Rôle du périplasme dans la perception par la bactérie de

Université des Sciences et Technologies de Lille
Thèse
Présentée par
Anne-France P ROUVOST
Pour l’obtention du grade de Docteur de l’Université des Sciences et Technologies de Lille
Discipline : Sciences de la vie et de la santé
Rôle du périplasme dans la perception par la
bactérie de son environnement :
•Utilisation des ȕ-galactanes par Erwinia chrysanthemi
•Voie de signalisation du système Rcs dans la virulence
d’Erwinia chrysanthemi
Soutenue le 22 octobre 2008, devant la commission d’examen composée de :
Président : Jean-Claude M ICHALSKI
Rapporteurs : Alain F ILLOUX
Jean-Claude L AZZARONI
Examinateurs : Jean-Marie L ACROIX
Anthony P UGSLEY
Directeur de Thèse : Jean-Pierre B OHIN
Thèse d'Anne-France Prouvost, Lille 1, 2008
© 2009 Tous droits réservés.
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Sommaire
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. Sommaire
. Remerciements ................................................................................................................. 7
. Introduction ...................................................................................................................... 9
A. L’enveloppe des protéobactéries.................................................................................... 9
1. L’enveloppe des bactéries .......................................................................................... 9
a) La membrane interne.............................................................................................. 9
• La double couche lipidique ................................................................................ 9
• Les protéines de la membrane interne.............................................................. 10
b) La membrane externe ........................................................................................... 11
• La double couche lipidique .............................................................................. 11
• Les protéines de la membrane externe ............................................................. 12
c) Le périplasme ....................................................................................................... 14
• Le peptidoglycane ............................................................................................ 14
• Les glucanes périplasmiques osmorégulés....................................................... 15
• Les protéines périplasmiques ........................................................................... 15
d) Structures associées à l’enveloppe ....................................................................... 16
• La capsule......................................................................................................... 16
• Les flagelles...................................................................................................... 17
• Les pilis ............................................................................................................ 17
e) Structures traversant l’enveloppe : les systèmes de transport .............................. 18
• Le système Sec ................................................................................................. 18
• Le système TAT ............................................................................................... 19
• Le système de type I : système de type ABC (ATP Binding Cassette)............ 20
• Le système de type II ....................................................................................... 21
• Le système de type III ...................................................................................... 21
• Le système de type IV...................................................................................... 21
• Le système de type V ....................................................................................... 21
• Le système de type VI...................................................................................... 22
2. Pouvoir pathogène, facteurs de virulence, facteurs d’antivirulence......................... 22
a) L’acquisition de gènes de virulence. .................................................................... 22
b) L’élimination de gènes d’antivirulence................................................................ 23
B. Les glucanes périplasmiques osmorégulés : les OPG .................................................. 25
1. Les OPG : structure des familles.............................................................................. 25
a) La famille I ........................................................................................................... 25
b) La famille II.......................................................................................................... 26
c) La famille III ........................................................................................................ 26
d) La famille IV ........................................................................................................ 26
2. Synthèse des OPG chez E. coli et E. chrysanthemi et leur régulation ..................... 28
3. Rôle et impact sur la virulence................................................................................. 31
C. Les systèmes à deux composants et les phosphorelais................................................. 34
1. Structure ................................................................................................................... 34
a) Le capteur............................................................................................................. 34
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b) Le régulateur ........................................................................................................ 34
c) Les phosphorelais................................................................................................. 35
2. La perception du signal ............................................................................................ 36
3. Le paradigme EnvZ-OmpR...................................................................................... 37
4. Une réponse graduée ................................................................................................ 38
5. Rôle dans la virulence .............................................................................................. 40
D. Le phosphorelais : RcsCDB ......................................................................................... 45
1. RcsCDB.................................................................................................................... 45
a) RcsC ..................................................................................................................... 45
b) RcsD..................................................................................................................... 45
c) RcsB ..................................................................................................................... 45
d) RcsA..................................................................................................................... 47
2. Protéines interagissant avec le phosphorelais Rcs ................................................... 47
a) RcsF...................................................................................................................... 47
b) IgaA...................................................................................................................... 47
c) DjlA...................................................................................................................... 49
3. Autres éléments interagissant avec le phosphorelais Rcs ........................................ 49
4. Les gènes cibles du système Rcs.............................................................................. 50
5. La mutation suppressive rcsC2 ................................................................................ 51
E. Le modèle d’étude : Erwinia chrysanthemi 3937 ........................................................ 53
1. Structure de la paroi de la plante hôte ...................................................................... 53
2. Mécanismes de virulence ......................................................................................... 55
. Objectifs .......................................................................................................................... 60
. Partie I – Contribution à la caractérisation du locus gan impliqué dans l’utilisation
des galactanes chez Erwinia chrysanthemi........................................................................... 61
A. Caractérisation du locus gan chez Erwinia chrysanthemi............................................ 61
1. Identification du locus.............................................................................................. 61
2. Caractérisation du locus : utilisation des galactanes et de leurs dérivés .................. 64
a) Caractérisation des activités galactanases ............................................................ 64
• GanA : l’endo-1,4-ȕ-galactanase...................................................................... 64
• GanB : l’exo-1,4-ȕ-galactanase........................................................................ 67
b) Caractérisation du système de transport des galactanes....................................... 68
B. Régulation des gènes gan............................................................................................. 69
1. Effet de la source de carbone sur l’expression des gènes gan ................................. 69
a) Effet des conditions de culture sur l’expression des fusions transcriptionnelles . 69
b) Effet des conditions de culture sur l’activité endo-1,4-ȕ-galactanase.................. 75
• Effet sur l’activité de GanA ............................................................................. 75
• Effet sur la fusion transcriptionnelle ganA::uidA............................................. 75
c) Effet des conditions de culture sur l’activité exo-1,4-ȕ-galactanase.................... 75
2. Effet de la phase stationnaire sur l’expression des gènes gan.................................. 76
3. Effet de GanR sur l’expression des gènes gan ......................................................... 78
4. Rôle du locus gan dans l’infection de l’hôte............................................................ 79
a) Impact sur la virulence ......................................................................................... 79
b) Expression du locus lors de l’infection ................................................................ 79
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C. Relation entre le locus gan, les OPG et le système RcsCDB....................................... 81
D. Conclusion et discussion .............................................................................................. 82
. Partie II - Rôle du système à deux composants RcsCDB dans le pouvoir pathogène
d’Erwinia chrysanthemi et lien existant entre les OPG et le système RcsCDB................. 87
A. Impact du système RcsCBD sur le pouvoir pathogène d’Erwinia chrysanthemi. ....... 87
1. Effet des mutations dans le système Rcs (rcsC2, rcsC, rcsD, rcsB, ǻrcsCBD et
rcsF) dans les contextes sauvage et opgG........................................................................ 87
a) Effet des mutations sur la mucosité...................................................................... 89
b) Effet des mutations sur la motilité........................................................................ 89
c) Effet des mutations sur l’activité pectinase.......................................................... 90
d) Effet des mutations sur la résistance aux sels biliaires......................................... 90
e) Effet des mutations sur la virulence ..................................................................... 91
f) Bilan des mutations .............................................................................................. 92
2. Caractérisation de la mutation rcsC2 ....................................................................... 94
a) Effets des mutations sur les fusions transcriptionnelles....................................... 94
• Fusion flhD-uidA .............................................................................................. 94
• Fusion ftsA-uidA............................................................................................... 96
b) La souche rcsC2 opgG ne perçoit plus le choc osmotique .................................. 97
c) Dominance de la mutation rcsC2 ......................................................................... 99
• Clonage du locus rcsCBD ................................................................................ 99
• Phénotype du mérodiploide : opgG, rcsC2, miniTn5rcsCBD ......................... 99
• Test de motilité............................................................................................... 100
• Virulence du mérodiploïde............................................................................. 100
3. Expression d’une version soluble de la lipoprotéine RcsF : TAT-RcsF ................ 101
a) Construction de la version soluble : TAT-RcsF................................................. 101
b) Caractérisation de la structure de la protéine : mutations des cystéines ............ 103
c) Détermination par délétion de la partie active de RcsF...................................... 105
d) Impact des mutations et des délétions dans TAT-rcsF sur l’expression de la
fusion cpsB-lacZ......................................................................................................... 106
e) Surexpression transitoire par le plasmide pNFW177 (contenant TAT-rcsF) chez
E. chrysanthemi.......................................................................................................... 108
4. Effet de la surexpression des gènes TAT-rcsF, igaA, djlA ..................................... 109
a) Surexpression chez E. coli ................................................................................. 109
b) Surexpression chez E. chrysanthemi : phénotypes sur boîte.............................. 109
• La mucosité .................................................................................................... 110
• La motilité ...................................................................................................... 111
c) Surexpression chez E. chrysanthemi : dosage de la fusion ftsA-uidA ................ 112
d) Virulence ............................................................................................................ 113
• Test de virulence sur les tubercules de pomme de terre................................. 113
• Test de virulence sur les feuilles d’endive. .................................................... 115
e) Bilan des surexpressions .................................................................................... 116
B. Relation entre les OPG et le système Rcs .................................................................. 117
1. Construction de p
araBAD
opgGH.............................................................................. 117
2. Effet de la variation de la quantité des OPG .......................................................... 118
a) Sur un des gènes cibles du système Rcs : la fusion ftsA-uidA............................ 118
b) Sur la fusion opgG-uidA..................................................................................... 121
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