Électrophorèse sur gel d`agarose - EU

Analyse d’échantillons alimentaires pour la
présence d’organismes génétiquement modifiés
Module 5
Électrophorèse sur gel d’agarose
M. Somma, M. Querci
WORLD HEALTH ORGANIZATION
REGIONAL OFFICE FOR EUROPE
WELTGESUNDHEITSORGANISATION
REGIONALBÜRO FÜR EUROPA
ORGANISATION MONDIALE DE LA SANTE
BUREAU REGIONAL DE L'EUROPE
ВСЕМИРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ ЗДРАВООХРАНЕНИЯ
ЕВРОПЕЙСКОЕ РЕГИОНАЛЬНОЕ БЮРО
Électrophorèse sur gel d’agarose
2
Table des matières
Module 5
Électrophorèse sur gel d’agarose
INTRODUCTION
3
PRINCIPES PHYSIQUES DE L’ELECTROPHORESE SUR GEL D’AGAROSE
3
COMPOSANTS DE L’ELECTROPHORESE SUR GEL D’AGAROSE
6
EXPERIENCE
8
REFERENCES
12
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Module 5
Électrophorèse sur gel d’agarose
3
Introduction
L’électrophorèse sur gel est une méthode de séparation des macromolécules en
fonction de leur taille, de leur charge électrique et d’autres propriétés physiques. Le
terme « électrophorèse » décrit la migration de particules chargées sous l’influence
d’un champ électrique. Le préfixe « électro » fait référence à l’électricité et la racine
« phorèse » vient du grec phoros, qui signifie « porter d’un côté à l’autre ».
L’électrophorèse sur gel fait référence à une technique où les molécules sont
obligées de traverser une couche de gel sous l’impulsion d’un courant électrique.
L’énergie motrice de l’électrophorèse est la tension qui est appliquée à des
électrodes placées de part et d’autre de la couche de gel. Les propriétés d’une
molécule déterminent la rapidité avec laquelle un champ électrique peut traverser un
milieu gélatineux.
Diverses macromolécules biologiques importantes (ex.: acides aminés, peptides,
protéines, nucléotides et acides nucléiques) possèdent des groupes ionisables qui, à
un pH donné, se transforment en espèces chargées électriquement sous forme
tantôt de cations (+), tantôt d’anions (-). En fonction de la nature de la charge du
réseau, les particules chargées migreront soit vers la cathode, soit vers l’anode. À
titre d’exemple, lorsqu’un champ électrique traverse un gel de pH neutre, les groupes
de phosphates chargés négativement de l’ADN provoquent la migration de celui-ci
vers l’anode (Westermeier, 1997).
L’électrophorèse à travers l’agarose est une méthode utilisée de façon standard pour
séparer, identifier et purifier des fragments d’ADN. La technique est simple et facile à
réaliser et peut dissoudre des fragments d’ADN que d’autres procédures ne
permettent pas de séparer correctement. La position de l’ADN dans le gel peut, par
ailleurs, être déterminée en teintant celui-ci avec une faible concentration de bromure
d’éthidium, un fluorochrome s’intercalant entre les bases de l’ADN.
Les paragraphes suivants présenteront les principes physiques, les composants
(matrice du gel, tampon, tampon de charge et marqueur) et les méthodes de
préparation de l’électrophorèse sur gel d’agarose (Sambrook et al., 1989).
Principes physiques de l’électrophorèse sur gel d’agarose
La technique de l’électrophorèse sur gel est utilisée pour séparer les acides
nucléiques et les protéines. La séparation de macromolécules dépend de deux
variables : la charge et la masse. Lorsqu’un échantillon biologique tel qu’un ADN est
mélangé à une solution tampon et appliqué sur un gel, il se produit une interaction
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des deux variables. Les molécules repoussées d’un côté par le courant électrique
produit par une électrode sont attirées simultanément par le courant produit par
l’autre électrode. La force de friction du matériau composant le gel joue le rôle de
« tamis moléculaire » et sépare les molécules en fonction de leur taille. Durant
l’électrophorèse, les macromolécules sont poussées à travers les pores. Leur vitesse
de migration à travers le champ électrique dépend des facteurs suivants :
• la résistance du champ,
• la taille et la forme des molécules,
• l’hydrophobicité relative des échantillons,
• la force ionique et la température du tampon dans lequel les molécules se
déplacent.
Afin de bien comprendre la séparation des particules chargées dans l’électrophorèse
sur gel, il est important d’examiner de plus près les équations simples applicables à
l’électrophorèse. Lorsqu’une tension est appliquée entre les électrodes, un gradient
de potentiel E est généré et peut être exprimé par l’équation
E = V/d
(1)
où V, mesuré en volts, désigne la tension appliquée et d, la distance en cm entre les
électrodes.
Lorsque le gradient de potentiel E est appliqué, une force F est générée sur une
molécule chargée et exprimée par l’équation :
F = Eq
(2)
où q est égal à la charge en coulombs qui pèse sur la molécule. C’est cette force,
mesurée en newtons, qui pousse une molécule chargée vers une électrode.
Il existe également une résistance de friction qui ralentit le mouvement des
molécules chargées. Cette force de friction est fonction de :
• la taille hydrodynamique de la molécule,
• la forme de la molécule,
• la taille de pore du milieu dans lequel se produit l’électrophorèse,
• la viscosité du tampon.
La vélocité v d’une molécule chargée dans un champ électrique est fonction du
gradient de potentiel, de la charge et de la force de friction de la molécule et peut
être exprimée par l’équation :
v = Eq / f
(3)
où f indique le coefficient de friction.
La mobilité électrophorétique M d’un ion peut alors être définie par la vélocité de l’ion
divisée par le gradient de potentiel :
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M=v/E
(4)
L’équation (3) permet, en outre, de voir que la mobilité électrophorétique M peut être
exprimée de manière équivalente comme étant la charge de la molécule q divisée
par le coefficient de friction f :
M = q / f.
(5)
Lorsqu’une différence potentielle s’applique, les molécules dotées de différentes
charges globales vont commencer à se séparer en raison de leur mobilité
électrophorétique différente. Cette mobilité électrophorétique est un paramètre
important et caractéristique d’une molécule ou d’une particule chargée et dépend de
la valeur pK du groupe chargé et de la taille de la molécule ou de la particule. Même
des molécules ayant des charges similaires commenceront à se séparer si elles ont
des tailles moléculaires différentes, attendu qu’elles auront des forces de friction
différentes. L’ADN linéaire à deux brins traverse les matrices de gel à des vitesses
qui sont inversement proportionnelles au log10 du nombre de paires de base. Les
molécules de plus grosse taille migrent plus lentement en raison de leur plus grande
traînée de frottement et de leur mouvement moins efficace à travers les pores du gel.
Le courant traversant la solution entre les électrodes est conduit principalement par
les ions du tampon, une faible proportion étant conduite par les ions de l’échantillon.
La relation entre le courant I, la tension V et la résistance R est exprimée comme
dans la loi d’Ohm :
R = V / I.
(6)
Cette équation démontre que pour une résistance donnée R, il est possible
d’accélérer une séparation électrophorétique en augmentant la tension V appliquée,
ce qui pourrait engendrer une augmentation correspondante de la circulation du
courant I. La distance parcourue lors de la migration sera proportionnelle au courant
et au temps. L’augmentation de la tension V et l’augmentation correspondante du
courant I provoqueront cependant l’un des principaux problèmes posés par la plupart
des formes d’électrophorèse, en l’occurrence la génération de chaleur. Ceci peut être
illustré par l’équation suivante où le courant W (mesuré en watts) généré durant
l’électrophorèse est égal au produit de la résistance multiplié par le carré du courant :
W = I2R.
(7)
Vu que la plus grande partie de l’électricité produite dans le processus
électrophorétique est dissipée sous forme de chaleur, les effets préjudiciables
suivants peuvent se produire:
•
un taux accru de diffusion d’ions d’échantillon et d’ions de tampon, entraînant un
élargissement des échantillons séparés ;
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•
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la formation de courants de convection, ce qui conduit à un mélange
d’échantillons séparés ;
•
l’instabilité thermique des échantillons qui sont plutôt sensibles à la chaleur (ex.:
dénaturation de l’ADN) ;
•
une diminution de la viscosité du tampon et donc une réduction de la résistance
du milieu.
Composants de l’électrophorèse sur gel d’agarose
Agarose
L’agarose, un colloïde naturel extrait d’une algue, est un polysaccharide linéaire
(masse moléculaire moyenne : ~12 000 Da) composé de l’unité de répétition
fondamentale agarobiose, elle-même composée d’unités alternantes de galactose et
de 3,6-anhydrogalactose. L’agarose est très fragile et se détruit facilement sous
l’effet de manipulations. Les gels d’agarose ont de grands « pores » et sont utilisés
essentiellement pour séparer les grandes molécules d’une masse moléculaire
supérieure à 200 kDa.
Les gels d’agarose se transforment rapidement, mais avec une résolution limitée,
étant donné que les liens qui s’y forment ont tendance à être flous/diffus et à s’étaler
en se disloquant. Ceci est dû au format du pore et ne peut être contrôlé. Les gels
d’agarose sont obtenus en mettant la poudre d’agarose déshydraté en suspension
dans un tampon aqueux, puis en faisant bouillir le mélange jusqu’à ce que l’agarose
se transforme en une solution claire. Celle-ci est ensuite versée sur un moule et
mise à refroidir à température ambiante jusqu’à formation d’un gel rigide. En
durcissant, l’agarose forme une matrice dont la densité est déterminée par sa
concentration.
Tampon d’électrophorèse
La mobilité électrophorétique de l’ADN est affectée par la composition et la
résistance ionique du tampon d’électrophorèse. En l’absence d’ions, la conductance
électrique est minimale et l’ADN migre lentement, voire pas du tout. Dans un tampon
à résistance ionique élevée, la conductance électrique est très efficace et une
quantité importante de chaleur est générée. Dans le pire des cas, le gel se met à
fondre et l’ADN se dénature.
Il existe plusieurs tampons pour l’électrophorèse de l’ADN natif double brins. Ces
tampons contiennent de l’EDTA (pH 8,0) et du tris-acétate (TAE), du tris-borate
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(TBE) ou du tris-phosphate (TPE) à une concentration avoisinant les 50 mM (pH 7,57,8). Les tampons d’électrophorèse sont généralement préparés sous forme de
solutions concentrées et conservés à température ambiante. Le TBE a été utilisé
initialement à une force de travail d’1x pour l’électrophorèse sur gel d’agarose. Une
solution fonctionnelle de 0,5x a toutefois déjà un pouvoir tampon plus que suffisant et
la quasi-totalité des électrophorèses sur gel d’agarose sont désormais exécutées en
utilisant cette concentration tampon.
Concentration d’agarose
Un fragment d’ADN d’une taille donnée migre à travers des gels à différents taux en
fonction de la concentration d’agarose. En fonction de la concentration spécifique de
l’agarose ou du tampon, des segments d’ADN contenant entre 20 et 50 000 bp
peuvent être séparés. Dans les gels horizontaux, l’agarose est généralement utilisé à
des concentrations comprises entre 0,7% et 3% (cf. Tableau 1).
Tableau 1. Concentration de gel d’agarose recommandée pour différencier des
molécules d’ADN linéaires
% d’agarose
Éventail de tailles
d’ADN (bp)
0,75
10 000 – 15 000
1,0
500 – 10 000
1,25
300 – 5 000
1,5
200 – 4 000
2,0
100 – 2 500
2,5
50 – 1 000
ADN marqueur
La distance de migration, pour une tension, un gel d’agarose et des concentrations
de tampon donnés, dépend du poids moléculaire du matériau de départ. Les puits
situés à gauche et à droite du gel devraient, dès lors, être remplis avec un ADN
marqueur d’une taille connue. Un marqueur contient généralement un nombre défini
de fragments d’ADN connus, ce qui permet de déterminer plus facilement la taille
des ADN inconnus si une distorsion systématique du gel devait se produire en cours
d’électrophorèse.
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Tampon de chargement
Les échantillons d’ADN à charger sur le gel d’agarose sont tout d’abord mélangés à
un tampon de chargement composé généralement d’eau, de saccharose et d’une
teinture (par exemple, du xylène cyanol, du bleu de bromophénol, du vert de
bromocrésol, etc.). La quantité maximale d’ADN pouvant être chargée dépend du
nombre de fragments. La quantité minimale d’ADN pouvant être détectée par la
photographie des gels teintés au bromure d’éthidium tourne autour des 2 ng sur une
bande de 0,5 cm de largueur. Si une largeur de bande renferme plus de 500 ng
d’ADN, le sillon sera surchargé, ce qui produira une traînée. Le tampon de
chargement a un triple objectif :
•
il augmente la densité de l’échantillon en faisant en sorte que les gouttes d’ADN
tombent de façon harmonieuse dans le puits ;
•
il ajoute de la couleur à l’échantillon, simplifiant ainsi le processus de
chargement ;
•
il attribue une teinture à l’échantillon qui, dans un champ électrique, évolue vers
l’anode à une vitesse prévisible.
Expérience
Attention : le bromure d’éthidium est un mutagène/carcinogène puissant et
modérément toxique. Veillez à toujours porter des gants lors de la manipulation de
solutions et de gels contenant du bromure d’éthidium.
Matériel
•
Une unité d’électrophorèse horizontale avec bloc d’alimentation électrique
•
Un four à micro-ondes ou un agitateur chauffant
•
Des micropipettes
•
Des tubes de réaction de 1,5 ml
•
Une balance précise à 0,1 g
•
Des spatules
•
Un rack pour tubes de réaction
•
Une verrerie de laboratoire
•
Un diaphanoscope (rayons UV, 312 nm)
•
Du matériel d’enregistrement (par exemple, un appareil photo Polaroid ou une
caméra vidéo)
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Réactifs
•
Agarose convenant pour l’électrophorèse d’ADN
•
Tris[hydroxyméthyl] aminomethane (Tris)
•
Acide borique
•
Na2EDTA
CAS 6381-92-6
•
Bromure d’éthidium
CAS 1239-45-8
•
Saccharose
•
Xylène cyanole FF
•
Marqueurs d’ADN:
ƒ
CAS 77-68-1
CAS 2650-17-1
Lambda ADN EcoRI/HindIII digéré (ou un autre marqueur similaire
adéquat)
ƒ
Marqueur d’ADN de 100 bp
10x tampon TBE (1 litre)
Tris[hydroxymethyl] aminomethane (Tris)
54,0 g
Acide borique
27,5 g
Na2EDTA
7,44 g
•
Mélangez le réactif à l’eau déionisée afin d’obtenir une solution d’un litre à pH de 8,3.
•
Conservez à température ambiante.
6x tampon de chargement (10 ml)
•
Xylène cyanole FF
0,025 g
Saccharose
4g
Ajoutez du saccharose et du xylène cyanole FF à de l’eau déionisée afin d’obtenir 10
ml de solution.
•
Mélangez la solution, passez à l’autoclave et conservez à 4°C.
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Procédure
•
À l’aide d’une bande adhésive ou d’un autre moyen, scellez les extrémités d’un
moule en plastique propre et sec. Positionnez le peigne adéquat de façon à
former des puits complets au moment de couler la solution d’agarose.
•
Diluez le tampon TBE 10x afin de préparer la quantité adéquate de tampon TBE
de 0,5 pour remplir le réservoir d’électrophorèse et préparez le gel.
•
Pesez l’agarose en poudre en suivant les indications du Tableau 2 et ajoutez-y
une quantité adéquate de 0,5 x tampon TBE dans un Erlenmeyer garni d’un
couvercle lâche (généralement 150 ml de solution à base de gel pour un moule
de 15 x 15 cm et 100 ml de gel pour un moule à gel de 15 x 10 cm).
0,8 - 1%
1,5%
2,0%
•
génomique
mg4
ADN
mg3
GM08
GM07
CRYIA4
HA-nos118-r
CRYIA3
HA-nos118-f
p35S-cr4
p35S-cf3
ZEIN4
GMO4
ZEIN3
GMO3
Tableau 2. Concentrations de gel d’agarose utilisées durant le cours
X
X
X
X
X
X
X
X
Chauffez la masse dans un four à micro-ondes ou dans un bain-marie jusqu’à
dissolution de l’agarose (contrôlez le volume de la solution après l’avoir
chauffée).
•
Laissez refroidir le mélange jusqu’à une température de 50-60 °C, puis ajoutez
du bromure d’éthidium (avec une solution de réserve de 10 mg/ml) afin d’obtenir
une concentration finale de 0,2 µg/ml et mélangez le tout convenablement.
•
Versez la solution sur le moule du gel et laissez le gel se figer. La quantité de gel
utilisée devrait correspondre à une épaisseur d’environ 3 à 5 mm.
•
Lorsque le gel est complètement figé, retirez soigneusement le peigne et la
bande adhésive et placez le gel dans un réservoir d’électrophorèse.
•
Ajoutez un tampon de 0,5 x TBE en quantité suffisante dans l’unité
d’électrophorèse pour recouvrir le gel d’une épaisseur de 2 à 5 mm.
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Préparez les échantillons et un marqueur pour l’ADN génomique en procédant
comme suit :
Échantillon
eau
tampon de chargement
échantillon
Marqueur
3 µl
2 µl
5 µl
10 µl
eau
6 µl
tampon de charge
2 µl
λ DNA EcoR I / Hind III 2 µl
10 µl
Préparez les échantillons et un marqueur pour les produits PCR en procédant
comme suit:
Échantillon
tampon de chargement
échantillon
•
Marqueur
2 µl
8 µl
10 µl
Marqueur ADN 100 bp 15 µl
Chargez 10 µl de chaque échantillon dans des puits consécutifs et placez le
marqueur d’ADN adéquat dans le premier et le dernier puits.
•
Fermez le couvercle du réservoir à gel et raccordez les fils électriques jusqu’au
moment où l’ADN migre vers l’anode, puis appliquez une tension de 5 à 10 V/cm.
•
Faites migrer le gel jusqu’au moment où le xylène cyanole a migré à l’intérieur du
gel sur la distance voulue (± 40 à 60 minutes).
•
Coupez le courant, retirez les fils et ôtez le couvercle du réservoir à gel.
Positionnez le gel sur une boîte d’éclairage UV et photographiez le gel.
•
Jetez le gel dans la poubelle pour déchets solides à base de bromure d’éthidium
qui a été fournie.
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Références
Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T. (1989). Gel electrophoresis of DNA. In:
Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T. (Eds.) Molecular Cloning: a
Laboratory Manual. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring
Harbor, NY, USA, chapter 6.
Westermeier, R. (1997). Electrophoresis in Practice: a Guide to Methods and
Applications of DNA and Protein Separation, VCH, Weinheim.
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