Tp 4

TP 4 Recherche du statut immunitaire chez un individu (Test ELISA)
Mise en situation et recherche à mener
Pour vérifier l’hypothèse du Dr House et afin de rester dans la course, vous lui proposez, en tant que jeune immunologiste, un dernier examen médical, le test
ELISA.
On cherche à détecter une séropositivité au flavivirus dans le cas de Léonor Grey et à doser les anticorps présents dans son sérum.
Ressources
Document :
- Les anticorps sont des molécules solubles qui se fixent
spécifiquement à un antigène. Cette reconnaissance entraîne la
formation d'un complexe immun (Ag-Ac) insoluble
- La technique ELISA (Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay) est
une technique immuno-enzymatique de détection qui permet de
visualiser une réaction antigène (AG) – anticorps (AC1 anti-AG)
grâce à une réaction colorée produite pas l’action sur un substrat
d’une enzyme (peroxydase) préalablement fixée à un deuxième
anticorps (AC2).
- Animation projetée du Test ELISA
Matériel envisageable :
 de laboratoire (verrerie, instruments …)
 d’observation (microscope, loupe binoculaire…)
 de mesure et d’expérimentation (balance, chaine ExAO…)
- informatique et d'acquisition numérique (toutes molécules nécessaires)
Etape 1 : Concevoir une stratégie pour résoudre une situation problème (durée maximale : 10 minutes)
1) En utilisant les ressources proposées, proposer une démarche d’investigation permettant de détecter la séropositivité de Leonor
Grey au flavivirus et de doser les anticorps de son sérum.
Appeler le professeur pour vérifier votre proposition et obtenir la suite du sujet.
Votre proposition peut s’appuyer sur un document écrit (utiliser les feuilles de brouillon mises à votre disposition) et/ou être faite à l’oral.
Etape 2 : Mettre en œuvre un protocole de résolution pour obtenir des résultats exploitables
2) Mettre en œuvre le protocole de détection de la présence des anticorps dirigés contre le flavivirus (test de détection
moléculaire ELISA) permettant de montrer la séropositivité de Miss GREY et de déterminer la teneur de ces anticorps dans son
sérum.
Appeler le professeur pour vérifier les résultats et éventuellement obtenir une aide.
Etape 3 : Présenter les résultats pour les communiquer
3) Sous la forme de votre choix, traiter les données obtenues pour les communiquer.
Répondre sur la fiche-réponse fournie, appeler le professeur pour vérification de votre production.
Etape 4 : Exploiter les résultats obtenus pour répondre au problème
4) Exploiter les résultats pour déterminer si Léonor Grey est séropositive au flavivirus.
5) En utilisant les données du document annexe, préciser la concentration de ses anticorps anti-flavivirus dans son sérum.
-
Matériel disponible et protocole d'utilisation du matériel
Matériel disponible :
- Sérum de Léonor Grey noté SLG
- Sérum d’un individu sain noté NIF
- 6 solutions d’anticorps anti-flavivirus de concentrations
décroissantes notées C1, C2, C3, C4, C5, C6
- Barrette de 8 puits au fond desquels sont fixés des antigènes
(protéines spécifiques du flavivirus)
- Solution d’anticorps de "détection" D : ce sont des anticorps antianticorps flavivirus, capables de se fixer sur la partie constante des
anticorps et sur lesquels on a fixé une enzyme : la peroxydase.
- Solution de substrat (TMB) de l’enzyme peroxydase qui, au contact
de la peroxydase, est catalysé et se colore en bleu (réaction enzymesubstrat)
- Solution de lavage notée R
- Gants, lunettes, papier filtre
- Micropipette et embouts jetables (ou équivalent),
- Un feutre permanent
1- Numéroter les puits de 1 à 6 et nommer SLG le 7° puits, et NIF le 8ème
puits.
2- Déposer 100 L :
 de la solution C1 dans le puits1 (témoin positif), C2 dans le puits 2, etc.,
jusqu’à C6 dans le puits 6 ;
 du sérum SLG de Léonor Grey, de concentration en anticorps inconnue,
dans le puits SLG ;
 du sérum de l’individu non immunisé NIF (témoin négatif) dans le puits NIF.
Attention, une seule solution par puits. Les niveaux des liquides doivent être, au
final, équivalents.
3- Laisser incuber 15 min à température ambiante
4- Vider la barrette en la renversant horizontalement
(voir schéma ci-contre) et d’un geste rapide audessus de l’évier de manière à éviter le mélange des
produits. Avant de la remettre à l’endroit, tamponner
la surface des puits sur du papier filtre pour éliminer
l’excès de produits et éviter la contamination.
5- Remplir tous les puits avec la solution de lavage R, sans débordement, et
vider immédiatement comme précédemment. Les anticorps fixés ne se
détachent pas. Répéter ce lavage deux fois.
6- Mettre dans chaque puits 100 L de la solution d’anticorps de détection D
sur lequel est déjà fixée l’enzyme peroxydase.
Les niveaux doivent être, au final, équivalents.
7- Laisser agir 15 minutes
8- Vider dans l’évier le contenu des puits en renversant la barrette et les laver
3 fois comme au point 5 afin d’éliminer l’excès d’AC n’ayant pas réagi.
9- Mettre dans chaque puits 3 gouttes de substrat S de l’enzyme peroxydase.
Les niveaux doivent être équivalents au final.
Une coloration se développe. Ne pas attendre trop longtemps pour
comparer les colorations car au bout de quelques minutes les différences
s’estompent.
Appeler le professeur pour vérifier les résultats.
FICHE ANNEXE
Concentration
en g d’Ac.mL-1
C1
C2
C3
C4
C5
C6
17,00
8,50
4,25
2,12
1,06
0,53
TP 4 Recherche du statut immunitaire chez un individu
Légendes :
Fond du puits avec protéines du flavivirus
Substrat de l’enzyme
Anticorps à doser = AC anti-Flavivirus
Substrat coloré en présence de peroxydase
(Test ELISA)
Anticorps de détection couplé à la peroxydase
Peroxydase
Tableau des résultats du Test ELISA :
Puits 1 (témoin-------------------)
Puits 5
Puits 7
Puits 8 (témoin -------------------------)
- Solutions versées dans le puits :
- Solutions versées dans le puits :
- Solutions versées dans le puits :
- Solutions versées dans le puits :
- Schéma d’interprétation des diverses
réactions s’étant déroulées dans le puits :
- Schéma d’interprétation des diverses
réactions s’étant déroulées dans le puits :
- Schéma d’interprétation des diverses
réactions s’étant déroulées dans le puits :
- Schéma d’interprétation des diverses
réactions s’étant déroulées dans le puits :
- Résultat :
- Résultat :
- Résultat :
- Résultat :