Sujet stage IMHE-M1 Escoubas Duvic DGIMI

Université Montpellier 2 - Master Sciences pour l’Environnement
Mention : Biologie des Plantes, des Microorganismes, Bioingéniéries, Bioprocédés
Spécialité : IMHE (Interactions Microorganismes, Hôtes, Environnements)
Renvoyer la proposition de sujet de stage à
[email protected] , [email protected]
Responsable des stages d’Initiation à la Recherche de M1 et de M2 :
Tatiana Vallaeys : [email protected] Tél : 04 67 14 40 11
Administration :
Patricia Quéméner : [email protected]
Sujet de stage préciser le niveau souhaité M1 et/ou M2 (le cas échéant indiquez vos
préférences:
Stage niveau M1
Etude de l'activité immunosupressive de bactéries entomopathogènes du genre
Xenorhabdus via un crible d'analyse fonctionnelle in cellulo.
Responsable (s) de stage : Escoubas J.-M. & Duvic B.
Encadrant (si différent du Responsable de stage notamment dans le cas où le Responsable
n’est pas un Enseignant-Chercheur ou un Chercheur) :
Personnel technique éventuellement impliqué dans la formation du stagiaire :
Eychenne M. ; Pages S.
Tel et Email du Responsable de stage et de l’encadrant (si différent du Responsable de
stage) : [email protected] 04 64 14 47 11
[email protected]
04 67 14 46 72
Laboratoire d’Accueil et nom du Directeur :
"Diversité, Génomes et Interactions Microorganismes-Insectes" (DGIMI)
Directeur : Tailliez P.
Equipe d’Accueil : Biologie intégrative des interactions bactérie – insecte – nématode
entomopathogène (BIBINE)
Responsable d’équipe : Givaudan A.
Dans quel contexte s’insère le sujet de stage (démarrage d’un projet, travail partiel d’un sujet
de thèse …….) :
Trois des quatre équipes du laboratoire DGIMI travaillent sur les interactions hôte pathogènes
au travers d’un modèle composé d’un hôte Spodoptera frugiperda (Lépidoptère, Noctuelle) et de trois
groupes de pathogènes, des complexes némato-bactériens, des parasitoïdes et des virus. Le sujet de
stage proposé constitue la première phase d’un projet inter-équipe visant à comparer, par des
approches in cellulo, les points communs et les divergences dans les stratégies de virulence des trois
pathogènes.
Techniques utilisées : Clonage, culture cellulaire, transfection, cytométrie en flux, ARN
interférence, bactériologie
Description du stage : donner un résumé (contexte, problématique, matériels et méthodes).
Contexte
Des données récentes indiquent que des pathogènes aussi différents que des bactéries et des virus
utilisent des stratégies communes pour déjouer les mécanismes de défense de leurs hôtes. En effet,
des travaux menés sur une bactérie entomopathogène et sur un parasitoïde montrent que les voies de
signalisation Rel/NF-κB (pivots de la réponse immunitaire des insectes) sont des cibles privilégiées
des pathogènes (1, 2). Afin d’analyser au niveau moléculaire, l’impact des pathogènes sur la voie de
signalisation Rel/NF-κB, nous allons développer un crible d’analyse fonctionnelle in cellulo. Cette
approche nous permettra d’agir, via l’ARN interférence, à la fois sur les facteurs de virulence produits
par les pathogènes et sur les éléments de la voie de signalisation. Grâce à ces analyses comparatives
nous déterminerons si différents pathogènes étudiés au laboratoire utilisent ou non la même stratégie
de virulence pour détourner la réponse immunitaire de leur hôte. Ce projet constitue un point de
départ à un projet plus ambitieux dans lequel nous analyserons l’impact des pathogènes sur d’autres
fonctions biologiques de l’hôte.
Programme de travail
Le projet consistera à développer et valider un crible d’analyse fonctionnelle in cellulo. Pour cela
le projet sera décliné en trois phases.
La première partie du stage consistera à construire des vecteurs exprimant un gène rapporteur
sous contrôle d’un promoteur régulé par une voie Rel/NF-κB (promoteur d’un gène codant un peptide
antimicrobien de la famille des défensines, la gallerimycine 3). Le vecteur que nous utiliserons
comme point de départ contient deux gènes rapporteurs (GFP et DsRed) sous contrôle de promoteur
constitutif (4). Il faudra remplacer le promoteur en amont de la DsRed par le promoteur du gène de la
gallerimycine.
Dans un deuxième temps, les vecteurs seront transfectés dans des lignées cellulaires de
Spodoptera (Sf9, Sl2b) afin de valider les vecteurs. Les efficacités de transfection seront mesurées via
la fluorescence de la GFP (expression constitutive) et la mesure de la fluorescence de la DsRed nous
permettra de choisir le vecteur répondant le mieux à la stimulation de la réponse immunitaire (LPS,
bactéries non pathogènes). La validation finale des vecteurs consistera à perturber la voie Rel/NF-κB
par ARN interférence en ciblant des protéines qui activent ou bloquent cette voie (ex : cactus et
dorsal). L’intérêt majeur de cette approche est la possibilité d’effectuer des cinétiques d’expression
quantitatives via la mesure de fluorescence (Cytométrie en flux).
La dernière partie du projet sera consacrée à l’utilisation du crible d’analyse fonctionnelle in
cellulo pour comparer l’impact de diverses souches de Xenorhabdus, de leurs surnageants de cultures
et de souches recombinantes (contrat INRA SPE « Innovation »2013-2014), sur la voie Rel/NF-κB et
affiner ainsi des données acquises in vivo (5, 6).
Résultat attendu :
Les analyses des mécanismes moléculaires de l’interaction hôte/pathogène telles que celle proposée
ici pour la voie Rel/NF-κB devrait permettre de déterminer la nature des molécules clés de
l’interaction (facteurs de virulence et cibles dans l’hôte) dans le modèle Spodoptera/Xenorhabdus. A
terme, ce projet sera étendu à l’étude d’autres fonctions biologiques (phagocytose, apoptose,
autophagie, …) et à d’autres pathogènes étudiés au laboratoire. D’autre part ce sujet s’insère dans un
projet plus vaste de recherche de molécules immunosuppressives pouvant intéresser différents
domaines d’application (santé humaine et vétérinaire ou agronomie).
Références :
1) Stein, M. L. et al. (2012). "One-shot NMR analysis of microbial secretions identifies highly potent proteasome
inhibitor." Proc Natl Acad Sci U S A 109(45), 18367-18371.
2) Bitra, K. et al. (2012). "Polydnavirus Ank proteins bind NF-kappaB homodimers and inhibit processing of Relish."
PLoS Pathog 8(5), e1002722.
3) Volkoff, A. N. et al. (2003). "Characterization and transcriptional profiles of three Spodoptera frugiperda genes
encoding cysteine-rich peptides. A new class of defensin-like genes from lepidopteran insects ?" Gene 319, 43-53.
4) Ando and Fujiwara (2013). "Electroporation-mediated somatic transgenesis for rapid functional analysis in insects"
Development 140(2), 454-8.
5) Aymeric, J. L. et al. (2010). "Imd pathway is involved in the interaction of Drosophila melanogaster with the
entomopathogenic bacteria, Xenorhabdus nematophila and Photorhabdus luminescens” Molecular Immunol. 47 (14),
2342-8.
6) Duvic, B. et al. (2012). "Cecropins as a marker of Spodoptera frugiperda immunosuppression during
entomopathogenic bacterial challenge." J. Insect Physiol. 58, 881-888.