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Méthodes de dépistage des sources de pollution microbienne : Les marqueurs bactériens : Alain Rincé, Stéphanie La Carbona Laboratoire de Microbiologie de l'Environnement USC INRA 2017 Université de Caen 14032 CAEN Cedex, FRANCE colloque qualité sanitaire des eaux de baignade et conchylicoles – Brest 29 octobre 2010 La qualité sanitaire (microbiologique) des eaux = enjeu important Contaminations fécales assez fréquemment observées. Ces pollutions fécales peuvent provenir d’une origine humaine (stations de traitement des eaux usées, fosses septiques)… où de matières fécales d'animaux (élevages, animaux sauvages ou domestiques). Discriminer les origines = important pour limiter ces contaminations. De nombreuses méthodes d’identification des sources de pollutions ont été décrites. Elles reposent sur : - la détection de composés chimiques signant l’origine de la pollution - la détection de virus ou bactériophages - la détection de bactéries Méthodes d’identification des sources de pollutions basées sur des caractéristiques bactériennes. Méthodes dépendantes de banques de données Méthodes indépendantes de banques de données Méthodes d’identification des sources de pollutions basées sur des caractéristiques bactériennes. Méthodes dépendantes de banques de données Font appel à une culture des bactéries Des bactéries sont isolées de différentes sources fécales d’origines connues (fèces, lisiers, eaux-usées) et des échantillons à analyser (eaux, sédiments, coquillages) Type humain Les isolats sont individuellement analysés par des approches phénotypiques ou génotypiques Les isolats des échantillons à analyser sont comparés à ceux provenant des sources fécales d’origines connues (Banque de donnée) Source(s) de pollution Type ovin Type bovin Méthodes d’identification des sources de pollutions basées sur des caractéristiques bactériennes. Méthodes indépendantes de banques de données Consistent à mettre en évidence des bactéries que l’on retrouve spécifiquement dans les matières fécales d’une origine donnée L’analyse peut faire appel ou non à une culture des bactéries origine humaine Depuis quelques années de nombreuses techniques basées sur la mise en évidence de marqueurs bactériens par amplification d’ADN et ne nécessitant pas de culture ont été décrites. Méthodes d’identification des sources de pollutions basées sur des caractéristiques bactériennes. Méthodes dépendantes de banques de données Approches phénotypiques ARA: Analyse de la résistance aux antibiotiques CUP: Profil d’utilisation de sources de carbone FAME: Profil d’esters méthyliques d'acides gras Approches génotypiques Ribotypage rep PCR : PCR basée sur des éléments répétés PFGE : Electrophorèse sur gel en champs pulsé DGGE : Electrophorèse en gradient de gel dénaturant AFLP : Polymorphisme de longueur de fragments d’ADN amplifiés RAPD : Amplification aléatoire d'ADN polymorphe Méthodes dépendantes de banques de données : Approches phénotypiques ARA: Analyse de la résistance aux antibiotiques Antibiotiques utilisés chez les humains et animaux différents les bactéries provenant de ces hôtes présentent des résistances différentes. Escherichia coli et streptocoques fécaux. Isolement de clones susceptibilité vis-à-vis d’une variété d’antibiotiques (différentes concentrations) Les profils de résistance des souches des échantillons à analyser sont comparés à ceux provenant de bactéries isolées à partir des matières fécales des différentes sources humaines ou animales potentielles (banque). Technique simple à mettre en œuvre et peu onéreuse Spécifique de chaque région géographique. Méthodes dépendantes de banques de données : Approches phénotypiques CUP: Profil d’utilisation de sources de carbone Méthode basée sur des différences dans la capacité des bactéries à utiliser des sources de carbone (ou d'azote) pour leur énergie et leur croissance. Enterocoques et E. coli. Isolement inoculation dans une microplaque 96 puits (substrats + réactifs) Technique relativement simple à mettre en œuvre et peu onéreuse. Méthodes dépendantes de banques de données : Approches phénotypiques FAME: Profil d’esters méthyliques d'acides gras Différences de conditions environnementales micro-organismes de sources différentes présentent des compositions en acides gras différentes. Simplement analysés : extraction des lipides trans-estérification pour former des esters méthyliques d'acides gras (FAME) chromatographie en phase gazeuse Les résultats génèrent pour chaque souche un profil FAME qui peut être comparé à ceux d’une banque. Méthodes dépendantes de banques de données : Approches génotypiques Ribotypage Méthode d’analyse des gènes codant l’ARN ribosomique. Plusieurs techniques : - Ribotypage par hybridation de Southern blot. Purification d’ADN Digestion Electrophorèse Transfert sur membrane Hybridation/révélation (sondes d'ADNr). Samadpour et al. 2005 (empreinte d’environ quatre à douze bandes) Méthodes dépendantes de banques de données : Approches génotypiques Ribotypage Méthode d’analyse des gènes codant l’ARN ribosomique. Plusieurs méthodologies : - Ribotypage par analyse de fragments de restriction d’ADNr amplifié. Amplification par PCR d’ADNr Digestion Electrophorèse Visualisation Méthodes dépendantes de banques de données : Approches génotypiques rep PCR : PCR basée sur des éléments répétés Consiste à réaliser une PCR à l’aide d’un oligonucléotide correspondant à une séquence répétée sur le génome des bactéries. REP-PCR : “Repetitive Extragenic Palindromic” ERIC-PCR : “Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus éléments” BOX-PCR : “BOX elements” (combinaisons de boites A, B et C). Purification d’ADN Numérisation Analyse informatique PCR Electrophorèse Dombek et al. 2003 Dombek et al. 2003 Méthodes dépendantes de banques de données : Approches génotypiques PFGE : Electrophorèse sur gel en champ pulsé Utilisation d’enzymes de restriction qui coupent rarement sur le génome entier d’une bactérie. Grands fragments d’ADN séparés par une électrophorèse (changement périodique de l’orientation du champ électrique). Emprisonnement des bactéries dans des blocs d’agarose Extraction de l’ADN Numérisation Digestion de l’ADN Analyse informatique Changement régulier Champ électrique 1 - Champ électrique 2 - - - - - + + + + + + + + Electrophorèse en champ pulsé Hager 2001 Méthodes dépendantes de banques de données : Approches génotypiques DGGE : Electrophorèse en gradient de gel dénaturant : Distinguer des bactéries sur la base de variations de séquences dans un fragment d’ADN. La migration d’un fragment d‘ADN dans un gel d'acrylamide où il rencontre des conditions de plus en plus dénaturantes est fortement ralentie lorsqu’il commence à se dénaturer, or la stabilité du double brin d’ADN dépend de sa séquence. PCR DGGE D’Elia et al. 2007 Méthodes dépendantes de banques de données : Approches génotypiques AFLP : Polymorphisme de longueur de fragments d’ADN amplifiés Basée sur l’amplification sélective de fragments de restriction à partir d’une digestion totale de l’ADN génomique. Digestion par des enzymes de restriction Ligation à des Amplification adaptateurs par PCR Electrophorèse Méthodes dépendantes de banques de données : Approches génotypiques RAPD : Amplification aléatoire d'ADN polymorphe Spectre de produits amplifiés caractéristique de l’ADN de départ (donc du microorganisme) Un oligonucléotide arbitraire (ou 2) de petite taille ou dégénéré va s’hybrider au hasard à de multiples régions sur le génome de façon à générer de nombreux fragments. Purification d’ADN PCR Electrophorèse Méthodes d’identification des sources de pollutions basées sur des caractéristiques bactériennes. Méthodes indépendantes de banques de données Méthodes basées sur la culture des bactéries FC/SF : rapport Coliformes fécaux /Streptocoques fécaux Bifidobactéries fermentant le sorbitol Rhodococcus coprophilus Streptococcus bovis Analyses moléculaires PCR ciblant une espèce bactérienne (ou un gène) spécifique d’une origine Méthodes indépendantes de banques de données : Approches basées sur la culture de bactéries FC/SF : rapport Coliformes fécaux/Streptocoques fécaux Le rapport coliformes fécaux/streptocoques fécaux proposé dès 1969. Excréments humains CF>SF Excréments d’animaux SF>CF Rapport CF/SF > 4 Rapport CF/SF< 0,7 pollution d’origine humaine pollution d’origine animale Peu fiable (différences du taux de survie ; variations en fonction du régime des individus) Méthodes indépendantes de banques de données : Approches basées sur la culture de bactéries Bifidobactéries fermentant le sorbitol Bifidobactéries présentes dans les fèces de l'homme et des porcs et parfois dans celles d’autres espèces animales. Les souches fermentant le sorbitol (ex Bifidobacterium adolescentis et B. breve) spécifiques de l’origine humaine. Présence de Bifidobactéries fermentant le sorbitol pollution fécale d’origine humaine. Facilement mises en évidence par culture sur un milieu HBSA (Human Bifid Sorbitol agar). Rapport (Bif tot / Bif sorbitol+) Rhodococcus coprophilus et Streptococcus bovis Rhodococcus coprophilus et Streptococcus bovis : deux espèces spécifiques de l’origine animale. Elles peuvent être mises en évidences en utilisant des milieux gélosés ou des tests en microplaques. Cependant, les temps d’incubation pour Rhocococcus sont relativement longs. Méthodes indépendantes de banques de données : Approches basées sur une amplification par PCR PCR ciblant une espèce bactérienne (ou un gène) spécifique d’une origine PCR ou PCRq (amorces spécifiques) Filtration Extraction de l’ADN à partir des microorganismes retenus sur le filtre Couples d’amorces décrits pour les différentes sources Ruminant (bovin) Humain Bactérie Bacteroidales Enterococcus (E. faecium, E. faecalis, E. hirae) Marqueur HF134 HF183 BACHum BT BV HuBac BacH HuBac1 HuM2 HUM3 Bf esp M66 M67 M68 M77 M81 M10 Bactérie Bacteroidales Marqueur CF128 CF193 CowBac2 BacR cowM2 cowM3 Rum2Bac RumB1 RumD1 RumD2 Bacbov1 Bacbov2 Bac2 Bac3 BoBac Enterococcus (E. mundtii, E. hirae) M15 M19 M40 M89 M90 M91 M93 M94 Bifidobacterium (B. adolescentis, B. dentium B. catenulatum) Bi-ADO Bi-DEN BiATg Escherichia coli B2 VIII/O81 Escherichia coli LTIIa HFB Faecalibacterium B2 VIII/O81 Methanobacter ruminantium Mrnif Faecalibacterium Methanobacter smithii Porc Bactérie Bacteroidales Marqueur PF163 PigBac2 Pig1Bac Pig2Bac Bifidobacterium Thermacidophilum GE35/GE 36 Méthanogènes Chien Bactérie Bacteroidales P23-2 Marqueur DF475 BacCan Cerf Bactérie Bacteroidales Marqueur EF990 Enterococcus casseliflavus M48 Mouette Bactérie Catellicoccus marimammalium Marqueur Gull2 Mnif Canard/oie Bactérie Bacteroidales Marqueur EF990 Desulfovibrio E2 Cheval Bactérie Bacteroidales Marqueur HoF597 HorseBac Poulet (volaille) Bactérie 12 marqueurs identifiés par métagénomique Marqueur Brevibacterium LA35 Méthodes indépendantes de banques de données : Approches basées sur une amplification par PCR PCR ciblant une espèce bactérienne (ou une gène) spécifique d’une origine Avantages: - Ne fait pas appel à une culture des bactéries - Ne nécessite pas de banque de donnée - Très rapide, très facilement accessible - Sensible (sinon possibilité de réaliser des enrichissements (culture, bioaccumulation ou “nested-PCR”)) - Nombreux marqueurs (et nombreuses cibles) Limites : - Présence d’inhibiteurs de la PCR - Il faut s’affranchir des variations entre l’évolution des indicateurs de contamination fécale (ou les pathogènes) et les bactéries utilisées comme cibles. - L’utilisation combinée de différents marqueurs = meilleure façon de prédire l’origine d’une pollution.
