PNF-SAN.25.2 - Centre national de biologie expérimentale

CENTRE NATIONAL DE BIOLOGIE EXPÉRIMENTALE (CNBE)
Procédure Normalisée de Fonctionnement
PNF-SAN.25.2
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PRODUCTION D’ANTICORPS POLYCLONAUX CHEZ LE LAPIN
DESTINATAIRES : Chercheur responsable, vétérinaire et personnel technique du CNBE.
OBJET : Décrire les étapes pour effectuer la production d’anticorps polyclonaux chez le
lapin afin de s’assurer du suivi du protocole et du bien-être des animaux.
GÉNÉRALITÉS : Les anticorps sont produits par le système immunitaire d'un animal comme
moyen de défense contre un immunogène spécifique. Le système immunitaire
agit par l'intermédiaire de deux principaux mécanismes qui sont la réponse de
type humoral (production d'anticorps) et la réponse à médiation cellulaire. Les
immunogènes (antigènes) sont les molécules qui peuvent déclencher une
réponse immunitaire spécifique; il s'agit généralement de substances
étrangères comme des protéines, des peptides synthétiques, des glucides, des
lipides ou des acides nucléiques.
MATÉRIEL : Seringues, aiguilles ˂ 20G, valve à 3 voies
"Bunny Snuggle"
Ethanol 70%, gaze
Peroxyde
Pentobarbital, acépromazine
Glycopyrrolate, xylazine, kétamine
Tube de prélèvement (anticoagulant ou tube avec gel)
Centrifugeuse
Rasoir
Crayon indélébile
Glace mouillée (tubes avec anticoagulant)
Glace sèche (sérum)
PROCÉDURE:
1 RÉCEPTION DES ANIMAUX
1.1 Utiliser des lapins vendus commercialement (New Zealand white rabbits ou autres selon les
recommandations du client).
1.2 Le poids recommandé est de 1.9 à 2.7 kg.
1.3 Une période d’acclimatation de 10 jours doit être allouée à l’arrivée des animaux au CNBE
afin de s’assurer de leur état de santé.
1.4 Les animaux sont pesés et observés chaque semaine par le personnel technique.
1.5 Couper les griffes au besoin.
2 ANTIGÈNE ET ADJUVANT
2.1 Le chercheur responsable (ou désigné), incluant le chercheur d’organisme ou de compagnie
externe, doit s’assurer que sa préparation antigénique est stable, sans pathogène activé, non-
toxique et exempte d’endotoxine. Une déclaration à cet effet (FOR-SAN.25) doit être signée
par le chercheur responsable de l’étude. Le pH doit être ajusté aux limites physiologiques (le
plus neutre possible).

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2.2 Le produit devra être homogène et passer facilement dans une aiguille 21G.
2.3 Le chercheur doit déterminer si son produit doit être mélangé à un adjuvant et dans quelle
proportion (ratio).
2.4 Les adjuvants les plus communs sont Quil A, TiterMax, hydroxyde d’aluminium, phosphate
d’aluminium, adjuvant incomplet de Freund (AIF) et adjuvant complet de Freund (ACF).
2.5 L’immunisation initiale de l’animal consiste en une première injection des antigènes
mélangés ou non avec l’adjuvant.
2.6 L’utilisation de l’adjuvant de Freund doit être justifiée scientifiquement en démontrant que
les autres adjuvants sont inadéquats pour les objectifs du projet.
2.7 Si l’ACF est utilisé pour l’immunisation initiale, les prochaines immunisations (rappels)
devront être faites avec l’AIF ou un autre adjuvant. Il est interdit de faire les rappels avec
l’adjuvant complet de Freund (ACF).
2.8 La concentration de l’ACF doit être de 0.5 mg/ml de mycobactéries ou moins.
3 ADMINISTRATION DE L’ANTIGÈNE ET SUIVI CLINIQUE
3.1 Faire les injections par voie intramusculaire (IM) ou sous-cutané (SC) avec des aiguilles < 20G.
3.2 Raser et entourer les sites avec un marqueur indélébile avant les injections SC.
3.3 Les sites d’injection doivent être suffisamment espacés pour empêcher la coalescence des
lésions inflammatoires, ce qui peut entraîner l’interruption de l’irrigation sanguine de la
région touchée et causer de la nécrose.
3.4 Aseptiser (p. ex. alcool ou hibitane dilué avec l’eau: 1.5 ml de chlorhexidine 4% + 4.5 ml
d’eau; la chlorhexidine diluée se conserve 24 heures) et laisser sécher les sites avant
l’injection d’immunogène ou de mélange immunogène/adjuvant.
3.5 L’administration de l’antigène avec adjuvant doit se faire avec un maximum de 1 ml sur 10
sites (0.1 ml par site) par voie SC et un maximum de 0.5 ml sur 2 sites (0.25 ml par site sur
chaque membre postérieur) par voie IM. Si l’antigène ne contient pas d’adjuvant, administrer
un volume maximum de 1.5 ml/site (SC) et 0.5 ml/site (IM).
3.6 Surveiller tout signe de réaction anaphylactique (p. ex. dyspnée, prurit, œdème de muqueuse,
problèmes de déglutition, pétéchie, diarrhée, anxiété, perte de conscience) pendant 15
minutes post-immunisation.
3.7 Observer les animaux quotidiennement afin de détecter rapidement une diminution de la
consommation d’eau et de nourriture ou des lésions reliées à l’immunisation (p.ex.
granulomes ou ulcères).
3.8 Le vétérinaire doit être informé de tous les signes cliniques anormaux, signes de douleur ou
détresse afin de procéder à une évaluation opportune.
3.9 Attendre 2 à 4 semaines entre chaque injection pour une réponse immunitaire. Un quatrième
rappel pourrait être nécessaire selon les objectifs de l’étude ou la nature de l’antigène. Une
justification scientifique devra être soumise par courriel au vétérinaire du CNBE.

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4 PRÉLÈVEMENT DE SANG
4.1 Un prélèvement de sang pré-immunisation doit être effectué pour confirmer l’absence
d’anticorps relié à l’antigène d’intérêt. Les prélèvements subséquents doivent être effectués
selon les recommandations du protocole.
4.2 Anesthésier l’animal avec l’acépromazine à raison de 1 à 2 mg/kg IM. Prélever le sang dans
la veine marginale de l’oreille du lapin 5 à 10 minutes après l’injection du sédatif.
4.3 Le volume de sang nécessaire sera prélevé à la fréquence recommandée à la section 6 ou celle
spécifiée dans le protocole d’utilisation d’animaux approuvé par le CIPA. Le volume et la
fréquence doivent être validés par le vétérinaire. Prélever le sang à l’aide d’un tube contenant
un anti-coagulant ou un tube sec avec gel selon les besoins de l’étude.
4.4 Centrifuger à 3600 rpm pendant 8 minutes, récolter délicatement le sérum ou le plasma et
garder au congélateur à -80°C. Pour obtenir un sérum, attendre au minimum 30 minutes à
température ambiante que le sang soit complètement coagulé avant de centrifuger le tube.
5 EXSANGUINATION ET EUTHANASIE
5.1 À la fin de l’étude, anesthésier l’animal avec du glycopyrrolate 0.1 mg/kg par voie IM, suivi
après un délai d’au moins 10 minutes de 5.0 mg/kg de xylazine et 35 mg/kg de kétamine par
voie IM.
5.2 Vérifier les réflexes de l’animal (réflexe de retrait suite à un pincement et réflexe pupillaire)
pour s’assurer que l’animal est sous anesthésie profonde.
5.3 Prélever un volume maximal de sang par ponction intracardiaque.
5.4 Préparer le sérum ou plasma tel que décrit en 4.4.
5.5 Euthanasier l’animal avec une surdose de pentobarbital par voie intracardiaque ou dans une
veine périphérique. Confirmer le décès à l’aide d’un stéthoscope.
5.6 Une nécropsie avec collecte d’organes peut être effectuée selon les besoins de l’étude.
5.7 Éliminer les carcasses selon la PNF-OPE.07.
6 CÉDULE
6.1 L’utilisation d’une cédule d’injections et de prélèvements est indispensable.
6.2 Une cédule est proposée ci-dessous mais des modifications peuvent être apportées selon les
recommandations du protocole.
Jour 0 → Prise de sang pré-immunisation et première immunisation
Jour 21 → Premier rappel
Jour 31 → Prise de sang
Jour 42 → Deuxième rappel
Évaluer les sites d’injection dans le cas d’inflammation reliée à
l’injection primaire.
Jour 52 → Prise de sang

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Jour 70 → Troisième rappel (si les taux d’anticorps sont insuffisants). Évaluer
les sites d’injection dans le cas d’inflammation reliée à l’injection
primaire.
Jour 80 → Exsanguination et euthanasie
6.3 Une justification doit être apportée s’il y a plus de 3 rappels dans la cédule
d’immunisation. Dans plusieurs cas, le niveau d’anticorps peut être atteint après le deuxième
rappel.
7 RÉFÉRENCES
Conseil canadien de protection des animaux, lignes directrices: production d'anticorps
http://www.ccac.ca
Jackson, L.R. et al., Institutional Policies and Guidelines on Adjuvants and Antibody Production,
1995, ILAR Journal, 37, 3.
Leenaars, M.P.P.A et al., The production of Polyclonal Antibodies in Laboratory Animals, The
European Centre for the Validation of Alternative Methods (ECVAM),1999, 27,19-102
ENTRÉE EN VIGUEUR
03 nov 2014