PNF-SAN.26.2 - Centre national de biologie expérimentale

CENTRE NATIONAL DE BIOLOGIE EXPÉRIMENTALE (CNBE)
Procédure Normalisée de Fonctionnement
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PRODUCTION D’ANTICORPS POLYCLONAUX CHEZ LE RAT
DESTINATAIRES: Chercheur responsable, vétérinaire et personnel technique du CNBE.
OBJET:
Décrire les étapes pour effectuer la production d’anticorps polyclonaux chez le
rat afin de s’assurer du suivi du protocole et du bien-être des animaux.
GÉNÉRALITÉS:
Les anticorps sont produits par le système immunitaire d'un animal comme
moyen de défense contre un immunogène spécifique. Le système immunitaire
agit par l'intermédiaire de deux principaux mécanismes qui sont la réponse de
type humoral (production d'anticorps) et la réponse à médiation cellulaire. Les
immunogènes (antigènes) sont les molécules qui peuvent déclencher une
réponse immunitaire spécifique; il s'agit généralement de substances étrangères
comme des protéines, des peptides synthétiques, des glucides, des lipides ou des
acides nucléiques.
MATÉRIEL:
Seringues
Aiguilles ˂ 20G
Valve à 3 voies
Rasoir
Gaze
Ethanol 70%
Crayon indélébile
Tube de prélèvement (anticoagulant ou tube avec gel)
Centrifugeuse
Glace mouillée (tubes avec anticoagulant)
Glace sèche (sérum)
PROCÉDURE:
1 RÉCEPTION DES ANIMAUX
1.1
Des rats adultes (Sprague Dawley ou autres selon les recommandations du client) doivent
être utilisés.
1.2
Le poids recommandé est de 200-250 g.
1.3
Une période d’acclimatation de 5 jours doit être allouée à l’arrivée des animaux au CNBE
afin de vérifier leur état de santé.
1.4
Les animaux sont pesés et observés chaque semaine par le personnel technique.
2 ANTIGÈNE ET ADJUVANT
2.1
Le chercheur responsable (ou son désigné), incluant le chercheur d’organisme ou de
compagnie externe, doit s’assurer que sa préparation antigénique est stable, sans pathogène
activé, non-toxique et exempte d’endotoxine. Une déclaration à cet effet (FOR-SAN.26) doit
être signée par le chercheur responsable de l’étude. Le pH doit être ajusté aux limites
physiologiques (le plus neutre possible).
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2.2
Le produit devra être homogène et passer facilement dans une aiguille 21G.
2.3
Le chercheur doit déterminer si son produit doit être mélangé à un adjuvant et dans quelle
proportion (ratio).
2.4
Les adjuvants les plus communs sont Quil A, TiterMax, hydroxyde d’aluminium, phosphate
d’aluminium, adjuvant incomplet de Freund (AIF) et adjuvant complet de Freund (ACF).
2.5
L’immunisation initiale de l’animal consiste en une première injection des antigènes
mélangés ou non avec l’adjuvant.
2.6
L’utilisation de l’adjuvant de Freund doit être justifiée scientifiquement en démontrant que
les autres adjuvants sont inadéquats pour les objectifs du projet.
2.7
Si l’ACF est utilisé pour l’immunisation initiale, les prochaines immunisations (rappels)
devront être faites avec l’AIF ou un autre adjuvant. Il est interdit de faire les rappels avec
l’adjuvant complet de Freund (ACF).
2.8
La concentration de l’ACF doit être de 0.5 mg/ml de mycobactéries ou moins.
3 ADMINISTRATION DE L’ANTIGÈNE ET SUIVI CLINIQUE
3.1
Faire les injections par voie sous-cutané (SC) avec des aiguilles < 20G.
3.2
Raser et entourer les sites avec un marqueur indélébile avant les injections.
3.3
Les sites d’injection doivent être suffisamment espacés pour empêcher la coalescence des
lésions inflammatoires, ce qui peut entraîner l’interruption de l’irrigation sanguine de la
région touchée et causer de la nécrose.
3.4
Aseptiser (p. ex. alcool ou hibitane dilué avec l’eau: 1.5 ml de chlorhexidine 4% + 4.5 ml
d’eau; la chlorhexidine diluée se conserve 24 heures) et laisser sécher les sites avant
l’injection d’immunogène ou de mélange immunogène/adjuvant.
3.5
L’administration de l’antigène avec adjuvant doit se faire avec 0.2 ml sur 4 sites (0.05 ml par
site) bilatéral au niveau thoraco-lombaire. Si l’antigène ne contient pas d’adjuvant,
administrer un volume maximum de 1.0 ml sur 5 sites (0.2 ml par site).
3.6
Surveiller tout signe de réaction anaphylactique (p. ex. dyspnée, prurit, œdème de muqueuse,
pétéchie, diarrhée, anxiété, perte de conscience) pendant 15 minutes post-immunisation.
3.7
Observer les animaux quotidiennement afin de détecter rapidement une diminution de la
consommation d’eau et de nourriture ou des lésions reliées à l’immunisation (p. ex.
granulomes ou ulcères).
3.8
Le vétérinaire doit être informé de tous les signes cliniques anormaux, des signes de douleur
ou détresse afin de procéder à une évaluation opportune.
3.9
Attendre 2 à 4 semaines entre chaque injection pour une réponse immunitaire. Un quatrième
rappel pourrait être nécessaire selon les objectifs de l’étude ou la nature de l’antigène. Une
justification scientifique devra être soumise par courriel au vétérinaire du CNBE.
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4 PRÉLÈVEMENT DE SANG
4.1
Un prélèvement de sang pré-immunisation doit être effectué pour confirmer l’absence
d’anticorps relié à l’antigène d’intérêt.
4.2
Le sang doit être prélevé dans la veine jugulaire, saphène ou sublinguale sans anesthésie.
4.3
Le volume de sang requis sera prélevé à la fréquence recommandée à la section 6 ou celle
spécifiée dans le protocole d’utilisation d’animaux approuvé par le CIPA. Le volume et la
fréquence doivent être validés par le vétérinaire.
4.4
Prélever le sang à l’aide d’un tube contenant un anti-coagulant ou un tube sec avec gel selon
les besoins de l’étude.
4.5
Centrifuger à 3600 rpm pendant 8 minutes, récolter délicatement le sérum ou le plasma et
garder au congélateur à -80°C. Pour obtenir un sérum, attendre au minimum 30 minutes à
température ambiante que le sang soit complètement coagulé avant de centrifuger le tube.
4.6
À la fin de l’étude, une exsanguination sera effectuée.
5 EXSANGUINATION ET EUTHANASIE
5.1
L’animal doit être anesthésié selon les procédures en place au CNBE.
5.2
Procéder à l’exsanguination par une ponction intracardiaque et euthanasier l’animal selon la
PNF-SAN.06.
5.3
Une nécropsie avec collecte d’organes pourra être effectuée selon les besoins de l’étude.
5.4
Éliminer les carcasses selon la PNF-OPE.07.
6 CÉDULE
6.1
L’utilisation d’une cédule d’injections et de prélèvements est indispensable.
6.2
Une cédule est proposée ci-dessous mais des modifications peuvent être apportées selon les
recommandations du protocole.
Jour 0
Jour 21
Jour 21 à 31
Jour 42
Jour 42 à 52
Jour 70
Jour 80
6.3
→ Prise de sang pré-immunisation et première immunisation
→ Premier rappel
→ Prise de sang (selon les besoins du client)
→ Deuxième rappel
Évaluer les sites d’injection dans le cas d’inflammation reliée à
l’injection primaire.
→ Prise de sang (selon les besoins du client) ou exanguination
→ Troisième rappel (si les taux d’anticorps sont insuffisants)
Évaluer les sites d’injection dans le cas d’inflammation reliée à
l’injection primaire.
→ Exsanguination et euthanasie
Une justification doit être apportée s’il y a plus de 3 rappels dans la cédule
d’immunisation. Dans plusieurs cas, le niveau d’anticorps peut être atteint après le deuxième
rappel.
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7 RÉFÉRENCES
Conseil canadien de protection des animaux, lignes directrices: production d'anticorps
http://www.ccac.ca
Jackson, L.R. et al., Institutional Policies and Guidelines on Adjuvants and Antibody
Production, 1995, ILAR Journal, 37, 3.
Leenaars, M.P.P.A et al., The production of Polyclonal Antibodies in Laboratory Animals,
The European Centre for the Validation of Alternative Methods (ECVAM),1999, 27,19-102
ENTRÉE EN VIGUEUR
03 nov 2014