PNF-SAN.25.2 - Centre national de biologie expérimentale
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CENTRE NATIONAL DE BIOLOGIE EXPÉRIMENTALE (CNBE) Procédure Normalisée de Fonctionnement Page 1 de 4 PNF-SAN.25.2 PRODUCTION D’ANTICORPS POLYCLONAUX CHEZ LE LAPIN DESTINATAIRES : Chercheur responsable, vétérinaire et personnel technique du CNBE. OBJET : Décrire les étapes pour effectuer la production d’anticorps polyclonaux chez le lapin afin de s’assurer du suivi du protocole et du bien-être des animaux. GÉNÉRALITÉS : Les anticorps sont produits par le système immunitaire d'un animal comme moyen de défense contre un immunogène spécifique. Le système immunitaire agit par l'intermédiaire de deux principaux mécanismes qui sont la réponse de type humoral (production d'anticorps) et la réponse à médiation cellulaire. Les immunogènes (antigènes) sont les molécules qui peuvent déclencher une réponse immunitaire spécifique; il s'agit généralement de substances étrangères comme des protéines, des peptides synthétiques, des glucides, des lipides ou des acides nucléiques. MATÉRIEL : Seringues, aiguilles ˂ 20G, valve à 3 voies "Bunny Snuggle" Ethanol 70%, gaze Peroxyde Pentobarbital, acépromazine Glycopyrrolate, xylazine, kétamine Tube de prélèvement (anticoagulant ou tube avec gel) Centrifugeuse Rasoir Crayon indélébile Glace mouillée (tubes avec anticoagulant) Glace sèche (sérum) PROCÉDURE: 1 RÉCEPTION DES ANIMAUX 1.1 Utiliser des lapins vendus commercialement (New Zealand white rabbits ou autres selon les recommandations du client). 1.2 Le poids recommandé est de 1.9 à 2.7 kg. 1.3 Une période d’acclimatation de 10 jours doit être allouée à l’arrivée des animaux au CNBE afin de s’assurer de leur état de santé. 1.4 Les animaux sont pesés et observés chaque semaine par le personnel technique. 1.5 Couper les griffes au besoin. 2 ANTIGÈNE ET ADJUVANT 2.1 Le chercheur responsable (ou désigné), incluant le chercheur d’organisme ou de compagnie externe, doit s’assurer que sa préparation antigénique est stable, sans pathogène activé, nontoxique et exempte d’endotoxine. Une déclaration à cet effet (FOR-SAN.25) doit être signée par le chercheur responsable de l’étude. Le pH doit être ajusté aux limites physiologiques (le plus neutre possible). CENTRE NATIONAL DE BIOLOGIE EXPÉRIMENTALE (CNBE) Procédure Normalisée de Fonctionnement PNF-SAN.25.2 Page 2 de 4 PRODUCTION D’ANTICORPS POLYCLONAUX CHEZ LE LAPIN 2.2 Le produit devra être homogène et passer facilement dans une aiguille 21G. 2.3 Le chercheur doit déterminer si son produit doit être mélangé à un adjuvant et dans quelle proportion (ratio). 2.4 Les adjuvants les plus communs sont Quil A, TiterMax, hydroxyde d’aluminium, phosphate d’aluminium, adjuvant incomplet de Freund (AIF) et adjuvant complet de Freund (ACF). 2.5 L’immunisation initiale de l’animal consiste en une première injection des antigènes mélangés ou non avec l’adjuvant. 2.6 L’utilisation de l’adjuvant de Freund doit être justifiée scientifiquement en démontrant que les autres adjuvants sont inadéquats pour les objectifs du projet. 2.7 Si l’ACF est utilisé pour l’immunisation initiale, les prochaines immunisations (rappels) devront être faites avec l’AIF ou un autre adjuvant. Il est interdit de faire les rappels avec l’adjuvant complet de Freund (ACF). 2.8 La concentration de l’ACF doit être de 0.5 mg/ml de mycobactéries ou moins. 3 ADMINISTRATION DE L’ANTIGÈNE ET SUIVI CLINIQUE 3.1 Faire les injections par voie intramusculaire (IM) ou sous-cutané (SC) avec des aiguilles < 20G. 3.2 Raser et entourer les sites avec un marqueur indélébile avant les injections SC. 3.3 Les sites d’injection doivent être suffisamment espacés pour empêcher la coalescence des lésions inflammatoires, ce qui peut entraîner l’interruption de l’irrigation sanguine de la région touchée et causer de la nécrose. 3.4 Aseptiser (p. ex. alcool ou hibitane dilué avec l’eau: 1.5 ml de chlorhexidine 4% + 4.5 ml d’eau; la chlorhexidine diluée se conserve 24 heures) et laisser sécher les sites avant l’injection d’immunogène ou de mélange immunogène/adjuvant. 3.5 L’administration de l’antigène avec adjuvant doit se faire avec un maximum de 1 ml sur 10 sites (0.1 ml par site) par voie SC et un maximum de 0.5 ml sur 2 sites (0.25 ml par site sur chaque membre postérieur) par voie IM. Si l’antigène ne contient pas d’adjuvant, administrer un volume maximum de 1.5 ml/site (SC) et 0.5 ml/site (IM). 3.6 Surveiller tout signe de réaction anaphylactique (p. ex. dyspnée, prurit, œdème de muqueuse, problèmes de déglutition, pétéchie, diarrhée, anxiété, perte de conscience) pendant 15 minutes post-immunisation. 3.7 Observer les animaux quotidiennement afin de détecter rapidement une diminution de la consommation d’eau et de nourriture ou des lésions reliées à l’immunisation (p.ex. granulomes ou ulcères). 3.8 Le vétérinaire doit être informé de tous les signes cliniques anormaux, signes de douleur ou détresse afin de procéder à une évaluation opportune. 3.9 Attendre 2 à 4 semaines entre chaque injection pour une réponse immunitaire. Un quatrième rappel pourrait être nécessaire selon les objectifs de l’étude ou la nature de l’antigène. Une justification scientifique devra être soumise par courriel au vétérinaire du CNBE. CENTRE NATIONAL DE BIOLOGIE EXPÉRIMENTALE (CNBE) Procédure Normalisée de Fonctionnement Page 3 de 4 PNF-SAN.25.2 PRODUCTION D’ANTICORPS POLYCLONAUX CHEZ LE LAPIN 4 PRÉLÈVEMENT DE SANG 4.1 Un prélèvement de sang pré-immunisation doit être effectué pour confirmer l’absence d’anticorps relié à l’antigène d’intérêt. Les prélèvements subséquents doivent être effectués selon les recommandations du protocole. 4.2 Anesthésier l’animal avec l’acépromazine à raison de 1 à 2 mg/kg IM. Prélever le sang dans la veine marginale de l’oreille du lapin 5 à 10 minutes après l’injection du sédatif. 4.3 Le volume de sang nécessaire sera prélevé à la fréquence recommandée à la section 6 ou celle spécifiée dans le protocole d’utilisation d’animaux approuvé par le CIPA. Le volume et la fréquence doivent être validés par le vétérinaire. Prélever le sang à l’aide d’un tube contenant un anti-coagulant ou un tube sec avec gel selon les besoins de l’étude. 4.4 Centrifuger à 3600 rpm pendant 8 minutes, récolter délicatement le sérum ou le plasma et garder au congélateur à -80°C. Pour obtenir un sérum, attendre au minimum 30 minutes à température ambiante que le sang soit complètement coagulé avant de centrifuger le tube. 5 EXSANGUINATION ET EUTHANASIE 5.1 À la fin de l’étude, anesthésier l’animal avec du glycopyrrolate 0.1 mg/kg par voie IM, suivi après un délai d’au moins 10 minutes de 5.0 mg/kg de xylazine et 35 mg/kg de kétamine par voie IM. 5.2 Vérifier les réflexes de l’animal (réflexe de retrait suite à un pincement et réflexe pupillaire) pour s’assurer que l’animal est sous anesthésie profonde. 5.3 Prélever un volume maximal de sang par ponction intracardiaque. 5.4 Préparer le sérum ou plasma tel que décrit en 4.4. 5.5 Euthanasier l’animal avec une surdose de pentobarbital par voie intracardiaque ou dans une veine périphérique. Confirmer le décès à l’aide d’un stéthoscope. 5.6 Une nécropsie avec collecte d’organes peut être effectuée selon les besoins de l’étude. 5.7 Éliminer les carcasses selon la PNF-OPE.07. 6 CÉDULE 6.1 L’utilisation d’une cédule d’injections et de prélèvements est indispensable. 6.2 Une cédule est proposée ci-dessous mais des modifications peuvent être apportées selon les recommandations du protocole. Jour 0 Jour 21 Jour 31 Jour 42 Jour 52 → Prise de sang pré-immunisation et première immunisation → Premier rappel → Prise de sang → Deuxième rappel Évaluer les sites d’injection dans le cas d’inflammation reliée à l’injection primaire. → Prise de sang CENTRE NATIONAL DE BIOLOGIE EXPÉRIMENTALE (CNBE) Procédure Normalisée de Fonctionnement Page 4 de 4 PNF-SAN.25.2 PRODUCTION D’ANTICORPS POLYCLONAUX CHEZ LE LAPIN Jour 70 Jour 80 6.3 → Troisième rappel (si les taux d’anticorps sont insuffisants). Évaluer les sites d’injection dans le cas d’inflammation reliée à l’injection primaire. → Exsanguination et euthanasie Une justification doit être apportée s’il y a plus de 3 rappels dans la cédule d’immunisation. Dans plusieurs cas, le niveau d’anticorps peut être atteint après le deuxième rappel. 7 RÉFÉRENCES Conseil canadien de protection des animaux, lignes directrices: production d'anticorps http://www.ccac.ca Jackson, L.R. et al., Institutional Policies and Guidelines on Adjuvants and Antibody Production, 1995, ILAR Journal, 37, 3. Leenaars, M.P.P.A et al., The production of Polyclonal Antibodies in Laboratory Animals, The European Centre for the Validation of Alternative Methods (ECVAM),1999, 27,19-102 ENTRÉE EN VIGUEUR 03 nov 2014
