA [6] . Une étude réalisée sur
des mitochondries, isolées à partir
d'un gliome de rat (lignée cellulaire
C6-2B) , a montré que le DBI et le
TIN augmentent la synthèse de pré­
gnénolone, alors que l'ODN est sans
effet [ 7 1 ] . On peut donc concevoir
que les endozépines, dont le lieu de
synthèse est essentiellement situé
dans les cellules gliales, puissent
moduler la transmission GABAergi­
que en contrôlant la biosynthèse des
neurostéroïdes. Une étude récente
montre que les endozépines sont
libérées par les astrocytes et peuvent
agir directement sur ces mêmes cel­
lules par un mécanisme de type
autocrine ou paracrine. En particu­
lier, sur des astrocytes en culture,
l'ODN provoque des modifications
de la concentration de calcium
intracellulaire ( [Ca2• ] J qui sont
fonction de la dose de peptide
administrée : à des concentrations
nanomolaires, l'ODN induit une élé­
vation de la [Ca2• ] ;, tandis qu'à
doses micromolaires il diminue la
[ Ca2• ] ;. La mobilisation du Ca2•
induite par les faibles doses d'ODN
n'est bloquée ni par le flumazenil,
ni par le PK 1 1 1 95, suggérant l'exis­
tence d'un nouveau type de récep­
teur pour les e ndozépines. A
l ' inverse, la diminution de la
[Ca2• ] ; induite par les fortes doses
d'ODN est bloquée par le flumaze­
nil, indiquant qu'à des concentra­
tions micromolaires, l'OD exerce
son effet via des RBZc ( communica­
tion personnelle, Lamacz et al., sou­
mis pour publication) .
Un certain nombre d'éléments per­
mettent d'envisager un rôle des
endozépines dans la réponse immu­
nitaire. Dans les monocytes humains,
le TIN et l 'ODN potentialisent
l'action d'une endotoxine bacté­
rienne (lipopolysaccharide, LPS) sur
la production d'interleukine 1 ( I L l )
et du TNF (tumor necrosis factor).
mls n° 4 vol.
10, avril
94
cellules � chez le rat, suggérant que
les endozépines pourraient être
impliquées dans certaines formes de
diabète insulinodépendant.
Quelques années après la décou­
verte du DBI, une protéine appelée
Acyl Co-A binding protein (ACBP) a
été purifiée et caractérisée à partir
du foie de bœuf sur la base de sa
capacité de stimuler la synthèse
d'acides gras [ 76] . Or, les recher­
ches d'analogie de structure ont
montré que l'ACBP possède exacte­
ment la même séquence que le DBI.
I l apparaît donc que le DBI pour­
rait exercer certaines fonctions
métaboliques, telles que la régula­
tion de la biosynthèse des acides
gras (élongation des acides gras à
8- 1 2 carbones) , indépendamment de
son rôle de ligand des récepteurs
des benzodiazépines.
L'effet des endozépines sur la pro­
duction de cytokines est mimé par
le Ro 5-4864 [ 72, 73] . Les cellules
du système immunitaire expriment
l 'une des composantes du RBZp, la
protéine 1 8K, qui est localisée à la
fois sur la membrane mitochon­
driale et la membrane plasmi­
que [20] . L'ensemble de ces don­
nées suggère que les peptides appa­
rentés au DBI pourraient jouer un
rôle physiologique dans le contrôle
de la réaction inflammatoire.
Certaines actions du DBI ne sem­
blent pas être liées à l'activation des
récepteurs des benzodiazépines.
Chez le rat, les endozépines dimi­
nuent la libération d'insuline induite
par le glucose sur une préparation
de pancréas isolé [ 74] . Le diabète
est souvent associé à une baisse de
la réplication de l'ADN dans les cel­
lules � du pancréas. Or, Sjôholm et
al. [ 75] ont observé que le DBI pro­
voque une diminution de l ' incorpo­
ration de thymidine tritiée dans les
1
Conclusion
Les endozépines constituent une
famille de polypeptides ubiquitaires
dont la structure a été conservée au
cours de l ' évolution, depuis les uni­
cellulaires jusqu'à l ' homme. La plu­
part des effets des endozépines
s'exercen t par l'intermédiaire, soit
des récepteurs des benzodiazépines
associés au site GABAA , soit des
récepteurs des benzodiazépines dits
de type périphérique, localisés sur la
membrane mitochondriale ou sur la
membrane plasmique. Bien que les
endozépines présentent de nom­
breuses activités pharmacologiques,
leurs fonctions physiologiques et
leurs modes d'action restent mal
connus. Les travaux récents indi­
quent que les endozépines pour­
raient agir à la fois comme des mes­
sagers intercellulaires et des média­
teurs intracellulaires. D'autres études
en cours devraient permettre de
déterminer le rôle des endozépines,
notamment dans le système nerveux
central et dans les glandes endocri­
nes •
Surnrnary
Endozepines : endogenous ligands
for benzodiazepine receptors
300
a-MSH (% niveau de base)
GABA
(1 0·4 M)
ODN ( 1 0·4 M)
GABA
Flumazénil ( 1 0·4 M)
GABA + ODN
(1 0·4 M)
200
1 00
0
2
2
3
2
3
Temps (heures)
F i g u re 6. Effet de l'endozépine ODN sur la réponse au GABA des cel­
lules du lobe intermédiaire de l'hypophyse. Administré in vitro, le GABA
provoque sur la sécrétion d'hormone mélanotrope {a-MSH) (points rouges)
un effet biphasique qui est aboli en présence de l'octadécaneuropeptide
(ODN). L'action de /'ODN est inhibée par un antagoniste spécifique des récep­
teurs des benzodiazépines, le flumazenyl.
m/s
n° 4 vol.
10, avril 94
Because of their anxiolytic, seda­
tive and myo-relaxant properties,
benzodiazepines are among the
most commonly used drugs in cli­
nical practice. The actions of
benzodiazepines are mediated by
two classes of receptors i.e. recep­
tors associated with the GABAA­
chloride channel complex also
named central-type benzodiaze­
pine recep tors and receptors
localized in the mitochondrial
membrane called peripheral-type
benzodiazepine receptors. The
existence of binding sites for ben­
zodiazepines has suggested the
existence of endogenous ligands
capable of interacting with either
central or peripheral type benzo­
diazepine receptors. This hypo­
thesis has led to the dicovery of
a family of regulatory peptides
named endozepines which dis­
place diazepam from its neuronal
binding sites and exert a wide
range of biological activities.
443