Mobilités Electrophorétiques

doc from JF Perrin
Mobilités électrophorétiques
1. Mobilité d'une particule chargée supposée unique soumise à l'action d'un
champ électrique uniforme
On suppose l'expérience de pensée suivante :
Une particule unique de charge q et de rayon hydrodynamique équivalent r est soumise à un champ
électrique E au sein d'un milieu neutre de viscosité η.
La particule est soumise à une force électrique de norme fe = q E.
La particule prend donc de la vitesse (v) et devient soumise à une force de frottement ff de norme = 6 π
η r v.
Elle accélère jusqu'à atteindre une vitesse constante pour laquelle :
fe = q E = ff = 6 π η r v
Qui donne l'égalité :
v = (q/6 π η r) . E
La vitesse de migration devient constante, elle est proportionnelle à la valeur du champ électrique
appliqué et à un facteur qui ne dépend que de la charge de la particule, de son rayon hydrodynamique
équivalent et de la viscosité du milieu, facteur appelé mobilité limite µl.
µl = v / E = q/6 π η r
E s'exprime en V/m ; v en m/s donc µl en m²V-1s-1.
Le rapport q/r généralement appelé densité de charge de la particule.
2. Mobilité électrophorétique de particules chargées P, dans un liquide de pH
tamponné et de force ionique donnée
II s'agit maintenant de se placer dans un cadre expérimental plus réel. On considère des particules
(macromolécules) chargées en solution dans un liquide de pH tamponné et de force ionique fi.
Chaque particule (représentée en marron, supposée sphérique, de rayon r, et avec une distribution
symétrique de son électricité) baigne dans un liquide qui contient des cations et des anions. La charge
globale du milieu est nulle. Chaque particule est entourée d'ions proches (on parle de son nuage
d'ions) ; la charge q n'est pas sans effet sur la distribution des ions du nuage. Le nuage d'ions contient à
la fois des cations et des anions mais annule globalement la charge q (soit q la charge de la particule, la
charge nette du nuage est de -q). Sur le schéma, on a représenté le nuage en bleu, il est sphérique
puisqu'on a supposé une particule sphérique à distribution d'électricité uniforme.
Charge globale nulle
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Si on applique un champ électrique E au système, chaque particule (ici supposée sphérique et avec une
distribution symétrique de son électricité) va se mettre en mouvement et va atteindre une vitesse v
uniforme. Cette vitesse sera atteinte très rapidement lorsque les 4 forces qui s'exercent sur la particule
auront une somme vectorielle nulle.
Présentons les 4 forces :
# la force fedue à l'application du champ électrique sur la particule de charge q. fe = q E
# la force de frottement ff due à la vitesse v dans un milieu de viscosité η. ff = 6 π n r v
# sous l'effet du champ électrique, les ions de l'atmosphère ionique se déplacent dans une
direction globalement opposée à celle de chaque particule de charge q (puisque la charge globale du
nuage est de -q). Ces ions entraînent avec eux des molécules de solvant (une sorte d'osmose locale) de
sorte que chaque particule de charge q se heurte à un contre courant de solvant qui la freine. Appelons
fret = forces de retard électrophorétique ce freinage.
Chaque particule se déplace globalement en sens opposé à celle-
ci. Conclusion : la force du champ électrique est rompue. Les
barycentre des charges + et - ne coïncident (.../...) champ
électrique local qui rappelle chaque particule. Appelons frap ces
forces
Quel est le bilan global du jeu des 4 forces ? Chaque particule va atteindre une vitesse (v) de migration
constante lorsque fe = ff + fret + frap ; soit :
q E = 6 π η r v + fret + frap; soit:
v = (q E / 6 π η r) - ( fret + frap/ 6 π η r)
Ainsi, si on appelle µr la mobiité d'une particule dans le système d'électrophorèse, on a :
µr = v / E = (q / 6 π η r) - ( fret + frap/ 6 π η r E)
On retrouve évidemment une formule proche de la formule vue au paragraphe précédent, celle de la
mobilité limite µl. Sans considérations théoriques poussées, on remarque que µr < µl.
On peut montrer que plus la force ionique du milieu de pH tamponné augmente, plus fret et frap
augmentent et donc plus la mobilité diminue par rapport à la mobilité limite.
On peut l'écrire µr = γ µl avec γ < 1 et γ d'autant plus faible que fi est élevée.
Ce qui en fait n'est pas très gênant pour la séparation de particules lors d'une électrophorèse:
Il reste vrai que plus la densité de charge d'une particule est élevée, plus elle migre vite dans un
système électrophorétique donné. Les mobilités limites et les mobilités électrophorétiques réelles
obtenues dans un liquide tamponné donné sont dans le même ordre ! La mobilité effective réalisée dans
un liquide de pH tamponné donné reste définie comme le rapport de la vitesse au champ électrique (en
m²V-1s-1)!!
3. Mobilité électrophorétique dans le cadre de montages techniques particuliers
3.1. Mobilités électrophorétiques et électrophorèses de zones en veine liquide imprégnant un support
poreux
On peut présenter ainsi les montages d'électrophorèses de zones sur support poreux :
Un support poreux (en pratique de l'acétate de cellulose, un gel de polyacrylamide, ou un gel d'agarose)
est imprégné d'un électrolyte de pH tamponné. Cet électrolyte remplit les deux réservoirs anodiques et
cathodiques au contact du support. Les 2 réservoirs d'électrolyte sont de volume suffisamment élevé
pour qu'on puisse négliger l'évolution de la composition de l'électrolyte en cours d'électrophorèse (en
toute rigueur cette composition évolue puisqu'il y a migration d'ions de l'électrolyte et électrolyse de
l'électrolyte). La charge de l'échantillon à analyser en ses différents constituants à séparer est faible
devant la concentration en ions de l'électrolyte de sorte qu'on peut considérer que le champ électrique
est constant.
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Ce type de montage va conduire à différents phénomènes qu'il convient de mentionner.
Le problème de l'apparition des courants de convection.
Qui dit électrophorèse dit intensité de courant et donc effet Joule, production de chaleur. Le dégagement
de chaleur se traduit par l'apparition de courants liquidiens de convection au sein du support poreux.
Ces courants élargissent les zones de séparation : le pouvoir séparatif est diminué !
Pour minimiser ce phénomène, on travaille sous des intensités de courant pas trop élevées et on
réfrigère en cours de manipulation. On verra au paragraphe 3.2. que les techniques en électrophorèse
capillaire permettent une diffusion parfaite de la chaleur sous des champs appliqués très importants. Les
convections sont évitées , la résolution est très élevée...
Les supports chargés qui conduisent à l'électroendosmose.
Certains supports portent des groupements chimiques chargés : c'est la cas des supports acétate de
cellulose et des agaroses pas totalement désulfatés qui portent des groupements à charge négative. De
tels supports entraînent l'apparition d'un courant liquidien : du pôle positif au pôle négatif dans la cas des
supports à charges négatives. Ce Courant liquidien est lié à la migration électrophorétiqué des contre-
ions du support qui entraînent le solvant par effet d'osmose: on parle électroendosmose liée au support.
Comme le montre le schéma, dans le cas d'un support chargé négativement (le cas classique), le
courant d'électroendosmose est dirigé du pôle positif vers le pôle négatif : il s'oppose à la migration
électrophorétique des particules chargées négativement et augmente la vitesse de migration des
particules chargées positivement.
L'utilisation de l'acétate de cellulose comme support d'électrophorèse tend à disparaître. Les agaroses
plus ou moins chargés restent utilisés pour des techniques de séparation de protéines qui ne
nécessitent pas un pouvoir de résolution très élevé. On peut aussi citer la technique
d'électroimmunodiffusion quantitative de Laurell qui met en œuvre un agarose sulfaté (à
électroendosmose) imprégné par un tampon de pH 9,2 chargé en immunoglobulines (anticorps). Dans
un tel système, l'électroendosmose liée au support contrarie très exactement la faible mobilité
électrophorétique des anticorps dans le tampon pH 9,2 (les anticorps ont un pHi élevé) : les anticorps
ont une mobilité globale nulle. Ils vont rester en place dans le gel et seront recrutés au fur et à mesure
par un antigène en migration électrophorétique... voir un cours spécialisé à ce sujet. (cf TP BCM!)
On verra dans le paragraphe 3.2. l'importance de l'électroendosmose dans les techniques
d'électrophorèses capillaires. Dans certaines techniques, on met en œuvre des effets de tamisage
moléculaire liés à la porosité du support. Lors des techniques de séparation électrophorétique de
fragments d'ADN ou de nacelles SDS-unités polypeptidiques réduites (des techniques très classiques),
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on met à profit le fait que les substances à séparer ont toutes la même densité de charge (à peu près).
Ainsi, si on réalisait l'électrophorèse en veine liquide sans support, les analytes à séparer auraient tous
la même mobilité électrophorétique et ne seraient donc absolument pas séparés !
Dans ces techniques on va mettre en œuvre un support de porosité contrôlée qui va exercer un effet de
tamisage sur les analytes en migration : plus ils sont de dimension élevée, plus ils sont freinés. On
parvient ainsi à une séparation électrophorétique selon le paramètre de taille (en fait étroitement corrélé
à la masse moléculaire).
Attention ! Qui dit support imprégné n'implique pas effet de tamisage moléculaire. Il suffit de prévoir une
porosité large devant la taille des analytes à séparer et l'effet de tamisage sera nulle. C'est le cas pour
les électrophorèses de protéines sur gels d'agarose par exemple.
Voyez les chapitres concernant les électrophorèses d'acides nucléiques et la SDS-PAGE.
Les supports "ouverts" conduisent à des courants d'évaporation.
Lors de la mise en œuvre de certaines techniques où il n'y a pas lieu de demander des performances
séparatives élevées, on travaille parfois en "milieu ouvert". La production de chaleur par effet Joule
génère alors un courant d'évaporation qui devient alors un nouveau paramètre de la mobilité. Il suffit de
travailler en "milieu fermé" pour éviter l'évaporation...
3.2. Mobilités électrophorétiques et électrophorèses capillaires
Les électrophorèses capillaires sont traitées dans un chapitre dédié. Il est néanmoins possible de
signaler dans cette page qu'elles mettent en œuvre une migration électrophorétique au sein d'un liquide
de pH tamponné à l'intérieur d'un capillaire de silice. Ce type de montage permet une évacuation très
efficace de la chaleur produite par effet Joule et autorise ainsi des champs électriques très élevés avec
très peu de convection : on atteint ainsi un pouvoir séparatif très élevé. Les techniques capillaires
utilisent souvent le flux d'électroendosmose lié aux charges négatives de la surface des capillaires de
silice et des méthodes mettant en œuvre des interactions avec des micelles du détergent chargé SDS
(sodium dodécylsulfate).
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