TP de culture cellulaire

publicité
TP de culture cellulaire
I.
Introduction
Aujourd’hui, l’embryologie est une science qui s’est tournée vers la compréhension des
mécanismes qui permettent le développement des organismes. Pour la plupart des oiseaux, et
notamment pour notre poule, le développement de l’embryon se fait en dehors de l’organisme
maternel, à l’abri d’une protection, vulgairement appelée œuf.
Cet œuf contient toutes les ressources nécessaires au développement de l’embryon, que ce soit
au niveau de l’énergie, de l’eau et de la protection. L’enveloppe externe de cet embryon
permet donc la protection de l’embryon, de par sa composition en 3 parties principales :
Vitellus, Amnios et Allantoïde. Nous verrons les rôles de ces enveloppes dans la première
partie.
En ce qui concerne le développement de l’embryon en lui-même, un certain nombre de
processus se mettent en place, que ce soit pour la division cellulaire en elle-même, ou pour la
reconnaissance, la migration et la différenciation cellulaire. Ces mécanismes ont pour finalité
de former les tissus et les organes de la future poule.
Composant ces tissus et organes, un grand nombre de molécules sont aujourd’hui connues,
aussi bien au niveau de la matrice extracellulaire qu’au niveau des membranes. Nous pouvons
de plus, à ce jour, mettre en culture des cellules, et ainsi mieux comprendre les mécanismes
biologiques et cellulaires. Pour notre TP, nous voulons mettre 2 types de cellules en culture,
des cellules cérébrales et des fibroblastes. Pour les mettre en culture, nous utilisons la
technique de culture de cellules adhérentes à un support.Nos observations se font au
microscope inversé, sous hotte à flux laminaire, et donc en conditions stériles.
II.
1ère partie : mécanisme d’adhésion et de migration cellulaire
A.
L’embryon et les annexes embryonnaires
Figure 1 : Schéma de l'embryon de poulet à 7 jours de développement
Figure 2 : Position relative de l'Embryon dans l'œuf, en vue du dessus, en ayant coupé
du côté du "gros bout"
Figure 3 : Photo de la position de l'œuf par rapport aux annexes embryonnaires une fois
l’embryon extrait de l’œuf.
Figure 4:Zone cérébrale d'un embryon d'œuf de poule
Rôle des annexes
a)
Vitellus
Réserves nutritives de l’embryon, rôle nourricier.
b)
Vésicule vitelline
Entoure la masse de Vitellus, sert d’organe digestif. Elle est parsemée de vaisseaux sanguins,
ainsi les produits sont absorbés par ceux-ci et transportés vers l’embryon.
c)
Allantoïde :
Fonction dans la respiration : la splanchnopleure amène une vascularisation ce qui permet des
échanges gazeux entre l’allanto-chorion et la coquille de l’œuf.
Fonction nutritive sur plusieurs aspects :prend le relais du raphé séro-amniotique pour
l’assimilation du reste de l’albumen et permet de récupérer le calcium de la coquille pour
former les os de l’embryonce quifragilise la coquille et ainsi facilite la sortie du poussin.
Fonction excrétrice : la cavité allantoïde est une poubelle de l’embryon, en effet les déchets
produits par les reins seront lâchés dans l’allantoïde. Au moment de l’éclosion l’allantochorion reste collée à la coquille.
d)
Chorion
Couche extra-embryonnaire externe constituée de mésoderme et d’ectoderme.
e)
Cœlome extra-embryonnaire
Cavité générale de l’œuf.
f)
Amnios
Permet le développement de l’embryon en milieu liquide.Permet l’assimilation de l’albumen
par le raphé séro-amniotique jusqu'à 16 jours d’incubation.Assure à l’embryon une protection
contre une possible dessiccation et d’éventuels chocs mécaniques.
C.
Mise en culture des cellules cérébrales embryonnaires de poulet
Matériel et méthodes :
1.
Milieu DMEM
a)
DMEM base
Le milieu DMEM base est acheté tel quel.
B.
b)
DMEM 5%
Le milieu DMEM 20% se prépare en suivant la composition suivante :
- Milieu de base : DMEM
500 mL
- Sérum de veau fœtal (SVF) 25 mL (5%)
- Antibiotique
6 mL
- L-glutamine
6 mL
c)
DMEM 20%
Le milieu DMEM 5% se prépare en suivant la composition suivante :
- Milieu de base : DMEM
500 mL
- Sérum de beau fœtal (SVF) 110 mL (20%)
- Antibiotique
6 mL
- L-glutamine
6 mL
2.
Poly Lysine
Pour 10 boites :
1- Peser l’acide borique dans un bécher de 50 mL et ajouter 40 mL environ d’H2O
2- Ensuite, peser la poly lysine dans un micro bécher à l’aide de 2 pinces et l’ajouter avec
attention à l’acide borique. Agiter le tout.
3- Peser le NaOH 1N dans un bécher de 25mL et ajouter de l’H2O puis mélanger avec
une tige de verre dans un bain-marie. Ensuite, le transvaser dans une fiole et ajuster à
50 mL. Agiter et mettre dans un flacon.
4- Le PH étant de 4,75 environ, il faut (0,5mL environ d’NaOH 1N) pour remonter le pH
à 8,4
5- Ensuite ajuster la solution à 50 mL avec H2O
6- Prévoir un bécher de 25 ou 50 mL et une seringue de 10 mL avec un filtre de 0,22 µm
et verser 2,5mL par boite de Pétri (sous la hotte). Ne plus bouger les boites jusqu’à la
mise en culture.
3.
Tampon borate
Pour les boites « borate », la procédure est la même sauf que l’on n’ajoute pas la poly lysine
au tampon borate.
4.
Fibronectine
On veut préparer 10 boites de 60 mm de diamètre, ayant donc chacune 28 cm² de surface. On
veut 2 µg.cm-2, on a donc besoin de 560 µg de fibronectine.
Pour cela on suit le protocole suivant :
1- Reconstituer avec 1 mL d’eau stérile par mg de protéine. Laisser dissoudre pendant au
moins 30 minutes.
2- Diluer la fibronectine dans une solution saline tamponnée (la dilution n’est pas
indiquée) et recouvrir la surface de culture avec un volume minimum.
3- Laisser sécher à l’air pendant au moins 45 minutes à température ambiante. L’excès de
fibronectine sera éliminé par aspiration.
Lors de notre manipulation, nous avons donc mis en culture des cellules cérébrales
embryonnaires de poulet dans des boites de Pétri présentant différents revêtements afin de
savoir lequel semblait être le plus adapté à ce type de culture cellulaire.
Protocole:
Répartir 1,5 mL de la solution cellulaire + 3,5 mL de DMEM 20% dans chaque boite
D.
Analyse et interprétation des résultats
1.
Tampon borate
Après 1 heure d’incubation à 37°C en incubateur à CO2, on observe une absence d’adhérence
des cellules sur le fond de la boite. On observe la présence d’amas cellulaires, sans doute dus
à une mauvaise séparation des cellules lors de la manipulation.
Figure 5 : Culture de neurones en tampon borate après 1 heure d'incubation
Après 4 jours d’incubation, les cellules n’ont toujours pas adhéré, on constate l’absence de
croissance cellulaire, et la présence de quelques corps apoptotiques (cellules mortes).
Après 7 jours d’incubation, les cellules n’ont ni adhéré, ni poussé, et seuls les corps
apoptotiques sont visibles.
Figure 6 : Culture de neurones en tampon borate après 4 jours d'incubation
Figure 7 : Culture de neurones en tampon borate après 7 jours d'incubation
Donc, le tampon borate n’est pas un milieu approprié pour la croissance descellules cérébrales
embryonnaires, en effet, dans les conditions expérimentales, nous n’avons observé aucune
adhérence, migration ou croissance de celles-ci.
2.
Polylysine
Après 1 heure d’incubation à 37°C en incubateur à CO2, on observe l’apparition de petits
prolongements cellulaires sur certaines cellules, ceci montre que les cellules sont entrain
d’adhérer à la paroi de la boite. Par ailleurs, on peut observer l’apparition de longs
prolongements qui pourraient traduire un début de croissance cellulaire.
Figure 8: Culture de cellules cérébrales embryonnaires sur polylysineaprès 1h d'incubation.
Après 4 jours d’incubation, on constate la présence de corps apoptotiques. Les cellules
vivantes adhèrent à la paroi. De plus, les cellules ont poussé, de nombreux prolongements
(axones et dendrites) sont apparus. On remarque aussi les synapses entre différents neurones.
Figure 9 : Culture de cellules cérébrales embryonnaires sur polylysine après 4 jours d'incubation.
Figure 10 : Culture de cellules cérébrales embryonnaires sur polylysine après 7 jours d'incubation.
Après 7 jours d’incubation, les corps apoptotiques sont toujours présents. Les neurones ont
davantage poussé, ils adhèrent toujours à la paroi de la boite et des nombreux prolongements
supplémentaires sont apparus.
Les neurones font tous des synapses les uns avec les autres.
La polylysine est un polymère de L-lysine, acide aminé présentant sur sa chaine latérale un
groupement amine. Le pH de notre solution étant à 8.4, la polylysineest chargée positivement
ce qui lui permet de se lier à des groupements chargés négativement par des interactions
électrostatiques.
Notre culture a bien adhéré à la paroi de la boite de Pétri, sans doute grâce à des liaisons
électrostatiques, les cellules ont bien poussé et migré. Il semblerait donc que dans ces
conditions d’expérimentations ce type de support soit approprié à la culture de neurones.
3.
Fibronectine
Après 1h d’incubation à 37°C en incubateur à CO2, on remarque l’apparition de petits
prolongements sur quelques cellules, celles-ci sont sans doute entrain d’adhérer à la paroi de
la boite de Pétri.
Figure 11 : Culture de cellules cérébrales embryonnaires sur fibronectine après 1h d'incubation.
Après 4 jours d’incubation, les cellules ont bien adhéré à la paroi, elles ont émit des
prolongements (axones et dendrites), quelques synapses sont apparues. On ne voit pas de
corps apoptotiques.
Figure 12 : Culture de cellules cérébrales embryonnaires sur fibronectine après 4 jours d'incubation.
Figure 13 : Culture de cellules cérébrales embryonnaires sur fibronectine après 7 jours d'incubation.
Après 7 jours d’incubation, les cellules ont très fortement adhéré à la paroi, elles ont émit une
multitude de prolongements et de nombreuses synapses sont visibles. De plus, les
grossissements sont les même sur toutes les photos présentées et on constate que sur celle-ci,
les cellules sont beaucoup plus grosses. On n’observe que peu de corps apoptotiques.
La fibronectine est une glycoprotéine dimérique de 440 kDa présentant de nombreux sites de
liaisons pour les récepteurs membranaires de certaines cellules, le collagène... In vivo, elle
joue un rôle important dans la migration et la différenciation cellulaire.
Notre culture a bien adhéré à la paroi de la boite de Pétri, en se fixant à la fibronectine. Les
cellules ont bien poussé et migré. De plus, la croissance cellulaire est plus importante que sur
la polylysine. Peu de corps apoptotiques sont présents.
E.
Conclusion
Dans nos conditions expérimentales, il apparait que le meilleur revêtement à utiliser pour la
mise en culture de cellules cérébrales embryonnaires de poulet soit la fibronectine. En effet,
les cellules poussent et migrent mieux que sur polylysine et peu de corps apoptotiques y sont
observés.
Par ailleurs, le soma des neurones ne présente pas de structure particulière.
III.
2ème partie : marquages subcellulaires de cultures primaires de fibroblastes
A.
1ère séance : Mise en culture des fibroblastes de poulet
Afin de mettre en culture des fibroblastes, nous avons travaillé sur le corps de l’embryon de
poulet. Nous avons éliminé les membres, les viscères et la colonne vertébrale. Nous avons
ensuite broyé et dispersé le reste des tissus dans du milieu DMEM 5% puis mis en culture à 2
concentrations différentes : une boite contenant 1 mL de suspension cellulaire et 4 mL de
DMEM 5%, et l’autre contenant 0,2 mL de suspension cellulaire et 4,8 mL de DMEM 5%.
Nous avons observé les cellules le jour même, à 7 jours et à 14 jours, en ayant réalisé un
passage à 7 jours.
Figure 14 : Observation d'une culture de fibroblastes (0,2 mL de culture + 4,8 mL de DMEM) à 7 jours
Figure 15 : Observation d'une culture de fibroblastes (1 mL de culture + 4mL de DMEM) à 7 jours
On observe sur chacune des photos plusieurs types cellulaires morphologiquement différents.
Après 7 jours, on observe que dans la boite à 0,2 mL, les cellules qui ont le plus poussé sont
les fibroblastes. Nous avons mis en culture un mélange de cellules contenant entre autre des
fibroblastes. Les fibroblastes sont des cellules qui ont besoin d’un support d’adhérence pour
croitre, et il se trouve que dans la boite à 1 mL, la présence d’autres types cellulaires à gêné
leur adhérence, les empêchant ainsi de se multiplier et de croitre. Dans la boite à 0,2 mL,
moins de cellules ont été ensemencées, les fibroblastes ayant une croissance plus rapide que la
moyenne, ils ont surpassé les autres cellules en fixation et en croissance. Ceci nous a permis
de réaliser un enrichissement en fibroblastes.
Contrairement au premier jour d’observation, à 7 jours, les fibroblastes présentent une
organisation spécifique, les cellules sont allongées et disposées parallèlement les unes par
rapport aux autres.
B.
2ème séance : Entretien de cultures cellulaires
Protocole corrigé :
- Prendre boite 0,2, éliminer le milieu avec une P1000
- Faire délicatement un rinçage avec 2 mL de milieu PBS pour éliminer le sérum, piège
pour l’action de la trypsine (attention à ne pas tout décoller)
- Décoller les cellules en faisant agir 1,5 mL de trypsine : la trypsine dégrade les
protéines extracellulaires qui interagissent avec la matrice. Il ne faut pas la laisser agir
trop longtemps, sinon elle s’attaque aux protéines cellulaires, et dégrade alors la
cellule en elle-même.
- Surveiller les cellules à l’œil et au microscope (transparence, peut prendre entre 2 et 5
minutes)
- Quand les cellules sont décollées, ajouter 0,2 mL de SFV (la
trypsine se fixe alors aux protéines de la SFV)
- Homogénéiser et prendre 1 mL, à mettre dans un tube
Eppendorf
- Mettre 50µL + 450 µL de DMEM base
- Placer 50 µL sur une cellule de Malassez
- Comptage
On observe en moyenne 4,5 cellules pour 1/100 µL, soit 450
cellule/µL. Notre solution a été diluée au 10ème, on a donc 10 fois
plus de cellules par µL, ce nous donne 4500 cellules par µL. On veut ensuite ensemencer les
cellules sur les lamelles de verre de la façon suivante :
1- 2500 cellules/cm²
2- 10000 cellules/cm²
3- 15000 cellules/cm²
Dans un volume final
de 500 µL de CEF
4- 40000 cellules/cm²
Le diamètre de chaque puits fait 1,5 cm, la surface S = π x r² = π x 0,75² = 1,77 cm². On veut
donc :
1- 2500 cellules par cm², donc pour 1,77 cm², on voudra 4425 cellules.
2- 17700 cellules dans le puits
3- 26550 cellules dans le puits
4- 70800 cellules dans le puits
Sachant qu’on a 4500 cellules par µL, on devra prendre :
1- 2,95 µL de la suspension cellulaire q.s.p. 1,5 mL de CEF (on prépare 1,5 mL car la
quantité de suspension à prélever pour un volume de 500 µL serait trop petite)
2- 11,8 µL q.s.p. 1,5 mL de CEF
3- 17,7 µL q.s.p. 1,5 mL de CEF
4- 47,2 µL q.s.p. 1,5 mL de CEF
On prélève ensuite 500 µL de chaque préparation que l’on dispose dans les puits 1 à 4. On
laisse ensuite pousser pendant 1 semaine à 37°C en incubateur à CO2.
C.
Séance 3 : marquage subcellulaire de l’ADN à l’acridine orange
L’acridine orange est une fluorescéine. Elle se fixe préférentiellement à l’ADN et permet ainsi
de mettre en évidence les noyaux et les mitochondries. On observe donc une fluorescence
dans le vert. Pour cela, on utilise un microscope à fluorescence, qui dispose d’une lampe à arc
et de filtres permettant la sélection de longueurs d’ondes précises.
Principe du microscope à
Figure 16 : Molécule d'acridine orange
fluorescence :
On excite notre molécule dans le bleu, dont l’absorbance est maximale à 450 nm, et on utilise
un filtre d’émission qui permet de mettre en évidence les émissions à partir de 520 nm dans le
vert.
Après avoir marqué nos cellules à l’acridine orange, nous les avons observé au microscope et
avons obtenu les photographies suivantes :
Figure 17 : Photographie de fibroblastes colorés à l'acridine orange et observés au
microscope à fluorescence
D.
Conclusion
La coloration à l’acridine orange permet de mettre en évidence la structure du noyau des
fibroblastes, en effet, ils sont constitués de plusieurs nucléoles.
Cette manipulation nous a permis de mettre en évidence la morphologie et l’organisation des
fibroblastes, effectivement, ce sont des cellules adhérentes, qui s’organisent parallèlement les
unes aux autres, ne supportent pas la confluence, et ont des noyaux constitués de plusieurs
nucléoles.
Téléchargement
Random flashcards
Ce que beaucoup devaient savoir

0 Cartes Jule EDOH

aaaaaaaaaaaaaaaa

4 Cartes Beniani Ilyes

découpe grammaticale

0 Cartes Beniani Ilyes

Fonction exponentielle.

3 Cartes axlb48

TEST

2 Cartes Enrico Valle

Créer des cartes mémoire