Évaluation des points critiques en laboratoire de biologie
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ACCRÉDITATION Points critiques en bactériologie Évaluation des points critiques en laboratoire de biologie médicale : l’exemple de la bactériologie clinique J.-P. KLEIN1, M. HAMMAD2, J.-M. GARNIER3, N. HIDRI4, J.-F. CAROD5 résumé L’analyse et la gestion des risques liés aux processus permettent d’anticiper les défaillances par la mise en œuvre d’actions préventives. L’objet de cet article est de présenter une méthodologie opérationnelle au quotidien pour identifier les points critiques en présentant des cas pratiques aussi bien pour les techniques manuelles que pour les techniques automatisées. Après un rappel de la gestion des risques et des exigences réglementaires et normatives, des exemples de points critiques en bactériologie seront présentés et discutés en portant une attention particulière à l’analyse de la concordance pour les techniques manuelles : cytologie urinaire, examen direct, lecture des concentrations minimales inhibitrices. Cette analyse systémique est essentielle car elle permet d’améliorer la maîtrise des points critiques et la standardisation des pratiques professionnelles. e i p o c r u e t au I. - INTRODUCTION L’examen bactériologique se caractérise par une combinaison de techniques manuelles et automatisées, mises en œuvre pour analyser des micro-organismes vivants très diversifiés en raison de leur grande plasticité génotypique et phénotypique. Il en résulte des difficultés lors de l’identification des souches cliniques et de l’étude de la sensibilité aux antibiotiques. L’évaluation des risques et l’identification des points de vulnérabilité du processus analytique permettent d’identifier les points critiques. Ces derniers sont plus nombreux en bactériologie que dans d’autres disciplines, en raison de spécificités liées à des manipulations importantes sur des organismes vivants. Une revue de la littérature a permis de constater les lacunes dans la connaissance de l’évaluation des points critiques du processus analytique. Les publications consacrées à cette thématique sont rares (1-2), alors que différents travaux ont été publiés pour les processus préanalytiques et postanalytiques (3-8). L’objectif de cet article est d’identifier les causes qui précèdent ou président les points critiques - ou les points sensibles - des différents processus et, le cas échéant, d’indiquer les conduites à tenir pour s’assurer de la qualité des examens bactériologiques et de la fiabilité des résultats. Laboratoire Syndibio, Commercy, [email protected] Laboratoire Biocentre, Tourcoing. 3 Laboratoire Bioxa, Reims. 4 Service de Bactériologie-Virologie-Hygiène, CHU Dupuytren, Limoges. 5 Centre Hospitalier, Saint-Claude. 1 L’analyse et la gestion des risques se placent dans une démarche d’anticipation plutôt que de correction. Une fois le diagnostic effectué, il faut mettre en place un plan de prévention afin de réduire la probabilité d’apparition des dysfonctionnements et limiter ainsi leur criticité. 2 - 45 - feuillets de Biologie VOL LIV N° 314 - SEPTEMBRE 2013 ACCRÉDITATION Points critiques en bactériologie mots-clés : analyse des risques, point critique, criticité, accréditation, microbiologie. II. - LE CONTEXTE NORMATIF La lecture attentive de la norme ISO 15189 (9) et des documents du Cofrac associés ont permis de recenser les exigences et les préconisations liées aux analyses des bénéfices / risques. A) Norme ISO 15189 août 2007 § 4. 11. 1 NOTE 1 : « Outre la revue des procédures opérationnelles, les actions préventives peuvent inclure l’analyse des données, y compris les analyses de tendances et de risques, et l’assurance externe de la qualité. » § 5. 6. 1 : « Il convient de veiller particulièrement à éliminer les erreurs susceptibles de se produire dans le processus de traitement des échantillons, des prescriptions, des analyses, des comptes rendus, etc. » phénomène. La criticité est un niveau de non-sécurité pouvant être atteint en rendant un évènement ou l’utilisation d’un produit dangereux » (15). Le risque avéré, statistiquement évalué, débouche sur la notion de probabilité contrairement au risque potentiel. Ce dernier relève de la précaution, alors que le risque avéré relève de la prévention. Si le risque est un évènement néfaste contre lequel on peut se prémunir, en revanche, l’aléa est une incertitude due au hasard. L’aléa est inhérent à l’acte médical. Exploité de façon constructive, prévenu par l’application du principe de précaution, l’aléa se rapproche de l’évènement indésirable (16). L’erreur est une appréciation inexacte, soit de qualité, soit de l’existence d’un fait (erreur de fait). L’erreur existe indépendamment de la faute et peut être considérée comme un facteur d’amélioration et de progrès. C’est la sonnette d’alarme placée sur les processus de réalisation. Il reste que des facteurs financiers et de rendement, ajoutés à des lacunes dans la formation du personnel peuvent augmenter le risque toujours présent d’erreur. e i p o c r u e t u a § 5. 8. 8 : « Afin de répondre aux besoins cliniques locaux, le laboratoire doit déterminer les limites critiques et leurs seuils d’alerte ou critiques. » B) Norme ISO 15189 décembre 2012 § 4. 11 : Actions préventives NOTE : « Outre la revue des procédures opérationnelles, les actions préventives peuvent inclure l’analyse des données, y compris les analyses des tendances et des risques et l’évaluation externe de la qualité (essais d’aptitude) » (10). § 4. 14. 6 : Gestion des risques « Le laboratoire doit évaluer l’impact des processus de travail et défaillances potentielles sur la sécurité des résultats des examens et doit modifier les processus pour réduire ou éliminer les risques identifiés, et documenter les décisions et les actions menées. » ACCRÉDITATION Points critiques en bactériologie C) SH REF 02 § 5. 3. 11 : « Le laboratoire de biologie médicale (LBM) met en œuvre une vérification de toutes les saisies manuelles des données électroniques/informatisées réalisée systématiquement ou à fréquence définie, selon une analyse bénéfice/risque, en fonction des types d’opérations » (11). § 5. 6. 1 : « Le LBM met en œuvre des CIQ sur plusieurs niveaux de concentration, en début et en fin de série ou à fréquence définie en fonction d’une analyse bénéfice/risque des spécifications des méthodes ou en cas d’intervention sur le processus analytique. Des seuils d’alarme et d’action sont à définir. » § 5. 6. 2 : « Il identifie les facteurs susceptibles d’influencer le résultat de mesure (analyse de risque). » Par ailleurs, les guides techniques d’accréditation (SH GTA 01, 06 et 09) (12-14) mentionnent également les modalités de validation des documents en fonction des risques et de la criticité des informations transmises. III. - TERMES ET DÉFINITIONS Selon le dictionnaire de la qualité, « le point critique est un élément physique ou temporel présentant un risque dont l’effet est inacceptable du fait de son occurrence ou par l’importance du Enfin, notons surtout que les points sensibles constituent le plus souvent des opportunités importantes d’amélioration. IV. - MÉTHODOLOGIE Les points critiques peuvent être décelés dans un système, dans un processus par l’Analyse des Méthodes de Défaillance, de leurs Effets et, de leur Criticité (AMDEC), ou par le système d'analyse des dangers et points critiques pour leur maîtrise, en abrégé système HACCP (Hazard Analysis Critical Control Point) mis en œuvre pour la maîtrise de la sécurité sanitaire des denrées alimentaires. En bactériologie comme en biologie médicale, on utilise classiquement la méthode des 5 M (méthode, moyen, matière première, milieu, main-d’œuvre) ou diagramme causes-effets d’Ishikawa (17). La gestion et l’analyse des risques comme moyen pour identifier les points critiques est un facteur de la culture qualité - sécurité. Pour chaque processus, il est nécessaire de réaliser une analyse des risques au minimum par la méthode des 5 M, mais il est possible de rajouter les M de « management », de « maintenance » et même de « monnaie », car la norme ISO 15189 mentionne l’efficience. Cet outil permet de classer par famille les causes d’un dysfonctionnement liées aux points de vulnérabilité. La figure 1 visualise l’analyse des risques et illustre le poids de la méthode des 5 M appliquée au laboratoire de bactériologie. Il appartient au laboratoire de biologie médicale (LBM) d’utiliser les textes professionnels (10, 18, 19), les référentiels réglementaires (20-21), en appliquant les recommandations des sociétés savantes (Société Française de Microbiologie, SFM) et des instances publiques : Haute Autorité de Santé, (HAS, ex-ANAES), Agence Nationale de Sécurité du Médicament et des produits de santé (ANSM, ex-AFSSAPS). - 46 - feuillets de Biologie VOL LIV N° 314 - SEPTEMBRE 2013 Points critiques en bactériologie Matière première Respect des conditions préanalytiques (recueil, acheminement, critères d’acceptation, renseignements cliniques, contamination) Enregistrement Conservation des souches Matériel Raccordement métrologique Vérifications / validations Réactifs, géloses PSM (maintenance) Connexions automates-SIL Gestion du SIL Méthode Respect des procédures Inoculum standardisé Durée d’incubation Lectures microscopiques Tests d’orientation et de confirmation Interface J0/J1/Jn Limite des tests (spécificité/sensibilité) CIQ/EEQ Réalisation des antibiogrammes Rapport d’analyse Satisfaction du client Échantillon primaire Milieu Consignes de sécurité, équipement de protection individuelle Environnement de travail (éclairage, ambiance, température) Stockage des réactifs Main d’œuvre Qualification, Formation continue Habilitation Réhabilitation Évaluation Communication Fig. 1 - Analyse des risques analytiques appliquée à la bactériologie clinique. e i p o c r u e t au Les points critiques sont susceptibles d’être à l’origine d’écarts critiques. Le document du Cofrac SH REF 05 (22) définit l’écart critique comme un écart dont le résultat met en cause la fiabilité des résultats ou l’aptitude du système de management à maintenir le niveau de qualité des prestations d’évaluation de la conformité. L’écart peut avoir un effet avéré, quantifiable par l’évaluateur, ou peut présenter un risque induit important sur le niveau de qualité des prestations. Il peut être d’ordre technique et/ou organisationnel. Le SH GTA 04 (23) ainsi que le « Quamic » (24) proposent des outils pour la maîtrise des risques. Point clé. Les différentes phases de ces processus doivent être identifiées et organisées. Leur maîtrise participe à diminuer la composante d’incertitude des résultats par le laboratoire. Si le diagramme des 5 M a pour objectif de mettre en évidence les points critiques, en revanche l’élaboration de la check-list vise à donner les lignes directrices pour gérer et maîtriser la vulnérabilité des différents processus. Les audits permettent de vérifier que les dispositions prises sont bien appliquées. Point clé. L’analyse des risques a pour but de surveiller l’ensemble des processus du préanalytique au postanalytique. Ils sont souvent situés à des interfaces entre les processus ou dans les processus faisant intervenir de nombreux opérateurs et/ou matériels. La maîtrise des points critiques est basée sur des faits, des preuves ou des données scientifiques, accompagnés d’un jugement professionnel fondé sur l’expérience des acteurs. Les points critiques doivent être identifiés pour hiérarchiser les risques encourus et mettre en œuvre un plan d’action en assurant son suivi. V. - LES CIBLES DE LA GESTION DES RISQUES Le système d’analyse des points critiques doit concerner, en premier lieu, les étapes clés des processus préanalytiques, analytiques et postanalytiques, mais aussi des processus support et de management. Pour ne rien oublier et gérer efficacement les risques, il est intéressant d’établir une check-list ou tableau de bord (Tableau I). En ce qui concerne le processus préanalytique, il est important de rappeler que les points critiques sont liés aux modalités de prélèvement (localisation, règles de l’art), aux délais d’acheminement et de conservation des échantillons dans de bonnes conditions et, bien entendu, à la prise en compte du contexte clinique (prélèvement à visée épidémiologique ou diagnostique). La qualité des prélèvements conditionne celle du diagnostic. Pour des prélèvements particuliers comme ceux de type pied diabétique, il faut veiller à former l’opérateur : laver au sérum physiologique, aspirer les sérosités après avoir introduit un cathlon dans le pertuis ou le trajet de la fistule (25). Les écouvillons floqués optimisent le recueil ainsi que le relargage des bactéries contenues dans l’échantillon (jusqu’à 90 % de l’échantillon clinique récupéré contre 30 % avec des écouvillons standard). La majorité des bactéries pathogènes chez l’homme sont des espèces mésophiles qui se développent à des températures comprises entre 25 et 40°C et un optimum de 35 ± 2°C (26-27). Le froid réduit simplement la cinétique de multiplication bactérienne. Dès que les conditions de - 47 - feuillets de Biologie VOL LIV N° 314 - SEPTEMBRE 2013 ACCRÉDITATION Points critiques en bactériologie VI. - LE PROCESSUS PRÉANALYTIQUE Tableau I - Check-list des points critiques des différents processus. Processus Points critiques Comment les maîtriser Vérifications des ordonnances Vérifications des saisies informatiques Préanalytique Enregistrement des dossiers Recherche active des renseignements cliniques Information des préleveurs internes et externes sur les modalités de prélèvement et diffusion du manuel de prélèvement Spécifications adaptées à chaque type de prélèvement Respect des contraintes préanalytiques (conditionnements adaptés, emballage résistant à 95 kPa, UN 3373) Renseignements cliniques (objectif diagnostique, traitement et son suivi, épidémiologie, etc.) Modalités de prélèvements Transport des échantillons Habilitation du personnel Évaluation des pratiques professionnelles Entretien individuel, test de maintien des compétences ACCRÉDITATION Points critiques en bactériologie Postanalytique Analytique Variabilité inter-opérateurs liée au versant manuel des tâches e i p o c r u e t au Maîtrise des processus analytiques : - isolement des souches cliniques - tests d’orientation et d’identification - antibiogrammes Analyse des concordances : - ensemencement et charge de l’inoculum, lecture des cultures - lectures des examens directs (coproculture, prélèvement pulmonaire, Gram, May-Grünwald-Giemsa, Ziehl-Neelsen) - lecture des antibiogrammes et des E-tests - contrôles qualité (CIQ, EEQ, CNQ) Minimiser les contaminations Utilisation de matériel à usage unique Équipement individuel et collectif de protection, utilisation d’un PSM Maîtrise de la métrologie Raccordement métrologique Système informatique du laboratoire (SIL) Vérification de la saisie des résultats (scanner des résultats / saisie manuelle) Convention de preuve (réception des résultats par les prescripteurs) Contrôle des saisies Vérification des interfaces entre les systèmes informatiques connectés Maîtrise de la vérification technique (validation technique) Formation des techniciens Maîtrise de la validation biologique Formation des biologistes Harmonisation des avis et commentaires Délais de rendu des résultats et critères d’alerte Étude de satisfaction / Indicateurs Signalement interne et externe des bactéries multirésistantes (BMR) et expertise biologique Procédure de signalement Prestation de conseils Résultats urgents Grille des critères d’alerte température redeviennent favorables à leur développement, les micro-organismes reprennent leur croissance. Les anaérobies ainsi que certains genres bactériens comme Neisseria et Haemophilus, comportent des souches sensibles aux variations de température qui nécessitent un transport à température ambiante (le mieux est d’utiliser des milieux de transport, Stuart ou Amies, par exemple, à condition que la durée de transport ne dépasse pas 24 heures). Le tableau II donne quelques exemples pour sécuriser le processus préanalytique. Point clé. Les milieux de transport réduisent la cytolyse et autorisent un délai plus important entre le prélèvement et la mise en culture (exemple : le recueil des urines sur des flacons avec de l’acide borique). Ils sont donc préconisés pour tout délai d’acheminement dépassant 2 heures. La majorité des bactéries pathogènes de l’homme sont des espèces mésophiles. À chaque fois que cela est possible, et tout particulièrement dans les localisations inhabituelles, le prélèvement bactériologique devra être fait par un microbiologiste (pour les laboratoires privés), qui prendra le temps de s’enquérir de l’histoire clinique du patient, ainsi que d’une éventuelle antibiothérapie préalable. Les prélèvements susceptibles de contenir des anaérobies doivent être transportés dans des milieux adaptés et à température ambiante. Pour les micro-organismes à développement intracellulaire (ex. : Chlamydia), il est impératif de récupérer des cellules. VII. - LE PROCESSUS ANALYTIQUE Pour le processus analytique, il est important de réaliser une analyse des concordances entre les différents opérateurs pour les examens biologiques réalisés par des techniques manuelles, notamment les lectures microscopiques - 48 - feuillets de Biologie VOL LIV N° 314 - SEPTEMBRE 2013 Points critiques en bactériologie Tableau II - Exemples de conditions préanalytiques à respecter en bactériologie incluant les recommandations du Rémic 2010. Paramètres et volumes recommandés Température de transport ou de conservation Fréquence d’analyse et particularités Délai d’analyse Matériel de recueil de prélèvement habituel Coproculture 3 noix de selles Continue Urgence pour le SHU T ambiante ou 5 ± 3°C < 2 heures ou < 12 heures Flacon coproculture ECBU 20 à 30 ml d’urine Continue Urine du matin ou après 4 h de séjour dans la vessie 5 ± 3°C T ambiante < 12 heures < 2 heures Flacon stérile BK dans les urines Totalité des urines de la 1ère miction Continue (recueil 3 j de suite) 5 ± 3°C < 24 heures Flacon stérile 500 ml Examen d’un pus ou écoulements Continue Prélèvement à la seringue conseillé T ambiante < 2 heures Seringue fermée ou 2 écouvillons Hémoculture Adulte : 10 ml de sang total minimum par flacon Enfant : 1-2 ml de sang total par flacon en fonction du poids Continue 2 ou 3 hémocultures par 24 heures T ambiante < 12 heures Flacons pour hémocultures (1 aérobie et 1 anaérobie), ou pédiatrique, levures, BK Bactéries anaérobies Continue Bactéries sensibles à l’oxygène et fragiles à 4°C T ambiante < 2 heures Seringue fermée et purgée d’air e i p o c r u e t au (les champs couverts par les couples objectifs/oculaires de marque ou de modèle différents peuvent varier très sensiblement pour un même grossissement). Le LBM doit déterminer les enregistrements nécessaires, pour apporter la preuve que les processus de réalisation des examens biologiques pour toute la chaîne depuis le prélèvement jusqu’à l’analyse sont réalisés conformément aux exigences de l’assurance qualité. Les techniques automatisées utilisées en bactériologie sont, d’une manière générale, robustes. Plutôt que de s’acharner sur des tests de répétabilité dispendieux, certes nécessaires, il vaut mieux se focaliser sur la vérification continue avec des contrôles internes de qualité (CIQ). Plus encore, il est recommandé de porter une grande attention aux différentes étapes des techniques manuelles qui comportent des points sensibles et critiques en ciblant les tests d’orientation et de confirmation, mais également en considérant l’observation macroscopique des divers échantillons biologiques. La morphologie et le caractère monomorphe ou polymorphe des cultures bactériennes, ainsi que la notion de prédominance, devront impérativement être pris en compte. Point clé. Il faut veiller à bien organiser le triptyque analytique : observation macroscopique des prélèvements, isolement des souches cliniques, suivi des tests d’orientation (Gram, oxydase, catalase, mobilité, métabolisme respiratoire, etc.) et de confirmation (tests phénotypiques ou génotypiques, antibiogrammes). A) Feuille de travail La composition de la feuille de travail, ou feuille de paillasse, doit être bien structurée. Cet enregistrement joue un rôle important dans la transmission des informations entre les différents opérateurs. Pourront y figurer les données suivantes : l’heure du recueil, le sexe du patient, les critères d’acceptation, les renseignements cliniques (nature et origine du prélèvement, traitement en cours), l’aide à l’interprétation pour l’opérateur, la traçabilité des opérateurs à J0/J1/Jn ; la spécialité du prescripteur est également une donnée intéressante (urologue, néphrologue, infectiologue, etc.). Toutes ces données sont très utiles dans le cas d’une étude de traçabilité d’un dossier. - 49 - feuillets de Biologie VOL LIV N° 314 - SEPTEMBRE 2013 ACCRÉDITATION Points critiques en bactériologie NOTE : L’utilisation de milieux de transport permet d’allonger de façon notable les délais d’acheminement et par conséquent de mieux maîtriser les conditions préanalytiques. Les milieux de transport les plus courant sont : Stuart (le tampon glycérophosphate permet la croissance des bactéries à Gram négatif) et Amies (le tampon phosphate inorganique empêche le développement des bactéries à Gram négatif) : certains milieux d’Amies modifiés ont un potentiel redox approprié permettant une survie accrue des anaérobies et des bactéries de culture difficile. Le milieu Cary Blair (Stuart modifié) assure le transport et la conservation des bactéries entéropathogènes (E. coli, Shigella, Salmonella, Yersinia, etc.). SHU : syndrome hémolytique et urémique. Tableau III - Interprétation des examens microscopiques. Cellules épithéliales ou polynucléaires (grossissement x 100) / nombre par champ Rares (+) <1 Quelques (++) 1-10 Assez nombreux (+++) 11-25 Nombreux (++++) > 25 Bactéries, levures, champignons (grossissement x 1 000) ) / nombre par champ Rares (+) <1 Quelques (++) 1-10 Assez nombreux (+++) 11-25 Nombreux (++++) > 25 e i p o c r u e t au Interprétation de l’examen microscopique (Canadian Coalition For Quality in Laboratory Medecine, novembre 2004). Tableau IV - Interprétation de l’examen microscopique d’une expectoration (Rémic 2010). Classes de Bartlett Cellules épithéliales/champ Leucocytes/champ Qualification 1 > 25 < 10 Refusé > 25 10-25 Refusé > 25 > 25 Refusé 10-25 > 25 Accepté < 10 > 25 Qualité optimale 2 3 4 5 ACCRÉDITATION Points critiques en bactériologie Tableau V - Harmonisation des lectures microscopiques pour les BAAR (CNQ 12 BAC 1). Dénombrement Ziehl - Neelsen Fluorescence 1+ 1 à 9 BAAR / 100 champs 1 à 9 BAAR / 10 champs 2+ 1 à 9 BAAR / 10 champs 1 à 9 BAAR / champ 3+ 1 à 9 BAAR / champ 10 à 90 BAAR / champ 4+ 10 à 90 BAAR / champ > 90 BAAR / champ Tableau VI - Interprétation de l’examen microscopique de la flore vaginale (grossissement x 1 000, European Manual of Clinical Microbiology 2012). Morphotypes Lactobacillus Morphotypes Gardnerella Morphotypes Mobilincus Nombre moyen de bactéries / champ Nombre moyen de bactéries / champ Nombre moyen de bactéries / champ 0 > 30 0 0 1 5 – 30 <1 1–5 2 1–4 1–4 >5 3 <1 5 – 30 4 0 > 30 Score - 50 - feuillets de Biologie VOL LIV N° 314 - SEPTEMBRE 2013 Points critiques en bactériologie Tableau VII - Vérification des cytologies urinaires. Lecture microscopique Uf-50 Dossiers Visa Leucocytes Hématies Cellules Leucocytes Hématies Cellules 1204527190 CG 20 000 10 000 ++ 39 200 39 600 ++ 1207520165 CG 80 000 10 000 ++ 128 200 10 000 ++ 1211052401 CG 516 000 35 200 ++ 490 000 19 500 ++ Tableau VIII - Score de Nugent.. Dossiers Score de Nugent Visa 110420152 4 CG, JPK, GM 110122069 1 CG, JPK, GM 110211156 8 CG, JPK, GM 110212206 7 CG, JPK, GM e i p o c r u e t au La cohérence du dossier est à vérifier dès la prise en charge de l’échantillon par l’opérateur. Un liquide citrin n’est pas obligatoirement une urine. Un prescripteur peut en cacher un autre : l’ophtalmologiste demande t-il souvent un prélèvement ostéo-articulaire au laboratoire ? (Attention aux homonymies). Le contexte clinique doit aussi inciter à utiliser des milieux complémentaires par rapport à ceux utilisés en routine. Point clé. La feuille de travail joue un rôle très important, notamment pour l’interface entre les différents opérateurs. La traçabilité doit être complète et bien lisible, avec les visas des techniciens. Il n’est pas toujours facile de trouver les préconisations de lecture pour les examens microscopiques. Aussi, nous indiquerons quelques recommandations permettant de standardiser les pratiques entre les différents opérateurs. Le tableau III présente l’harmonisation des lectures microscopiques pour les cellules épithéliales et les polynucléaires (grossissement x 100), ainsi que pour les bactéries, les levures et les champignons (grossissement x 1 000). 1) Lecture des états frais, des colorations de Gram, de May-Giemsa-Grünwald (MGG) et de Ziehl-Neelsen Certaines bactéries sont appelées à Gram variable et sont susceptibles de poser des difficultés lors de l’identification des souches cliniques liées à des variations et/ou des discordances inter-opérateurs : Gardnerella vaginalis, Gemella spp., Mobilincus spp., Acinetobacter spp. Par ailleurs, des genres bactériens comme Corynebacterium, Haemophilus ou Bacteroides sont aussi à l’origine de résultats variables selon les techniciens en raison d’artéfacts techniques lors de la coloration (28). Les appareils automatisés pour la coloration des lames de cytologie permettent de mieux standardiser les manipulations. Enfin, certaines bactéries peuvent être pléiomorphes, notamment dans les hémocultures : Haemophilus influenzae, Acinetobacter baumannii, Streptococcus pneumoniae. Le tableau V présente l’harmonisation des lectures microscopiques pour les bacilles acido-alcoolo-résistants (BAAR) sur frottis d’expectorations au grossissement x 1 000. La détermination du score de Nugent nécessite une lecture des frottis avec évaluation des morphotypes Gardnerella et anaérobies (bacilles à Gram variable, polymorphes) et le morphotype Mobiluncus (bacilles incurvés à Gram variable). Le tableau VI expose le score de Nugent. Si la reproductibilité inter-opérateurs ne semble pas poser de problème pour les scores extrêmes, l’interprétation est plus délicate, pour les scores intermédiaires. Il est utile de signaler que la prise de probiotiques contenant différentes espèces du genre Lactobacillus (L. fermentum, L. delbrueckii, L. casei var. rhamnosus Döderleini, etc.), peuvent fausser les résultats. Là encore, les renseignements cliniques prennent toutes leurs importances. - 51 - feuillets de Biologie VOL LIV N° 314 - SEPTEMBRE 2013 ACCRÉDITATION Points critiques en bactériologie Les données du tableau IV, tirées du Rémic 2010, permettent de standardiser l’étude microscopique des expectorations selon 5 classes au grossissement x 100 (oculaire 10 / objectif 10) en réalisant une moyenne sur 10 champs. Le biologiste devra aussi statuer pour les cas intermédiaires qui ne figurent pas parmi les classes de Bartlett : 10 à 25 cellules épithéliales/champ avec < 10 leucocytes/champ. B) Lecture des examens directs au microscope Point clé. Pour les hémocultures, le pléiomorphisme des bactéries en milieu liquide peut constituer une véritable difficulté pour la lecture de la coloration de Gram. 2) Harmonisation des lectures microscopiques À titre d’exemple, nous indiquerons dans les tableaux VII et VIII les possibilités pour sécuriser et harmoniser les études cytologiques. Il est possible de déterminer un biais maximal toléré pour apprécier la performance des opérateurs, car la lecture microscopique des cytologies urinaires peut être utilisée comme un « back up » en cas de panne d’automate. Le 1er quadrant est ensemencé avec l’écouvillon, puis les autres quadrants avec une öse à usage unique. Fig. 2 - Schéma classique d’ensemencement. Point clé. Il est essentiel que les différents opérateurs rendent des résultats cohérents et standardisés. Les renseignements cliniques, ainsi que les traitements médicamenteux en cours, sont importants pour l’interprétation contextuelle des résultats. diffusion) (Tableau IX). Dans une logique d’assurance qualité, ils doivent être standardisés. Le volume ensemencé est un point critique (expectoration, hémoculture, urine, etc.), aussi bien pour les techniques conventionnelles que pour les techniques automatisées (peigne chez bioMérieux®, bille aimantée chez BD, öse chez I2A). C) Schémas et techniques d’ensemencement Les schémas d’ensemencement varient en fonction des techniques automatisées et manuelles utilisées (Figure 2), mais aussi en fonction des échantillons (selle, urine, cathéter, valve, biopsie) et des analyses demandées (concentration minimum inhibitrice, antibiogramme par Point clé. L’automatisation de l’étape d’ensemencement ne dispense pas de la présence d’un technicien, qui puisse être en mesure de résoudre d’éventuels dysfonctionnements des chaînes robotisées (incohérences des résultats...). Tableau IX - Exemple de modalités d’ensemencement d’échantillons biologiques. Types de prélèvement e i p o c r u e t au Urine ACCRÉDITATION Points critiques en bactériologie Selle – diarrhéique – non diarrhéique Modalités d’ensemencement Recommandations 10 µL Rémic 2010 Pur Dilution d’une noix de selle dans 3 mL de sérum physiologique CNR Campylobacter : – selles récemment émises ou gardées à + 4°C, – fraîcheur des milieux de cultures(a) Cathéter Cathéter dans 1 mL de sérum physiologique, vortex 1 minute, ensemencement de 10 µL (si méthode de Brun-Buisson) Rémic 2010 Expectoration Dilution 10-5, 10-7 Patient mucoviscidosique : fluidification de l’expectoration, ensemencement de 20 µL d’homogénat pur ou dilué au 1/1 000 Rémic 2010 Hémoculture (adulte) 10 mL de sang au minimum par flacon Rémic 2010 Lavage broncho-alvéolaire Dilution 10-2, 10-4 Rémic 2010 Prélèvement distal protégé Pur, dilution 10-2 Rémic 2010 Prélèvement ostéo-articulaire Utilisation d’un broyeur de type Ultra-Turrax®, PSM Rémic 2010 Sperme Ensemencement au râteau de 10 µL de sperme pur ou de 100 µL de sperme dilué au 1/10 Rémic 2010 (a) Privilégier la préparation extemporanée, mais cela implique des contraintes importantes difficilement compatibles avec l’accréditation. - 52 - feuillets de Biologie VOL LIV N° 314 - SEPTEMBRE 2013 Points critiques en bactériologie D) Charge de l’inoculum La charge de l’inoculum est excessivement importante, aussi bien pour l’identification que pour la réalisation de l’antibiogramme (comité de l’antibiogramme de la société française de microbiologie), CA-SFM) (29). Pour mémoire, selon le Rémic 2010 et le CA-SFM 2013, 0,5 McFarland correspond classiquement à 108 UFC/mL, ou encore à 106 UFC/mL pour Neisseria meningitidis. Toutefois, il convient de ne pas ignorer les limites de cette technique : – acquisition d’une certaine technicité pour le dépôt sur la cible ; – nécessité d’une culture solide ou liquide pour disposer d’un inoculum suffisant ; – pureté du dépôt obligatoire ; – durée de culture optimale, ni trop jeune, ni trop âgée, variable selon les espèces à identifier ; Point clé. La charge de l’inoculum devra être respectée strictement en fonction des recommandations du fabricant et du CA-SFM. – fausses identification possibles, notamment entre certains streptocoques oraux et Streptococcus pneumoniae, de même, identification des Shigella en E. coli ; E) Dilution des expectorations Les dilutions sont différentes selon le type de prélèvement et selon la pathologie : par exemple, pour les expectorations des patients atteints de mucoviscidose, fluidification de l’échantillon et ensemencement de 20 µl d’homogénat pur ou dilué au 1/1 000 (Rémic 2010). – identification limitée au genre pour Salmonella spp. et Acinetobacter spp. ; e i p o c r u e t au – plus rarement, absence d’identification de certaines espèces bactériennes ne figurant pas encore dans la base de données. F) Identification bactérienne De nombreuses méthodes sont à la disposition du bactériologiste pour identifier les bactéries, depuis la simple observation macroscopique jusqu’au séquençage considéré comme le « gold standard » en la matière, exception faite des genres comme Brucella ou Salmonella pour lesquels le sérotypage est nécessaire. Jusqu’ici, les méthodes phénotypiques basées sur l’utilisation de techniques chromogènes ou enzymatiques étaient les plus accessibles en termes de praticabilité et pour un coût modique. L’inconvénient majeur de ces techniques est le risque de mauvaise identification en cas de contamination de l’inoculum de la souche à tester. Ce problème est facilement identifiable si l’on prend soin de pratiquer en parallèle un réisolement. Néanmoins, la pureté n’est pas le seul critère de bonne identification : une grossière erreur dichotomique initiale peut conduire à une « vraie fausse » identification (Gram non réalisé sur la souche à tester, Gram trop ou pas assez décoloré, oxydase non recherchée, etc.). De plus, ces techniques atteignent très vite leurs limites dès lors qu’il s’agit d’espèces moins courantes. Si la biologie moléculaire reste, en raison de son coût, un outil d’exception qui justifie son positionnement particulier, la spectrométrie de masse a fait une offensive significative dans le milieu de la bactériologie depuis 5-6 ans. Cette technique du MALDI-TOF (Matrix Assisted Laser Desorption Ionization - Time Of Flight) permet une identification fiable et très rapide de nombreuses espèces jusqu’ici difficilement accessibles aux laboratoires de routine. Cette technique constitue un progrès substantiel en matière de qualité diagnostique (30-32), certains auteurs allant même jusqu’à la juger aussi performante que le séquençage (33). G) Quantification de Streptococcus agalactiae par la technique des quadrants Pour le dépistage de Streptococcus agalactiae (streptocoques du groupe B, SGB) entre la 34ème et la 38ème semaine de grossesse, la richesse de culture doit être évaluée de façon semi-quantitative. Le risque de transmission materno-fœtale est faible à 1 + et majeur à 4 + en fonction du nombre de quadrants concernés par la croissance du SGB sur gélose au sang, sans enrichissement sélectif préalable en milieu liquide (grade A) (recommandation ANAES 2001). Cette gradation du risque ne dicte en aucun cas la prescription d’une antibioprophylaxie, qui reste identique quelle que soit la quantification (33-35). Pour les infections néonatales, la Nomenclature des Actes de Biologie Médicale (NABM) requiert deux prélèvements distincts. La cohérence des résultats entre les deux prélèvements est à prendre en compte. Point clé. La mise en évidence du SGB à l’uroculture (seuil significatif ≥ 104 UFC/mL en culture monomorphe ou non) aboutit à la prescription d’une antibioprophylaxie per-partum dans les mêmes conditions qu’en cas de portage vaginal. H) Recherche de l’oxydase La recherche de l’oxydase est un test important pour l’identification de certaines souches cliniques. Elle s’inscrit dans une démarche d’identification dichotomique et doit être réalisée dans de bonnes conditions et conformément aux préconisations des fabricants, c’est-à-dire sur milieu Trypticase-soja et en évitant dans la mesure du possible la gélose au sang. Citons quelques exemples de bactéries - 53 - feuillets de Biologie VOL LIV N° 314 - SEPTEMBRE 2013 ACCRÉDITATION Points critiques en bactériologie Point clé. L’identification bactérienne par des techniques conventionnelles tend à être remplacée par la spectrométrie de masse et par la biologie moléculaire. Dans tous les cas, une approche méthodologique utilisant des tests d’orientation reste utile. Point clé. Une attention particulière doit être portée aux dilutions réalisées pour les différents types d’échantillons broncho-pulmonaires, notamment la formule de calcul pour le rendu quantitatif. oxydase-positives (Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas stutzeri, Pseudomonas putida, Aeromonas spp., Plesiomonas spp., Vibrio spp., Pasteurella spp.), et de bactéries oxydase négatives (Pseudomonas luteola, P. oryzihabitans, Stenotrophomonas maltophilia). Point clé. La recherche d’oxydase doit être effectuée à partir d’isolement sur des milieux de cultures validés ou compatibles. Il est important d’éviter de racler la gélose pour réaliser ce test. I) Températures, atmosphères et durées d’incubation : points sensibles ou points critiques ? Les températures d’incubation préconisées par le Rémic 2010 sont les suivantes : – 35 +/- 1,5°C : cas général ; – 36 +/- 1,5°C : BK ; – 30 +/- 1,5°C : Mycobacterium marinum, M. chelonae, M. ulcerans ; – 42 +/- 1,5°C : Mycobacterium xenopi ; – 30 +/- 1,5°C : mycologie, Yersinia spp. ; – Campylobacters thermotolérants : le Centre National de Référence des Campylobacters recommande une température d’incubation de 37°C, bien que la température d’incubation optimale de croissance des souches les plus fréquemment isolées soit de 42°C ; – Yersinia sur milieux sélectifs (Cefsulodine-Irgarsan-Novobiocine) : 48 heures entre 25 et 30°C. Les préconisations de températures d’incubation précitées révèlent toute la difficulté de respecter les optimums de croissance pour les espèces bactériennes des différents prélèvements cliniques. Il est donc impératif que le biologiste définisse ses besoins en fonction du recrutement des patients. Les micro-organismes tels que Pseudomonas fluorescens, Listeria monocytogenes, Yersinia enterocolytica, Serratia liquefaciens, Hafnia spp., Lactobacillus casei et Candida spp., sont dits psychrotrophes/psychrotolérants avec un optimum de pousse inférieur à + 22°C . Pseudomonas fluorescens est susceptible de former des biofilms sur les parois des réfrigérateurs. D’autres bactéries, dites thermophiles, se développent encore à des températures supérieures à + 42°C (Pseudomonas aeruginosa, Clostridium difficile, Lactobacillus acidophilus) (26, 27, 37, 38). e i p o c r u e t au En complément de ce qui précède, signalons qu’en hydrobiologie, la recherche des bactéries coliformes (bactéries lactose-positives) est effectuée après incubation Tableau X - Exemples de durées d’incubation à respecter selon les bactéries recherchées. ACCRÉDITATION Points critiques en bactériologie Types de prélèvement Bactéries Lecture et remarques Durées d’incubation ECBU Corynebacterium urealyticum Aerococcus spp. Actinobacillus spp. Culture lente ≥ 48 heures sur gélose au sang sous CO2 Prélèvements bronchiques et urines Mycobacterium spp. - 1/jour à J1, J2, J3 - 2/semaine pendant 4 semaines - 1/semaine pendant 3 mois 90 jours PU et PV Neisseria gonorrhoeae Lecture à J2 72 heures Abcès pulmonaire ou du cerveau Nocardia spp. Aérobie strict 10 - 21 jours Ponction ou biopsie Actinomyces spp. Meilleure croissance en anaérobiose 15 jours Ponction ou biopsie ostéo-articulaires Toutes les bactéries Lecture précoce à J1, et J2, et tardive à J5 Anaérobies à J8 7 à 10 jours : milieux gélosés 15 jours : milieux liquides Gorge Arcanobacterium haemolyticum Angine avec parfois rash cutané 48 à 96 heures pour détecter l’hémolyse b Oreille Alliococcus otitidis Otite moyenne chronique chez l’enfant 5 jours Hémoculture Toutes les bactéries Cas général Si suspicion d’endocardite 5 jours 15 jours / 30 jours Suppurations closes et des séreuses Bactéries anaérobies à croissance lente Réincuber rapidement après une lecture Milieux gélosés : 5 jours Milieux liquides : 15 jours - 54 - feuillets de Biologie VOL LIV N° 314 - SEPTEMBRE 2013 Points critiques en bactériologie Tableau XI - Maîtrise de la durée d’incubation pour la lecture des ECBU*. Horaire d’incubation Bactéries Horaire de lecture (lendemain) Durée d’incubation 9 h 30 Toutes 8 h 30 23 heures 11 h 30 Toutes 8 h 30 21 heures 14 h 30 Toutes 11 h 30 21 heures 16 h Toutes 13 h 21 heures * ECBU : durée à respecter : 21 ± 3 heures. Tableau XII - Tests d’orientation et de confirmation. Morphologie Oxydase Catalase Gram Glucose γ-GT Neisseria gonorrhoeae diplocoques + + - + + Neisseria cinerea diplocoques + + - - - Kingella denitrificans coccobacilles + - - + - e i p o c r u e t au durant 21 ± 3 heures à 44 ± 0,5°C (39-40). Parmi les coliformes fécaux, encore appelés coliformes thermotolérants, il faut citer : E. coli, Klebsiella pneumoniae, K. oxytoca, Enterobacter aerogenes, Citrobacter freundii, etc. Pour les espèces du genre Haemophilus, on veillera à maintenir une bonne humidité dans l’étuve pour favoriser la pousse. Les durées d’incubation constituent aussi un point critique. Le tableau X illustre quelques exemples de durées d’incubation importantes à respecter. Le tableau XI propose un exemple de maîtrise des durées d’incubation appliquées aux ECBU pour que la durée d’incubation de 18 à 24 heures soit bien respectée. Point clé. Les renseignements cliniques sont essentiels pour le diagnostic (ex. : recherche de mycobactéries à + 30°C chez les éleveurs de poissons ou les aquariophiles). Il faut bien hiérarchiser ce qui est essentiel et ce qui est secondaire. Les conditions de culture en aérobiose, anaérobiose, sous CO2 ou en micro-aérophilie, sont autant de points critiques à surveiller impérative- J) Diagnostic différentiel : l'exemple de Neisseria gonorrhoeae Les diagnostics différentiels entre certaines espèces sont susceptibles de poser des problèmes d’ordre technique, comme l’illustre le tableau XII. K) Recherche de bêta-lactamase L’absence de pénicillinase doit être confirmée chez les staphylocoques sensibles à la pénicilline G par un test à la nitrocéfine (disque de Céfinase™), après induction par l’oxacilline (5 µg) ou la céfoxitine (30 µg) (18, 41). La production de bêta-lactamase doit également être recherchée par l’utilisation de céphalosporines chromogènes (disque de Céfinase™) pour les espèces suivantes (la lecture du test, s’il est négatif, n’est valide qu’au bout d’une heure) : – Anaérobies (Bacteroides, Clostridium, Fusobacterium et Prevotella) ; – Moraxella (Branhamella) catarrhalis ; – Enterococcus spp. ; – Haemophilus influenzae ; – Neisseria gonorrhoeae, N. meningitidis. On notera que la recherche de pénicillinase par le disque de nitrocéfine n’est pas validée pour les Campylobacter spp. Il faut faire attention à la réalisation de ce test à partir des milieux chromogènes, pour éviter les artéfacts techniques dus à la coloration du milieu. - 55 - feuillets de Biologie VOL LIV N° 314 - SEPTEMBRE 2013 ACCRÉDITATION Points critiques en bactériologie L’atmosphère d’incubation est un point critique qui doit être maîtrisé (CO2, microaérophilie, aérobiose, anaérobiose). – Aérobiose : incubation en présence d’oxygène (air ambiant), aucun dispositif particulier n’est utilisé. – CO2 : atmosphère enrichie en CO2 (3 à 6 %), jarre ou sachet générateur d’atmosphère ou étuve à CO2 (gestion de la traçabilité métrologique, de la sécurité et des coûts à considérer). – Anaérobiose : oxygène < 1 % + 20 % de CO2, jarre ou sachet générateur d’atmosphère. – Microaérophilie : oxygène 5 %, jarre ou sachet générateur d’atmosphère. ment, tout comme les durées d’incubation (Neisseria, Campylobacter, Nocardia, etc.). Il existe des dispositifs pour gérer l’atmosphère nécessaire à la culture des bactéries exigeantes. Les appareils intègrent un micro-processeur, des électrovannes et un capteur de pression pour la gestion des atmosphères de cultures bactériennes. Certains staphylocoques à coagulase négative (SCN) comme Staphylococcus saprophyticus et S. lugdunensis présentent des faux positifs pour la sensibilité à la pénicilline G avec les techniques automatisées (Vitek 2). La présence d’une souche produisant une bêta-lactamase nécessite d’accompagner le résultat d’un commentaire interprétatif du type de celui mentionné ci-dessous. Commentaire. « Staphylococcus aureus avec recherche de pénicillinase positive : ne pas utiliser les pénicillines à l’exception des pénicillines M (ex. : Bristopen®, Orbénine®...) et des associations pénicillines + inhibiteurs de bêta-lactamase (ex. : Augmentin®, Claventin®…). » Point clé. La bonne compréhension, par les opérateurs, des modalités techniques à mettre en œuvre pour étudier la résistance à la méticilline devra être vérifiée par les biologistes. M) Identification des phénotypes de résistance La résistance des bactéries aux antibiotiques est un sujet d’actualité préoccupant devant l’augmentation régulière des résistances qui touchent maintenant l’ensemble des espèces bactériennes d’importance médicale et la totalité des antibiotiques disponibles. La résistance des bacilles à Gram négatif aux carbapénèmes se développe actuellement dans le monde entier. Dans ce contexte, la maîtrise de ce phénomène est devenue une priorité sanitaire. Les autorités françaises ont accompagné les alertes par des textes réglementaires concernant la détection, le signalement et la maîtrise des bactéries multirésistantes (BMR). L’étude de la sensibilité des bactéries aux antibiotiques est de plus en plus complexe et il est difficile dans certains cas de préciser le phénotype de résistance. Les capacités d’expertise et de détection de nouveaux types de résistance sont à surveiller pour les différents automates. e i p o c r u e t au L) Recherche de la résistance à la méticilline (détection des staphylocoques méti-R) Les systèmes Vitek sont à l’origine de faux résistants du « cefoxitin screen test » pour Staphylococcus saprophyticus et S. lugdunensis (29). Il faut alors impérativement utiliser des disques de céfoxitine et de moxalactam. L’expression hétérogène de la résistance inductible des staphylocoques aux isoxazolyl-pénicillines (oxacilline, cloxacilline) doit être recherchée par diffusion à l’aide d’un disque de céfoxitine (30 mg) et de moxalactam (30 mg) dans les conditions standard de l’antibiogramme des staphylocoques (en milieu de Mueller-Hinton avec un inoculum de ~ 106 UFC/mL et une incubation de 18-24 heures voire 48 heures). L’incubation doit être effectuée à 30°C sur milieu non supplémenté en NaCl, ou à 37°C sur milieu hypersalé pour les disques d’oxacilline (29). Il ne doit pas être tenu compte d’une éventuelle zone fantôme pour la lecture des diamètres d’inhibition de la céfoxitine. Les souches présentant un diamètre ≥ 27 mm (céfoxitine 30 µg) ou ≥ 24 mm (moxalactam 30 µg) sont sensibles aux isoxazolyl-pénicillines (oxacilline, cloxacilline). ACCRÉDITATION Points critiques en bactériologie Les souches présentant un diamètre < 25 mm (céfoxitine) ou < 23 mm (moxalactam) sont résistantes. Les entérobactéries productrices de carbapénèmases (EPC) doivent faire l’objet d’un signalement au prescripteur et à l’Agence Régionale de Santé (ARS) par le LBM en cas d’un antibiogramme montrant une diminution de sensibilité aux carbapénèmes. Il convient alors de confirmer le phénotype de résistance par envoi de la souche au CNR ou à un laboratoire expert (42-46). La recherche de bêta-lactamase à spectre étendu (BLSE) pour les bactéries du groupe 3 (Enterobacter aerogenes, E. cloacae, Citrobacter freundii, Morganella morganii, Providentia stuartii, Proteus rettgeri, etc.) peut requérir l’utilisation de géloses de Mueller-Hinton additionnées de 250 mg/L de cloxacilline (inhibition des céphalosporinases naturelles). Pour Pseudomonas aeruginosa et Acinetobacter baumannii, il peut être nécessaire d’utiliser des concentrations de cloxacilline de 500 ou 1 000 mg/L pour inhiber les céphalosporinases de ces espèces. Pour les souches présentant des diamètres compris entre ces bornes (i.e., 25-27 mm pour la céfoxitine et 2324 mm pour le moxalactam), il faut rechercher le gène mecA ou son produit, la PLP2a (SLIDEX® MRSA). Point clé. Il est important d’effectuer une veille scientifique pour connaitre l’évolution des phénotypes de résistances émergents, et de se tenir à jour de l’actualité en bactériologie clinique pour contribuer à éviter la dissémination des souches multirésistantes. S’agissant des rapports d’analyses, il peut être utile d’indiquer à la suite de l’antibiogramme : « le CA-SFM recommande de ne pas modifier la catégorisation clinique en dehors des règles de lecture interprétative. » Il faut encore signaler qu’il existe aussi un gène mecC codant la PLP2c. Commentaire. « Staphylococcus aureus résistant à la méticilline (SARM) : cette souche est une BMR ; les SARM sont résistants à toutes les bêta-lactamines (pénicillines associées ou non à un inhibiteur de bêta-lactamase), aux céphalosporines (exception de la ceftaroline et du ceftobiprole) et aux carbapénèmes. » NB : lors du dépistage de SARM dans les situations préopératoires, il paraît opportun de signaler la présence en quantité importante de Staphylococcus aureus méticillinosensible (SAMS) - surtout en l’absence de SARM - et aussi de rendre l’antibiogramme. N) Détermination de la concentration minimum inhibitrice (CMI) En pratique de routine, la détermination d’une CMI se fait à l’aide d’une bandelette E-test®. Il s’agit d’une méthode de diffusion en milieu solide d’un gradient continu d’antibiotique qui nécessite de maîtriser un certain nombre de paramètres : conservation des bandelettes, ensemencement des boîtes par écouvillonnage, charge de l’inoculum, - 56 - feuillets de Biologie VOL LIV N° 314 - SEPTEMBRE 2013 Points critiques en bactériologie Tableau XIII - Traçabilité et concordance des lectures de CMI en mg/L. Souche ATCC / CNQ Enterococcus faecium (CNQ 11-Bac2) Enterococcus faecium (CNQ 11-Bac2) P. aeruginosa (ATCC 27853) P. aeruginosa (ATCC 27853) Isolats cliniques Téicoplanine 0,78 - 1 0,75 1 1 1 Vancomycine 8 - 16 8 12 12 8 Méropénème 0,25 - 1 0,38 0,5 0,38 0,5 Méropénème 0,25 - 1 0,38 0,25 0,38 0,25 Antibiotiques Concentrations CMI CMI CMI CMI testés critiques Opérateur 1 Opérateur 2 Opérateur 3 Opérateur 4 ≤ 2 (S) Méropénème 1 (S) 1 (S) > 8 (R) ≤ 0,5 (S) Ertapénème 0,75 (I) 0,75 (I) 0,75 (I) 0,75 (I) > 1 (R) ≤ 2 (S) Méropénème 0,19 (S) 0,19 (S) 0,19 (S) 0,19 (S) > 8 (R) ≤ 2 (S) Méropénème 0,5 (S) 0,5 (S) > 8 (R) ≤ 2 (S) Méropénème 0,25 (S) 0,25 (S) > 8 (R) choix des milieux de culture, etc. La lecture et l’interprétation des CMI doivent être effectuées par des opérateurs expérimentés conformément aux recommandations des fournisseurs (47). Pour standardiser les protocoles techniques, il est important d’étudier en parallèle des souches tests dont les fournisseurs donnent les limites d’acceptabilité (P. aeruginosa 0,25-1 mg/L pour le méropénème). Ces limites d’acceptabilité indiquées dans les notices fournisseurs ne doivent pas être confondues avec les concentrations critiques mentionnées par le CA-SFM (P. aeruginosa : imipénème ≤ 4 (S), > 8 (R) ; méropénème ≤ 2 (S), > 8 (R) ; doripénème ≤ 1 (S), > 4 (R)). Pour Enterococcus spp., les systèmes Vitek mentionnent en commentaire : « en fonction de la nature de l’infection (ex. : endocardite infectieuse), vérifier la CMI à l’aide d’une bandelette E-test®. » Il est utile de rappeler que la NABM distingue deux cas pour la détermination des CMI : – le cas général s’applique aux infections systémiques et comprend l’étude au minimum de deux antibiotiques ; – le cas de Streptococcus pneumoniae avec utilisation d’une gamme de concentration adaptée à la mise en évidence d’une diminution de sensibilité aux bêta-lactamines. Le tableau XIII donne des exemples de lecture de CMI utilisés pour vérifier la standardisation des lectures pour des isolats cliniques et des CIQ et CNQ en fonction des différents opérateurs. Point clé. Le mode de lecture des E-tests® est délicat et varie en fonction de l’antibiotique testé. Il nécessite une bonne formation des opérateurs. Les CMI des souches cliniques doivent être comparées aux concentrations critiques du CA-SFM. Les CMI des souches tests doivent être comparées aux limites d’acceptabilité des fournisseurs de bandelettes. La détermination des CMI est un facteur clé pour assurer la sécurité des traitements des infections graves (méningites, endocardites, infections ostéo-articulaires, patient de réanimation) et pour adapter les posologies sur la base des propriétés PK /PD des antibiotiques. O) Les prélèvements précieux et « risqués » : l’exemple des ponctions ou biopsies ostéo-articulaires La bonne qualité des prélèvements ostéo-articulaires ainsi qu’une prise en charge adaptée par le laboratoire doivent être organisées. Le nombre de prélèvements nécessaires - idéalement effectués de façon per-opératoire est actuellement fixé à 5. L’écouvillonnage superficiel ou profond de la plaie ou de la fistule doit être proscrit (4849). Il est aussi important de traiter les échantillons biologiques avec un broyeur à billes d’acier pour homogénéiser les tissus et éviter la contamination des échantillons. L’interprétation bactériologique est le plus souvent délicate pour plusieurs raisons : – les opérateurs doivent être entraînés et expérimentés ; – les incubations des milieux de cultures doivent être prolongées durant 7 à 10 jours pour les milieux solides - 57 - feuillets de Biologie VOL LIV N° 314 - SEPTEMBRE 2013 ACCRÉDITATION Points critiques en bactériologie e i p o c r u e t au P. aeruginosa 1303515157 Enterobacter cloacae 1304329081 Enterobacter cloacae 1304329081 P. aeruginosa 1304603113 P. aeruginosa 13011803034 Antibiotiques Limites CMI CMI CMI CMI testés d’acceptabilité Opérateur 1 Opérateur 2 Opérateur 3 Opérateur 4 et 15 jours pour les milieux liquides ; – les bactéries du genre Propionibacterium sont des commensaux des glandes sébacées et des bulbes pileux qui peuvent être à l’origine de contaminations des cultures anaérobies lorsqu’elles sont introduites accidentellement lors des prélèvements ; l’isolement de ces souches lors des prélèvements per-opératoires posent de réels problèmes d’interprétation, notamment s’il s’agit de déterminer le caractère nosocomiale d’une infection postopératoire, et c’est pourquoi il est important de disposer de plusieurs prélèvements ; – l’aspect des colonies peut être polymorphe, notamment dans le cas des « small colony variants » de SCN, des variants déficients donnant des colonies naines (50), qui ne sont pas des contaminants (43). pathogènes opportunistes et des pathogènes stricts au sein de la flore commensale ; – des questionnaires de types quiz pour évaluer la compréhension des dispositions prises dans les procédures techniques. Le tableau XIV présente un exemple de fiche d’habilitation pour les prélèvements urogénitaux. e i p o c r u e t au En ce qui concerne ces prélèvements précieux, il y a lieu de rappeler qu’il est de jurisprudence constante que les antécédents médicaux, connus du praticien, doivent donner lieu à des mesures de précautions particulières pour exclure la responsabilité a minima au titre de perte de chance (51-52). Point clé. La documentation bactériologique est le pivot de la prise en charge thérapeutique pour les infections ostéo-articulaires. Ces prélèvements nécessitent une formation approfondie des techniciens et une attention particulière des biologistes. P) Évaluation et habilitation du personnel L’évaluation est un sujet majeur de préoccupation des biologistes. C’est évidemment moins le principe que les modalités qui posent problème (53). L’évaluation pourra porter sur : – l’examen direct accompagné d’une coloration de Gram, de May-Giemsa-Grünwald ou de Ziehl-Neelsen ; – la distinction des micro-organismes saprophytes, des Point clé. La formation continue, l’habilitation du personnel en général, des techniciens et des biologistes en particulier, est un point crucial pour le respect de l’exigence de qualité. Q) Analyse de la criticité des processus Le SH GTA 06 (13) indique une méthode que le laboratoire peut mettre en place pour évaluer la criticité basée sur 3 items, chacun coté de 1 à 3. Fréquence d’apparition des anomalies constatées (F) 0 à 1 fois / an : 1 ; 2 à 3 fois / an : 2 ; > 3 fois / an : 3. Gravité de l’anomalie sur le processus analytique et ses incidences sur le diagnostic, le traitement ou l’épidémiologie (G) Aucune : 1 ; Incidence probable : 2 ; Incidence certaine : 3. Détectabilité au cours du processus analytique (du préanalytique au postanalytique) (D) Anomalie détectable : 1 ; Détection possible : 2 ; Anomalie non détectable : 3. La cotation de chaque paramètre va permettre d’établir un indice de criticité (IC) résultant de la multiplication des 3 items : IC = F x G x D. ACCRÉDITATION Points critiques en bactériologie Tableau XIV - Fiche d’habilitation du personnel. Validation Formé Formateur Cellules épithéliales Leucocytes Hématies Flore bactérienne Lactobacilles Cocci Gram+ Bacilles Gram+ Bacilles GramCocci GramLevures Filaments Résultats de la culture D1 : sans incidence sur l’interprétation. D2 : avec incidence sur l’interprétation. Validation de la formation : 10 prélèvements uro-génitaux de suite sans D2. - 58 - feuillets de Biologie VOL LIV N° 314 - SEPTEMBRE 2013 D1 D2 Points critiques en bactériologie Tableau XV - Évaluation de la criticité. Dysfonctionnements F G D IC Processus préanalytique 3 Enregistrement 3 2 Conduite à tenir 18 Vérification des ordonnances Processus analytique Antibiogramme automatisé Résultat non concordant 3 3 2 18 Antibiogramme en milieu gélosé 3 3 3 27 Double lecture par deux opérateurs Antibiogramme en milieu gélosé Lecture des E-tests Cytologie e i p o c r u e t au Cytologie automatisée 3 3 2 18 Lecture microscopique Lecture des colorations de Gram pour les hémocultures 3 3 2 18 Double lecture par deux opérateurs Processus postanalytique Transmission des résultats préoccupants 2 3 2 Étude des délais de rendu des résultats préoccupants 12 Tableau XVI - Exemple de grille des critères d’alerte en microbiologie. Microbiologie Secteur Analyse Seuil critique Remarques Hémoculture + Tout résultat positif Cathéter, liquide pleural, liquide de dialyse, lavage broncho-alvéolaire + Tout résultat positif Recherche de légionnelles + *Antigénurie positive LCR Tout résultat Moins de 1 heure Adénovirus-Rotavirus + Urgence modérée sauf service de pédiatrie Tous prélèvements Selles BMR C. difficile toxinogène Infections liées aux soins C’est à chaque laboratoire d’établir le seuil à partir duquel une action ou un CIQ doit être mis en place (ex. : mise en place d’une action si IC > 6). Une analyse de la criticité pourra être réalisée pour les différents processus du préanalytique au postanalytique (Tableau XV), mais aussi pour les processus « support ». Point clé. L’analyse de la criticité des risques ainsi que l’évaluation de leur impact réel ou potentiel permet d’engager des actions de prévention pour diminuer les risques à un niveau acceptable. Cette analyse des risques et des impacts peut être effectuée sur les processus de réalisation (du préanalytique au postanalytique) et/ou sur les processus de pilotage (hygiène et sécurité, management, amélioration continue, audit, ressources humaines, etc.). VIII. - LE PROCESSUS POSTANALYTIQUE Pour le processus postanalytique, les résultats des rapports d’analyses devront faire l’objet d’un commentaire pour faciliter la prise en charge du patient et, le cas échéant, faire l’objet d’un signalement à l’équipe opérationnelle d’hygiène et/ou à l’ARS pour les BMR. Une grille des critères d’alertes pour les urgences vitales ou pour les résultats préoccupants doit être facilement accessible, aussi bien pour les techniciens que pour les biologistes (Tableau XVI). D’une façon générale, devant tout résultat critique, il est important de s’assurer de la compatibilité clinique. Point clé. La sécurisation du processus postanalytique nécessite une bonne traçabilité, notamment lors de la transmission des examens urgents et/ou préoccupants. - 59 - feuillets de Biologie VOL LIV N° 314 - SEPTEMBRE 2013 ACCRÉDITATION Points critiques en bactériologie * Si antigénurie positive, il convient de demander une expectoration ou une aspiration bronchique avant la mise en place de l’antibiothérapie. Tableau XVII - Questionnaire d’audit appliqué aux points critiques. Document d’enregistrement Vérification et commentaires Questions Preuves Criticité Une étude de la gestion des risques par le diagramme causes-effets a-t-elle été réalisée ? Les modalités d’ensemencement pour les différents types de prélèvements sont-elles connues ? Les volumes ensemencés pour les différents types de prélèvements sont-ils formalisés ? e i p o c r u e t au Quels sont les moyens de maîtrise des colorations de Gram ? Quels sont les moyens de maîtrise pour la recherche de l’oxydase ? Pour quelles espèces les bêta-lactamases sont-elles recherchées ? La quantification des Streptococcus agalactiae par technique des quadrants est-elle appliquée ? Quelles sont les modalités de recherche de la résistance à la méticilline ? Étude de la sensibilité des bactéries aux antibiotiques : les recommandations du CA-SFM sont-elles appliquées ? Les vérifications des lectures microscopiques sont-elles connues et appliquées ? Les techniques de dilution pour les expectorations sont-elles connues et appliquées ? Les modalités d’étude des CMI sont-elles connues et appliquées ? Quand et comment le PSM est-il utilisé ? ACCRÉDITATION Points critiques en bactériologie Les précautions « standard » sont-elles appliquées ? Les bonnes pratiques de laboratoire sont-elles appliquées ? Quelles sont les précautions renforcées pour les entérocoques résistant aux glycopeptides et les entérobactéries productrices de carbapénémases ? Y a-t-il un défaut de culture qualité ou un défaut dans la gestion des ressources humaines ? La communication interne est-elle suffisante ? Un audit sur ce thème a-t-il eu lieu ? La formation interne sur les points critiques en bactériologie a-t-elle été utile ? - 60 - feuillets de Biologie VOL LIV N° 314 - SEPTEMBRE 2013 Points critiques en bactériologie IX. - L’AUDIT DES POINTS CRITIQUES ET DES RISQUES Le tableau XVII fournit des exemples de questions d’audit pour évaluer la maîtrise des points critiques. Les objectifs de cet audit sont : – identifier les points de vulnérabilité et évaluer les risques encourus et leurs répercussions financières ; – évaluer et améliorer les pratiques ; – mesurer les progrès accomplis ; – optimiser les processus de réalisation ; – prévenir, réduire ou éliminer les défaillances potentielles sur la sécurité des résultats des examens en identifiant les points critiques. surcroît, il y a également lieu de vérifier si le dossier administratif est bien complet et s’il prend en compte toutes les restructurations notamment pour un LBM multisite. Point clé. L’audit initial, de surveillance ou d’extension nécessitent une préparation de l’ensemble du personnel, et l’analyse des risques est un excellent complément aux audits à blanc pour ne rien oublier. e i p o c r u e t au Cette réflexion globale, menée sur les différentes étapes des processus préanalytique, analytique et postanalytique au laboratoire de bactériologie, permet de maîtriser la criticité des risques liée à leur gravité et à leur probabilité d’apparition. D’une façon générale, réduire la variabilité d’un processus, c’est réduire le nombre des défauts. Le tableau XVIII résume l’analyse et la gestion des risques. Point clé. La sécurisation des différents processus permet de satisfaire les attentes des clients par la fiabilité des prestations offertes. X. - L’ÉVALUATION PÉRIODIQUE DU COFRAC L’analyse des risques peut être appliquée aux différents processus de réalisation, comme nous l’avons vu plus haut, mais également pour préparer avec efficacité les évaluations périodiques du Cofrac. Les enseignements tirés des audits précédents nous ont montré que ce type de démarche est très intéressant, car les tâches à finaliser sont très nombreuses durant les mois qui précèdent les évaluations externes. À titre d’exemple, la disponibilité d’un personnel en nombre suffisant devra être vérifiée au préalable, afin que les journées d’évaluation ne perturbent pas le bon fonctionnement du laboratoire (Figure 3). Les organigrammes fonctionnels et nominatifs doivent bien mettre en évidence le mode de gouvernance du laboratoire. De XII. - DISCUSSION L’analyse et la gestion des risques ne s’improvisent pas : disposer d’une documentation technique, réglementaire et pratique est devenu un impératif absolu. Il appartient à la direction d’identifier les points de vulnérabilité de l’entreprise, pour évaluer les risques encourus et leurs répercussions en terme de criticité et de risques financiers. Les qualiticiens des LBM doivent être formés sur ces aspects transversaux du management pour être aptes à construire des projets et apporter des solutions. La Matériel Fiches de vie et maintenance des automates Vérification continue des performances Matière première Sécurisation des différents processus Méthode Gestion et veille documentaire Audits de paillasses Suivi des contrôles qualité Convention de preuve Gestion des écarts, et prise en compte des opportunités d’amélioration, remarques et commentaires du Cofrac Renouvellement de l’accréditation Milieu Surveillance des conditions environnementales Hygiène et sécurité Stockage des réactifs et élimination des déchets Main d’œuvre Gestion des plannings (disponibilité du personnel) et des ressources humaines : qualification, formation, habilitation, évaluation Entretien individuel Information préleveurs externes Fig. 3 - Analyse des risques pour préparer les évaluations périodiques du Cofrac. - 61 - feuillets de Biologie VOL LIV N° 314 - SEPTEMBRE 2013 ACCRÉDITATION Points critiques en bactériologie Point clé. L’audit de paillasse est un outil essentiel pour analyser et maîtriser les points critiques. C’est aussi un excellent outil de management. XI. - MAÎTRISE DES RISQUES Tableau XVIII - Maîtrise des risques appliquée au processus analytique. Modalités de maîtrise Examen macroscopique et examen microscopique Lecture des boîtes (flore commensale, polymorphe ou monomorphe, souches pathogènes) Kit d’identification Examen cytologique (frottis avec coloration MGG, Gram) Techniques automatiques Fiche d’instruction conforme au référentiel Rémic (2010), CA-SFM (2013) Respect des modes opératoires des automates Vérification sur site des méthodes manuelles et automatisées Fiches fournisseur disponibles au poste de travail (site internet du fournisseur, notices fournisseur) Audits de la paillasse de bactériologie Respect du temps et de la température d’incubation Préparation de l’inoculum Microscope Colorants MGG, Gram Automate d’identification et d’antibiogramme Cartes d’identification et d’antibiogramme Pipette de précision Contrôle des systèmes de sécurité lors des maintenances fournisseur Entretien et suivi métrologique des microscopes Respect des recommandations de conservation des réactifs Contrôle qualité (CIQ : souche ATCC, CQN, CIL) Respect des modes opératoires et fiches d’instruction Vérification sur site des automates Étalonnage des pipettes (détermination de l’incertitude mesure, EMT) Respect des recommandations de conservation des réactifs Évaluation de la tolérance des incubateurs (T/3, cartographie des enceintes thermiques) Compétence du personnel Formation (interne et externe) Qualification - habilitation - évaluation Affectation des ressources humaines en fonction des nécessités de l’activité Audits de la paillasse de bactériologie Échantillon primaire Données patient et renseignements cliniques Milieux de culture ensemencés : date de péremption, absence de contamination, bonne fertilité, colonies correctement isolées Respect et maîtrise des critères d’acceptation des échantillons Prestation de conseil préanalytique Respect des procédures de prélèvements Maîtrise du système informatique Compétence du personnel Main d’œuvre Matériel Milieu Bio-nettoyage des paillasses Surveillance des conditions environnementales (température, hygrométrie) Contrôle de surface Travail sous PSM Absence de contamination de l’opérateur Absence de contamination des inocula Matière ACCRÉDITATION Points critiques en bactériologie Points critiques à maîtriser Méthode Données d’entrée e i p o c r u e t au direction devra être consultée sur les mesures à prendre pour sensibiliser le personnel à l’utilisation des systèmes de prévention. Les revues systématiques et les méta-analyses (regroupement de plusieurs études ou enquêtes) aident à fonder les pratiques professionnelles sur des preuves scientifiques (54-55). Une gestion documentaire efficace associée à une veille électronique est indispensable pour répondre aux multiples enjeux de la maîtrise du risque infectieux. La formation continue pour renforcer ou actualiser les compétences doit être au cœur des préoccupations, d’autant qu’elle est facilitée par les « e-learnings » des différents sites internet. - 62 - feuillets de Biologie VOL LIV N° 314 - SEPTEMBRE 2013 Points critiques en bactériologie Les tests d’orientation tout comme les tests diagnostiques doivent être bien choisis et utilisés selon les recommandations professionnelles, afin d’améliorer la qualité des soins et les rapports bénéfices/risques et bénéfices/ coûts de nos pratiques. Dans certains cas, l’initiative du technicien correctement formé peut être déterminante pour assurer un diagnostic correct : la recherche de mycobactéries à partir d’un prélèvement cutané doit immédiatement conduire à une culture à 30°C. La maîtrise des points critiques passe avant tout par une communication interne efficace au sein du laboratoire, mais aussi par l’implication des biologistes pour obtenir les renseignements cliniques. La formation initiale et continue des opérateurs et des biologistes, associée à l’emploi de procédures techniques qui suivent les recommandations actualisées du CA-SFM et du Rémic, est essentielle pour un exercice de qualité. Les difficultés d’identification de certaines souches, ainsi que l’émergence de nouveaux phénotypes de résistance, nécessitent une actualisation permanente des techniques utilisées pour identifier correctement ces phénotypes et pouvoir, par des mesures préventives ou des traitements adaptés, limiter leur diffusion. Enfin, l’ensemble des dispositions techniques et organisationnelles prises doivent sans cesse évoluer, pour permettre une interprétation rigoureuse et des commentaires circonstanciés pour des résultats d’examens de biologie médicale qui répondent au mieux aux besoins et aux attentes des cliniciens. Globalement, la réflexion menée doit accroître la sécurisation des pratiques, afin de pouvoir élargir le périmètre d’accréditation en termes d’extension de portée et d’extension multisite à chaque évaluation périodique du cycle d’accréditation. e i p co r u e t u a Point clé. La gestion et l’analyse des risques nécessitent l’implication du personnel ainsi qu’une bonne communication au sein de l’entreprise. XIII. - CONCLUSION La bactériologie est une discipline difficile à sécuriser totalement, d’une part en raison de sa complexité et de l’utilisation de matériel vivant et, d’autre part, du fait de l’absence assez fréquente d’information sur le contexte clinique. Le LBM a de plus en plus besoin de garantir sa méthodologie et la qualité de ses pratiques, pour donner confiance en la fiabilité de ses résultats et plus particulièrement lors des audits d’accréditation. Références Bibliographiques (1) Quentin C. L’antibiogramme automatisé : entre piège et sécurité. Feuillets de Biologie 2012 ; LIII/307 : 19-31. (2) Védy S. Contrôle de qualité interne en antibiologie : retour d’expérience. Annales de Biologie Clinique 2012 ; 70 (3) : 341-52. (3) Piémont Y, Rieder C, Mahoudeau I, Rousée J.M, de Martino S. Les prélèvements en bactériologie. La lettre de l’infectiologue 2000 ; 15/2 : 54-60. (4) Gérome P, Dusseau J, Masseron T, Bercion R. La phase pré-analytique en bactériologie. Revue Française des Laboratoires 2001 ; 335 : 23-33. (5) Eloy C, Goudard B, Thouvenine M. Le pré-analytique en microbiologie. Feuillets de Biologie 2010 ; LI/297 : 45-52. (6) Hammad M, Paris L. Accréditation en bactériologie. Retour d’expérience. Feuillets de biologie 2011 ; LII/ 300 : 39-48. (7) Klein J.P. Prestations de conseils et comptes rendus en bactériologie clinique. Feuillets de Biologie 2012 ; LIV/310 : 51-9. Conflit d’intérêt : aucun. Remerciements : les auteurs remercient tous les confrères qui ont fait des suggestions pour l’amélioration et l’enrichissement de ce travail. (8) Klein J.P. Le processus postanalytique en bactériologie dans le cadre de l’accréditation. Revue Francophone des Laboratoires 2012 ; 445 : 91-100. (9) NORME NF EN ISO 15189. Laboratoires d’analyses de biologie médicale. Exigences particulières concernant la qualité et la compétence. AFNOR ; Août 2007. (10) NORME NF EN ISO 15189. Laboratoires d’analyses de biologie médicale. Exigences concernant la qualité et la compétence. AFNOR ; Décembre 2012. (11) Document Cofrac SH REF 02. Recueil des exigences pour l’accréditation des laboratoires de biologie médicale. 2012. Révision 01. (12) Document Cofrac SH GTA 01. Guide technique d’accréditation en biologie médicale. Révision 00 – mai 2011. (13) Document Cofrac SH GTA 06. Contrôle de qualité en biologie médicale. Document SH GTA 06. Révision 00 – juillet 2012. (14) Document Cofrac SH GTA 09. Guide technique d’accréditation dématérialisation des données. 1ère partie : transmission électronique des rapports de résultats. Révision 01 – septembre 2008. - 63 - feuillets de Biologie VOL LIV N° 314 - SEPTEMBRE 2013 (15) Froman B, Gourdon C. Dictionnaire de la qualité. AFNOR. 2003 ; Saint-Denis-La-Plaine. 224 p. (16) Hureau J. L’aléa médical dans tous ses états. Revue Experts 2012 ; 104 : 20-4. (17) Naudin C. ARAP : mais à quoi sert donc une analyse de risque a priori ? Revue Francophone des Laboratoires 2012 ; 442 : 8-11. (18) Référentiel en microbiologie médicale (bactériologie et mycologie). Société Française de Microbiologie. 4e édition. Vivactis Plus éditeur ; 2010. (19) Cornaglia G, Courcol R, Herrmann J.L, et coll. European manual of clinical microbiology. 2012 ; 1st edition. SFM - ESCMID. 469 p. (20) Guide de Bonne Exécution des Analyses de Biologie médicale (GBEA). Arrêté du 26 novembre 1999 relatif à la bonne exécution des analyses de biologie médicale. JO du 11 décembre 1999 modifié par arrêté du 28 avril 2002, (JO du 4 mai 2002). (21) Nomenclature des actes de Biologie médicale. www.ameli.fr ACCRÉDITATION Points critiques en bactériologie Finalement, la sécurisation des examens bactériologiques par la mise en œuvre d’un programme préventif implique de mieux s’organiser pour gagner en efficacité quotidiennement dans l’intérêt des patients. Une démarche qualité bien menée doit être avant tout réaliste et adaptée aux besoins. (22) Document Cofrac SH GTA 05. Règlement d’accréditation. Révision 04 – décembre 2012. (23) Document Cofrac SH GTA 04. Guide technique de vérification (portée A) / validation (portée B) des méthodes en biologie médicale. Révision 00 – avril 2011. (24) QUAMIC. Comité qualité de la société française de microbiologie. Recommandations 2013. (25) Lavigne J.P, Sotto A. Recommandations pour la bonne pratique du prélèvement microbiologique dans les infections cutanées et osseuses : à propos du pied diabétique. Spectra Biologie 2007 ; 159 : 29-34. (36) Carod J.F, Quentin R. Guide pratique pour la recherche de streptocoque du groupe B chez la femme enceinte. Spectra Biologie 2012 ; 197 : 35-44. (50) Riegel P, Archambaud M, Clavé D, Vergnaud M. Bactéries de culture et d’identification difficiles. Editions bioMérieux ; 2006. 119 p. (37) Richard C. Les eaux, les bactéries, les hommes et les animaux. Elsevier éditeur ; 1996. 115 p. (51) Carbonne A. Infections nosocomiales et expertise médico-légale. Spectra Biologie 2011 ; 186 : 32-5. (38) Champiat D, Larpent J.P. Biologie des eaux. Méthodes et techniques. Masson éd. ; 1998. 374 p. (52) Deharo G. L’expertise médicale dans le raisonnement du juge. Revue Experts 2011 ; 98 : 10-6. (39) NORME NF ISO 9308-1. Recherche et dénombrement des Escherichia coli et des bactéries coliformes. Septembre 2000. (53) Klein J.P. Accréditation et gestion des ressources humaines : pour une harmonisation des pratiques professionnelles. Spectra Biologie 2012 ; 192 : 28-39. (40) NORME V08-057-2. Méthode de routine pour le dénombrement des staphylocoques à coagulase positive par comptage des colonies à 37°C. Janvier 2004. (54) Agence nationale d’accréditation et d’évaluation en santé. Guide d’analyse de la littérature et gradation des recommandations. Janvier 2000. (41) Courvalin P, Leclercq R (sous la direction de). Antibiogramme. 3e édition. Paris : Editions ESKA ; 2012. 800 p. (55) Wadine J. Revues systématiques et méta-analyses en biologie clinique : principes et méthodes. Annales de Biologie Clinique 2004 ; 62 : 611-27. e i p o c r u e t au (26) Freney J, Renaud F, Leclercq R, Riegel P (sous la direction de). Précis de bactériologie clinique. 3e éd. ESKA éditeur ; 2012. (27) Prieur D, Geslin C, Payan C. Mini manuel de microbiologie. Paris : Dunod éd. 210 p. (28) Jeanne L. L’examen direct en bactériologie. Option Bio 2011 ; 464 : 17-9. (29) CA SFM. Comité de l’antibiogramme de la société française de microbiologie. Recommandations 2013. (30) Ros A, Carricajo A. Utilisation en routine du système d’identification bactérienne par spectrométrie de masse par MALDI-TOF (Mattrix Assisted Laser Desorption Ionization- Time of Flight) Spectra Biologie 2011 ; 188 : 34-40. (31) Garnier J.M. Spectrométrie de masse au laboratoire d’analyses : validation de méthode ; bilan de 15 mois d’utilisation. Biotribune 2011 ; 40 : 19-40. ACCRÉDITATION Points critiques en bactériologie (32) Gravet A, Camdessoucens-Miehé G. Application de la spectrométrie de masse à la microbiologie. Revue Francophone des Laboratoires 2011 ; 437 : 55-64. (42) Circulaire n°DGS/RI/DGOS/PF/2010/413 du 6 décembre 2010 relative à la mise en œuvre de mesure de contrôles des cas importés d’entérobactéries productrices de carbapénèmases (EPC). (43) Haute autorité de santé, Recommandations relatives aux mesures à mettre en œuvre pour prévenir l’émergence des entérobactéries BLSE et lutter contre leur dissémination. Haut Conseil de la Santé Publique. Février 2010. (44) Haut conseil de santé publique. Recommandations relatives aux mesures à mettre en œuvre pour prévenir l’émergence des entérobactéries BLSE et lutter contre leur dissémination. Février 2010. (45) Instruction N°DGS/DUS/RI/2011/224 du 28 août 2011 relative aux mesures de contrôle des entérobactéries productrices de carbapénémases (EPC). (46) Jehl F, Chomarat M, Tankovic J, Gérard A. De l’antibiogramme à la prescription. Editions bioMérieux ; Octobre 2012. 163 p. (33) Bizzini A, Jaton K, Romo D et al. 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