Apports de la cytométrie en flux dans le diagnostic des

Apports de la cytométrie en flux dans
le diagnostic des immunodéficiences
primaires
Françoise Mascart, MD, PhD
Liliane Schandené, PhD
Immunobiology Clinic, Hôpital Erasme
Laboratory of Vaccinology and Mucosal Immunity
Université Libre de Bruxelles, U.L.B.
Séminaire d’hématologie – ULB 23 avril 2013 Déficits immunitaires primaires
•  Maladies génétiques rares < mutations
affectant un ou plusieurs gènes qui
contrôle(nt) l’expression et les activités des
réponses immunes.
•  prévalence ~ 1/5.000
•  >200 déficits décrits
•  >150 gènes identifiés
•  en général symptomatiques dès les 1ères
années de vie (10 signes d’alerte parmi lesquels des
infections sévères, récurrentes et/ou inhabituelles)
Mais plus récemment:
● DIPs conférant une prédisposition à un
agent et/ou une famille d’agents pathogènes
àdiagnostic plus tardif souvent à l’âge adulte
(plus fréquents??)
● DIPs de l’homéostasie immunitaire:
manifestations auto-inflammatoires ou autoimmunes, lymphoproliférations, néoplasies…
Cellules immunitaires affectées
<> agents infectieux
The type of infec-on is a guide to which part of the immune system immunityis deficient q  Defects of innate
•  Phagocytes •  An?gen-­‐presen?ng cells •  NK lymphocytes •  Pyogenic bacteria q  Defects in immune regula?on •  Persistent fungal skin infec?on q  Defects of adaptative immunity
• 
•  T Lymphocytes • 
•  B Lymphocytes • 
Recurrent viral infec?ons Intracellular bacteria Pyogenic bacteria Classification of DIPs
• 
• 
• 
• 
• 
• 
• 
• 
Déficits immunitaires combinés (T et B)
Déficits immunitaires humoraux (B)
Déficits immunitaires syndromiques
Déficits de régulation du système immunitaire
Déficits des cellules phagocytaires
Autres déficits de l’immunité innée
Déficits immunitaires du complément
Désordres auto-inflammatoires
International Union of Immunological Societies (IUIS) Expert Committee on Primary
Immunodeficiency New York June 2011
Rôle de la cytométrie en flux
Anamnèse, examen clinique
ê
1/Hémogramme, dosage IgG-A-M, sérologies postvaccinales et infectieuses
ê
2/ Phénotypage lymphocytaire T,B,NK
+-Tests fonctionnels
ê
Diagnostic
Traitement
Autres marqueurs
ê
Confirmation génétique:
- diagnostic définitif
- conseil génétique
Numération des lymphocytes T, B et NK
Interprétation en % et en valeurs absolues
-normes en fonction de l’âge
Evolution en nombre absolus des sous-populations
lymphocytaires en fonction de l'âge
8
nombre absolu (x109/L)
7
6
5
4
3
2
1
on
a
ne
âge
y
ul
ts
ad
-1
6
10
y
5-
5y
2-
10
lymphocytes
CD19+
CD3+
CD3+CD4+
CD3+CD8+
CD3+TCRab+
CD3+TCRgd+
CD3-CD16+56+
ta
l(
n=
1w
35
-2
m
)
o
(n
=1
3)
25m
o
59m
o
915
m
o
15
-2
4m
o
0
Déficits immunitaires combinés (T et B)
Cc
-a/ déficits immunitaires combinés sévères,
lymphopénie T sévère, diminution des IgG-A-M
Mort des thymocytes/lymphocytes
déficit en ADA
Défaut de réarrangement de VDJ
déficit RAG1/2, Artemis, Ligase IV
T-B-NKT-B-NK+
Anomalies du TCR ou du pré-TCR
T-B+NK+
CD45, CD3E, CD3D, CD3G, CD3Z, ZAP70
Défaut de signalisation cytokinique
déficit IL-2RG, JAK3
IL-7RA
T-B+NKT-B+NK+
Exemple de DICS T-B+NK-
Apport de la cytométrie en flux:
Expression de la chaîne IL-2Rγ négativeàT-B+NK-
Expression de la chaîne IL-2Rγ+ mais Il-7Rα -àT-B+NK+
Déficits immunitaires combinés (T et B)
-b/ déficits immunitaires combinés
lymphopénie T variable, B présents,
Ig normales ou diminuées
plus de 20 types
Apport de la cytométrie en flux
Déficit CMH de classe II: lymphopénie T CD4, diminution IgGA, taux élevé ou normal IgM (voir déficits humoraux)
Facteurs de transcription (CIITA, RFX-ANK, RFX5, RFXAP)
Syndrome d’Omenn: T présents mais hétérogénéité restreinte
diminution des IgG-A-M sauf IgE, hyperéosinophilie
Différentes mutations hypomorphiques: le plus souvent RAG1
ou RAG2, Artémis, IL7RA.
IOTest® Beta Mark PN IM3497
TCR Vβ Repertoire Kit
Clonogramme: expression de la diversité des TCR Vβ
expansion de lymphocytes T activés DR+ mémoires CD45RO+
avec un répertoire TCR Vβ restreint, oligoclonal
Déficits immunitaires humoraux
-a/ diminution Ig (au moins 2 isotypes)
T présents, B normaux ou diminués
Défauts d’expression de marqueurs B de surface
Apport de la cytométrie en flux
Déficit en CD81: fillette de 6 ans d’origine marocaine, hypo
IgG, IgA suboptimales, IgM normales, thrombopénie, syndrome
inflammatoire, absence de réponse vaccinale
Contrôle
Patient
M.C. van Zelm, J. Smet, B. Adams, F. Mascart, L. Schandené et al. J. Clin
Invest. 120(4), 1265-1274, 2010
Déficit immunitaire commun variable (DICV):
Fourre-tout de ttes les hypo IgG (hypo IgA ou IgM), mutation
non définie, diminution des lymphocytes B mémoires switchés
Lymphocytes B
Lymphocytes totaux
B naïfs CD19+CD27-IgM+IgD+
B mémoires CD19+CD27+IgM++IgD+
(Zone marginale de la rate)
B mémoires switchés CD19+CD27+IgD-IgM-(IgG+,IgA+)
NB: normes suivant l’âge
Déficits immunitaires humoraux
-b/ diminution IgG et A, IgM normale ou élevée
T présents, B normaux ou diminués
Défaut de coopération T-B/monocytes au sein des organes
lymphoïdes, essentielle pour la commutation isotypique des Ig
Apport de la cytométrie en flux
Déficit CD40L: T présents, diminution IgG-A, taux élevé
ou normal IgM, neutropénie transitoire cf déficit en CD40
CD69 4 hrs in vitro s?mula?on of PBMC (PMA+Ionomycin) absence d’expression du CD40L (CD154) par les
lymphocytes T activés
CD40L Déficits immunitaires humoraux
-c/ diminution Ig (tous les isotypes)
T présents, B fortement diminués ou absents
7 types décrits
Agammaglobulinémie de Bruton ou agammaglobulinémie
liée à X:
-mutation du gène BTK (Bruton Tyrosine Kinase) qui code
pour une tyrosine kinase impliquée dans l’ontogénie B
Apport de le cytométrie en flux:
marqueurs intracytoplasmiques
Déficits de régulation du système
immunitaire
-a/ lymphohistiocytoses hémophagocytaires ou
syndromes hémophagocytaires:
génétiques
acquises
-hémophagocytose
-causée par la prolifération incontrôlée de lymphocytes
activés et d’histiocytes secrétant de grandes quantités de
cytokines inflammatoires
Défauts cytotoxiques des T CD8
et des NK
Défauts moléculaires associés aux formes génétiques
peuvent affecter différentes étapes de l’exocytose des granules
cytotoxiques vers la cible
Cytométrie en flux:
Test de dégranulation CD107a
CD107a=LAMP « lysosomal associated membrane proteins »
Activité cytotoxique
CD107a
-sang total (IL-2) incubé avec K562 et PHA
No s?mula?on K562 Control Pa?ent 2 Griscelli
CD3-­‐ CD16+CD56+ CD3-­‐ CD16+CD56+ Pa?ent 1 FHLH-3
FHLH-2
Pa?ent 3 CD107 Perforin Déficits de régulation du système
immunitaire
-b/ syndromes avec autoimmunité:
Le syndrome lymphoprolifératif avec auto-immunité
ou autoimmune lymphoproliferative syndrome
(ALPS):
-autoimmunité, lymphadénopathie chronique non-maligne
+- splénomégalie
-déficits de l’apoptose lymphocytaire, 5 sous-types
Mécanismes de l’apoptose Fas-induite
-mutation hétérozygote du gène FasL
ALPS type Ib
-mutation hétérozygote du gène Fas (TNFRSF6)
-mutation homozygote du gène Fas
ALPS type Ia
ALPs 0
-mutation du gène caspase-10 ou 8 ALPs type IIa
-mutation inconnue, ou mutation somatique ALPS type III
IL-­‐10 et FasL soluble dans le sérum C. Picard Cytométrie en flux: défauts subtils
Accumulation dans le sang et les organes lymphoïdes secondaires d’une
population polyclonale de lymphocytes T TCRαβ doubles négatifs CD4CD8- (TCRαβ CD4-CD8->2 % des CD3+)
Contrôle àTCRαβ CD4-CD8-=1.51 % des CD3+
Pa?ent àTCRαβ CD4-CD8-=7 % des CD3+
Apoptose Fas-induite des lymphoblasteslignée PHA IL-2
Apoptose Fas-induite des lymphoblastes PHA
J=0
J=1
J=2
J=3
Contrôle
anti-Fas 1 µg/ml
anti-Fas 0.1 µg/ml
30%
30%
64%
78%
38%
55%
79%
34%
57%
84%
anti-CD3 1 µg/ml anti-CD3 0.1 µg/ml
38%
52%
73%
40%
58%
nd
% apoptose
Résultats exprimés en % de cellules apoptotiques
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
anti-Fas CH11
0
1
2
3
Jours d'incubation
Conclusion: déficit de l’apoptose Fas-médiée
Déficits de régulation du système
immunitaire
-b/ syndromes avec autoimmunité:
Le syndrome IPEX « immune dysregulation,
polyendocrinopathy, enteropathy, X-linked »
-eczéma, manifestations autoimmunes importantes,
sévères et précoces (entéropathie, diabète, thyroïdite, et
cytopénie) avec des auto-anticorps
-déficits (absence ou fonction) des T régulateurs
Mutations dans le gène FOXP3
Cytométrie en flux:
détection d’un marqueur nucléaire
-facteur de transcription FoxP3
Déficits de l’immunité innée
Déficits de l’adhésion leucocytaire
-chimiotactisme PMN anormal (PMN++ en périphérie),
foyer d’infections sans pus, cicatrisation lente (chute
tardive du cordon)
-déficit d’expression de la chaîne β de 3 intégrines:
CD11a/CD18, CD11b/CD18, CD11c/CD18
Apport de la cytométrie en flux
C. Picard Déficits de l’immunité innée
Déficits de l’explosion oxydative
-granulomatose septique chronique, XL
-déficit dans le complexe NADPH oxydase (sousunité gp91phox)àproduction déficiente d’H2O2 et de
superoxyde par les cellules phagocytaires,
formation de granulomes
Cytométrie en flux:
test fonctionnel
-  Stimulation PMN avec PMA
-  conversion du colorant
intracellulaire
Events -  H2O2 production
dihydrorhodamine-1,2,3 en un
composé fluorescent
lié à l’oxydation
fluorescence Classiquement : réduction du nitrobleu de tétrazolium (NBT)
Déficits de l’immunité innée
Syndrome
de prédisposition mendélienne aux
infections mycobactériennes
-sensibilité accrue à Mycobacterium bovis du BCG et/ou
mycobactéries atypiques (M Avium..)
-infection associée fréquente: cf salmonellose
-aujourd’hui 7 défauts génétiques identifiés <<mutations
identifiées dans gènes affectant l’axe IL-12/IL-23/IFN-γ
IL12RB1, IL12B, IFNGR1, IFNGR2, STAT1
Axe IL-12/IFN-γ
Defects in the collabora?on between APC and T lymphocytes: defects of the IL-­‐12; IL-­‐23/ IFN-­‐γ signaling pathway Phagocytic cells/ dendritic cells
NK cells/ T lymphocytes
Exemples de deux patients:
1/ Patient de 30 ans, d’origine martiniquaise
Admis pour: T° 38.5°C avec frissons et sudations nocturnes <
3-4 semaines, perte de poids +++ (10 kg en 3 semaines),
dyspnée avec obstruction des voies aériennes supérieures,
grosses adénopathies cervicales fluctuantes
<adénite cervicale à Salmonella D
2/Patiente de 37 ans , d’origine belge
Adénite cervicale avec fièvre, PCR identifie 16sr DNA of
Mycobacterium Tilburgii
Cytométrie en flux
TEMOIN
PATIENT
Déficit d’expression de la chaîne β 1 du récepteur à l’IL-12
par les lymphocytes périphériques (sang total)
Cytométrie en flux: ce n’est pas tout
-d’autres cellules cf cellules dendritiques
Control -tests fonctionnels: prolifération, profil cytokinique,
facteurs de transcription, phosphoprotéines…;
Hyper IgE syndrome (Job syndrome ) Th17 defect < STAT3 muta?ons •  Merci pour votre attention