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Eléments de microscopie optique et
électronique
Marc Landry
UFR SDV, Université Bordeaux Segalen
IINS, CNRS UMR 5297
Les échelles de grandeur
Microscope de Hooke (XVIIème siècle)
1. Bases de la microscopie
1.1. Dualité onde-corpuscule
1.2. Eléments d’un microscope
1.3. Formation d’une image en microscopie optique
1.4. Electron et rayonnement
1.1. Dualité onde-corpuscule
• Fréquence: n = c/l
• Energie: E = hn
De Broglie
•Ondes : diffraction, interférences
•Corpuscules : collision
1.2. Eléments d’un microscope
Deux catégories de microscopes
Tout microscope est constitué :
•d’une source de rayonnement
•d’un échantillon
•d’un détecteur de la vitesse et des directions des particules après collision
•Détecteur loin de l’échantillon: microscopie de champ lointain
•Pas de séparation entre source, échantillon et détecteur (sonde
locale): microscopie de champ proche
1.2. Eléments d’un microscope
Le microscope optique
•Observation en transmission
•Observation en réflexion
1.3. Formation d’une image
en microscopie optique
1.3.1. Interaction onde-matière
1.3.2. Principe d’une lentille convergente
1.3.3. Trajet de la lumière dans un microscope
1.3.4. Limites de résolution
1.3.5. Anomalies des lentilles
1.3.1. Interaction onde-matière
Absorption-Emission
1.3.1. Interaction onde-matière
Réflexion-Réfraction
•Propagation différentielle selon le milieu traversé (déphasage et déviation)
•Caractérisé par un indice de réfraction n=c/v
•Propagation différentielle selon les longueurs d’onde
1.3.1. Interaction onde-matière
Réflexion-Réfraction
1.3.1. Interaction onde-matière
Diffraction
1.3.1. Interaction onde-matière
Fluorescence
Simplified Jablonski diagram
S1


10-15s
hvex

hvem
S0
Wavelength (nm)
: Change from ground state S to excited state S’ following light energy absorption hv
Step : Energy of S’ is partially dissipated  S from which fluorescence emission originates
Step : A photon of energy hv is emitted, returning the fluorophore to its ground state S .
Step
S0 = Ground state
S’1 S1 = Excited state
10-9s à 10-7s
S’1
0
1
ex
1
1
em
0
Due to energy dissipation during the excited-state lifetime, the energy of this photon is lower and
therefore of longer wavelength than the excitation photon hvex.
Important fluorochromes used in microscopy
immunofluorescence
AMCA ; Alexa Fluor 488, Alexa 568, Alexa 647, etc. ; Cy2 (Cyanine2), FITC, Cy3.5, TRITC,
lissamine rhodamine, Texas Red, Cy5
DNA
Propidium iodide, YOYO, SYTO16 (vital), chromomycine A3 ou mithramycine (bases GC),
bisbenzimide Hoechst 33342 , DAPI, DRAQ5, YOPRO, TOTO3, TOPRO3
mitochondria
Rhodamine123, DiOC6(3), DiOC7(3), JC-1, MitoTracker Red CMXRos (vital; post-fixation
possible)
membranes
FM1-43, FM4-64, GFP-tagged probes
Endoplasmic reticulum
(non specific) DiOC6(3) high concentrations ; GFP-tagged probes
Golgi apparatus
Antibodies, GFP-tagged probes ; NBD-C6-ceramide (not for plants)
Cell wall
Acriflavine Feulgen, Calcofluor (UV), aniline blue (sur callose), chromomycine or propidium
iodide(non spécific), FM1-43, FM4-64
pH
carboxy-SNARF-1 and derivatives, BCECF
calcium
Fluo-3 ou -4 (FF), Fura Red, CalciGreen ; Indo-1, Cameleon
viability
fluoresceine di-acetate ; exclusion of propidium iodide ; Fluoro-Jade (Histo-Chem) and
morphology by differential interference contrast (DIC)
autofluorescent proteins
BFP, CFP, GFP, YFP, DsRed, DsRed2, HcRed1, etc
miscellaneous
Acridine Orange, Neutral Red, Lucifer Yellow, chlorophyl
Fluorescent proteins : Green Fluorescent Protein
Aequorea victoria (Shimomura
et al., 1962)
Spectral
characterization
Specific features
Advantadges
Can be fused to other proteins of
interest
No substrate or cofactor
No species specificity
Stable
(pH,
T,
denaturation,
proteases, aldehydes)
Disadvantadges
Non optimal excitation peak for the
existing laser sources
Cryptic intron in plants
Need to obtain spectral variants
GFP variants
(Heim et al.,
1994, 1995,
1996)
Red Fluorescent Proteins
Coral reef proteins from
the Indian and pacific
Ocean (Matz et al., 1999)
Characteristics similar
to GFP except for a
slower maturation and
the
obligatory
oligomerization
Mutation to generate
fast maturing variants
and monomers
Broad excitation/emission spectra
18
EBFP
ECFP
EGFP EYFP DsRed
Intensité
100
mRFP1
EBFP ECFP EGFP EYFP DsRed
100
HcRed
80
80
60
60
40
40
20
20
0
350
UV
400
450
500
550
HcRed
0
600
UV
bleu
vert orange rouge
Longueur d’onde (nm)
ε (M-1. cm-1)
mRFP1
400
450
bleu
500
550
600
650
vert orange rouge
Longueur d’onde (nm)
brillance (ε .  UA)
21 600
700
IR
Ex (nm)
Em (nm)
wtGFP neutre
395
508
wtGFP phénolate
475
503
9,5-14 000
EBFP
380
440
31 000
0,18
5 600
bleu
ECFP
434
477
26 000
0,40
10 000
cyan
EGFP
488
509
55 000
0,60
33 000
5,5
vert
EYFP
515
529
80 400
0,61
49 000
6,9
jaune
Venus YFP
510
530
92 000
0,57
52 000
6,0
insensible Cl-1
DsRed ; DsRed2
558
583
57 000
0,79
45 000
4,7
Discosoma striata
mRFP1
584
607
44 000
0,25
11 000
4,5
DsRed monomère
HcRed1 ; HcRed-2A
588
618
fluorescéine
490
520
80 000
0,90
72 000
605
2 400 000
0,40
1 000 000
Quantum Dot 405/605
25-30 000
F
0,79
pKa
Remarque
4,5
Aequorea victoria
~9 400
Aequorea victoria
faible
Heteractis crispa
6,3
à valider
Epi-fluorescence microscope
Excitation
filter
Arc
lamp
Band Pass filter
Ocular
Lens
Emission
filter
Dichroic
mirror
Collector
lens
Objectif
lens
Sample
Long Pass filter
Light source spectral characteristics
Mercury lamp (HBO)
● power 50 to 100W
● lifetime from 150 to 300h
● good excitation in UV
● peak of intensity in the blue and green light
Xenon Lamp (XBO)
● power 50 to 150W
● lifetime from 150 to 2000h
● homogenous light for all wavelength
● weak intensity in UV, strong intensity in IR
Dichroïc mirror
Dichroïc mirror at 45°
510 Long Pass (LP)
Transmitted Light
Detector
100%
0%
Sample
% Reflection
Reflected light
100%
Reflect
UV
Pass
wavelength
% Transmission
Light source
0%
IR
Fluorescence Filters
>520 nm
Light source
Transmitted light
% Transmission
520 nm Long Pass Filter
block
pass
UV
IR
Light source
Transmitted light
<575 nm
% Transmission
575 nm Short Pass Filter
block
pass
630 nm BandPass Filter
Light source
Transmitted light
620 -640 nm Light
% Transmission
UV
IR
block
block
pass
UV
IR
1.3.2. Principe d’une lentille convergente
2f>d>f
d>2f
1.3.3. Trajet de la lumière dans un microscope
1.3.4. Limites de résolution
Tache d’Airy
La résolution résulte de :
•La fonction de défocalisation en z
•La fonction d’étalement du point dans le
plan focal (point spread function, PSF)
Interférences constructives et destructives
D=0,61×l/nsina
1.3.4. Limites de résolution
Ouverture numérique
Numerical Aperture (NA) = n(sin m)
1.3.4. Limites de résolution
Illumination
Focalisation de la lumière sur l’objet
Le rôle du condenseur
1.3.5. Anomalies des lentilles
•Anomalie sphérique
•Anomalie comatique
•Astigmatisme
•Anomalie chromatique (meilleure focalisation des longueurs d’onde courtes)
1.3.5. Anomalies des lentilles
Correction des objectifs
1.4. Electron et rayonement
Longueur d’onde
•Equation de De Broglie
•Energie cinétique
(charge e = 1,6.10-19 C; masse m = 9,11.10-28 g;
différence de potentiel V)
1 Joule = 107.cm2.g.s-2
Exemple : si V = 60 kV; alors l = 5.10-3 nm
1.4. Electron et rayonnement
Vitesse des électrons
V
l (nm)
v (•10-10 cm/sec)
v/c
10,000
0.0123
0.593
0.198
50,000
0.0055
1.326
0.442
100,000
0.0039
1.875
0.625
1,000,000
0.0012
5.930
1.977!
•Correction relativiste
V
l (nm)
v (•10-10 cm/sec)
v/c
10,000
0.0123
0.593
0.195
50,000
0.0055
1.326
0.414
100,000
0.0037
1.875
0.548
1,000,000
0.00087
5.930
0.941
2. Elements d’un microscope électronique
2.1. Histoire de la microscopie électronique
2.2. Grands types de microscopes électroniques
2.3. Sources d’électrons
2.4. Lentilles électro-magnétiques
2.5. Détecteurs d’électrons
2.6. Microscopes à transmission et à balayage
2.1. Histoire de la microscopie électronique
2.1. Histoire de la microscopie électronique
Comparaison optique-électronique
Similarités:
•Système d’illumination: source de rayonnement +
condenseur
•Echantillon
•Formation de l’image: lentille objectif + lentille
projective
•Détection de l’image
Différences:
•Lentilles optiques et ferromagnétiques
•Grandissements obtenus par changement de
lentilles objectifs ou de la distance focale de la
lentille projective
•Profondeur de champ
•Nature du contraste
•Vide et déshydratation
2.2. Grands types de microscopes
Le microscope électronique simplifié
Ruska, 1931
2.3. Sources d’électrons
Source thermo-ionique
½mv² = e(Vc-Va)
v = [2e(Vc-Va)/m]
et l = h/(mv)
1/2
l = h/[2me(Vc-Va)]
Filament de tungstène ou
d’hexaborure de lanthane
1/2
Va-Vc (kV)
v (m/s)
100
200
1,9.108
2,7.108
Source à effet de champ
(Field Emission Gun)
constantes
l (10-1nm)
0,039
0,027
h = 6,63.10-34 J.s (constante de Planck)
m = 9,11.10-31 kg (masse de l'électron)
e = -1,6.10-19 C (charge de l'électron)
c = 3.108 m/s (vitesse de la lumière)
2.4. Lentilles électro-magnétiques
Focalisation des électrons
Le facteur d’excitation modifie l’intensité
de la composante radiale du champ, donc la
convergence de la lentille
K = N2I2/V*
2.4. Lentilles électro-magnétiques
Anomalies des lentilles
•Anomalie sphérique (d’ouverture)
•Pouvoir de résolution
2.5. Détecteurs d’électrons
Microscopie à transmission: Détecteur 2D
•Ecran fluorescent
•Emulsion photographique
•Détecteurs CCD et PDA
Microscopie à balayage: Détecteur simple
2.6. Microscopes à transmission et à balayage
Colonne du microscope à transmission
2.6. Microscopes à transmission et à balayage
Système de vide
2.6. Microscopes à transmission et à balayage
Insertion de l’échantillon
2.6. Microscopes à transmission et à balayage
Colonne du microscope à balayage
3. Formation des images en microscopie
électronique
3.1. Interactions électron-matière
3.2. Contraste dans les structures amorphes
3.3. Contraste dans les structures cristallines
3.4. Contraste en microscopie à balayage
3.1. Interactions electron-matière
Microscopie optique:
Variations d’absorbance
Microscopie électronique:
Interactions électroniques
•Diffusion élastique (contraste)
•Diffusion inélastique (microscopie analytique)
3.2. Contraste dans les structures amorphes
Diaphragme de contraste

Contraste d’absorption
3.3. Contraste dans les structures cristallines
Diffraction par un réseau
Champ clair
Champ noir
3.4. Contraste en microscopie à balayage
P(R) = nZ
S = image de la surface
4. Préparation des échantillons et exemples d’applications
4.1. Préparation des échantillons
4.2. Cytologie
4.3. Physiologie cellulaire
4.4. Immunohistochimie
4.5. Hybridation in situ
4.6. Biologie des virus
4.7. Autoradiographie
4.1. Préparation de l'échantillon
Si l'échantillon est inorganique
•Polissage électrolytique (métaux et alliages)
•Polissage chimique (presque tous les types de matériaux)
•Amincissement sous bombardement d'ions primaires (presque tous les types de matériaux)
•Polissage mécanique très doux sur un système dit "tripode"
•Coupe par ultramicrotomie
Si l'échantillon est organique
•Traitement de fixation (processus chimique ou physique).
•Déshydratation par substitution à température ambiante de solvants organiques (alcool ou
acétone) à l'eau.
•Imprégnation dans différents types de résines, choisies en fonction de l'observation
recherchée (polymérisation).
•Le matériau est suffisamment résistant pour être débité sous forme de lames minces de
0,5 à 0,05 µm d'épaisseur en moyenne. (ultramicrotome : couteau de verre ou en diamant).
•Pour améliorer le contraste entre les différents organites cellulaires, on expose souvent
l'échantillon à un produit contenant des atomes lourds (acétate d'uranyle et citrate de
plomb), afin que ces derniers, en diffusant à la surface des différentes structures
cellulaires, les rendent visibles.
Préparation des échantillons en microscopie à
transmission
Coupes ultra-fines
Cryofractures
Comparaison des images
Microscopie à transmission
Microscopie à balayage
Visualisation 3D en microscopie électronique
• Tomographie électronique ou cellulaire
Organisation tridimensionnelle des épines
pccor10_img
• Visualisation
2D
• Tomogramme
• Visualisation
3D
• Reconstitution
3D
Réseau pré-synaptique
• Réticulation des
vésicules synaptiques
• Vésicules “dockées”
4.2 Cytologie
4.2.1. Organelles
4.2.2. Cytosquelette
4.2.3. Noyau
4.2.4. Situations pathologiques
4.2.5. Artéfacts
4.2.6. Cryométhodes
4.2.1. Organelles
Muscle
Polyribosomes
Mitochondrie
Synapse
4.2.2. Cytosquelette
Coupes de microtubules
Coupe de cil
Coupes de microtubules
4.2.3. Noyau
Fuseau mitotique
Empreinte d’ADN
4.2.5. Artéfacts
Artéfacts d’observation
Membranes accolées
Confronting cisterns
4.2.5. Artéfacts
Artéfacts de fixation
Myelin-like body
Corps multivésiculé
4.2.6. Cryométhodes
4.3. Physiologie cellulaire
Trafic intracellulaire
Pinocytose
Vésicules recouvertes de clathrine
4.3. Physiologie cellulaire
Biologie du développement: Gastrulation
4.3. Physiologie cellulaire
Biologie du développement: Neurogénèse
Tube nerveux
Cône de croissance
Filopodia
4.3. Physiologie cellulaire
Reconstructions tridimensionnelles
Reticulum
Mitochondries confluentes
4.4. Immunocytochimie
Localisation
Marqueur enzymatique:
Microscopie optique
Microscopie électronique
4.4. Immunocytochimie
Localisation
Or colloïdal:
Microscopie électronique
4.4. Immunocytochimie
Physiologie cellulaire
Secrétion peptidergique
Rôle de neurotransmetteur, Libération extrasynaptique
Pow and Morris, 1989
4.4. Immunocytochimie
Marquages multiples
Différentes tailles de particules
4.4. Immunocytochimie
Trafic intracellulaire
Bernard et al., 2003
4.5. Hybridation in situ
Détection radioactive
4.5. Hybridation in situ
Protocoles non radioactifs
ARNm Gal
4.6. Biologie des virus
4.7. Autoradiographie
Division cellulaire
Thymidine H3
Recapture de noradrénaline H3
Conclusions
Sources d’informations irremplaçables
Autres développements: microscopie analytique
Préservation des structures
Résolution améliorée: microscopie à force atomique