Évaluation des points critiques en laboratoire de biologie

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feuillets deBiologie
VOL LIV N° 314 - SEPTEMBRE 2013
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ACCRÉDITATION Points critiques en bactériologie
Évaluation des points critiques
en laboratoire de biologie médicale :
l’exemple de la bactériologie clinique
J.-P. KLEIN1, M. HAMMAD2, J.-M. GARNIER3, N. HIDRI4, J.-F. CAROD5
ACCRÉDITATION Points critiques en bactériologie
I. - INTRODUCTION
L’examen bactériologique se caractérise par une com-
binaison de techniques manuelles et automatisées, mises
en œuvre pour analyser des micro-organismes vivants très
diversifiés en raison de leur grande plasticité génotypique
et phénotypique. Il en résulte des difficultés lors de l’iden-
tification des souches cliniques et de l’étude de la sensibilité
aux antibiotiques. L’évaluation des risques et l’identifica-
tion des points de vulnérabilité du processus analytique
permettent d’identifier les points critiques. Ces derniers
sont plus nombreux en bactériologie que dans d’autres
disciplines, en raison de spécificités liées à des manipula-
tions importantes sur des organismes vivants.
L’analyse et la gestion des risques se placent dans une
démarche d’anticipation plutôt que de correction. Une
fois le diagnostic effectué, il faut mettre en place un plan
de prévention afin de réduire la probabilité d’apparition
des dysfonctionnements et limiter ainsi leur criticité.
Une revue de la littérature a permis de constater
les lacunes dans la connaissance de l’évaluation des points
critiques du processus analytique. Les publications
consacrées à cette thématique sont rares (1-2), alors que
différents travaux ont été publiés pour les processus
préanalytiques et postanalytiques (3-8).
L’objectif de cet article est d’identifier les causes qui
précèdent ou président les points critiques - ou les points
sensibles - des différents processus et, le cas échéant, d’in-
diquer les conduites à tenir pour s’assurer de la qualité des
examens bactériologiques et de la fiabilité des résultats.
1
Laboratoire Syndibio, Commercy, [e-mail]
2Laboratoire Biocentre, Tourcoing.
3 Laboratoire Bioxa, Reims.
4
Service de Bactériologie-Virologie-Hygiène, CHU Dupuytren,
Limoges.
5Centre Hospitalier, Saint-Claude.
résumé
L’analyse et la gestion des risques liés aux processus permettent d’anticiper les défaillances par la mise en œuvre d’actions
préventives. L’objet de cet article est de présenter une méthodologie opérationnelle au quotidien pour identifier les
points critiques en présentant des cas pratiques aussi bien pour les techniques manuelles que pour les techniques
automatisées. Après un rappel de la gestion des risques et des exigences réglementaires et normatives, des exemples de
points critiques en bactériologie seront présentés et discutés en portant une attention particulière à l’analyse de la
concordance pour les techniques manuelles : cytologie urinaire, examen direct, lecture des concentrations minimales
inhibitrices. Cette analyse systémique est essentielle car elle permet d’améliorer la maîtrise des points critiques et la
standardisation des pratiques professionnelles.
mots-clés :analyse des risques, point critique, criticité, accréditation, microbiologie.

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II. - LE CONTEXTE NORMATIF
La lecture attentive de la norme ISO 15189 (9) et des
documents du Cofrac associés ont permis de recenser
les exigences et les préconisations liées aux analyses des
bénéfices / risques.
A) Norme ISO 15189 août 2007
§ 4. 11. 1 NOTE 1 : « Outre la revue des procédures opéra-
tionnelles, les actions préventives peuvent inclure l’analyse des
données, y compris les analyses de tendances et de risques, et
l’assurance externe de la qualité. »
§ 5. 6. 1 : « Il convient de veiller particulièrement à éliminer
les erreurs susceptibles de se produire dans le processus de traitement
des échantillons, des prescriptions, des analyses, des comptes rendus,
etc. »
§ 5. 8. 8 : « Afin de répondre aux besoins cliniques locaux, le
laboratoire doit déterminer les limites critiques et leurs seuils d’alerte
ou critiques. »
B) Norme ISO 15189 décembre 2012
§ 4. 11 : Actions préventives
NOTE : « Outre la revue des procédures opérationnelles, les
actions préventives peuvent inclure l’analyse des données, y com-
pris les analyses des tendances et des risques et l’évaluation externe
de la qualité (essais d’aptitude) » (10).
§ 4. 14. 6 : Gestion des risques
« Le laboratoire doit évaluer l’impact des processus de travail et
défaillances potentielles sur la sécurité des résultats des examens et
doit modifier les processus pour réduire ou éliminer les risques iden-
tifiés, et documenter les décisions et les actions menées. »
C) SH REF 02
§ 5. 3. 11 : « Le laboratoire de biologie médicale (LBM) met en
œuvre une vérification de toutes les saisies manuelles des données
électroniques/informatisées réalisée systématiquement ou à fré-
quence définie, selon une analyse bénéfice/risque, en fonction des
types d’opérations » (11).
§ 5. 6. 1 : « Le LBM met en œuvre des CIQ sur plusieurs ni-
veaux de concentration, en début et en fin de série ou à fréquence
définie en fonction d’une analyse bénéfice/risque des spécifications
des méthodes ou en cas d’intervention sur le processus analytique.
Des seuils d’alarme et d’action sont à définir. »
§ 5. 6. 2 : « Il identifie les facteurs susceptibles d’influencer le
résultat de mesure (analyse de risque). »
Par ailleurs, les guides techniques d’accréditation (SH
GTA 01, 06 et 09) (12-14) mentionnent également les
modalités de validation des documents en fonction des
risques et de la criticité des informations transmises.
III. - TERMES ET DÉFINITIONS
Selon le dictionnaire de la qualité, « le point critique est
un élément physique ou temporel présentant un risque dont l’effet
est inacceptable du fait de son occurrence ou par l’importance du
phénomène. La criticité est un niveau de non-sécurité pouvant être
atteint en rendant un évènement ou l’utilisation d’un produit dan-
gereux » (15).
Le risque avéré, statistiquement évalué, débouche sur
la notion de probabilité contrairement au risque potentiel.
Ce dernier relève de la précaution, alors que le risque
avéré relève de la prévention. Si le risque est un évènement
néfaste contre lequel on peut se prémunir, en revanche,
l’aléa est une incertitude due au hasard. L’aléa est inhé-
rent à l’acte médical. Exploité de façon constructive,
prévenu par l’application du principe de précaution, l’aléa
se rapproche de l’évènement indésirable (16).
L’erreur est une appréciation inexacte, soit de qualité,
soit de l’existence d’un fait (erreur de fait). L’erreur existe
indépendamment de la faute et peut être considérée
comme un facteur d’amélioration et de progrès. C’est la
sonnette d’alarme placée sur les processus de réalisation.
Il reste que des facteurs financiers et de rendement, ajoutés
à des lacunes dans la formation du personnel peuvent
augmenter le risque toujours présent d’erreur.
Enfin, notons surtout que les points sensibles consti-
tuent le plus souvent des opportunités importantes d’amé-
lioration.
IV. - MÉTHODOLOGIE
Les points critiques peuvent être décelés dans un
système, dans un processus par l’Analyse des Méthodes de
Défaillance, de leurs Effets et, de leur Criticité (AMDEC),
ou par le système d'analyse des dangers et points critiques
pour leur maîtrise, en abrégé système HACCP (Hazard
Analysis Critical Control Point) mis en œuvre pour la maîtrise
de la sécurité sanitaire des denrées alimentaires.
En bactériologie comme en biologie médicale, on uti-
lise classiquement la méthode des 5 M (méthode, moyen,
matière première, milieu, main-d’œuvre) ou diagramme
causes-effets d’Ishikawa (17). La gestion et l’analyse des
risques comme moyen pour identifier les points critiques
est un facteur de la culture qualité - sécurité. Pour chaque
processus, il est nécessaire de réaliser une analyse des
risques au minimum par la méthode des 5 M, mais il est
possible de rajouter les M de « management », de « main-
tenance » et même de « monnaie », car la norme ISO
15189 mentionne l’efficience. Cet outil permet de classer
par famille les causes d’un dysfonctionnement liées aux
points de vulnérabilité. La figure 1 visualise l’analyse des
risques et illustre le poids de la méthode des 5 M appliquée
au laboratoire de bactériologie.
Il appartient au laboratoire de biologie médicale (LBM)
d’utiliser les textes professionnels (10, 18, 19), les référen-
tiels réglementaires (20-21), en appliquant les recomman-
dations des sociétés savantes (Société Française de
Microbiologie, SFM) et des instances publiques : Haute
Autorité de Santé, (HAS, ex-ANAES), Agence Nationale
de Sécurité du Médicament et des produits de santé
(ANSM, ex-AFSSAPS).
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Les points critiques sont susceptibles d’être à l’origine
d’écarts critiques. Le document du Cofrac SH REF 05 (22)
définit l’écart critique comme un écart dont le résultat met
en cause la fiabilité des résultats ou l’aptitude du système
de management à maintenir le niveau de qualité des pres-
tations d’évaluation de la conformité. L’écart peut avoir
un effet avéré, quantifiable par l’évaluateur, ou peut pré-
senter un risque induit important sur le niveau de qualité
des prestations. Il peut être d’ordre technique et/ou or-
ganisationnel. Le SH GTA 04 (23) ainsi que le « Quamic »
(24) proposent des outils pour la maîtrise des risques.
Point clé. L’analyse des risques a pour but de surveiller
l’ensemble des processus du préanalytique au postana-
lytique. Ils sont souvent situés à des interfaces entre les
processus ou dans les processus faisant intervenir de
nombreux opérateurs et/ou matériels. La maîtrise des
points critiques est basée sur des faits, des preuves ou
des données scientifiques, accompagnés d’un jugement
professionnel fondé sur l’expérience des acteurs. Les
points critiques doivent être identifiés pour hiérarchiser
les risques encourus et mettre en œuvre un plan d’ac-
tion en assurant son suivi.
V. - LES CIBLES DE LA GESTION
DES RISQUES
Le système d’analyse des points critiques doit concer-
ner, en premier lieu, les étapes clés des processus préana-
lytiques, analytiques et postanalytiques, mais aussi des
processus support et de management. Pour ne rien ou-
blier et gérer efficacement les risques, il est intéressant
d’établir une check-list ou tableau de bord (Tableau I).
Point clé. Les différentes phases de ces processus doi-
vent être identifiées et organisées. Leur maîtrise parti-
cipe à diminuer la composante d’incertitude des
résultats par le laboratoire. Si le diagramme des 5 M a
pour objectif de mettre en évidence les points critiques,
en revanche l’élaboration de la check-list vise à donner
les lignes directrices pour gérer et maîtriser la vulnéra-
bilité des différents processus. Les audits permettent de
vérifier que les dispositions prises sont bien appliquées.
VI. - LE PROCESSUS PRÉANALYTIQUE
En ce qui concerne le processus préanalytique, il est im-
portant de rappeler que les points critiques sont liés aux
modalités de prélèvement (localisation, règles de l’art),
aux délais d’acheminement et de conservation des échan-
tillons dans de bonnes conditions et, bien entendu, à la
prise en compte du contexte clinique (prélèvement à visée
épidémiologique ou diagnostique). La qualité des prélè-
vements conditionne celle du diagnostic. Pour des prélè-
vements particuliers comme ceux de type pied diabétique,
il faut veiller à former l’opérateur : laver au sérum physio-
logique, aspirer les sérosités après avoir introduit un cath-
lon dans le pertuis ou le trajet de la fistule (25). Les
écouvillons floqués optimisent le recueil ainsi que le relar-
gage des bactéries contenues dans l’échantillon (jusqu’à
90 % de l’échantillon clinique récupéré contre 30 % avec
des écouvillons standard).
La majorité des bactéries pathogènes chez l’homme
sont des espèces mésophiles qui se développent à des tem-
pératures comprises entre 25 et 40°C et un optimum de
35 ± 2°C (26-27). Le froid réduit simplement la cinétique
de multiplication bactérienne. Dès que les conditions de
Fig. 1 - Analyse des risques analytiques appliquée à la bactériologie clinique.
Matière première
Respect des conditions préanalytiques
(recueil, acheminement,
critères d’acceptation,
renseignements cliniques,
contamination)
Enregistrement
Conservation des souches
Milieu
Consignes de sécurité, équipement
de protection individuelle
Environnement de travail
(éclairage, ambiance, température)
Stockage des réactifs
Main d’œuvre
Qualification, Formation continue
Habilitation
Réhabilitation
Évaluation
Communication
Échantillon
primaire Rapport d’analyse
Satisfaction du client
Matériel
Raccordement métrologique
Vérifications / validations
Réactifs, géloses
PSM (maintenance)
Connexions automates-SIL
Gestion du SIL
Méthode
Respect des procédures
Inoculum standardisé
Durée d’incubation
Lectures microscopiques
Tests d’orientation et de confirmation
Interface J0/J1/Jn
Limite des tests (spécificité/sensibilité)
CIQ/EEQ
Réalisation des antibiogrammes
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température redeviennent favorables à leur développe-
ment, les micro-organismes reprennent leur croissance.
Les anaérobies ainsi que certains genres bactériens comme
Neisseria et Haemophilus, comportent des souches sensibles
aux variations de température qui nécessitent un transport
à température ambiante (le mieux est d’utiliser des mi-
lieux de transport, Stuart ou Amies, par exemple, à condi-
tion que la durée de transport ne dépasse pas 24 heures).
Le tableau II donne quelques exemples pour sécuriser le
processus préanalytique.
Point clé. Les milieux de transport réduisent la cytolyse
et autorisent un délai plus important entre le prélève-
ment et la mise en culture (exemple : le recueil des
urines sur des flacons avec de l’acide borique). Ils sont
donc préconisés pour tout délai d’acheminement dé-
passant 2 heures. La majorité des bactéries pathogènes
de l’homme sont des espèces mésophiles. À chaque fois
que cela est possible, et tout particulièrement dans les
localisations inhabituelles, le prélèvement bactériolo-
gique devra être fait par un microbiologiste (pour les
laboratoires privés), qui prendra le temps de s’enquérir
de l’histoire clinique du patient, ainsi que d’une éven-
tuelle antibiothérapie préalable. Les prélèvements sus-
ceptibles de contenir des anaérobies doivent être
transportés dans des milieux adaptés et à température
ambiante. Pour les micro-organismes à développement
intracellulaire (ex. : Chlamydia), il est impératif de récu-
pérer des cellules.
VII. - LE PROCESSUS ANALYTIQUE
Pour le processus analytique, il est important de réaliser
une analyse des concordances entre les différents opéra-
teurs pour les examens biologiques réalisés par des tech-
niques manuelles, notamment les lectures microscopiques
Processus Points critiques Comment les maîtriser
Enregistrement des dossiers Vérifications des ordonnances
Vérifications des saisies informatiques
Renseignements cliniques (objectif diagnostique,
traitement et son suivi, épidémiologie, etc.)
Recherche active des renseignements cliniques
Information des préleveurs internes et externes sur les moda-
lités de prélèvement et diffusion du manuel de prélèvement
Spécifications adaptées à chaque type de prélèvement
Respect des contraintes préanalytiques (conditionnements
adaptés, emballage résistant à 95 kPa, UN 3373)
Modalités de prélèvements
Transport des échantillons
Variabilité inter-opérateurs liée
au versant manuel des tâches
Habilitation du personnel
Évaluation des pratiques professionnelles
Entretien individuel, test de maintien des compétences
Maîtrise des processus analytiques :
- isolement des souches cliniques
- tests d’orientation et d’identification
- antibiogrammes
Analyse des concordances :
- ensemencement et charge de l’inoculum, lecture
des cultures
- lectures des examens directs (coproculture,
prélèvement pulmonaire, Gram, May-Grünwald-Giemsa,
Ziehl-Neelsen)
- lecture des antibiogrammes et des E-tests
- contrôles qualité (CIQ, EEQ, CNQ)
Minimiser les contaminations Utilisation de matériel à usage unique Équipement individuel et collectif de protection,
utilisation d’un PSM
Maîtrise de la métrologie Raccordement métrologique
Système informatique du laboratoire (SIL)
Vérification de la saisie des résultats
(scanner des résultats / saisie manuelle)
Convention de preuve (réception des résultats par les
prescripteurs)
Contrôle des saisies
Vérification des interfaces entre les systèmes
informatiques connectés
Maîtrise de la vérification technique
(validation technique) Formation des techniciens
Maîtrise de la validation biologique Formation des biologistes
Harmonisation des avis et commentaires
Délais de rendu des résultats et critères d’alerte Étude de satisfaction / Indicateurs
Signalement interne et externe des bactéries
multirésistantes (BMR) et expertise biologique Procédure de signalement Prestation de conseils
Résultats urgents Grille des critères d’alerte
Préanalytique
AnalytiquePostanalytique
Tableau I - Check-list des points critiques des différents processus.
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(les champs couverts par les couples objectifs/oculaires de
marque ou de modèle différents peuvent varier très sensi-
blement pour un même grossissement). Le LBM doit
déterminer les enregistrements nécessaires, pour apporter
la preuve que les processus de réalisation des examens
biologiques pour toute la chaîne depuis le prélèvement
jusqu’à l’analyse sont réalisés conformément aux exi-
gences de l’assurance qualité.
Les techniques automatisées utilisées en bactériologie
sont, d’une manière générale, robustes. Plutôt que de
s’acharner sur des tests de répétabilité dispendieux, certes
nécessaires, il vaut mieux se focaliser sur la vérification
continue avec des contrôles internes de qualité (CIQ).
Plus encore, il est recommandé de porter une grande
attention aux différentes étapes des techniques manuelles
qui comportent des points sensibles et critiques en ciblant
les tests d’orientation et de confirmation, mais également
en considérant l’observation macroscopique des divers
échantillons biologiques. La morphologie et le caractère
monomorphe ou polymorphe des cultures bactériennes,
ainsi que la notion de prédominance, devront impérative-
ment être pris en compte.
Point clé. Il faut veiller à bien organiser le triptyque ana-
lytique : observation macroscopique des prélèvements,
isolement des souches cliniques, suivi des tests d’orien-
tation (Gram, oxydase, catalase, mobilité, métabolisme
respiratoire, etc.) et de confirmation (tests phénoty-
piques ou génotypiques, antibiogrammes).
A) Feuille de travail
La composition de la feuille de travail, ou feuille de pail-
lasse, doit être bien structurée. Cet enregistrement joue
un rôle important dans la transmission des informations
entre les différents opérateurs. Pourront y figurer les don-
nées suivantes : l’heure du recueil, le sexe du patient, les
critères d’acceptation, les renseignements cliniques (nature
et origine du prélèvement, traitement en cours), l’aide à
l’interprétation pour l’opérateur, la traçabilité des opéra-
teurs à J0/J1/Jn; la spécialité du prescripteur est également
une donnée intéressante (urologue, néphrologue, infec-
tiologue, etc.). Toutes ces données sont très utiles dans le
cas d’une étude de traçabilité d’un dossier.
Tableau II - Exemples de conditions préanalytiques à respecter en bactériologie incluant les recommandations du Rémic 2010.
Paramètres et
volumes recommandés
Fréquence d’analyse
et particularités
Température
de transport
ou de conservation
Délai d’analyse Matériel de recueil
de prélèvement habituel
Coproculture
3 noix de selles
Continue
Urgence pour le SHU
T ambiante
ou 5 ±3°C
< 2 heures
ou < 12 heures Flacon coproculture
ECBU
20 à 30 ml d’urine
Continue
Urine du matin
ou après 4 h de séjour
dans la vessie
5 ± 3°C
T ambiante
< 12 heures
< 2 heures Flacon stérile
BK dans les urines
Totalité des urines
de la 1ère miction
Continue
(recueil 3 j de suite) 5 ± 3°C < 24 heures Flacon stérile 500 ml
Examen d’un pus
ou écoulements
Continue
Prélèvement
à la seringue conseillé
T ambiante < 2 heures Seringue fermée
ou 2 écouvillons
Hémoculture
Adulte : 10 ml de sang
total minimum par flacon
Enfant : 1-2 ml de sang
total par flacon en
fonction du poids
Continue
2 ou 3 hémocultures
par 24 heures
T ambiante < 12 heures
Flacons pour hémocultures
(1 aérobie et 1 anaérobie),
ou pédiatrique, levures, BK
Bactéries anaérobies
Continue
Bactéries sensibles à
l’oxygène et fragiles à 4°C
T ambiante < 2 heures Seringue fermée
et purgée d’air
NOTE : L’utilisation de milieux de transport permet d’allonger de façon notable les délais d’acheminement et par conséquent de mieux maîtriser les condi-
tions préanalytiques. Les milieux de transport les plus courant sont : Stuart (le tampon glycérophosphate permet la croissance des bactéries à Gram négatif)
et Amies (le tampon phosphate inorganique empêche le développement des bactéries à Gram négatif) : certains milieux d’Amies modifiés ont un potentiel
redox approprié permettant une survie accrue des anaérobies et des bactéries de culture difficile. Le milieu Cary Blair (Stuart modifié) assure le transport
et la conservation des bactéries entéropathogènes (E. coli, Shigella, Salmonella, Yersinia, etc.).
SHU : syndrome hémolytique et urémique.
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